JP2002196253A

JP2002196253A - 干渉縞投影光学系及びこの光学系を用いた顕微鏡

Info

Publication number: JP2002196253A
Application number: JP2000395589A
Authority: JP
Inventors: Hisao Osawa; 日佐雄大澤; Yasushi Oki; 裕史大木
Original assignee: Nikon Corp
Current assignee: Nikon Corp
Priority date: 2000-12-26
Filing date: 2000-12-26
Publication date: 2002-07-12

Abstract

(57)【要約】【課題】小型かつ安価に３次元白色表示が可能な格子
照明顕微鏡を提供する。【解決手段】白色光源１から出射した光は、コンデン
サレンズ２で平行光とされ１次元格子３を均一に照明す
る。格子３を透過した光はその焦点が格子３上にあるレ
ンズ４を透過しハーフミラー７で反射されたのち、レン
ズ４と瞳位置を共有する対物レンズ８で標本５０に投影
される。レンズ４と対物レンズ８との共有瞳位置には空
間フィルタ５が設けられており、格子３に対する±１次
光成分のみを透過させ他の成分を除去する。このため、
標本上には±１次光のみによる正弦波状の干渉縞が生成
される。白色干渉縞で照明された像はハーフミラー７,
結像レンズ２２を介してCCDカメラに撮像され、格子３
を1/3ピッチづつ移動させた３つの像を合成することに
より白色表示が可能な格子照明顕微鏡を得る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、光源装置に関し、
なお詳細には顕微鏡装置等に好適に用いられる白色の投
影光源装置に関する。

【０００２】

【従来の技術】従来から広く用いられている通常の光学
顕微鏡では、合焦位置から焦点をぼかしたときにも、合
焦時と何等変わりのない明るさの像が観察される。換言
すれば、焦点をぼかした高さの標本上に細かい構造がな
い限り、観察される明暗像から標本の構造を読みとるこ
とができない。従って、通常の顕微鏡では標本に対する
光学系の光軸方向の情報を得ることが困難であり、立体
構造を観察したい場合には不向きであった。

【０００３】これに対して共焦点顕微鏡では、照明光を
集光して標本を点状に照明するとともに、その照明点で
散乱された光を結像させて点状の光検出器で検出するこ
とにより、標本中で焦点の合っている面のみの情報を得
るように構成している。そして、この照明点を標本上で
２次元的に走査させて検出値を合成することにより従来
の顕微鏡と同様の２次元的な情報（平面構造）を得るこ
とができる。さらに標本中の焦点面を光軸方向に移動さ
せて同様に２次元走査させることにより、３次元的な情
報（立体構造）を得ることができる。従って、共焦点顕
微鏡は標本の立体構造を観察したいという要求のあると
ころに、急速にその利用が拡大している。

【０００４】ところが、共焦点顕微鏡は、その原理上標
本表面に光スポットを照射し、この光スポットを走査さ
せながら同期して光強度を計測する必要がある。このた
め、光スポットを標本に照射して走査させるための光学
系が必要であり、例えば、レーザを光源として用いる場
合には、レーザ発振器、スキャナー（ガルバノメーター
ミラー）、リレーレンズ、偏光光学素子等が、通常のラ
ンプを光源として用いる場合には、ニポウディスク（Ｎ
ipkow disc）、ディスク回転機構などが必要となる。こ
のため、いずれの光源を用いても顕微鏡システム全体が
大型化するうえ、安価に製造できないという問題があっ
た。

【０００５】近年、上記問題を解決して安価に標本の３
次元画像を得ることができる小型の顕微鏡として、格子
状に標本を照明する顕微鏡（以下、本明細書において
「格子照明顕微鏡」という。）が開発され注目を集めて
いる。

【０００６】この顕微鏡では、照明光が照射され標本で
散乱された光のうち、０次光の信号強度が焦点ずれに対
して殆ど変化しないのに対し、０次光以外の光成分は焦
点ずれによって急速に信号強度を失っていくことに着目
し、この特性を利用する。すなわち、標本を格子状に照
明して散乱光の主成分が０次光以外になるようにしてお
き、検出情報に残存する０次光成分を画像間の演算処理
によって除去して焦点ずれに対して敏感な（高分解能
の）顕微鏡を構成しようとするものである。この顕微鏡
の原理を簡単に説明する。標本の照明パターンとしてピ
ッチΛの一次元正弦波を仮定すると、その振幅分布Ｓ
(ｔ,ω)は、

【０００７】

【数１】

【０００８】であるから、画像上の各点における光強度
Ｉ(ｔ,ω)は次式で表される。

【０００９】

【数２】

【００１０】いま、位相φを、φ₁＝０，φ₂＝2π/3，
φ₃＝4π/3 として三つの画像を合成すると、通信工学
におけるＳquare-Ｌawと同様にして、

【００１１】

【数３】

【００１２】となって、０次光成分の除去が行える。さ
らにこのとき焦点ずれさせた時の信号応答は、

【００１３】

【数４】

【００１４】従って、光学系の光軸方向の分解能がおよ
そ、

【００１５】

【数５】

【００１６】となり、標本の３次元情報を得ることがで
きる。

【００１７】図４は、この原理に基づいて構成された格
子照明顕微鏡の主要構成を示したものである。レーザ光
源１０１から射出された光は、ハーフミラー１０２で二
つの光路に分岐され、一方はこのミラーを透過してミラ
ー１０６，１０７で反射され標本５０を図における左斜
め上方から照明する。他方、ハーフミラー１０２で反射
された光は、ピエゾアクチュエータ１２４に固定された
ミラー１０３を介してミラー１０４，１０５で反射さ
れ、標本５０を図における右斜め上方から照明する。

【００１８】このとき、左右から照明する二つの光が、
標本５０に垂直な観察軸から左右にそれぞれ同一の角度
θ傾いた入射角度で標本に入射するようにしておくと、
標本上には、

【００１９】

【数６】ピッチ＝λ/(2sinθ) (6)

【００２０】の干渉縞が生成される。すなわち、標本５
０は(6)式に示すピッチの格子状の光で照明された状態
になる。そして、この格子状に照明された標本の像を対
物レンズ１２１，リレーレンズ１２２でＣＣＤカメラ１
２３に結像させ、その信号を制御装置１２６に取り込む
ことで、第１の光強度分布Ｉ₁が得られる。

【００２１】次いで、制御装置１２６はＰＺＴドライバ
ー１２５に指令信号を出力してピエゾアクチュエータ１
２４を駆動（伸長または縮小作動）させ、ミラー１０３
をわずかに変位させる。このミラー変位量は、ミラー１
０３の変位によりミラー１０５を介して標本５０に入射
する光の標本上での変位量が、標本表面に平行な方向に
上記干渉縞のピッチの1/3、すなわちλ/(6sinθ)となる
ようにしておく。すると、標本上にはミラー１０３を変
位させる前の干渉縞に対して位相が1/3だけずれた干渉
縞が生成される。この干渉縞で照明された標本の像もＣ
ＣＤカメラ１２３で撮像して制御装置１２６に取り込
み、第２の光強度分布Ｉ₂として記憶させておく。

【００２２】同様にピエゾアクチュエータ１２４を駆動
してミラー１０３を変位させ、干渉縞の位相をさらに1/
3ピッチ（最初の状態から2/3ピッチ）ずらせ、そのとき
の標本の像をＣＣＤカメラ１２３で撮像して制御装置１
２６に取り込み、第３の光強度分布Ｉ₃として記憶させ
る。

【００２３】そして、以上のようにして得た３つの画像
Ｉ₁,Ｉ₂,Ｉ₃を、前述した(3)式に代入してＩ_Pを計算す
ることで、標本上の焦点が合っている高さのみの２次元
画像を得ることができる。

【００２４】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、図４に
示した従来の格子照明顕微鏡システム１００では、２方
向から光を入射させて焦平面上に光の干渉作用を利用し
た干渉縞を生成させ、これによって正弦波状の強度分布
をもった照明を行っているため、光源１０１は単色（単
一波長）でなければならない。

【００２５】例えば、光源として波長442nm(青),538nm
(緑),636nm(赤)の３波長同時発振ができるホローカソー
ド型Ｈe-Ｃdレーザのような白色レーザ光源を用いたと
しても、単一の入射角度で同様の照明を行ったときに標
本上に生じる干渉縞は、波長ごとにそのピッチが異なる
ため、全ての干渉縞をピエゾアクチュエータで同時に1/
3ピッチ分だけずらすということができない。例えば、
図４に示した光学系で、左右の照明光の入射角度θを45
度とすれば、(6)式から３色の干渉縞のピッチは、それ
ぞれ0.31μm,0.38μm,0.45μmとなり全くピッチが異な
っている。

【００２６】このため、従来の格子照明顕微鏡の照明方
法では、単色の顕微鏡画像しか得ることができず、通常
の白色の照明光によるカラー画像の顕微鏡観察ができな
い、という大きな問題を有していた。

【００２７】本発明は、上記問題に鑑みて成されたもの
であり、簡明な装置構成で白色の格子状照明ができる白
色干渉縞投影光学系を提供するとともに、小型かつ安価
に３次元カラー画像の顕微鏡観察ができる格子照明顕微
鏡を提供することを目的とする。

【００２８】

【課題を解決するための手段】上記目的達成のため、本
発明は、光源と、この光源の光で照明された格子と、格
子のフーリエ変換像を形成する第１光学素子と、フーリ
エ変換像位置に配置されフーリエ変換像のうち±１次光
成分を透過させ他の次数の光成分を除去する空間フィル
タと、空間フィルタを透過した±１次光による格子像を
形成する第２光学素子とからなり、被照明体上に±１次
光による干渉縞を生成させて干渉縞投影光学系を構成す
る。

【００２９】なお、光源は白色光源であることが好まし
い。

【００３０】また、格子は透過型の格子であることが好
ましい。

【００３１】また、格子として位相格子を用いることが
好ましい。

【００３２】さらに、第１光学素子及び第２光学素子は
レンズであることが好ましい。

【００３３】そして、上記いずれかの白色干渉縞投影光
学系を用いて顕微鏡を構成する。

【００３４】なお、格子３として透過型の格子を用い
る。

【００３５】なお、格子からの光をコリメートする第１
光学素子、及び空間フィルタを透過した±１次光を被照
明体に結像させる第２光学素子として、前述したような
透過型の光学素子すなわちレンズを用いることにより、
装置構成を単純化して光軸調整を容易にすることがで
き、小型顕微鏡に好適な投影光学系を構成することがで
きる。

【００３６】そして、これらの白色干渉縞投影光学系を
格子照明顕微鏡の照明光源として用いることにより、小
型かつ安価に３次元カラー画像の顕微鏡観察ができる格
子照明顕微鏡を得ることができる。

【００３７】

【発明の実施の形態】以下、本発明の課題解決手段の原
理について、図１を参照して説明する。この光学系１０
は、白色光源１を用いてスクリーンＳ上に白色の干渉縞
を生成する白色干渉縞投影光学系の構成を示したもので
ある。なお、図では一つの格子を通過した０次光と±１
次光の軌跡を表示している。

【００３８】白色光源１から出射した光は、コンデンサ
レンズ２で略平行光にされ、１次元格子３(13)を均一に
照射する。格子を通過した光はその焦点が格子３上にあ
るレンズ４を透過し、さらにレンズ４と瞳位置を共有す
るレンズ８を透過してスクリーンＳ上に結像される。

【００３９】ここで、図中に示す空間フィルタ５が無け
れば一般的な投影光学系であり、スクリーンＳ上に格子
３の像が生成されるに過ぎない。本発明に係る投影光学
系では、レンズ４とレンズ８の共通の瞳位置に空間フィ
ルタ５(15)を設け、格子３を透過した光（格子３として
反射形の格子を用いる場合には反射した光）がもつ様々
な空間周波数成分のうち特定の成分の光のみを取り出
す。すなわち、本発明では、この空間フィルタ５で±１
次光以外の光成分を除去し、空間フィルタを透過した±
１次光成分のみでスクリーンＳ上に干渉縞を生成させ
る。

【００４０】この結果、±１次光成分のみによって生成
される格子３の像は、２次以上の高次の空間周波数成分
をもたないため、たとえ格子３が一般的な１次元格子
（例えば透過面と反射面からなる振幅格子や、1/2ピッ
チごとに透過光路長が異なる位相格子）であっても、ス
クリーンＳ上には綺麗な正弦波状の強度分布をもった像
を生成させることができる。

【００４１】次に、上記のような機能を持つ空間フィル
タ５の成立性について検討する。いま、振幅格子３のピ
ッチをｐとすると、格子３を通過した光のうち±ｎ次光
成分は、光軸に対してsinθ＝ｎλ/ｐなる角度θをも
つ。従って、レンズ４の焦点距離をｆとすると、空間フ
ィルタ５が置かれている瞳位置では、各次数の光は光軸
からの距離ｈとすれば、

【００４２】

【数７】ｈ＝ｆsinθ＝ｎｆλ/ｐ (7)

【００４３】なる位置を通る。つまり、空間フィルタ５
を通過しようとする光の位置は、格子に対する光の次数
によって異なった位置を通り、また０次光を除き各次数
の光はそれぞれ波長ごとに異なった位置を通る（各次数
ごとにスペクトルを生じる）。

【００４４】ここで、白色光源１から射出される白色光
の波長帯域を400nm(紫)〜680nm(赤)とすれば、０次光の
通る位置はｈ₀＝０、±１次光はｈ₁＝400〜680ｆ/ｐ、
±２次光はｈ₂＝800〜1360ｆ/ｐなる位置を通る。従っ
て、このように観察に利用する光の波長を最長波長が最
短波長の２倍以下となる波長帯域とし、ｆ/ｐを適宜な
数値を選択することにより、±１次光成分のみを分離し
て透過させ他の次数の光成分を除去することができる。
なお、±３次光ではｈ₃＝1200〜2040ｆ/ｐとなり、２次
スペクトルの赤の領域と３次スペクトルの紫の領域とが
一部重なってしまうため、上記波長帯域の白色光におけ
る±２次以上の次数の光を単独で取り出すことが困難な
ことも理解される。

【００４５】このように、本発明の解決手段を用いるこ
とで簡明な装置構成で白色の格子状照明ができる白色干
渉縞投影光学系を提供することができる。

【００４６】以上説明した白色干渉縞投影光学系１０を
格子照明顕微鏡に適用した実施例について説明する。図
２は本発明の好適な第１実施例として、透過型の振幅格
子を用いて構成した格子照明顕微鏡２０を示している。

【００４７】ハロゲンランプや水銀ランプ等の白色光源
１を出射した光は、波長400〜680nmを透過する波長選択
フィルタ１１を透過し、コンデンサレンズ２でほぼ平行
光とされ、１次元格子３を均一に照明する。この１次元
格子３は、例えば平行平板ガラス等の基板上に蒸着等で
付けたクロム膜などを、周期的なパターンで残るように
パターニングすることで、周期的な透過率変化をもたせ
た振幅格子である。

【００４８】格子３を透過した光は、その焦点が格子３
上にあるレンズ４を透過し、ハーフミラー７で反射され
たのち、レンズ４と瞳位置を共有するレンズ（対物レン
ズ）８で標本５０上に投影される。レンズ４と対物レン
ズ８との共有瞳位置には空間フィルタ５が設けられてい
る。

【００４９】ここで、格子３は顕微鏡システムの構成に
よって適宜なピッチのもの（一般に数μm〜数百μm程
度）を選択できるが、本実施例では格子ピッチｐ＝25μ
m，レンズ４の焦点距離ｆ＝250mmとした。このとき、格
子に対する±１次光のみを透過させる空間フィルタ５の
開口領域は(7)式から求められ、その光軸からｈ＝4〜6.
8mmの位置を透過させるように２本のスリット状に構成
している。なお、空間フィルタ５で空間周波数を選別す
るのは格子３によって回折が起こる方向、すなわち格子
の向きに直交する方向のみである。こうすることによ
り、空間フィルタ５を透過する光は、格子３で回折され
た光のうち、400〜680nmの±１次光成分のみとなる。

【００５０】空間フィルタ５でフィルタリングされた±
１次光はハーフミラー７及び対物レンズ８を介して標本
５０に投影され、標本上に±１次光のみによる正弦波状
の干渉縞を生成する。

【００５１】標本５０で散乱された光は、対物レンズ８
及びハーフミラー７を透過後、結像レンズ２２でＣＣＤ
カメラ２３の撮像デバイス上に結像される。制御装置２
６はＣＣＤカメラ２３で撮像された像を取り込んで、第
１の光強度分布Ｉ₁としてメモリー内に記憶する。

【００５２】次いで、制御装置２６はＰＺＴドライバー
２５に指令信号を出力してピエゾアクチュエータ２４を
駆動（伸長または縮小作動）させ、格子３をその格子の
直交方向に格子ピッチの1/3だけ変位させる。これによ
り、標本５０に投影される正弦波状の干渉縞も格子３の
変位に対応して位相が1/3ピッチ分だけ変化する。制御
装置２６は、このときにＣＣＤカメラ２３で撮像される
像を第２の光強度分布Ｉ₂としてメモリー内に記憶す
る。

【００５３】制御装置２６は、さらに格子３を変位させ
て干渉縞の位相をさらに1/3ピッチ分変化させ、そのと
きの標本の像をＣＣＤカメラ２３で撮像し、第３の光強
度分布Ｉ₃としてメモリー内に記憶する。

【００５４】そして、メモリー内に記憶された３枚の光
強度分布の画像Ｉ₁,Ｉ₂,Ｉ₃を前述した(3)式に当てはめ
てＩ_pを各画像点ごとに計算すれば、算出される各点の
信号は焦点の合っている面のみについて正弦波成分を除
去した標本自身の信号である。そこで、このＩ_pからな
る信号を合成してＣＲＴ等に表示することにより、焦点
が合っている面のみの標本５０の顕微鏡画像を得ること
ができる。

【００５５】さらに、標本５０が載置されている図示し
ないステージを上下（図中に矢印を付記する観察軸方
向）に移動させ、上述したと同様に強度分布を計測する
ことで、標本５０の３次元像を得ることができる。

【００５６】なお、波長選択フィルタ１１は可視領域外
の不要な外乱光を除去するためのフィルタであり、本実
施例では白色光源１の直後としているが、光路中のいず
れの位置、例えばＣＣＤカメラ２３の直前であっても良
い。また、格子３やレンズ４は反射形の格子やミラーを
用いて構成することもできるが、上記のように透過型の
素子を用いることにより、光軸調整を容易に行え、さら
に小型かつ安価に格子照明顕微鏡を構成することができ
る。

【００５７】次に、本発明の好適な第２実施例として、
図３に位相格子を用いて構成した格子照明顕微鏡３０の
構成を示している。この格子照明顕微鏡３０は、第１実
施例の格子照明顕微鏡２０における振幅格子３及び空間
フィルタ５を、それぞれ位相格子１３及び空間フィルタ
１５に置き換えたことを除き、上記格子照明顕微鏡２０
と同一構成である。そこで同一部分には同一番号を付し
て重複説明を省略する。

【００５８】位相格子は、透過型の振幅格子のように光
の透過率を周期的に変化させるのではなく、透過する光
路の光学長（光路の幾何学的長さ×光路に沿った屈折
率）を1/2ピッチずつ周期的に変化させることで、透過
後の光の位相を周期的に変化させる格子である。そし
て、このような位相格子を図１における格子３として用
いたときにも、スクリーンＳ上には振幅格子を用いたと
同様に（但し同一周期の透過型振幅格子の場合の1/2照
明周期の）正弦波状の強度分布をもった像を生成させる
ことができる。

【００５９】さらに、振幅格子を用いた場合には０次光
が最大強度成分となり、瞳位置に配設する空間フィルタ
５で０次光を除去する必要があったが、位相差をπとし
たような位相格子を用いた場合には原理的に０次光の強
度が弱いため、空間フィルタで０次光を除去する必要が
ない（後に空間フィルタ１５として説明する）。加え
て、位相格子を透過した光のほとんどは±１次光に成分
に集まるため、光の利用効率が極めて高く、明るい白色
干渉縞投影光学系を提供することができる。

【００６０】本実施例における格子１３はピッチ50μm
の位相格子を用い、レンズ４は第１実施例と同様焦点距
離ｆ＝250mmのレンズを用いる。このとき、空間フィル
タ１５の開口範囲は前記同様に(7)式で求められる。但
し、前述したように、格子として位相格子を用いたとき
には、原理上０次光(の強度)が弱いため、０次光を除去
する領域を設ける必要がない。このため、本実施例で
は、空間フィルタ１５として、その光軸から±3.4mm以
内を通る光を透過させる矩形形状の空間フィルタを用い
ればよい。なお、空間フィルタで空間周波数を選別する
のは実施例１と同様格子１３による回折の起こる方向の
みである。

【００６１】このような構成をとることにより、空間フ
ィルタ１５を透過した光は格子１３で回折された光のう
ち、ほとんど400〜680nmの±１次光成分のみとなる。こ
の結果、標本５０上には、第１実施例と同一ピッチの正
弦波状の干渉縞が生成される。

【００６２】あとは、第１実施例と同様に、制御装置２
６が、ＰＺＴアクチュエータ２４で格子１３をそのピッ
チの1/3ずつ変位させながらそれぞれの光強度分布Ｉ₁,
Ｉ₂,Ｉ₃を順次メモリー内に記憶させ、これ等３枚の光
強度分布の画像Ｉ₁,Ｉ₂,Ｉ₃を合成してＣＲＴ等に表示
させることにより、焦点が合っている面のみの標本５０
の顕微鏡画像を得ることができる。そして、標本５０が
載置されているステージを上下に移動させ、上記同様に
強度分布を計測することで、標本５０の３次元像を得る
ことができる。

【００６３】このような構成の格子照明顕微鏡３０で
は、空間フィルタで０次光を除去する必要がないため、
空間フィルタ１５の構成を極めて単純化することができ
ることに加えて、位相格子１３を透過した光のほとんど
が±１次光に成分に集まるため、光の利用効率が極めて
高く、明るい視野を有した格子照明顕微鏡を提供するこ
とができる。

【００６４】

【発明の効果】以上説明したように、本発明は、光源の
光で照明された格子と、格子のフーリエ変換像を形成す
る第１光学素子と、フーリエ変換像位置に配置されフー
リエ変換像のうち±１次光成分を透過させ他の次数の光
成分を除去する空間フィルタと、空間フィルタを透過し
た±１次光による格子像を形成する第２光学素子とから
なり、被照明体上に±１次光による干渉縞を生成させて
干渉縞投影光学系を構成する。このため、以上に説明し
たような極めて簡明な構成で被照明体上に正弦波状の干
渉縞を生成させることができる。そして、このような干
渉縞投影光学系を格子照明顕微鏡に適用することによ
り、小型かつ安価に３次元表示が可能な格子照明顕微鏡
を提供することができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明に係る干渉縞投影光学系の原理を説明す
る説明図である。

【図２】本発明に係る顕微鏡の第１の好ましい実施例を
示す構成図である。

【図３】本発明に係る顕微鏡の第２の好ましい実施例を
示す構成図である。

【図４】従来の格子照明顕微鏡の構成を示す構成図であ
る。

【符号の説明】

Ｓスクリーン（被照明体）１白色光源３格子（振幅格子）４レンズ（第１光学素子）５空間フィルタ８レンズ，対物レンズ（第２光学素子）１０白色干渉縞投影光学系１３格子（位相格子）１５空間フィルタ２０格子照明顕微鏡（顕微鏡）３０格子照明顕微鏡（顕微鏡）５０標本（被照明体）

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】光源と、前記光源の光で照明された格子と、前記格子のフーリエ変換像を形成する第１光学素子と、前記フーリエ変換像位置に配置され、前記フーリエ変換
像のうち±１次光成分を透過させ他の次数の光成分を除
去する空間フィルタと、前記空間フィルタを透過した±１次光による前記格子像
を形成する第２光学素子とからなり、前記被照明体上に前記±１次光による干渉縞を生成させ
ることを特徴とする干渉縞投影光学系。
【請求項２】前記光源が白色光源であることを特徴と
する請求項１に記載の干渉縞投影光学系。
【請求項３】前記格子が透過型の格子であることを特
徴とする請求項１または請求項２に記載の干渉縞投影光
学系。
【請求項４】前記格子が位相格子であることを特徴と
する請求項３に記載の干渉縞投影光学系。
【請求項５】前記第１光学素子又は前記第２光学素子
がレンズであることを特徴とする請求項１から請求項４
のいずれか一項に記載の干渉縞投影光学系。
【請求項６】請求項１から請求項５のいずれか一項に
記載の干渉縞投影光学系を有することを特徴とする顕微
鏡。