JPWO2015052920A1 - 構造化照明装置及び構造化照明顕微鏡装置 - Google Patents

Abstract

構造化照明装置の一例は、光源からの光を複数の光束に分岐する空間光変調器と、複数の光束の全部又は一部により干渉縞を形成し、干渉縞で標本を照明する光学系と、空間光変調器を制御する制御部とを備える。制御部は、空間光変調器に対して駆動信号を出力することにより、干渉縞に寄与する複数の光束の強度比が予め決められた値になるように、空間光変調器の第１の領域に対して第１の位相遅延量を設定し、第２の領域に対して第２の位相遅延量を設定する。

Description

本発明は、構造化照明装置及び構造化照明顕微鏡装置に関する。

生体標本などの被観察物（標本）を超解像観察するための手法に、標本の構造の空間周波数を照明光で変調する構造化照明顕微鏡が知られている。

この構造化照明顕微鏡は、空間変調された照明パターンで標本を照明し、標本の構造に含まれる解像限界を超える高い空間周波数の情報を、顕微鏡光学系の結像に寄与させる。また、構造化照明顕微鏡は、互いに異なる照明パターンの下で得られた複数の変調像のデータ（以下、「変調画像」と称す。）へ演算を施すことにより復調像のデータ（以下、「復調画像」又は「超解像画像」と称す。）を取得する。

特に、非特許文献１に記載の構造化照明顕微鏡では、縞状の照明パターンを生起させるための位相回折格子として二次元の空間光変調器（ＳＬＭ：Spatial Light Modulator）を用いている。ＳＬＭは液晶画素を密に配列しており、個々の液晶画素に与える電圧を制御することで個々の液晶画素における光の位相遅延量を制御することができる。このＳＬＭの位相遅延量を一方向に亘って周期的な分布に設定すればＳＬＭに位相回折格子が現れる。この位相回折格子の方位及び位相を切り換えるには、ＳＬＭに与える電圧分布を切り換えればよい。よって、非特許文献１に記載の構造化照明顕微鏡装置は、機械的な駆動を伴わずに照明パターンの方位及び位相を切り換えることができる。

Peter Kner, Bryant B Chhun, Eric R Griffis, Lukman Winoto & Mats G L Gustafsson, "Super-resolution video microscopy of live cells by structured illumination", Nature Methods: doi:10.1038/nmeth.1324

しかしながら、位相回折格子として機能させるＳＬＭを適切に制御しないと、却って構造化照明顕微鏡の性能を低下させてしまう虞がある。

本発明の構造化照明装置の一例は、光源からの光を複数の光束に分岐する空間光変調器と、複数の光束の全部又は一部により干渉縞を形成し、干渉縞で標本を照明する光学系と、空間光変調器を制御する制御部とを備える。制御部は、空間光変調器に対して駆動信号を出力することにより、干渉縞に寄与する複数の光束の強度比が予め決められた値になるように、空間光変調器の第１の領域に対して第１の位相遅延量を設定し、第２の領域に対して第２の位相遅延量を設定する。

本発明の構造化照明顕微鏡装置の一例は、本発明の構造化照明装置の一例と、干渉縞で空間変調された標本の画像である変調画像を取得する撮像部とを備える。

構造化照明顕微鏡装置１の構成図である。 ＳＬＭ１３を説明する図である。 位相回折格子の方向と干渉縞の方向との関係を説明する図である。 ０次光シャッタ２００、高次光カット部材１８を説明する図である。 １／２波長板１７の機能を説明する図である。 干渉縞の位相シフトを説明する図である。 位相回折格子の位相差Φと回折強度との関係を示す図である。 制御装置３９の動作フローチャートである。 ＳＬＭ１３の配置姿勢の変形例である。

［第１実施形態］
以下、本発明の第１実施形態として構造化照明顕微鏡装置（ＳＩＭ：Structured Illumination Microscopy）を説明する。

図１は、構造化照明顕微鏡装置１の構成図である。以下では構造化照明顕微鏡装置１を３Ｄ−ＳＩＭモードで使用する場合を主として説明する。図１に示すとおり構造化照明顕微鏡装置１には、レーザユニット１００と、光ファイバ１１と、照明光学系１０と、結像光学系３０と、撮像素子３５と、制御装置３９と、画像記憶・演算装置４０と、画像表示装置４５とが備えられる。このうち、照明光学系１０と結像光学系３０とは、対物レンズ６及びダイクロイックミラー７を共用している。

レーザユニット１００には、第１レーザ光源１０１、第２レーザ光源１０２、シャッタ１０３１、１０３２、ミラー１０５、ダイクロイックミラー１０６、レンズ１０７が備えられる。第１レーザ光源１０１及び第２レーザ光源１０２の各々は可干渉光源であって、互いの出射波長は異なる。ここでは、第１レーザ光源１０１の波長λ_１は、第２レーザ光源１０２の波長λ_２よりも長いと仮定する（λ_１＞λ_２）。これらの第１レーザ光源１０１、第２レーザ光源１０２、シャッタ１０３１、１０３２は、それぞれ制御装置３９によって駆動・制御される。

光ファイバ１１は、レーザユニット１００から射出したレーザ光を導光するために、例えば、偏波面保存型のシングルモードファイバによって構成される。光ファイバ１１の出射端の光軸ＡＺ方向における位置は、位置調整機構１１Ａによって調節可能である。この位置調整機構１１Ａは、制御装置３９によって駆動・制御される。なお、位置調整機構１１Ａとしては、例えば、ピエゾ素子等が用いられる。

照明光学系１０には、光ファイバ１１の出射端側から順に、コレクタレンズ１２と、偏光板２３と、光束分岐部１５と、集光レンズ１６と、光束選択部２４と、レンズ２５と、視野絞り２６と、フィールドレンズ２７と、励起フィルタ２８と、ダイクロイックミラー７と、対物レンズ６とが配置される。

光束分岐部１５には、位相回折格子として機能する２次元の液晶空間光変調器（ＳＬＭ：Spatial Light Modulator）１３と、液晶駆動回路１５Ａとが備えられる。このうち液晶駆動回路１５Ａは、制御装置３９によって駆動・制御される。ここで、ＳＬＭとは、入射光束に対して空間的に（その光束の空間内で）所定の分布を付与する機能を有した部材のことをいう。

光束選択部２４には、０次光シャッタ２００と、１／２波長板１７と、高次光カット部材１８と、回動機構２００Ａと、波長板駆動回路１７Ａとが備えられる。このうち回動機構２００Ａ、波長板駆動回路１７Ａは、それぞれ制御装置３９によって駆動・制御される。

結像光学系３０には、標本５の側から順に、対物レンズ６と、ダイクロイックミラー７と、バリアフィルタ３１と、第２対物レンズ３２とが配置される。

標本５は、例えば、平行平板状のガラス表面に配置された蛍光性の細胞（蛍光色素で染色された細胞）や、シャーレ内に存在する蛍光性の生体細胞（蛍光色素で染色された動く細胞）などの細胞である。この細胞には、波長λ_１の光によって励起される第１蛍光領域と、波長λ_２の光によって励起される第２蛍光領域との双方が発現している。第１蛍光領域は、波長λ_１の光に応じて中心波長λ_１’の第１蛍光を発生させ、第２蛍光領域は、波長λ_２の光に応じて中心波長λ_２’の第２蛍光を発生させる。

撮像素子３５は、ＣＣＤやＣＭＯＳ等からなる二次元撮像素子である。撮像素子３５は、制御装置３９によって駆動されると、撮像素子３５の撮像面３６に形成された像を撮像し、画像を生成する。この撮像素子３５が生成した画像は、制御装置３９を介して画像記憶・演算装置４０へ取り込まれる。なお、撮像素子３５は、所定のフレーム周期で画像生成（撮像）を繰り返すことが可能である。撮像素子３５のフレーム周期（撮像の繰り返し周期）は、例えば、３０ｍｓｅｃ、６０ｍｓｅｃなどに設定される。撮像素子３５のフレーム周期（撮像の繰り返し周期）は、撮像素子の撮像時間（すなわち電荷蓄積及び電荷読出に要する時間）、干渉縞の方向切り換えに要する時間、その他の所要時間のうち、律速によって定められる。

制御装置３９は、第１レーザ光源１０１、第２レーザ光源１０２、シャッタ１０３１、１０３２、位置調整機構１１Ａ、液晶駆動回路１５Ａ、回動機構２００Ａ、波長板駆動回路１７Ａ、撮像素子３５を駆動・制御する。

画像記憶・演算装置４０は、撮像素子３５が生成した画像に対して復調演算を施して超解像画像を生成すると、その超解像画像を不図示の内部メモリに格納すると共に、画像表示装置４５へ送出する。

次に、構造化照明顕微鏡装置１におけるレーザ光の振る舞いを説明する。

第１レーザ光源１０１から射出した波長λ_１のレーザ光（第１レーザ光）は、シャッタ１０３１を介してミラー１０５へ入射すると、ミラー１０５を反射し、ダイクロイックミラー１０６へ入射する。一方、第２レーザ光源１０２から射出した波長λ_２のレーザ光（第２レーザ光）は、シャッタ１０３２を介してビームスプリッタ１０６へ入射し、第１レーザ光と統合される。ダイクロイックミラー１０６から射出した第１レーザ光及び第２レーザ光は、レンズ１０７を介して光ファイバ１１の入射端に入射する。

なお、制御装置３９は、第１レーザ光源１０１、第２レーザ光源１０２、シャッタ１０３１、１０３２を制御することにより、レーザユニット１００の出射波長、すなわち構造化照明顕微鏡装置１の光源波長λを、長い波長λ_１と短い波長λ_２との間で切り換えることができる。

光ファイバ１１の入射端に入射したレーザ光は、光ファイバ１１の内部を伝搬して光ファイバ１１の出射端に点光源を生成する。その点光源から射出したレーザ光は、コレクタレンズ１２によって平行光束に変換され、偏光板２３を介してＳＬＭ１３へ入射すると、各次数の回折光束（以下、「回折光束群」と称す。）に分岐される（詳細は後述）。この回折光束群に含まれる各次数の回折光束は、集光レンズ１６に入射すると、集光レンズ１６の集光作用を受けて瞳共役面６Ａ’の各位置に集光する。

ここで、瞳共役面６Ａ’は、フィールドレンズ２７及びレンズ２５に関して対物レンズ６の瞳面６Ａ（各次数の回折光束が個別に集光する位置）と共役な位置のことである。集光レンズ１６は、集光レンズ１６の焦点位置（後ろ側焦点位置）が瞳共役面６Ａ’と一致するように配置されている。但し、ここでいう「共役な位置」の概念には、当業者が対物レンズ６、フィールドレンズ２７、レンズ２５の収差、ビネッティング等の設計上必要な事項を考慮して決定した位置も含まれるものとする。

なお、光ファイバ１１として偏波面保存型のシングルモードファイバを使用した場合、偏光板２３は省略することも可能であるが、余分な偏光成分を確実にカットするために有効である。また、レーザ光の利用効率を高めるため、偏光板２３の軸は、光ファイバ１１から射出したレーザ光の偏光方向に一致していることが望ましい。因みに、光ファイバ１１としてマルチモードファイバを使用した場合、偏光板２３は必須である。また、ＳＬＭ１３を回折格子として利用する場合は、ＳＬＭ１３に入射する光束の偏光方向を、適切な方向に設定しておく必要がある。

さて、瞳共役面６Ａ’に向かった回折光束群は、瞳共役面６Ａ’の近傍に配置された光束選択部２４へ入射する。

構造化照明顕微鏡装置１が３Ｄ−ＳＩＭモードで使用される場合、光束選択部２４は、入射した回折光束群のうち３つの回折光束のみ（０次回折光束及び±１次回折光束のみ）を選択的に通過させる。なお、光束選択部２４の０次光シャッタ２００には、０次回折光束を必要に応じてオン／オフする機能があり、光束選択部２４の高次光カット部材１８には、２次以上の高次回折光束を常時遮光する機能がある（詳細は後述）。

光束選択部２４を通過した０次回折光束及び±１次回折光束は、レンズ２５によって視野絞り２６付近でＳＬＭ１３と共役な面を形成する。その後、０次回折光束及び±１次回折光束の各々は、フィールドレンズ２７により収束光に変換され、さらに励起フィルタ２８を経てからダイクロイックミラー７で反射し、対物レンズ６の瞳面６Ａ上の互いに異なる位置に集光する。

瞳面６Ａ上に集光した０次回折光束及び±１次回折光束の各々は、対物レンズ６の先端から射出される際には平行光束となり、標本５の表面で互いに干渉し、干渉縞を形成する。この干渉縞が、構造化照明光として使用される。

このような干渉縞により標本５を照明すると、標本５が空間変調され、干渉縞の周期構造と標本５における蛍光領域の周期構造との差に相当するモアレ縞が現れるが、このモアレ縞においては、蛍光領域における高周波数の構造が元の周波数より低周波数側にシフトしているため、この構造を示す蛍光は、元の角度よりも小さい角度で対物レンズ６へ向かうことになる。よって、干渉縞により標本５を照明すると、蛍光領域の高周波数の構造情報までもが対物レンズ６によって伝達される。

標本５で発生した蛍光は、対物レンズ６に入射すると、対物レンズ６で平行光に変換された後、ダイクロイックミラー７及びバリアフィルタ３１を透過し、第２対物レンズ３２を介して撮像素子３５の撮像面３６上に蛍光領域の変調像を形成する。その変調像は、撮像素子３５によって画像化され、変調画像が生成される。その変調画像は、制御装置３９を介して画像記憶・演算装置４０へと取り込まれる。さらに、その変調画像には、画像記憶・演算装置４０において復調演算が施され、蛍光領域の復調画像（超解像画像）が生成される。そして、この超解像画像は、画像記憶・演算装置４０の内部メモリ（図示せず）に記憶されるとともに、画像表示装置４５へと送出される。なお、復調演算としては、例えば、米国特許８１１５８０６号明細書に開示された方法が用いられる。

次に、ＳＬＭ１３を詳しく説明する。

図２（Ａ）は、ＳＬＭ１３の一部を拡大した模式図である。図２（Ａ）に示すとおりＳＬＭ１３は反射型空間光変調器であり、画素回路を二次元配置したＣＭＯＳなどの回路層１３ｃと、ネマティック液晶などからなる液晶層１３ａと、波長λ_１、λ_２の光に対して透明な保護層１３ｂとを順に積層してなる。つまり、ＳＬＭ１３は、互いに直交する２方向の各々に亘って液晶素子からなる画素を密に配列した二次元液晶部材を含んでいる。このＳＬＭ１３は、入射光束に対して保護層１３ｂの側を向けており、その保護層１３ｂの表面（入射面）の法線は、入射光束の主光線に対して例えば４５°の角度を成す。

なお、ＳＬＭの構成は、正反射で使用される構成であっても良い。その場合は、ハーフミラーや偏光ビームスプリッタ、さらには波長板の組み合わせにより、ＳＬＭに対する入射光とＳＬＭからの反射光とを空間的に分離することが望ましい。

回路層１３ｃの各画素回路に電圧が印加されると、液晶層１３ａの各画素（Pixel）の配向が変化し、各画素の屈折率が変化する。液晶層１３ａの各画素の屈折率が変化すると、液晶層１３ａの各画素で反射する光の位相遅延量が変化する。

よって、回路層１３ｃの各画素回路へ印加される電圧値を制御すれば、ＳＬＭ１３に対する入射光束の位相分布を制御することができる。なお、ＳＬＭ１３に対する入射光束の振幅分布及び偏光方向分布は何ら変化しない。

このような反射型空間光変調器としては、例えば、浜松ホトニクス社のＸ１０４６８、ＨＯＬＯＥＹＥ社のＬＣ−Ｒ７２０などを適用することができる。また、ここではＳＬＭ１３として反射型空間光変調器を使用したが、透過型空間光変調器を使用してもよい。また、ここでは光の変調方式として液晶方式を利用したが、光路の屈折率が可変の他の方式を利用してもよい。

さて、前述した液晶駆動回路１５Ａ（図１参照）は、制御装置３９（図１参照）の制御下で、液晶相１３ａの屈折率分布を一方向に亘って周期的な分布に設定する。これによって、例えば図２（Ｂ）に示すような１方向位相回折格子がＳＬＭ１３に表示される。入射光束を回折光束群に分岐するのは、この位相回折格子の働きである。

なお、ＳＬＭ１３に表示された位相回折格子の格子パターンは、実際には目視することはできない。但し、以下では説明の都合上、位相回折格子の格子パターンを可視化する。また、ＳＬＭ１３のうち少なくとも有効な光束の入射する領域の位相遅延量分布が周期的な分布に設定されることを「ＳＬＭ１３に位相回折格子が表示される」などと表現する。

図２（Ｂ）は、ＳＬＭ１３に表示された位相回折格子を標本側から見た模式図である。図２（Ｂ）では、相対的に屈折率の低い画素領域１３Ａ（位相遅延量の相対的に小さな画素領域）を白色で表し、相対的に屈折率の高い画素領域１３Ｂ（位相遅延量の相対的に大きい画素領域）をグレーで表した。また、図２（Ｂ）では、位相回折格子の格子周期（構造周期）Ｐを実際よりも大きく描いた。

ここでは、相対的に屈折率の低い画素領域１３Ａに付与する位相遅延量は領域内で一定値であり、相対的に屈折率の高い画素領域１３Ｂに付与する位相遅延量は領域内で一定値である。この場合、ＳＬＭは、矩形型の凹凸の回折格子と同じになる。

なお、ＳＬＭの位相遅延量分布のパターンは、ＳＬＭの各画素領域の境界領域のみにアンチエイリアスを施したようなパターンであっても良い。この場合も、ＳＬＭは上記矩形型の概念に含まれる。

但し、これに限定されず、ＳＬＭにおける位相遅延量の分布を、正弦波状の分布としてもよい。

具体的には、相対的に屈折率の低い画素領域１３Ａの位相遅延量は、正弦波状に分布する値であって、最小値を含むように設定されてもよく、相対的に屈折率の高い画素領域１３Ｂの位相遅延量は、正弦波状に分布する値であって、最大値を含むように設定されてもよい。

なお、画像領域１３Ａ、１３Ｂの位相遅延量分布を形成するために、複数の画素の値をつなげる場合は、局所的にみると、正弦波状の分布は不連続であるが、ＳＬＭの全体として、正弦波状に分布しているとみなせればよい。

ここで、画素領域１３Ａの位相遅延量、及び画素領域１３Ｂの位相遅延量が、それぞれ一定値であり、互いに値が異なる場合（以下、矩形波モード）と、画素領域１３Ａの位相遅延量が正弦波状に分布する値であって、最大値を含み、画素領域１３Ｂの位相遅延量が正弦波状に分布する値であって、最小値を含む場合（以下、正弦波モード）との違いは、以下のとおりである。

０次回折光束の強度と＋１次回折光束の強度と−１次回折光束の強度との比が例えば０．７：１：１になるように第１の位相遅延量と第２の位相遅延量とを設定する場合、位相遅延量の分布形状に起因して第１の位相遅延量と第２の位相遅延量との差は、正弦波モードに比べて矩形波モードの方が小さくなる。

また、相対的に屈折率の低い画素領域１３Ａの位相遅延量は、逆台形状（上辺が長く、下辺が短い）に分布する値であって、下辺が最小値になるように設定し、相対的に屈折率の高い画素領域１３Ｂの位相遅延量は、台形状（上辺が短く、下辺が長い）に分布する値であって、上辺が最大値になるように設定すればよい。さらに、台形（逆台形）の場合は、上辺と下辺を結ぶ線は通常直線であるが、直線を曲線に変更しても台形（逆台形）とみなす。

このＳＬＭ１３へ入射した光束は、位相回折格子の周期構造の方向Ｖにかけて分岐した回折光束群に変換される。この回折光束群には、０次回折光束及び±１次回折光束が含まれ、このうち互いの次数が共通である±１次回折光束は、光軸ＡＺに関して対称な方向に進行し、０次回折光束は、光軸ＡＺに沿って進行する。これらの０次回折光束及び±１次回折光束は、瞳共役面６Ａ’の互いに異なる位置に集光する。図２（Ｃ）に示すとおり、０次回折光束の集光点１４ａは、光軸ＡＺ上に位置し、±１次回折光束の集光点１４ｂ、１４ｃは、光軸ＡＺに関して対称となり、これら集光点１４ｃ、１４ａ、１４ｂの配列方向は、回折光束群の分岐方向Ｖと同じになる。

なお、ここでいう「集光点」とは、最高強度の８割以上の強度を有する領域の重心位置のことである。そのため、本実施形態の照明光学系１０は、完全な集光点が形成されるまで光束を集光する必要はない。

また、位相回折格子の構造周期Ｐは、±１次回折光束の各々の集光点１４ｂ、１４ｃが瞳共役面６Ａ’の概ね最外周に位置するような適正値Ｐ_０に設定されている。この適正値Ｐ_０によると、干渉縞（図２（Ｄ））の縞周期が適度に小さくなる（なお、図２（Ｄ）では、構造周期Ｐを実際よりも大きく描いた。）。

また、本実施形態では、後述する式（１）に基づいて、位相回折格子の屈折率差Δｎ、すなわち、画素領域１３Ａの屈折率と画素領域１３Ｂの屈折率との差は、位相回折格子から射出する０次回折光束の強度と＋１次回折光束の強度と−１次回折光束の強度との比が、例えば０．７：１：１となるような適正値Δｎ_０に設定されている。この適正値Δｎ_０によると、復調画像（超解像画像）のコントラストが最適となる（詳細は、後述する。）。

この理由は以下の通りである。

すなわち、０次回折光と１次回折光との強度比を１：１とした場合、３光束干渉による構造化照明を利用した３Ｄ−ＳＩＭモードにおける２次のＯＴＦのフーリエスペクトルの大きさが、２光束干渉による構造化照明を利用した２Ｄ−ＳＩＭモードにおける２次のＯＴＦのフーリエスペクトルよりも低下してしまうためである。その理由は、３Ｄ−ＳＩＭモードにおいては、０次回折光及び＋１次回折光の干渉縞、０次回折光及び＋１次回折光の干渉縞に起因する１次のＯＴＦが生成され、そのために２次のＯＴＦの大きさが低下してしまうことにある。ここで、２次のＯＴＦとは、＋１次回折光及び−１次回折光の干渉縞に起因するＯＴＦを意味する。

したがって、復調画像（超解像画像）の高周波成分のコントラストを向上させるには、０次回折光束の強度を、±１次回折光束の強度より低くする必要がある。

さらに、前述した液晶駆動回路１５Ａは、制御装置３９（図１参照）の制御下で、液晶層１３ａの屈折率分布を切り換えることにより、位相回折格子の表示方向を例えば図３（Ａ１）→図３（Ａ２）→図３（Ａ３）に示すとおり６０°の角度周期で３通りに切り換える。

図３（Ａ１）に示すとおり位相回折格子の周期構造の方向がＶ_１であるとき、図３（Ｂ１）に示すとおり瞳共役面６Ａ’における集光点１４ｃ、１４ａ、１４ｂの配列方向は、方向Ｖ_１と同じになる。

因みに、光ファイバ１１から射出するレーザ光の波長をλ、ＳＬＭ１３の格子周期をＰ、レンズ１６の焦点距離をｆｃとすると、光軸ＡＺから集光点１４ｂ、１４ｃまでの距離Ｄは下記の式で表される。

Ｄ∝２ｆｃλ／Ｐ
図３（Ａ２）に示すとおり位相回折格子の周期構造の方向がＶ_２であるとき、図３（Ｂ２）に示すとおり瞳共役面６Ａ’における集光点１４ｃ、１４ａ、１４ｂの配列方向は、方向Ｖ_２と同じになる。なお、集光点１４ｃ、１４ｂから光軸ＡＺまでの距離は、周期構造の方向がＶ_１であるときの距離（図３（Ｂ１）参照）と同じである。

図３（Ａ３）に示すとおり位相回折格子の周期構造の方向がＶ_３であるとき、図３（Ｃ３）に示すとおり瞳共役面６Ａ’における集光点１４ｃ、１４ａ、１４ｂの配列方向は、方向Ｖ_３と同じになる。なお、集光点１４ｃ、１４ｂから光軸ＡＺまでの距離は、周期構造の方向がＶ_１であるときの距離（図３（Ｂ１）参照）と同じである。

したがって、本実施形態の液晶駆動回路１５Ａは、標本５に形成される干渉縞の方向を、図３（Ｃ１）→図３（Ｃ２）→図３（Ｃ３）に示すとおり、６０°の角度周期で３通りに切り換えることができる。しかも、本実施形態では、位相回折格子としてＳＬＭ１３を使用したので、干渉縞の方向切り換えは高速に行われる。

次に、０次光シャッタ２００を詳しく説明する。

図４（Ａ）は、０次光シャッタ２００を説明する図である。図４（Ａ）に示すとおり０次光シャッタ２００は、円形の透明基板の一部に円形の遮光部２００Ｃを形成してなる空間フィルタである。

０次光シャッタ２００の遮光部２００Ｃは、０次回折光束の光路（集光点１４ａ）をカバーし、０次光シャッッタ２００の非遮光部（透過部２００Ｂ）は、±１次回折光束の光路となりうる領域（すなわち集光点１４ｂ、１４ｃの形成されうる領域）の全体をカバーする。

この０次光シャッタ２００は、前述した回動機構２００Ａ（図１参照）により、照明光学系１０の光軸ＡＺと平行、かつその光軸ＡＺから離れた直線（軸ＡＲ）の周りに回動可能である。

なお、 回動機構２００Ａには、例えば、０次光シャッタ２００を保持し、かつ軸ＡＲの周りに回転可能な不図示の回動軸と、その回動軸へ回転力を与える不図示のモータ（回転モータ）とが備えられる。このモータが駆動されると、回転軸が回転し、０次光シャッタ２００が軸ＡＲの周りに回転する。

０次光シャッタ２００の回動角が図４に示した基準角度（０°）に設定されると、遮光部２００Ｃが０次回折光束の光路（集光点１４ａ）に挿入され、０次光シャッタ２００の回動角が基準角度から外れた所定角度（例えば３０°）に設定されると、遮光部２００Ｃが０次回折光束の光路（集光点１４ａ）から外れる。

したがって、０次光シャッタ２００の回動角を基準角度（０°）と所定角度（３０°）との間で切り換えれば、±１次回折光束をオンしたまま０次回折光束をオン／オフすることができる。なお、図４（Ａ）は０次回折光束がオフされた状態を示しており、図１は、０次回折光束がオンされた状態を示している。因みに、０次回折光束がオフされると構造化照明顕微鏡装置１が２Ｄ−ＳＩＭモードに設定され、０次回折光束がオンされると構造化照明顕微鏡装置１が３Ｄ−ＳＩＭモードに設定される。

なお、０次光シャッタ２００の回動角が基準角度（０°）、所定角度（３０°）の何れである場合にも、０次光シャッタ２００の遮光部２００Ｃは、±１次回折光束の光路となりうる領域（すなわち集光点１４ｂ、１４ｃの形成されうる領域）を遮ることは無いものとする。

また、ここでは０次光シャッタ２００を回動可能な空間フィルタとしたが、スライド可能な空間フィルタや、固定配置された液晶素子などで０次光シャッタ２００を構成してもよい。液晶素子の配向を電気的に制御すれば、液晶素子の屈折率異方性を制御することができるので、液晶素子を０次光シャッタ２００として機能させることができる。

次に、高次光カット部材１８を詳しく説明する。

図４（Ｂ）は、高次光カット部材１８を説明する図である。図４（Ｂ）に示すとおり高次光カット部材１８は、円形の不透明基板（マスク用基板）に、円形の開口部１８ａと輪帯状の開口部１８ｂとを形成してなる空間フィルタである。

高次光カット部材１８において円形の開口部１８ａは、０次回折光束の光路（集光点１４ａ）をカバーしており、輪帯状の開口部１８ｂは、±１次回折光束の光路となりうる領域（すなわち集光点１４ｂ、１４ｃの形成されうる領域）をカバーしている。また、高次光カット部材１８において２次以降の高次回折光束の光路となりうる領域は、遮光部（非開口部）となっている。

なお、ＳＬＭ１３で発生する２次以降の高次回折光束の強度が十分に弱い場合には、高次光カット部材１８を省略してもよい。

次に、１／２波長板１７（図１参照）の機能を詳しく説明する。

１／２波長板１７（図１参照）は、干渉縞に寄与する回折光束群の偏光状態をＳ偏光に維持するために使用される。その回折光束群の偏光状態がＳ偏光であるときに干渉縞のコントラストが最大となるからである。

図５（Ａ）に示すとおり回折光束群の分岐方向がＶ_１であるときには、回折光束群の偏光方向は、図５（Ａ）に点線矢印で示した方向Ｖ_１’とされるべきである。この方向Ｖ_１’は、方向Ｖ_１を光軸ＡＺの周りに９０°だけ回転させた方向である。

図５（Ｂ）に示すとおり回折光束群の分岐方向がＶ_２であるときには、回折光束群の偏光方向は、図５（Ｂ）に点線矢印で示した方向Ｖ_２’とされるべきである。この方向Ｖ_２’は、方向Ｖ_２を光軸ＡＺの周りに９０°だけ回転させた方向である。

図５（Ｃ）に示すとおり回折光束群の分岐方向がＶ_３であるときには、回折光束群の偏光方向は、図５（Ｃ）に点線矢印で示した方向Ｖ_３’とされるべきである。この方向Ｖ_３’は、方向Ｖ_３を光軸ＡＺの周りに９０°だけ回転させた方向である。

そこで、本実施形態では、ＳＬＭ１３の上流側に配置された偏光板２３の軸方向を、方向Ｖ_２’に予め一致させておき、ＳＬＭ１３の下流側に配置された１／２波長板１７の進相軸の方向を、波長板駆動回路１７Ａ（図１参照）によって適宜に光軸ＡＺの周りに回動させる。なお、１／２波長板１７の進相軸とは、その軸の方向に偏光した光が１／２波長板１７を通過するときの位相遅延量が最小となるような方向のことである。

また、本実施形態では、回折光束群の分岐方向の切り換えがＳＬＭ１３によって高速化されたので、その高速化の効果が損なれないよう、１／２波長板１７も液晶素子で構成されたと仮定する。この液晶素子の配向を波長板駆動回路１７Ａ（図１参照）が電気的に制御すれば、１／２波長板１７の進相軸の方向が高速に切り換わる。

図５（Ａ）に示すとおり回折光束群の分岐方向がＶ_１であるとき、１／２波長板１７の進相軸の方向は、図５（Ａ）に実線の両矢印で示す方向に設定される。この方向は、１／２波長板１７へ入射する回折光束群が有している偏光方向Ｖ_２’と、１／２波長板１７から射出する回折光束群が有しているべき偏光方向Ｖ_１’とを二等分する方向である。

図５（Ｂ）に示すとおり回折光束群の分岐方向がＶ_２であるとき、１／２波長板１７の進相軸の方向は、図５（Ｂ）に実線の両矢印で示す方向に設定される。この方向は、１／２波長板１７へ入射する回折光束群が有している偏光方向Ｖ_２’と、１／２波長板１７から射出する回折光束群が有しているべき偏光方向Ｖ_２’とを二等分する方向（＝Ｖ_２’）である。

図５（Ｃ）に示すとおり回折光束群の分岐方向がＶ_３であるとき、１／２波長板１７の進相軸の方向は、図５（Ｃ）に実線の両矢印で示す方向に設定される。この方向は、１／２波長板１７へ入射する回折光束群が有している偏光方向Ｖ_２’と、１／２波長板１７から射出する回折光束群が有しているべき偏光方向Ｖ_３’とを二等分する方向である。

なお、ここでは、干渉縞に寄与する回折光束群をＳ偏光に保つために液晶素子からなる１／２波長板１７を使用したが、干渉縞に寄与する回折光束群をＳ偏光に保つための方法は他にもある（後述）。

次に、干渉縞の位相シフトに関する液晶駆動回路１５Ａ（図１参照）の動作を詳しく説明する。

上述した復調演算には、例えば、同一の標本５かつ同一方向の干渉縞に関する変調画像であって、干渉縞の位相の異なる複数枚の変調画像（例えば５枚の変調画像）が必要である。なぜなら、構造化照明顕微鏡装置１が生成する変調画像には、標本５の蛍光領域の構造のうち、干渉縞により空間周波数の変調された構造情報である０次変調成分、＋１次変調成分、−１次変調成分、＋２次変調成分、−２次変調成分が含まれており、それら５つの未知パラメータを復調演算で既知とする必要があるからである。

そこで、液晶駆動回路１５Ａは、干渉縞の位相をシフトするために、ＳＬＭ１３における位相回折格子の表示先をシフトさせる。そのシフト方向は、例えば図６に示すとおり位相回折格子の周期構造の方向Ｖ（ここではＶ_１、Ｖ_２、Ｖ_３の何れか）に対して非垂直な方向（ｘ方向）である。

因みに、干渉縞の位相をφだけシフトさせるために必要な位相回折格子のｘ方向のシフト量Ｌは、位相回折格子の構造周期Ｐと、図６に示した角度θとによって定まる。この角度θは、位相回折格子のシフト方向（ｘ方向）と周期構造の方向Ｖ（ここではＶ_１、Ｖ_２、Ｖ_３の何れか）とが成す角度である。また、復調演算に必要な干渉縞の位相数がＮである場合、位相シフト周期φは例えば２π／Ｎに設定される。

次に、光源波長λの切り換えに関する液晶駆動回路１５Ａ（図１参照）の動作を詳しく説明する。

干渉縞に寄与する０次回折光束と±１次回折光束との強度比は、基本的に、ＳＬＭ１３に表示された位相回折格子の位相差Φに依存する。位相回折格子の位相差Φとは、ＳＬＭ１３の入射光束に対して画素領域１３Ａが与える位相遅延量と画素領域１３Ｂが与える位相遅延量との差のことである。

ここで、位相回折格子の位相差Φと位相回折格子で発生する各次数の回折強度との関係は、図７に示すとおりである。なお、ここでいう「回折強度」は、位相回折格子に対する入射光束の強度が「１」であるときに発生する回折光束の強度のことを指す。

図７によると、位相差Φ＝０においては０次回折光束のみが発生し、他の次数の回折光束は発生しないことがわかる。

また、図７によると、位相差Φ＝２［ｒａｄ］（曲線が交わっている箇所）においては０次回折光束、＋１次回折光束、−1次回折光束の強度比は、１：１：１になることがわかる。

また、図７によると、位相差Φ＝π≒３［ｒａｄ］においては０次回折光束が発生せず、±１次回折光束と高次の回折光束とが発生することがわかる。

したがって、図７によると、０次回折光束の強度と＋１次回折光束の強度と−１次回折光束の強度との比が例えば０．７：１：１になるような位相差Φは、Φ≒２．２であることがわかる。

なお、図７の曲線は、位相分布が正弦波モードである場合を示している。位相分布が矩形波モードの場合は、０次回折光束の強度と＋１次回折光束の強度と−１次回折光束の強度との比を例えば０．７：１：１とするための位相差Φは、位相分布が正弦波モードである場合のそれと比べて小さくなるので、ＳＬＭに設定する位相値を変化させる必要がある。

そして、位相回折格子の位相差Φは、位相回折格子の屈折率差Δｎによって定まる。位相回折格子の屈折率差Δｎとは、ＳＬＭ１３における画素領域１３Ａの屈折率と画素領域１３Ｂの屈折率と差のことである。

但し、位相回折格子の位相差Φは、位相回折格子の屈折率差Δｎだけでなく、入射光束の波長λにも依存する。これを式で表すと、以下の式（１）とおりである。

Φ＝２π・Δｎ・ｄ／λ …（１）
なお、式（１）におけるｄは、ＳＬＭ１３の液晶層１３ａの光軸ＡＺ方向の厚さ（定数）である。

したがって、位相回折格子の屈折率差Δｎの適正値Δｎ_０は、光源波長λが長い波長λ_１であるときと短い波長λ_２であるときとで若干異なる。

そこで、本実施形態では、０次回折光束の強度と＋１次回折光束の強度と−１次回折光束の強度との比（強度比）と屈折率差Δｎとの関係を波長λごとに示す関数テーブルが制御装置３９内の記憶部（不図示）に予め記憶されているものと仮定する。

この場合、制御装置３９は、必要な強度比及び使用波長λに応じてこの関数テーブルを参照することにより、屈折率差Δｎの適正値Δｎ_０を求めることができる。これによって、液晶駆動回路１５ＡがＳＬＭ１３へ与えるべき駆動信号（電圧値）の適正値が確定する。

なお、ここでは、必要な強度比及び使用波長λに応じて屈折率差Δｎの適正値Δｎ_０を確定するために（つまりＳＬＭ１３へ与えるべき駆動信号（電圧値）の適正値を確定するために）、「強度比及び使用波長λから屈折率差Δｎを求めるための関数テーブル」を使用したが、他のテーブルを使用してもよい。例えば、「強度比から位相差Φを求めるための関数テーブル」と「使用波長λ及び位相差Φから屈折率差Δｎを求めるための関数テーブル」との２つを使用してもよい。

また、ここでは、記憶部に格納されるべき情報を関数テーブルとしたが、記憶部に格納されるべき情報の一部又は全部は、関数それ自体であってもよい。例えば、「使用波長λ及び位相差Φから屈折率差Δｎを求めるための関数テーブル」の代わりに式（１）を使用してもよい。

但し、関数テーブルを使用した方が、屈折率差Δｎの適正値Δｎ_０（ひいてはＳＬＭ１３へ与えるべき電圧値の適正値）を高速に導出できるので好ましい。

そして、本実施形態の液晶駆動回路１５Ａ（図１参照）は、制御装置３９（図１参照）の制御下で、ＳＬＭ１３の画素領域１３Ａに与える電圧値と画素領域１３Ｂに与える電圧値との組み合わせを制御することにより、位相回折格子の屈折率差Δｎを適宜に調整する。

具体的に、液晶駆動回路１５Ａは、光源波長λが長い波長λ_１であるときには位相回折格子の屈折率差ΔｎをΔｎ_０１に設定し、光源波長λが短い波長λ_２であるときには位相回折格子の屈折率差ΔｎをΔｎ_０２に設定する。

但し、Δｎ_０１は、光源波長λがλ_１であるときに０次回折光束の強度と＋１次回折光束の強度と−１次回折光束の強度との比が例えば０．７：１：１となるような適正値である。この適正値Δｎ_０１によると、波長λ_１の復調画像（超解像画像）のコントラストが最適となる。

一方、Δｎ_０２は、光源波長λがλ_２であるときに０次回折光束の強度と＋１次回折光束の強度と−１次回折光束の強度との比が例えば０．７：１：１となるような適正値である。この適正値Δｎ_０２によると、波長λ_２の復調画像（超解像画像）のコントラストが最適となる。

したがって、本実施形態では、復調画像（超解像画像）のコントラストは光源波長λに依らず高く維持される。

因みに、Δｎ_０１、Δｎ_０２の関係は、以下の式（２）で表される。

Δｎ_０１／λ_１＝Δｎ_０２／λ_２ …（２）
上述したとおりλ_１＞λ_２であるので、Δｎ_０１＞Δｎ_０２である。

次に、波長の異なる２種類の超解像画像に必要なデータの取得手順を説明する。

図８は、制御装置３９の動作フローチャートである。以下、図８の各ステップを順に説明する。

ステップＳ１：制御装置３９は、回動機構２００Ａを介して０次光シャッタ２００の回動角を基準角度に設定することにより、構造化照明顕微鏡装置１を３Ｄ−ＳＩＭモードに設定する。また、制御装置３９は、レーザユニット１００を介して構造化照明顕微鏡装置１の光源波長λを長い波長λ_１に設定する。

ステップＳ２：制御装置３９は、液晶駆動回路１５Ａを介してＳＬＭ１３を駆動することによりＳＬＭ１３へ位相回折格子を表示する。この位相回折格子の屈折率差ΔｎはΔｎ_０１であり、位相回折格子の周期構造の方向ＶはＶ_１であり、位相回折格子の構造周期ＰはＰ_０である。また、制御装置３９は、波長板駆動回路１７Ａを介して１／２波長板１７を駆動することにより、１／２波長板１７の進相軸を図５（Ａ）における実線両矢印の方向に設定する。

ステップＳ３：制御装置３９は、液晶駆動回路１５Ａを介してＳＬＭ１３における位相回折格子の表示先を所定シフト周期でＮ通りにシフトさせることにより、干渉縞の位相をシフト周期φ＝２π／ＮでＮ通りにシフトさせ、それらＮ通りの位相の下でレーザユニット１００及び撮像素子３５を駆動することにより、Ｎ枚の変調画像を取得する。

ステップＳ４：制御装置３９は、液晶駆動回路１５Ａを介してＳＬＭ１３を駆動することにより、位相回折格子の周期構造の方向ＶをＶ_２に切り換えると共に、波長板駆動回路１７Ａを介して１／２波長板１７を駆動することにより、１／２波長板１７の進相軸を図５（Ｂ）における実線両矢印の方向に切り換えると、ステップＳ３を実行する。

なお、ステップＳ４においてＳＬＭ１３に表示される位相回折格子とステップＳ２においてＳＬＭ１３に表示される位相回折格子との間では、屈折率差Δｎ及び構造周期Ｐが共通である。

ステップＳ５：制御装置３９は、液晶駆動回路１５Ａを介してＳＬＭ１３を駆動することにより、位相回折格子の周期構造の方向ＶをＶ_３に切り換えると共に、波長板駆動回路１７Ａを介して１／２波長板１７を駆動することにより、１／２波長板１７の進相軸を図５（Ｃ）における実線両矢印の方向に切り換えると、ステップＳ３を実行する。

なお、ステップＳ５においてＳＬＭ１３に表示される位相回折格子とステップＳ２においてＳＬＭ１３に表示される位相回折格子との間では、屈折率差Δｎ及び構造周期Ｐが共通である。

ステップＳ６：制御装置３９は、レーザユニット１００を介して構造化照明顕微鏡装置１の光源波長λを長い波長λ_１から短い波長λ_２へと切り換える。

ステップＳ７：制御装置３９は、液晶駆動回路１５Ａを介してＳＬＭ１３を駆動することによりＳＬＭ１３へ位相回折格子を表示する。この位相回折格子の屈折率差ΔｎはΔｎ_０２であり、位相回折格子の周期構造の方向ＶはＶ_１であり、位相回折格子の構造周期ＰはＰ_０である。また、制御装置３９は、波長板駆動回路１７Ａを介して１／２波長板１７を駆動することにより、１／２波長板１７の進相軸を図５（Ａ）における実線両矢印の方向に切り換える。

ステップＳ８：制御装置３９は、液晶駆動回路１５Ａを介してＳＬＭ１３における位相回折格子の表示先を所定シフト周期でＮ通りにシフトさせることにより、干渉縞の位相をシフト周期φ＝２π／ＮでＮ通りにシフトさせ、それらＮ通りの位相の下でレーザユニット１００及び撮像素子３５を駆動することにより、Ｎ枚の変調画像を取得する。

ステップＳ９：制御装置３９は、液晶駆動回路１５Ａを介してＳＬＭ１３を駆動することにより、位相回折格子の周期構造の方向ＶをＶ_２に切り換えると共に、波長板駆動回路１７Ａを介して１／２波長板１７を駆動することにより、１／２波長板１７の進相軸を図５（Ｂ）における実線両矢印の方向に切り換えると、ステップＳ８を実行する。

なお、ステップＳ９においてＳＬＭ１３に表示される位相回折格子とステップＳ７においてＳＬＭ１３に表示される位相回折格子との間では、屈折率差Δｎ及び構造周期Ｐが共通である。

ステップＳ１０：制御装置３９は、液晶駆動回路１５Ａを介してＳＬＭ１３を駆動することにより、位相回折格子の周期構造の方向ＶをＶ_３に切り換えると共に、波長板駆動回路１７Ａを介して１／２波長板１７を駆動することにより、１／２波長板１７の進相軸を図５（Ｃ）における実線矢印の方向に切り換えると、ステップＳ８を実行する。

なお、ステップＳ１０においてＳＬＭ１３に表示される位相回折格子とステップＳ７においてＳＬＭ１３に表示される位相回折格子との間では、屈折率差Δｎ及び構造周期Ｐが共通である（以上、ステップＳ１０）。

以上、本実施形態の制御装置３９は、ＳＬＭ１３へ表示する位相回折格子の屈折率差Δｎを、光源波長λが長いときほど大きく設定する。具体的に、本実施形態の制御装置３９は、光源波長λが長い波長λ_１であるときには屈折率差Δｎを大きな値Δｎ_０１に設定し、光源波長λが短い波長λ_２であるときには屈折率差Δｎを小さな値Δｎ_０２に設定する（式（２）を参照。）。

したがって、本実施形態の制御装置３９は、光源波長λの切り換えに拘わらず復調画像（超解像画像）のコントラストを維持することができる。

なお、本実施形態の画像記憶・演算装置４０は、上記のステップＳ３〜Ｓ５で取得された変調画像（波長λ_１で取得された変調画像）に対して３Ｄ−ＳＩＭモードの復調演算を施すことにより第１蛍光領域の超解像画像を生成し、上記のステップＳ８〜Ｓ１０で取得された変調画像（波長λ_２で取得された変調画像）に対して３Ｄ−ＳＩＭモードの復調演算を施すことにより第２蛍光領域の超解像画像を生成する。

上述したとおり本実施形態の制御装置３９は、光源波長λの切り換え前後で復調画像（超解像画像）のコントラストを高く維持するので、波長λ_１で取得された変調画像と、波長λ_２で取得された変調画像との双方の画質が高くなる。

したがって、本実施形態の画像記憶演算装置４０は、第１蛍光領域の超解像画像と第２蛍光領域の超解像画像との双方を、高精度に取得することができる。

その結果、本実施形態のユーザは、標本５上の互いに異なる蛍光領域（第１蛍光領域、第２蛍光領域）を正確に比較・評価することができる。

［実施形態の補足］
なお、上述した実施形態の制御装置３９は、位相回折格子の屈折率差Δｎの調整を光源波長λに応じて行ったが、標本５の種類に応じて行ってもよいし、標本５の種類と光源波長λとの双方に応じて行ってもよい。

なぜなら、復調画像（超解像画像）のコントラストを最適にするために必要な回折光束群の強度比は、標本５の種類（主に標本５の厚さ）によって、上述した強度比（０．７：１：１）から多少外れることもある。

そこで、本実施形態の構造化照明顕微鏡装置１には、次のような自動調整モードが搭載されてもよい。自動調整モードにおける制御装置３９は、屈折率差Δｎを調整しながら、変調画像の取得・復調画像（超解像画像）の生成からなる一連の処理を繰り返すと共に、復調画像（超解像画像）のコントラストを監視し、コントラストが最適となった時点で、屈折率差Δｎの調整を終了する。

なお、この自動調整モードは、少なくとも標本５が交換されたタイミングで発現することが望ましい。或いは、装置の環境変化に対処するため、この自動調整モードを連続的又は定期的に発現させてもよい。

また、本実施形態の構造化照明顕微鏡装置１には、次のような手動調整モードが搭載されてもよい。手動調整モードにおける制御装置３９及び画像表示装置４５は、ユーザからの調整指示に応じて屈折率差Δｎを調整しながら、変調画像の取得・復調画像（超解像画像）の生成・復調画像（超解像画像）の表示からなる一連の処理を繰り返す。ユーザは、表示された調復画像（超解像画像）を目視しながら調整指示を入力し、その復調画像（超解像画像）のコントラストが最適となった時点で調整指示の入力を終了する。

なお、構造化照明顕微鏡装置１に手動調整モードを搭載する場合は、ユーザからの調整指示を受け付ける不図示のユーザインタフェースが構造化照明顕微鏡装置１に備えられる必要がある。

また、上述した実施形態の制御装置３９は、光源波長λの切り換え前後で位相回折格子の構造周期Ｐを不変としたが、光源波長λの切り換え前後で位相回折格子の構造周期Ｐを調整してもよい。例えば、光源波長λの切り換え前後で構造化照明顕微鏡装置１の超解像効果が不変となるように構造周期Ｐを調整してもよい。具体的には、光源波長λの切り換え前後で集光点１４ｂ、１４ｃから光軸ＡＺまでの距離が不変となるように構造周期Ｐを調整してもよい。

また、図１に示す構造化照明顕微鏡装置１では、反射型空間光変調器（ＳＬＭ１３）の姿勢を、保護層１３ｂの表面（入射面）の法線が入射光束の主光線に対して例えば４５°の角度を成すように設定したが、図９において符号Ａで示すように、法線と主光線とが０°の角度を成すように設定してもよい。その場合は、例えば、レンズ１６とＳＬＭ１３との間にビームスプリッタ１０１を４５°の角度で配置すればよい。このビームスプリッタ１０１は、レーザユニット１００側からの光束を反射してＳＬＭ１３へ正面から入射させると共に、ＳＬＭ１３で反射した光束（回折光束）を透過してレンズ１６へ正面から入射させる。

また、上述した実施形態では、構造化照明顕微鏡装置１を３Ｄ−ＳＩＭモードで使用したが（すなわち０次光回折光束をオンして標本５へ投影する干渉縞を３光束干渉縞としたが）、構造化照明顕微鏡装置１を２Ｄ−ＳＩＭモードで使用してもよい（すなわち０次光回折光束をオフして標本５へ投影する干渉縞を２光束干渉縞としてもよい）。

また、構造化照明顕微鏡装置１を２Ｄ−ＳＩＭモードの１種であるＴＩＲＦＭ（全反射蛍光顕微鏡）として使用してもよい。構造化照明顕微鏡装置１をＴＩＲＦＭとして使用する場合、対物レンズ６は、液浸型（油浸型）の対物レンズとして構成される。つまり、対物レンズ６と標本５のガラスとの間隙は、不図示の浸液（油）で満たされる。

また、構造化照明顕微鏡装置１をＴＩＲＦＭとして使用する場合、標本５の表面に入射する±１次回折光束の入射角度は、エバネッセント場の生成条件である全反射条件（ＴＩＲＦ条件）を満たす必要がある。このＴＩＲＦ条件を満たすために、瞳面６Ａにおける±１次回折光束の集光点は、瞳面６Ａの最外周における所定の輪帯状領域（ＴＩＲＦ領域）に位置していればよい。この場合、標本５の表面近傍には、干渉縞によるエバネッセント場が生起する。

因みに、２Ｄ−ＳＩＭモードでは０次回折光束を使用しないので、光源波長λを切り換えたとしても干渉縞に寄与する回折光束群の強度比は基本的に変化しないが、２Ｄ−ＳＩＭモードと３Ｄ−ＳＩＭモードとの間でモード切り換えが行われたときには、復調画像（超解像画像）のコントラストを最適にするために必要な強度比が変化するので、屈折率差Δｎの調整を行うことが望ましい。

例えば、３Ｄ−ＳＩＭモードにおける制御装置３９は、０次回折光束、＋１次回折光束、−１次回折光束の強度比が例えば０．７：１：１となるように屈折率差Δｎを設定し、２Ｄ−ＳＩＭモードにおける制御装置３９は、０次回折光束、＋１次回折光束、−１次回折光束の強度比が例えば０：１：１となるように屈折率差Δｎを設定してもよい。

また、３Ｄ−ＳＩＭモードで生成される変調画像には、互いに分離すべき５成分が重畳されているのに対して、２Ｄ−ＳＩＭモードで生成される変調画像には、互いに分離すべき３成分が重畳されているので、３Ｄ−ＳＩＭモードでは、干渉縞の位相シフトにおいて必要な位相数Ｎは、例えば「５」となるのに対して、２Ｄ−ＳＩＭモードでは、干渉縞の位相シフトにおいて必要な位相数Ｎは、例えば「３」となる。また、２Ｄ−ＳＩＭモードと３Ｄ−ＳＩＭモードとの間では、変調画像の枚数が異なるので、画像記憶・演算装置４０が実行すべき復調演算の内容が異なる。

また、上述した実施形態では、光源波長の数を２としたが、１としてもよく、また、２以上に拡張してもよい。

また、上述した実施形態では、標本５に入射する回折光束群をＳ偏光に保つために、進相軸の方向を切り換え可能な１／２波長板１７を使用したが、１／２波長板の代わりに、２枚の１／４波長板を使用すると共に、一方の１／４波長板の進相軸の方向を切り換え可能としてもよい。

また、上述した実施形態では、超解像画像（復調画像）を取得するために、一連の変調画像を用いて公知の演算を行ったが、これに限定されることはなく、例えば、米国特許８０８１３７８に記載された光学的復調によって復調画像（超解像画像）を取得してもよい。

その場合、ダイクロイックミラー７をミラーに置き換え、ＳＬＭ１３とコレクタレンズ１２との間の光路に対して、励起光（波長λ_１、λ_２）に応じて発生した蛍光（波長λ_１’、λ_２’）をその励起光から分離するダイクロイックミラーを配置し、分離された蛍光を受光する撮像素子を配置すればよい。

また、上述した実施形態の照明光学系１０は、対物レンズ６による落射照明光学系で構成されたが、これに限定されることはなく、例えば、コンデサレンズによる透過照明光学系又はコンデンサレンズによる反射照明光学系で構成されてもよい。その場合、集光点が形成されるのは、コンデサレンズの瞳面である。

また、上述した実施形態では、２Ｄ−ＳＩＭモードの２光束干渉縞又は３Ｄ−ＳＩＭモードの３光束干渉縞を形成するための回折光として、±１次回折光及び０次回折光の組み合わせを用いたが、他の組み合わせを用いてもよい。３光束干渉縞を形成するためには、回折次数の間隔が等間隔な３つの回折光による３光束干渉を生起させればよいので、例えば、０次回折光、１次回折光、２次回折光の組み合わせ、±２次回折光及び０次回折光の組み合わせ、±３次回折光及び０次回折光の組み合わせ、などを用いることが可能である。

何れにせよ、制御装置３９は、干渉縞に寄与する回折光束群の強度比を、その復調画像（超解像画像）のコントラストが最適となるような強度比に調整（制御）することが望ましい。

［実施形態の作用効果］
以上、本実施形態の構造化照明装置（照明光学系１０）は、光源からの射出光束を複数の光束に分岐する分岐部と、前記複数の光束による干渉縞を標本（５）に形成する光学系（レンズ１６、２５、２７、６）と、前記分岐部を制御する制御部（液晶駆動回路１５Ａ、制御装置３９）とを備え、前記分岐部は、単位素子群からなる部材を含む空間光変調器（ＳＬＭ１３）を有し、前記制御部（液晶駆動回路１５Ａ、制御装置３９）は、第１の位相遅延量を前記射出光束に対して付与する第１の領域と第２の位相遅延量を前記射出光束に対して付与する第２の領域との繰り返しからなる周期領域を前記空間光変調器内に設定するとともに、前記干渉縞に寄与する複数の光束の強度比が所定値になるように、前記第１の位相遅延量と前記第２の位相遅延量との間に差を付与する駆動信号を、前記単位素子群のうちの所定の単位素子へ出力する。

なお、前記第１の位相遅延量、及び前記第２の位相遅延量は、それぞれ一定値であり、前記第１の位相遅延量と前記第２の位相遅延量とは互いに値が異なる（例えば矩形波モード）。

或いは、前記第１の位相遅延量は、所定の形状に分布する値であって、最大値を含み、前記第２の位相遅延量は、所定の形状に分布する値であって、最小値を含む（例えば正弦波モード）。

また、前記制御部（液晶駆動回路１５Ａ、制御装置３９）は、前記第１の領域と前記第２の領域との間に位相遅延量の差を付与するために、前記第１の領域と前記第２の領域との間に屈折率の差を付与する駆動信号を前記所定の単位素子へ出力する。

また、前記制御部（液晶駆動回路１５Ａ、制御装置３９）は、前記所定の単位素子へ出力する前記駆動信号を、前記射出光束の波長に応じて切り換える。

また、前記制御部（液晶駆動回路１５Ａ、制御装置３９）は、前記第１の領域と前記第２の領域との間の位相遅延量の差を、前記射出光束の波長（λ）が長いときほど大きくする。

また、前記制御部（液晶駆動回路１５Ａ、制御装置３９）は、必要な前記強度比と前記波長とに応じて前記所定の単位素子へ出力すべき適正な前記駆動信号を確定するために必要な情報の少なくとも一部を、テーブルとして予め記憶している。

また、本実施形態の構造化照明装置（照明光学系１０）は、前記空間光変調器（ＳＬＭ１３）における前記周期領域の形成先をシフトさせることにより前記干渉縞の位相をシフトさせる位相シフト部（液晶駆動回路１５Ａ、制御装置３９）を更に備える。

また、本実施形態の構造化照明装置（照明光学系１０）は、前記空間光変調器における前記周期領域の形成方向を切り換えることにより前記干渉縞の方向を切り換える方向切換部（液晶駆動回路１５Ａ、制御装置３９）を更に備える。

また、前記空間光変調器（ＳＬＭ１３）は、前記射出光束の偏光方向分布及び振幅分布を維持しつつ前記射出光束の位相分布を変化させる空間光変調器である。

また、本実施形態の構造化照明顕微鏡装置（１）は、本実施形態の構造化照明装置（照明光学系１０）と、前記干渉縞で空間変調された前記標本（５）の画像である変調画像を取得する撮像部（撮像素子３５、制御装置３９）とを備える。

また、本実施形態の構造化照明顕微鏡装置（１）は、前記変調画像に基づき前記標本（５）の復調画像を生成する演算部（画像記憶・演算装置４０）を更に備える。

また、前記制御部（液晶駆動回路１５Ａ、制御装置３９）は、前記復調画像のコントラストが最適になるように前記設定を行う。

したがって、本実施形態の構造化照明顕微鏡装置（１）の性能は、構造化照明顕微鏡装置（１）の使用状況、例えば、前記射出光束の波長、前記標本の厚さなどに依らず、維持される。

［その他］
なお、上述の各実施形態の要件は、適宜組み合わせることができる。また、一部の構成要素を用いない場合もある。また、法令で許容される限りにおいて、上述の各実施形態及び変形例で引用した装置などに関する全ての公開公報及び米国特許の開示を援用して本文の記載の一部とする。

１…構造化照明顕微鏡装置、１００…レーザユニット、１１…光ファイバ、１０…照明光学系、３０…結像光学系、３５…撮像素子、３９…制御装置、４０…画像記憶・演算装置、４５…画像表示装置、１２…コレクタレンズ、２３…偏光板、１５…光束分岐部、１６…集光レンズ、２４…光束選択部、２５…レンズ、２６…視野絞り、２７…フィールドレンズ、２８…励起フィルタ、７…ダイクロイックミラー、６…対物レンズ、５…標本、１７…１／２波長板、１８…高次光カット部材、１７Ａ…波長板駆動回路、２００…０次光シャッタ、２００Ａ…回動機構、１５Ａ…液晶駆動回路、１３…ＳＬＭ

本発明の構造化照明装置の一例は、複数の画素電極が設けられた第１基板と、第１基板に対向する第２基板と、液晶部材とを含み、光源からの光を複数の光束に分岐する光変調器と、光変調器から射出された複数の光束の少なくとも一部により形成される干渉縞によって標本を照明する照明光学系と、光変調器を制御する制御部とを備える。制御部は、画素電極に駆動信号を出力して光変調器の第１の領域の位相遅延量と第２の領域の位相遅延量との差を調整することにより、複数の光束の強度比を調整する。

Claims (15)

1. 光源からの光を複数の光束に分岐する空間光変調器と、
   前記複数の光束の全部又は一部により干渉縞を形成し、前記干渉縞で標本を照明する光学系と、
   前記空間光変調器を制御する制御部とを備え、
   前記制御部は、
   前記空間光変調器に対して駆動信号を出力することにより、前記干渉縞に寄与する複数の光束の強度比が予め決められた値になるように、前記空間光変調器の第１の領域に対して第１の位相遅延量を設定し、第２の領域に対して第２の位相遅延量を設定することを特徴とする構造化照明装置。
2. 請求項１に記載の構造化照明装置において、
   前記空間光変調器は、
   複数の画素電極が設けられた第１基板と、前記第１基板に対向する第２基板と、前記第１基板と前記第２基板とにより挟持された液晶部材とを含み、
   前記制御部は、
   前記画素電極それぞれに駆動信号を出力することにより、前記干渉縞に寄与する複数の光束の強度比が予め決められた値になるように、前記空間光変調器の第１の領域に対して第１の位相遅延量を設定し、第２の領域に対して第２の位相遅延量を設定することを特徴とする構造化照明装置。
3. 請求項１または請求項２に記載の構造化照明装置において、
   前記第１の位相遅延量、及び前記第２の位相遅延量は、それぞれ一定値であり、前記第１の位相遅延量と前記第２の位相遅延量とは互いに値が異なる
   ことを特徴とする構造化照明装置。
4. 請求項１または請求項２に記載の構造化照明装置において、
   前記第１の位相遅延量は、前記第１の領域において最大値を有し、
   前記第２の位相遅延量は、前記第２の領域において最小値を有する
   ことを特徴とする構造化照明装置。
5. 請求項１〜請求項４の何れか一項に記載の構造化照明装置において、
   前記制御部は、
   前記第１の領域と前記第２の領域との間に位相遅延量の差を付与するために、前記第１の領域と前記第２の領域との間に屈折率の差を付与する駆動信号を前記空間光変調器へ出力する
   ことを特徴とする構造化照明装置。
6. 請求項１〜請求項５の何れか一項に記載の構造化照明装置において、
   前記制御部は、
   前記空間光変調器へ出力する前記駆動信号を、前記射出光束の波長に応じて切り換える
   ことを特徴とする構造化照明装置。
7. 請求項６に記載の構造化照明装置において、
   前記制御部は、
   前記第１の領域と前記第２の領域との間の位相遅延量の差を、前記射出光束の波長が長いときほど大きくする
   ことを特徴とする構造化照明装置。
8. 請求項７に記載の構造化照明装置において、
   前記制御部は、
   必要な前記強度比と前記波長とに応じて前記空間光変調器へ出力すべき適正な前記駆動信号を確定するために必要な情報の少なくとも一部を、テーブルとして予め記憶していることを特徴とする構造化照明装置。
9. 請求項１〜請求項８の何れか一項に記載の構造化照明装置において、
   前記空間光変調器における前記第１の領域および前記第２の領域の分布を変化させることにより前記干渉縞の位相をシフトさせる位相シフト部を更に備えた
   ことを特徴とする構造化照明装置。
10. 請求項１〜請求項９の何れか一項に記載の構造化照明装置において、
    前記空間光変調器における前記第１の領域および前記第２の領域の分布を変化させることにより前記干渉縞の方向を切り換える方向切換部を更に備えた
    ことを特徴とする構造化照明装置。
11. 請求項１〜請求項１０の何れか一項に記載の構造化照明装置において、
    前記空間光変調器は、
    前記射出光束の偏光方向分布及び振幅分布を維持しつつ前記射出光束の位相分布を変化させる空間光変調器である
    ことを特徴とする構造化照明装置。
12. 請求項１〜請求項１１の何れか一項に記載の構造化照明装置において、
    前記干渉縞に寄与する複数の光束は、０次回折光束および±１次回折光束であり、
    前記制御部は、０次回折光束の強度を、±１次回折光束の強度より低くすることを特徴とする構造化照明装置
13. 請求項１〜請求項１２の何れか一項に記載の構造化照明装置と、
    前記干渉縞で空間変調された前記標本の画像である変調画像を取得する撮像部と、
    を備えたことを特徴とする構造化照明顕微鏡装置。
14. 請求項１３に記載の構造化照明顕微鏡装置において、
    前記変調画像に基づき前記標本の復調画像を生成する演算部を更に備える
    ことを特徴とする構造化照明顕微鏡装置。
15. 請求項１４に記載の構造化照明顕微鏡装置において、
    前記制御部は、
    前記復調画像のコントラストが最高になるように前記設定を行う
    ことを特徴とする構造化照明顕微鏡装置。
    

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