JP2024519860A - 生体試料を分析する方法およびデバイス - Google Patents
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Abstract
生体試料（１００２）を分析する方法であって、次のステップを含む：複数のマーカー（１６１２）を提供するステップであって、各マーカー（１３００～１３０９，１４００～１４２２，１５００～１５０８，１５１８，１５２６）は、マーカー（１３００～１３０９，１４００～１４２２，１５００～１５０８，１５１８，１５２６）に固有の蛍光色素（１３２０）と、マーカー（１３００～１３０９，１４００～１４２２，１５００～１５０８，１５１８，１５２６）に固有の親和性試薬（１３１０～１３１９）と、を含み、親和性試薬（１３１０～１３１９）は、試料（１００２）内の所定の構造（１７０６～１７１４）に付着するように構成されているステップ。複数のマーカー（１６１２）を試料（１００２）に導入することによって、試料（１００２）を染色するステップ。マーカーの第１のセット（１６１４）の蛍光色素（１３２０）を励起するために、第１の波長スペクトルを有する第１の励起光を試料（１００２）に向けるステップ。第１のセット（１６１４）の励起された色素によって発光された蛍光光から少なくとも１つの第１の画像を生成するステップであって、第１の画像は少なくとも２つのチャネルを含み、各チャネルはマーカーの第１のセット（１６１４）のうちの１つのマーカー（１３００～１３０９，１４００～１４２２，１５００～１５０８，１５１８，１５２６）に対応するステップ。マーカーの第２のセット（１６１６）の蛍光色素（１３２０）を励起するために、第２の波長スペクトルを有する少なくとも１つの第２の励起光を試料（１００２）に向けるステップであって、第２のセット（１６１６）は第１のセット（１６１４）とは異なるステップ。第２のセット（１６１６）の励起された色素によって発光された蛍光光から少なくとも１つの第２の画像を生成するステップであって、第２の画像は少なくとも２つのチャネルを含み、各チャネルは前記マーカーの第２のセット（１６１６）のうちの１つのマーカー（１３００～１３０９，１４００～１４２２，１５００～１５０８，１５１８，１５２６）に対応するステップ。
Description
本発明は、生体試料を分析する方法に関する。さらに、本発明は、生体試料を分析するためのデバイスに関する。
生命科学の分野における重要な問題に対処するためには、生体試料、例えば組織試料または細胞培養物内の特定の構造を正確に同定し、その位置を特定することが不可欠である。これは、特定の構造、例えば特定の生体分子に付着するマーカーを試料に導入することによって行うことができる。これらのマーカーは、典型的には、対象構造に付着する親和性試薬と、親和性試薬に直接コンジュゲートするか、二次親和性試薬によって親和性試薬に付着する蛍光色素と、を含む。このようにして調製された生体試料を分析するための様々な技術がある。既知の技術は、高い空間分解能を有するか、または多数の異なる蛍光色素を同定することができる。しかしながら、多数の異なる蛍光を高い空間分解能でイメージングできる技術はない。
蛍光顕微鏡法では、高い空間分解能で試料をイメージングできるが、関与する異なる蛍光色素の数は少なく、典型的には１～５種類である。利用可能なマーカーは、細胞型の同定に使用されるマーカー、対象タンパク質のような機能マーカーおよび一般的な形態学的マーカーを同じ実験に対応させなければならない。これは、ほとんどのイメージング実験では、細胞型の同定が不十分なものにとどまることを意味する。これは、かなり広範な多細胞型集団が研究されていることを意味し、生成される結果の予測力および翻訳価値を著しく制限している。より信頼性が高くロバストな細胞型の同定を可能にする、例えば遺伝子制御ネットワーク（ＧＲＮ）の解析に基づく最新のアプローチは存在するが、それらのアプローチは、試料から読み出されるはるかに多くの異なるマーカーの数を必要とする。
隣接するサイトメトリーの分野では、マスサイトメトリーおよびイメージングマスサイトメトリー技術が、約１２～３０種類の異なるマーカーを区別することができるが、それらの空間分解能は低い。
空間プロファイリング技術は、オリゴヌクレオチドを試料にハイブリダイズさせ、次いで、結合したオリゴヌクレオチドを領域選択的に放出した後、放出されたオリゴヌクレオチドの次世代シーケンシングを行うことに基づいているため、空間分解能はさらに低いものの、数桁高い多くの異なるマーカーを区別することができる。
したがって、本発明の目的は、高い空間分解能で、数が増加したマーカーのセットを分析することを可能にする、生体試料を分析するための方法およびデバイスを提供することである。
前述の目的は、独立請求項の主題によって達成される。有利な実施形態は、従属請求項および以下の説明において定義される。
生体試料を分析する方法は、以下のステップを含む：ａ）複数のマーカーを提供するステップであって、各マーカーは、マーカーに固有の蛍光色素と、マーカーに固有の親和性試薬と、を含み、親和性試薬は、試料内の所定の構造に付着するように構成されているステップ。ｂ）複数のマーカーを試料に導入することによって試料を染色するステップ。マーカーの第１のセットの蛍光色素を励起するために、第１の波長スペクトルを有する第１の励起光を試料に向けるステップ。第１のセットの励起色素によって発光された蛍光光から少なくとも１つの第１の画像を生成するステップであって、第１の画像は少なくとも２つのチャネルを含み、各チャネルはマーカーのセットの１つのマーカーに対応するステップ。マーカーの第２のセットの蛍光色素を励起するために、第２の波長スペクトルを有する少なくとも１つの第２励起光を試料に向けるステップであって、第２のセットは第１のセットとは異なるステップ。第２のセットの励起された色素によって発光された蛍光光から少なくとも１つの第２の画像を生成するステップであって、第２の画像は少なくとも２つのチャネルを含み、各チャネルはマーカーの第２のセットの１つのマーカーに対応するステップ。
各マーカーは、その固有の蛍光色素を生体試料内の所定の構造（例えば特定の生体分子）に標的化する。それによって、マーカーは蛍光イメージングで構造を可視化する。複数のマーカーは、少なくとも２つのセット、すなわち、第１の励起光によって励起される蛍光色素を含む第１のセットと、第２の励起光によって励起される蛍光色素を含む少なくとも第２のセットとに分けられる。これは、各セットが異なる励起光によって独立に励起され、したがって、各セットによって発光された蛍光光も独立に検出され得ることを意味する。これは、各々が異なるセットによって発光された蛍光光をキャプチャする、生体試料の少なくとも２つの画像を生成するために使用される。各画像では異なる蛍光色素が励起され、したがって、試料の異なる構造が可視化される。各画像でキャプチャされた蛍光光はさらに異なるチャネルに分けられ、各チャネルは単一のマーカーに対応する。次いで、画像および／またはチャネルを組み合わせて、単一の画像でキャプチャ可能になるであろうより多くのチャネルを含む単一の画像にすることができる。
したがって、上述の方法は、以前のマーカーを除去もしくは不活性化する必要なく、かつ追加で染色することなく、イメージングできるマーカーの数を大いに増加させる。例えば、各セットがｙ個のマーカーを含み、ｎ個の異なる画像を生成するためにｎ個の異なる励起光が使用される場合、イメージングできる固有のマーカーの数はｎ×ｙ個である。さらに、本方法は蛍光顕微鏡に容易に適応され、非常に高い空間分解能で生体試料をイメージングすることができる。
本方法は、試料の追加画像のキャプチャにも容易に適応される。この目的のために、マーカーの追加的なセットの蛍光色素を励起するために、追加的な波長スペクトルを有する追加励起光が試料に向けられる。追加的なセットは他のセットとは異なる。次いで、追加画像は、追加的なセットの励起色素によって発光された蛍光光から生成される。追加画像は少なくとも２つのチャネルを含み、各チャネルはマーカーの追加的なセットの１つのマーカーに対応する。
親和性試薬は、特に、抗体、シングルドメイン抗体（ナノボディとしても知られる）、少なくとも２つのシングルドメイン抗体の組み合わせ、アプタマー、所定の標的配列に相補的なオリゴヌクレオチド、リガンドまたは毒素、例えば、アクチンフィラメントに結合する毒素であるファロイジンであってもよい。
本明細書では、マーカーという語は、マーカーとして使用される単一分子と、マーカーとして使用される同一分子の集合体との両方を示すために使用される。さらに、「蛍光色素」、「フルオロフォア」、「フルオロクロム」という用語は、蛍光性化合物または構造を示すために互換的に使用される。特に、有機蛍光色素、蛍光量子ドット、蛍光炭素ドット、グラフェン量子ドットまたは他の炭素ベースの蛍光ナノ構造体、蛍光タンパク質、蛍光ＤＮＡ折り紙ベースのナノ構造体のうちのいずれか１つである。有機蛍光色素のうち、以下のものの誘導体が特に意味される：キサンテン（例えば、フルオレセイン、ローダミン、オレゴングリーン、テキサス）、シアニン（例えば、シアニン、インドカルボシアニン、オキサカルボシアニン、チアカルボシアニン、メロシアニン）、誘導体、スクアレンロタキサン誘導体、ナフタレン、クマリン、オキサジアゾール、アントラセン（アントラキノン、ＤＲＡＱ５、ＤＲＡＱ７、ＣｙＴＲＡＫ Ｏｒａｎｇｅ）、ピレン（カスケードブルー）、オキサジン（ナイルレッド、ナイルブルー、クレシルバイオレット、オキサジン１７０）、アクリジン（プロフラビン、アクリジンオレンジ、アクリジンイエロー）、アリルメチン（オーラミン、クリスタルバイオレット、マラカイトグリーン）、テトラピロール（ポルフィン、フタロシアニン、ビリルビン）、ジピロメテン（ＢＯＤＩＰＹ、ａｚａ－ＢＯＤＩＰＹ）。以下の商標群は、商業的に入手可能な蛍光色素を指定し、これらは異なる化学ファミリーに属する色素：ＣＦ色素（Biotium社）、ＤＲＡＱおよびＣｙＴＲＡＫプローブ（BioStatus）、ＢＯＤＩＰＹ（Invitrogen社）、ＥｖｅｒＦｌｕｏｒ（Setareh Biotech社）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（Invitrogen社）、Ｂｅｌｌａ Ｆｌｕｏｒｅ（Setareh Biotech社）、ＤｙＬｉｇｈｔ Ｆｌｕｏｒ（Thermo Scientific社）、Ａｔｔｏ ａｎｄ Ｔｒａｃｙ（Sigma-Aldrich社）、ＦｌｕｏＰｒｏｂｅｓ（Interchim社）、Ａｂｂｅｒｉｏｒ Ｄｙｅｓ（Abberior Dyes社）、Ｄｙ ａｎｄ ＭｅｇａＳｔｏｋｅｓ Ｄｙｅｓ（Dyomics社）、Ｓｕｌｆｏ Ｃｙ ｄｙｅｓ（Cyandye社）、ＨｉＬｙｔｅ Ｆｌｕｏｒ（AnaSpec社）、Ｓｅｔａ、ＳｅＴａｕおよびＳｑｕａｒｅ Ｄｙｅｓ（SETA BioMedicals社）、ＱｕａｓａｒおよびＣａｌ Ｆｌｕｏｒ ｄｙｅｓ（Biosearch Technologies社）、ＳｕｒｅＬｉｇｈｔ Ｄｙｅｓ（Columbia Biosciences社）、Ｖｉｏ Ｄｙｅｓ（Milteny Biotec社）を含み得る。前述のリストはen.wikipedia.org/wiki/Fluorophoreから引用した。蛍光タンパク質のグループからは、ＧＦＰおよびＧＦＰ様タンパク質（例えば、ＤｓＲｅｄ、ＴａｇＲＦＰ）を含む緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）ファミリーのメンバー、およびそれらの（単量体化）誘導体（例えば、ＥＢＦＰ、ＥＣＦＰ、ＥＹＦＰ、Ｃｅｒｕｌａｅｎ、ｍＴｕｒｑｕｏｉｓｅ２、ＹＦＰ、ＥＹＦＰ、ｍＣｉｔｒｉｎｅ、Ｖｅｎｕｓ、ＹＰｅｔ、Ｓｕｐｅｒｆｏｌｄｅｒ ＧＦＰ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＰｌｕｍ）が、特に本明細書の意味における「蛍光色素」を意味する。さらに、蛍光タンパク質のグループから、本明細書の意味における「蛍光色素」という用語には、例えばＢＦＰｍｓ１のようにリガンドの結合によって、または例えば酸化還元感受性のｒｏＧＦＰもしくはｐＨ感受性のバリアントのように環境の変化に応答して、吸光度もしくは発光特性が変化する蛍光タンパク質が含まれ得る。蛍光タンパク質のグループからはさらに、本明細書の意味における「蛍光色素」という用語には、シアノバクテリアのフィコビリタンパク質の誘導体である小さな超赤色蛍光タンパク質ｓｍＵＲＦＰだけでなく、ｓｍＵＲＦＰから誘導され得る蛍光タンパク質ナノ粒子も含まれ得る。蛍光タンパク質の概要は、Rodriguez et al. 2017 in Trends Biochem Sci. 2017 Feb; 42(2): 111-129に見出され得る。本明細書の意味における「蛍光色素」という用語は、さらに蛍光量子ドットを指す場合がある。本明細書の意味における「蛍光色素」という用語は、Yan et al. 2019 in Microchimica Acta (2019) 186: 583およびIravani and Varma 2020 in Environ Chem Lett. 2020 Mar 10 : 1-25に記載されるような蛍光炭素ドット、蛍光グラフェン量子ドット、蛍光炭素ベースのナノ構造体をさらに指す場合がある。
好ましい実施形態では、少なくとも１つのマーカーは、マーカーに固有の親和性試薬にコンジュゲートした、マーカーに固有の蛍光色素を含む。親和性試薬は、試料内の所定の構造に付着するように構成されている。蛍光色素を親和性試薬に直接付着させる、例えば化学的に結合させることで、蛍光色素が所定の構造に結合するまでに起こるべき反応の回数を減らす。それによって時間が節約される。さらに、ノイズが減少し、分析に誤差をもたらすことになるであろう交差反応性の可能性が制限される。親和性試薬が抗体またはシングルドメイン抗体の場合、これは一次または直接免疫蛍光法としても知られている。
別の好ましい実施形態では、少なくとも１つのマーカーは、マーカーに固有の蛍光色素、マーカーに固有の一次親和性試薬、およびマーカーに固有の二次親和性試薬を含む。蛍光色素は二次親和性試薬にコンジュゲートしている。一次親和性試薬は、試料内の所定の構造に付着するように構成されている。二次親和性試薬は、一次親和性試薬に付着するように構成されている。このように、複数の二次親和性試薬が単一の一次親和性試薬に付着し、それによって全体のシグナル強度を高め、分析をより信頼性の高いものにすることができる。親和性試薬が抗体またはシングルドメイン抗体の場合、これは二次または間接免疫蛍光法としても知られている。
別の好ましい実施形態では、試料の一連の画像を作成するために、以下のステップを少なくとも２回反復する：試料を染色するステップ。第１の励起光を試料に向けるステップ。第１の画像を生成するステップ。第２の励起光を試料に向けるステップ。第２の画像を生成するステップ。請求項１に定義されるステップは、画像取得の単一のラウンドを説明する。試料の一連の画像を取得するために、追加のラウンドを実行してもよい。特に、一連の後続画像は、経時的に生じる試料の変化を観察するために使用することができる。
別の好ましい実施形態では、本方法はさらに、複数のマーカー、マーカーの少なくとも１つのセット、少なくとも１つのマーカーのうちの少なくとも１つを不活性化するステップを含む。本明細書では、１つ以上のマーカーを不活性化するとは、関連する蛍光色素が将来的に試料から蛍光光を発光するのを防ぐことを意味する。これは、試料から蛍光色素を除去するか、蛍光色素を漂白するかのいずれかによって行うことができる。それによって、異なるマーカーのセットに関連する蛍光色素間のクロストークが大幅に低減する。言い換えれば、マーカーのセットを不活性化することで、前述のセットによってマークされた構造は、将来の画像では可視化されなくなる。これは、例えば、類似の発光スペクトルを有する蛍光色素を後続画像で使用できることを意味し、それによって、単一のラウンド、単一の実験および／または単一の生体試料で使用され得るマーカー全体の数が増加する。
好ましくは、不活性化ステップは、少なくとも１つのマーカーに固有の蛍光色素を漂白すること、少なくとも１つのマーカーを試料から除去することのうちの少なくとも一方によって、好ましくは、蛍光色素を親和性試薬から解離もしくは切断すること、または親和性試薬を標的構造から解離することのうちの少なくとも一方によって行われる。
別の好ましい実施形態では、チャネルを生成するステップは、スペクトルアンミキシング、蛍光色素の蛍光寿命、および蛍光色素の励起フィンガープリントのうちの少なくとも１つに基づいている。スペクトルアンミキシング（スペクトルイメージングおよび線形アンミキシング、またはチャネルアンミキシングとも呼ばれる）は、線形アンミキシング、主成分分析、スペクトルの教師なし手段の学習、サポートベクターマシン、ニューラルネットワーク、（スペクトル）フェーザアプローチ、およびモンテカルロ分離アルゴリズムを含むが、これらに限定されない様々な方法で実行することができる。異なるマーカーに関連する蛍光色素間のクロストークを低減するために、いくつかの手法を採用することができる。アンミキシング技術は、同じ検出チャネルに対する異なる蛍光色素からの寄与、すなわち重複する発光スペクトルによるクロストークを分離するために使用される。これらの技術を採用すると、ノイズが減少することで方法の感度が大幅に向上し得る。さらに、蛍光色素を正しく同定するために、蛍光色素の蛍光寿命および励起フィンガープリントを使用することができる。これを使用して、画像１枚当たりにより多くのマーカーのセットを採用し、すなわち１つのセットにおけるマーカーのセットを増やすことができる。こうして、イメージングできるマーカーの総数が大いに増加する。
別の好ましい実施形態では、本方法はさらに、試料のハイパースペクトル画像をキャプチャするステップを含む。マルチスペクトル画像が、限られた数の波長帯域、典型的には１０未満または１０前後の波長帯域をキャプチャするのとは対照的に、ハイパースペクトル画像はピクセル１個当たり数十または数百の波長帯域をキャプチャする。言い換えれば、ハイパースペクトル画像は非常に高いスペクトル分解能を有する。これにより、蛍光色素の発光スペクトルに基づいて蛍光色素をより細かく区別することができ、それによって方法の感度および信頼性が向上する。
別の好ましい実施形態では、本方法はさらに、第１の励起光の後に第２の励起光を一時的に印加するステップをさらに含む。好ましくは、第１の励起光を適用してから第２の励起光を適用するまでの時間は、第１のセットの蛍光色素の蛍光寿命よりも長い。これにより、第２の画像を生成するために、第２のセットの蛍光色素によって発光された蛍光光のみがキャプチャされることが保証される。それによって、蛍光色素間のクロストークが低減され得、本方法の感度がさらに向上する。
別の好ましい実施形態では、第１の波長スペクトルおよび第２の波長スペクトルのうちの少なくとも一方は、５０ｎｍよりも小さい波長範囲、３０ｎｍよりも小さい波長範囲、１０ｎｍよりも小さい波長範囲または単一波長を含む。これらの波長帯域は、例えば、蛍光顕微鏡で使用される二色性ビームスプリッタやバンドパスフィルタの典型的な範囲である。試料の照明または蛍光色素の励起のために、それぞれの波長スペクトルを生成するために、様々な方法を使用することができる。例えば、波長域をフィルタリングするバンドパスフィルタを、広い波長スペクトルを有する光を発する光源、例えば水銀ランプまたはキセノンランプと組み合わせて使用することができる。代替的に、あるいは追加的に、スーパーコンティニューム白色光を発する白色光レーザを、発光された光の単一波長を選択するためのＡＯＴＦと組み合わせて使用することもできる。
別の好ましい実施形態では、第１および／または第２のサブ複数（sub-pluralities）における各マーカーに固有の蛍光色素は、本質的に１つの波長スペクトルによって、または同じ波長スペクトルによって励起され得る。これにより、単一のサブ複数の蛍光色素を、例えば狭い発光スペクトルを有する単一の光源によって励起することができる。本方法のこの実施形態は、しばしばそのような光源を含む既存の蛍光顕微鏡を用いて容易に実施することができる。
別の好ましい実施形態では、第１および／または第２のサブ複数の各マーカーに固有の蛍光色素は、少なくとも部分的に異なる波長範囲の発光スペクトルを含む。それによって、単一のサブ複数のマーカーのセットは、関連する蛍光色素の発光スペクトルによって別のものと容易に区別することができる。これにより、各画像のチャネルを分離するために必要なアンミキシングの計算負荷が低減または排除され、方法がより高速かつ信頼性の高いものとなる。
別の好ましい実施形態では、少なくとも２つの蛍光色素は、１つのマーカーにそれぞれ固有であり、異なる蛍光寿命を有する。それによって、少なくとも２つの蛍光色素は、その寿命によって別のものと区別することができる。特に、これを利用して、画像１枚当たりのチャネル数を増やし、すなわち画像１枚当たりにより多くのマーカーをキャプチャすることができる。したがって、イメージングできるマーカーの総数が大幅に増加する。さらに、少なくとも２つの蛍光色素の寿命を使用して、イメージングされたマーカーのセットを正しく同定することができ、それによって本方法をよりロバストにすることができる。特に、既存の蛍光色素は、塩基構造を変更するか、蛍光色素を異なる分子環境に置くことによって、同様の励起および／または発光スペクトルを有するが、異なる蛍光寿命を有する誘導体蛍光色素を生成するように設計することができる。
別の好ましい実施形態では、第１および／または第２のセットにおける少なくとも２つの蛍光色素（各々１つのマーカーに固有）は、試料の第１の条件において本質的に同じ波長範囲の発光スペクトルおよび本質的に同じ蛍光寿命を有し、第２の条件において本質的に同じ波長範囲の発光スペクトルおよび実質的に異なる蛍光寿命を含む。第１および第２の条件は、試料の一定のｐＨ値、一定の酸化還元レベル、一定の温度、リガンドの一定の濃度（例えば、以下のＣｕ（ＩＩ）、Ｚｎ（ＩＩ）、小分子のうちの１つの低濃度）であってもよい。
別の好ましい実施形態では、少なくとも１つのマーカー内のマーカーは、セットに固有の非蛍光色素を含む。非蛍光色素は、その特徴的な光吸収挙動によって同定することができる。例えば、マーカーの各セットに対して、例えば、単純な透過光（すなわち、蛍光光ではない）顕微鏡検査において、このマーカーが緑色または赤色に着色された領域として現れるような光吸収特性を有する、１つの非蛍光色素を使用することができる。それによって、１ラウンド当たりに使用できるマーカーの総数がさらに増加する。
本発明はまた、上記の生体試料を分析するための方法を実施するように適合された生体試料を分析するためのデバイスに関する。本デバイスは、方法と同じ利点を有し、方法を対象とした従属請求項の特徴を使用して補足することができる。
好ましい実施形態では、本デバイスは、第１の励起光を発するように構成された第１の光源、および第２の励起光を発するように構成された少なくとも１つの第２の光源のうちの少なくとも１つを含む。代替的に、あるいは追加的に、本デバイスは、第１および第２の励起光を発するように構成された調整可能な光源を含む。好ましくは、第１の励起光および第２の励起光のうちの少なくとも一方はコヒーレント光である。
別の好ましい実施形態では、第１および／または第２の画像を少なくとも２つのチャネルに分離することは、プリズムと少なくとも１つの検出器とを含む分光計または回折格子と少なくとも１つの検出器とを含む分光計のうちの少なくとも一方によって行われる。回折素子を使用して、例えば、異なる波長を単一の検出器の異なる部分に向けることによって、または異なる検出器に向けることによって、キャプチャされた蛍光光を光学的に波長ごとに別個のチャネルに分離することができる。これらのチャネルは検出器のハードウェアによって作成されるので、以下では検出チャネルとも呼ぶ。共焦点走査型顕微鏡用のこのような分光計の配置例は、例えば米国特許第６，６１４，５２６号明細書に開示されている。
別の好ましい実施形態では、第１および／または第２の画像を少なくとも２つのチャネルに分離することは、少なくとも１つの時間指定検出器（time-sensitive detector）によって行われる。このような検出器は、波長スペクトルだけでなく、キャプチャされた蛍光光の到達時間も記録する。それらはまた時間ゲート式、すなわち、時間ゲートと呼ばれる離散的な時間セグメント内のイベントを記録するように構成されることもあり、例えば、キャプチャされた蛍光光の到達時間から寿命情報を決定することが可能になる。それによって、発光スペクトルは著しく重複するが蛍光寿命は異なる蛍光色素を、異なるチャネルに確実に分離することができる。これにより、１つのサブ複数にグループ化できる、すなわち同時にイメージングできるマーカーの数がさらに増加する。
本発明はさらに、上述の生体試料を分析するためのデバイスを含む顕微鏡システムに関する。顕微鏡システムは、好ましくは、レンズレス顕微鏡、ライトフィールド顕微鏡、ワイドフィールド顕微鏡、蛍光ワイドフィールド顕微鏡、ライトシート顕微鏡、走査型顕微鏡、または共焦点走査型顕微鏡である。
以下、図面を参照して具体的な実施形態を説明する。
以下、図面を参照して具体的な実施形態を説明する。
図１は、生体試料１００２を分析する方法のフローチャートである。
プロセスはステップＳ１００で開始される。ステップＳ１０２では、複数のマーカー１６１２が試料１００２に導入される（図１０および図１６を参照のこと）。各マーカー１３００～１３０９，１４００～１４２２，１５００～１５０８，１５１８，１５２６（図１３～図１５ｃを参照のこと）は、生体試料１００２内の所定の構造１７０６～１７１４に付着するように構成された親和性試薬１３１０～１３１９を含む。各マーカー１３００～１３０９，１４００～１４２２，１５００～１５０８，１５１８，１５２６はさらに、蛍光色素１３２０を含む。蛍光色素１３２０は、所定の構造１７０６～１７１４に付着する親和性試薬１３１０～１３１９に直接結合するか、または二次親和性試薬１５１０もしくは１５１４に結合するかのいずれかである。後者の場合、所定の構造１７０６～１７１４に付着する親和性試薬１３１０～１３１９は一次親和性試薬とも呼ばれ、二次親和性試薬１５１０～１５１８は一次親和性試薬１３１０～１３１９に付着するように構成されている。いくつかの例示的なマーカー１３００～１３０９，１４００～１４２２，１５００～１５０８，１５１８，１５２６を、図１３～１５ｃを参照して以下に説明する。親和性試薬１３１０～１３１９または親和性試薬１３１０～１３１９，１５１０～１５１８と、蛍光色素１３２０との両方は、それぞれのマーカー１３００～１３０９，１４００～１４２２，１５００～１５０８，１５１８，１５２６に各々固有であるので、複数のマーカー１６１２内の各マーカー１３００～１３０９，１４００～１４２２，１５００～１５０８，１５１８，１５２６は固有である。それによって、特定のマーカーに関連する所定の構造１７０６～１７１４は、特定のマーカー１３００～１３０９，１４００～１４２２，１５００～１５０８，１５１８，１５２６に固有の蛍光色素１３２０によって同定することができる。全てのマーカー１３００～１３０９，１４００～１４２２，１５００～１５０８，１５１８，１５２６は、少なくとも２つの異なるセット１６１４～１６２０に選別される（図１６を参照のこと）。好ましくは、１つのセット１６１４～１６２０内の全てのマーカー１３００～１３０９，１４００～１４２２，１５００～１５０８，１５１８，１５２６は、著しく重複する励起スペクトルを有する蛍光色素１３２０、すなわち同じ励起光によって励起され得る蛍光色素１３２０を含む。
ステップＳ１０４では、マーカーのセット１６１４～１６２０が続いて励起され、蛍光色素１３２０によって発光された蛍光光がキャプチャされる。各セット１６１４～１６２０からキャプチャされた蛍光光は、各チャネルが単一のマーカー１３００～１３０９，１４００～１４２２，１５００～１５０８，１５１８，１５２６に対応するチャネルにさらに分離される。チャネルへの分離は、光学的に、例えば回折光学系を用いて、かつ／または計算的に、例えばチャネルアンミキシングおよび／またはスペクトルアンミキシングによって行うことができる。光学的に、すなわち計算的ではなく検出器ハードウェアによって作成されるチャネルは、検出チャネルとも呼ばれる。さらに、チャネルへの分離は、例えば時間分解検出器もしくは時間ゲート検出器、または蛍光色素１３２０の励起フィンガープリントの助けを借りて、蛍光寿命に基づいて行うことができる。したがって、１つの特定のセット１６１４～１６２０の蛍光色素１３２０が各々異なる寿命および／または発光スペクトルを有する場合、チャネルに確実に分離することができるマーカー１３００～１３０９，１４００～１４２２，１５００～１５０８，１５１８，１５２６の数を増加させることができる。次いで、分離されたチャネルからの情報／データは、各セット１６１４～１６２０について、試料１００２の１つの画像に結合される。次いで、これらの画像は、ステップＳ１０４においてキャプチャされた全てのチャネルを含む試料１００２の単一の画像にさらに結合され得る。ステップＳ１０４は、図２を参照して以下にさらに詳述される。
任意選択で、画像のキャプチャに続いて、ステップＳ１０６において蛍光色素１３２０が不活性化される。不活性化は、蛍光色素１３２０が将来的に蛍光光を発するのを防止するために行われる。蛍光色素１３２０を不活性化する方法には、蛍光色素１３２０を化学的に不活性化するか、もしくは光物理学的に漂白することのいずれかによって、蛍光色素１３２０を漂白する方法、または蛍光色素１３２０を試料１００２から除去する方法が含まれる。試料１００２から蛍光色素１３２０を除去するためには、一次親和性試薬１３１０～１３１９と所定の構造１７０６～１７１４との間の結合を切断しなければならない。これは、親和性試薬が抗体１３１０～１３１４である場合に、例えば抗体溶出によって行うことができる。代替的に、一次親和性試薬１３１０～１３１９または二次親和性試薬１５１０～１５１８のいずれかから蛍光色素１３２０を除去することもできる。これは、例えば、蛍光色素１３２０と、親和性試薬１３１０～１３１９，１５１０～１５１８とを結合するペプチドまたはオリゴヌクレオチド結合を酵素的に切断することによって行うことができる。また、例えば、オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションおよびバーコード化抗体の使用により、蛍光色素１３２０を親和性試薬１３１０～１３１９，１５１０～１５１８に可逆的に結合させることも可能である。
蛍光色素１３２０が不活性化された後、プロセスはステップＳ１０８で停止されるか、または試料１００２の追加画像をキャプチャするためにステップＳ１０２～Ｓ１０６が反復される。
図２は、図１に示される生体試料１００２を分析する方法のステップＳ１０４をさらに詳細に示すフローチャートである。
プロセスはステップＳ２００で開始される。ステップＳ２０２では、第１の波長スペクトルを有する第１の励起光が試料１００２に向けられる。第１の波長スペクトルは、マーカーの第１のセット１６１４の蛍光色素１３２０が励起されて蛍光光を発するように選択される。次いで、発光された蛍光光は、ステップＳ２０４でキャプチャされ、異なるチャネルに分離される。各チャネルは、単一のマーカー１３００～１３０９，１４００～１４２２，１５００～１５０８，１５１８，１５２６に対応する。これらのチャネルを組み合わせることによって、試料１００２の第１の画像が生成される。ステップＳ２０６では、マーカーの第２のセット１６１６の蛍光色素１３２０を励起するために、第２の波長スペクトルを有する第２の励起光が試料１００２に向けられる。ステップＳ２０６は、ステップＳ２０２の後またはステップＳ２０４の後に時間的に続く。第２のセット１６１６の蛍光色素１３２０によって発光された蛍光光は、ステップＳ２０８においてキャプチャされ、異なるチャネルに分離される。ステップＳ２０８で取得されたチャネルを組み合わせることによって、試料１００２の第２の画像が生成される。励起光を試料１００２に向け、それによって励起された蛍光色素１３２０からの蛍光光をキャプチャするステップは、さらなる励起光およびマーカー１６１８～１６２０のセットについて反復される。ステップＳ２１０では、ｎ番目の波長スペクトルを有するｎ番目の光が試料１００２に向けられる。それによって、ｎ番目のマーカーのセット１６２０の蛍光色素１３２０が励起され、蛍光光を発し始める。この蛍光光は、ステップＳ２１２でキャプチャされ、異なるチャネルに分離され、チャネルは、試料１００２のｎ番目の画像に結合される。このステップに続いて、プロセスはステップＳ２１４で終了する。
図３は、５つの異なる蛍光色素１３２０の励起スペクトルおよび発光スペクトルの２つのダイアグラム３００，３０２を示している。上側のダイアグラムは、５つの蛍光色素１３２０の５つの励起スペクトル３０４～３１２を示している。励起スペクトル３０４～３１２は重複しているが、明確な極大値を有する。したがって、５つの蛍光色素１３２０は、５つの異なる波長スペクトルを有する５つの異なる励起光によって励起され得る。下側のダイアグラムは、５つの蛍光色素１３２０の発光スペクトル３１４～３２２を示している。５本の線３２４が上側のダイアグラム３００と下側のダイアグラム３０２とを結んでおり、下側のダイアグラム３０２における５つの励起スペクトル３０４～３２２の極大値の位置を示している。図３は、励起スペクトル３０４～３２２の極大値と、発光スペクトル３１４～３２２の極大値とが、ストークスシフトによって分離されていることを明瞭に示しており、図３では両頭矢印３２６で示されている。ストークスシフトの量は、図３に示される各蛍光色素１３２０についてほぼ等しい。
図４は、ストークスシフトの量が異なる５つの蛍光色素１３２０の異なる励起スペクトルおよび発光スペクトルの２つのダイアグラム４００，４０２を示す。上側のダイアグラムは、５つの蛍光色素１３２０の５つの励起スペクトルを示している。分かりやすくするために、図４では５つの励起スペクトルを全て単一の参照数字４０４で示している。励起スペクトル４０４は著しく重複しており、それらの極大値は単一の波長付近に集まっている。励起スペクトル４０４の重なりにより、５つの蛍光色素１３２０は、狭い波長スペクトル、または単一波長をも有する単一の励起光で励起され得る。下側のダイアグラム４０２は、５つの蛍光色素１３２０の発光スペクトル４０６～４１４を示している。図４の一本の線４１６は、下側のダイアグラムの５つの励起スペクトル４０４の極大値のおおよその位置を示している。下側のダイアグラム４０２に見られるように、励起スペクトル４０４は著しく重複しているが、５つの蛍光色素１３２０は、ストークスシフトの量が異なるおかげで、明確な発光スペクトル４０６～４１４を有し、ここでも両頭矢印４１８で示されている。異なる発光スペクトル４０６～４１４を使用して、試料１００２の画像を生成するために、５つの蛍光色素１３２０によって発光された蛍光光を５つの別々のチャネルに分離することができる。図４から分かるように、ストークスシフトの量が異なる蛍光色素１３２０を使用して、単一の励起光で複数のチャネルを生成することができる。図１および図２を参照して上述した方法の場合、これは、異なる波長スペクトルを有するｎ個の励起光について、各々がマーカーの単一のセット１６１４～１６２０に関連するｙ個の異なる蛍光色素１３２０を励起することを意味し、確実に区別することができるマーカーの総数はｎ×ｙ個である。
図５は、４つの異なる蛍光色素１３２０の蛍光発光減衰曲線５００～５０６のダイアグラムであり、これは時間指定検出器を用いて記録することができる。第１の軸ｔは蛍光寿命τをｎｓで示し、第２の軸Ｉは強度を任意の単位で示す。減衰曲線５００～５０６は部分的に重複しているが、それらの極大値は異なっている。図５は、同一または類似の発光スペクトルを有する可能性のある４つの異なる蛍光色素１３２０が、時間ゲート検出器によってどのように区別され得るかを示している。時間ゲート検出器は、蛍光寿命ゲートまたはτゲートと呼ばれる時間の離散セグメント内のイベントを記録するように構成されている。図５では、４つの蛍光寿命ゲート５０８～５１４を実線の枠で囲んだ長方形で示している。蛍光寿命は、励起スペクトルまたは発光スペクトルからのスペクトル情報と組み合わせて使用することができる直交情報であり、チャネルに確実に分離することができる蛍光色素１３２０の総数を増加させる。これについては、図６に関連して以下にさらに説明する。
図６は、蛍光寿命によって３つのクラス６１２～６１６にグループ化された１５個の蛍光色素１３２０の異なる励起スペクトルおよび発光スペクトル６０４～６１０の２つのダイアグラム６００，６０２を示している。各クラスは、ストークスシフトの量が異なる５つの蛍光色素１３２０を含む。上側のダイアグラムは、１５個の蛍光色素１３２０の励起スペクトル６０４を示している。分かりやすくするために、図６では、１５個の励起スペクトルを全て単一の参照数字６０４で示している。図４に関連して上述した例と同様に、励起スペクトル６０４は著しく重複しており、それらの極大値は単一の波長の周りに集まっており、１５個の蛍光色素１３２０は全て単一の励起光で励起され得る。下側のダイアグラム６０２は、１５個の蛍光色素１３２０の発光スペクトル６０６～６１０を示している。分かりやすくするために、図６では、１５個の発光スペクトルのうち最初の３個だけが参照数字で示されている。下側のダイアグラム６０２は３つの軸を有する。第１の軸は波長λをｎｍで示し、第２の軸は強度を示し、第３の軸は蛍光寿命τをｎｓで示す。グループ化された蛍光色素１３２０は、蛍光寿命によってグループ化されているので、それらの発光スペクトル６０６～６１０は、第３の軸に沿って３つの異なるクラス６１２～６１６で下側のダイアグラムに現れる。これらの３つのクラス６１２～６１６は、第１の軸および第３の軸によって定義される平面内で実線の枠で囲んだ長方形によって下側のダイアグラムで示され、τゲートと命名することもできる。クラス６１２～６１６は、例えば少なくとも１つの時間指定検出器で分離することができる。このような検出器は、波長スペクトルだけでなく、キャプチャされた蛍光光の到達時間も記録する。代替的に、検出器は時間ゲート式、すなわち蛍光寿命ゲート５０８～５１４内のイベントを記録するように構成されていてもよい。図６では、図５に示される寿命ゲート５０８～５１４が、下側のダイアグラムの実線の枠で囲んだ長方形６１２～６１６に対応している。適切な検出器を用いてクラス６１２～６１６を分離することによって、発光スペクトル６０６～６１０は著しく重複するが蛍光寿命が異なる蛍光色素１３２０、例えば図６で示される、点線の枠で囲んだ長方形６１８を有する３つの色素のグループを、異なるチャネルに確実に分離することができる。図４を参照して上述した例に戻ると、蛍光寿命を追加的な観測値として使用することによって、より多くのマーカーを単一のセット１６１４～１６２０にグループ化することが可能である。各セット１６１４～１６２０は、蛍光寿命によってグループ化されたｔ個のクラスの蛍光色素１３２０を含むことができ、各クラス自体は、単一の励起光によって励起され得るｙ個の異なる蛍光色素１３２０を含み得る。図１および図２を参照して上述した方法の場合、これは、確実に区別することができるマーカーの総数がｎ×ｙ×ｔ個であることを意味する。図４～図６を参照して前述した結果を図７にまとめる。
図７は、上述した方法の異なる実施形態で確実に区別することができるマーカーの総数を示すダイアグラムである。
このダイアグラムは、３つのサブダイアグラム７００～７０４を含み、各サブダイアグラムは、異なる数の検出チャネル、すなわち光学的に分離されたチャネル、励起光、および寿命ゲートについて、区別可能なマーカーの総数１３００～１３０９，１４００～１４２２，１５００～１５０８，１５１８，１５２６を示している。各サブダイアグラムは、上述した方法で区別可能なマーカー１３００～１３０９，１４００～１４２２，１５００～１５０８，１５１８，１５２６の数を、実線の黒色バー７０６～７１０として表示している。各サブダイアグラム７００～７０４は、黒い実線のバーの隣に、実線の境界線を有する白色バー７１２～７１６を示す。白色バー７１２～７１６は、マーカー１３００～１３０９，１４００～１４２２，１５００～１５０８，１５１８，１５２６が検出チャネルによってのみ分離される場合に区別され得るマーカー１３００～１３０９，１４００～１４２２，１５００～１５０８，１５１８，１５２６の数を表示する。
第１のサブダイアグラム７００、すなわち左端のサブダイアグラムは、５つの検出チャネル（ｙ＝５）および５つの励起光（ｎ＝５）に対する区別可能なマーカーの数１３００～１３０９，１４００～１４２２，１５００～１５０８，１５１８，１５２６を示している。上述の方法では、区別可能なマーカーの総数はｎ×ｙ＝２５である。第２のサブダイアグラム７０２、すなわち中央のサブダイアグラムでは、検出チャネルの数は８（ｙ＝８）に増加される。したがって、上述の方法では、区別可能なマーカー１３００～１３０９，１４００～１４２２，１５００～１５０８，１５１８，１５２６の総数はｎ×ｙ＝４０となる。第３のサブダイアグラム７０４、すなわち右端のサブダイアグラムでは、さらに２つの寿命ゲートが使用される（ｔ＝２）。それによって、上述の方法で区別可能なマーカー１３００～１３０９，１４００～１４２２，１５００～１５０８，１５１８，１５２６の総数はｎ×ｙ×ｔ＝８０に増加する。これらの例によって、かつ実線の黒色バー７０６～７１０を白色バー７１２～７１６と比較することによって分かるように、上述の方法は、検出チャネルごとに区別可能なマーカー１３００～１３０９，１４００～１４２２，１５００～１５０８，１５１８，１５２６の数を大幅に増加させる。これは、多数のマーカー１３００～１３０９，１４００～１４２２，１５００～１５０８，１５１８，１５２６の分析が望まれ、反復プロセスによって達成される多重化バイオマーカー分析において特に有利である。例えば、マーカー１３００～１３０９，１４００～１４２２，１５００～１５０８，１５１８，１５２６が検出チャネルによってのみ分離されるとき、本明細書に記載される方法を使用した２ラウンドとは対照的に、対象となる５０個の生体分子をイメージングするには、１０回の反復ステップまたはラウンドが必要である。さらなる寿命ゲートの追加（ｔ＞２）、発光光のより微細なスペクトル分離、励起フィンガープリンティング、物理化学的特性が本明細書に開示された方法に最適化された蛍光色素１３２０の専用セットの使用のうちの少なくとも１つにより、上述の方法で区別可能なマーカー１３００～１３０９，１４００～１４２２，１５００～１５０８，１５１８，１５２６の総数が８０よりも有意に多くなる可能性があることに留意することが重要である。
図８は、市販されている種々の蛍光色素の平均蛍光寿命、溶媒ならびに励起極大および発光極大の位置を示した表である。この図は、http://www.iss.com/resources/reference/data_tables/LifetimeDataFluorophores.htmlから引用した。
図９は、市販されている種々の蛍光色素の蛍光寿命を示したダイアグラムである。この図は、http://www.iss.com/resources/reference/data_tables/LifetimeDataFluorophores.htmlから引用した。図９から分かるように、蛍光寿命によってグループ化され得る蛍光色素１３２０を選択することが可能である。例えば、ほとんどの蛍光色素の寿命は５ｎｓをはるかに下回るが、寿命が５ｎｓを上回り１０ｎｓを下回る２つの色素（ＳｅＴａｕ－４０４－ＮＨＳおよびＳｅＴａｕ－４０５－ＮＨＳ）がある。リストアップされた色素のうち４つ（臭化エチジウム＋ｄｓＤＮＡ／ｓｓＤＮＡ、ＳｅＴａｕ－３８０－ＮＨＳ、およびＳｅＴａｕ－４２５－ＮＨＳ）は１０ｎｓをはるかに上回る寿命を有する。この非常に限られたリストからでさえ、少なくとも３つの異なるクラスを選択することができる。この点で、蛍光色素の蛍光寿命は、蛍光色素１３２０の塩基構造にさらなる基を追加することによって、または環境を変化させることによって変更できることを知っておくことは重要である。励起スペクトルおよび発光スペクトルの点では類似のスペクトル特性を有するが、蛍光寿命の点で異なる蛍光色素１３２０のセットを生成するために、両方の戦略が採用され得る。本明細書に記載される方法で機能するように最適化された蛍光色素１３２０は、このようにして生成することができる。
図１０は、生体試料１００２を分析するためのデバイス１０００の概略図を示している。特に、デバイス１０００は、図１～図９を参照して上述した生体試料１００２を分析するための方法を実行することができる。図１０において、デバイス１０００は、顕微鏡システム１００４の一部であることが例示的に示されている。
デバイス１０００は、複数のマーカー１６１２を試料１００２に導入するための染色ユニット１００６を含む。そのために、染色ユニット１００６は、自動化されていてもいなくてもよい１つ以上のピペットを含んでいてもよい。デバイス１０００はまた、蛍光色素１３２０を励起するための励起ユニット１００８を含む。励起ユニット１００８は、少なくとも１つの光源、好ましくはコヒーレント光源を含む。少なくとも１つの光源は、マーカーの各セット１６１４～１６２０に関連する励起光を発するように構成されている。異なる波長または波長スペクトルの励起光を発光するために、光源は調整可能な光源であってもよい。代替的に、デバイス１０００は、異なる波長または波長スペクトルの光を発光する２つ以上の光源を含んでいてもよい。図１０に示される実施形態では、励起ユニット１００８によって発光された励起光は、ビーム分割ユニット１０１０によって試料１００２に向けられる。
デバイス１０００のイメージングユニット１０１２は、励起色素１３１０によって発光された蛍光光から画像を生成するように構成されている。イメージングユニット１０１２は、蛍光光をキャプチャするために試料１００２に向けられた対物レンズ１０１４を含む。次いで、キャプチャされた蛍光光は、ビーム分割ユニット１０１０によって検出ユニット１０１６に向けられる。検出ユニット１０１６は、蛍光光を異なる検出チャネルに分割するための少なくとも１つの検出素子と回折素子とを含む。検出ユニット１０１６については、図１１および図１２に関連して以下でさらに詳細に説明する。
試料１００２をイメージングした後、蛍光色素１３２０を不活性化する必要がある場合がある。これは、例えば、励起ユニット１００８の光源の少なくとも１つによって発光されるコヒーレント光で蛍光色素１３２０を光漂白することによって行うことができる。代替的に、蛍光色素１３２０を化学的に不活性化するための漂白剤を、染色ユニット１００６を用いて試料１００２に導入することもできる。さらに、一次または二次親和性試薬１５１０～１５１８のいずれかから蛍光色素１３２０を除去することも可能である。これは、例えば、染色ユニット１００６を用いて試料１００２に酵素切断剤を導入することによって行うことができる。代替的に、あるいは追加的に、蛍光色素１３２０は抗体溶出によって、または蛍光標識オリゴヌクレオチド１３０９の場合には脱ハイブリダイゼーション（すなわち融解）および溶出によって不活性化されてもよい。したがって、励起ユニット１００８および／または染色ユニット１００６は、試料１００２中に存在するマーカーの少なくとも１つのセット１６１４～１６２０を不活性化するように構成されたマーカー不活性化ユニットを形成する。
デバイス１０００はさらに、染色ユニット１００６、励起ユニット１００８および検出ユニット１０１６に接続されたプロセッサ１０１８を含む。プロセッサ１０１８は、生体試料１００２を分析するための方法を実行するために、デバイス１０００の素子を制御するように構成されている。特に、プロセッサ１０１８は、少なくとも１つのユーザ入力に基づいて方法を実行するように構成されている。
図１１は、図１０によるデバイス１０００のイメージングユニット１１００の実施形態の概略図である。本実施形態によるイメージングユニット１１００は、６つの検出器素子１１０２とプリズム１１０４とを含む。プリズム１１０４は、入射蛍光光１１０６を分割し、それをその波長に従って検出器素子１１０２に向ける。それによって、入射蛍光光１１０６は、波長によって６つの検出チャネルに分離される。
図１２は、図１０によるデバイス１０００のイメージングユニット１２００の別の実施形態の概略図である。本実施形態によるイメージングユニット１２００は、６つの検出器素子１２０２と回折格子１２０４とを含む。この実施形態では、回折格子１２０４は、入射蛍光光１１０６を分割し、それをその波長に従って検出器素子１２０２に導く回折素子として作用する。それによって、入射蛍光光１１０６は、波長によって６つの検出チャネルに分離される。
図１３は、各々が親和性試薬１３１０～１３１９と蛍光色素１３２０とを含む６つのマーカー１３００～１３０９の概略図である。マーカー１３００～１３０９を、左から右に第１～第６のマーカーと称する。
第１のマーカー１３００は、その親和性試薬としてシングルドメイン抗体１３１０（ナノボディとも呼ばれる）を含む。このようなシングルドメイン抗体１３１０は、ラクダ科の種だけでなく特定の軟骨魚類に天然に存在する。また、それらは通常の抗体１３１４から生物工学的に作製することもできる。それらは通常の抗体１３１４と比較して、分子量はずっと低くなる。第２のマーカー１３０２は、その親和性試薬として２つのシングルドメイン抗体１３１２の組み合わせを含む。このような組み合わせ１３１２は、他の方法では得られない特異的親和性（二重特異的反応性）を達成するために、またはアビディティを増加させるために操作することができる。本明細書の意味において１３１２は、二量体のみならず、多量体化されたシングルドメイン抗体一般を表すものとする。第３のマーカー１３０４は、その親和性試薬として通常の抗体１３１４を含む。３つのマーカー１３００～１３０４は、いずれも抗原の特定の所定のエピトープ１７０６～１７１０に結合する（図１７を参照のこと）。第４のマーカー１３０６は、親和性試薬としてアプタマー１３１６を含む。第５のマーカー１３０８は、親和性試薬としてオリゴヌクレオチド配列１３１８を含む。アプタマー１３１６とオリゴヌクレオチド配列１３１８との両方は、所定の標的配列１７１２，１７１４（図１７を参照のこと）に相補的であり、それに付着する。第６のマーカーは、その親和性試薬としてリガンド、例えば薬物分子または毒素１３１９、例えば、アクチンフィラメントに結合する毒素であるファロイジンを有する。
図１４は、１２個のマーカー１４００～１４２２の概略図であり、各々は、親和性試薬１３１０～１３１６と、二次親和性試薬の標的として使用される親和性タグ１４３８～１４４２と、を含み、これは、蛍光色素によって直接標識されるか、蛍光色素コンジュゲート三次親和性試薬によって認識されるか、または図１５ｂおよび１５ｃに示されるようにオリゴヌクレオチドバーコードもしくは標識増幅用酵素を担持するかのいずれかである。マーカー１４００～１４２２は、上から下に１行目から３行目までラベル付けされた３つの行１４２４～１４２８と、左から右に１列目から４列目までラベル付けされた４つの列１４３０～１４３６に配置される。
同じ列１４３０～１４３６の３つのマーカーは同じ親和性試薬１３１０～１３１６を含み、同じ行１４２４～１４２８のマーカーは同じ親和性タグ１４３８～１４４２を含む。１列目１４３０におけるマーカー１４００～１４０４は、その親和性試薬としてシングルドメイン抗体１３１０を含む。２列目１４３２におけるマーカー１４０６～１４１０は、その親和性試薬としてシングルドメイン抗体１３１２の二量体または多量体を含む。３列目１４３４におけるマーカー１４１２～１４１６は、その親和性試薬として通常の抗体１３１４を含む。４列目１４３６のマーカーは、その親和性試薬としてアプタマー１３１６を含む。１行目１４２４におけるマーカーは、その親和性タグとしてオリゴヌクレオチドバーコード１４３８を含む。２行目１４２６におけるマーカーは、その親和性タグとしてペプチドタグ１４４０を含む。３行目１４２８におけるマーカーは、その親和性タグとしてハプテンタグ１４４２を含む。
図１５ａは、各々が一次親和性試薬１３１０～１３１４、二次親和性試薬１５１０～１５１６、および蛍光色素１３２０を含む５つのマーカーの概略図である。マーカーは、左から右に第１～第５のマーカーと呼ぶ。
第１のマーカー１５００は、一次親和性試薬としてのシングルドメイン抗体１３１０と、二次親和性試薬としての別のシングルドメイン抗体１５１０と、を含む。別のシングルドメイン抗体１５１０は、蛍光色素１３２０とコンジュゲートしている。第２～第５のマーカー１５０２～１５０８，１５１８，１５２６は各々、一次親和性試薬として通常の抗体１３１４を含む。第２のマーカー１５０２は、二次親和性試薬として蛍光色素１３２０とコンジュゲートしたシングルドメイン抗体１５１０を含む。第３のマーカー１５０４の二次親和性試薬は、オリゴヌクレオチドバーコード１４３８を有するシングルドメイン抗体１５１２である。蛍光色素１３２０は、バーコードと相補的なオリゴヌクレオチド１３０８に付着している。第４および第５のマーカー１５０６，１５０８は各々、二次親和性試薬として通常の抗体１５１４，１５１６を含む。第４のマーカー１５０６の蛍光色素１３２０は抗体１５１４に直接付着しており、第５のマーカー１５０８の蛍光色素１３２０は、オリゴヌクレオチドバーコード１４３８を介して抗体１５１６に付着している。
代替的に、あるいは追加的に、蛍光色素１３２０は、一次親和性試薬１３１４または１３０８と結合する二次親和性試薬１５１２および１５１６と結合する三次親和性試薬と結合してもよい。
図１５ｂは、蛍光シグナルがイムノローリングサークリング増幅によって増幅されるマーカー１５１８の概略図を示す。二次親和性試薬１５１６はオリゴヌクレオチドバーコード１４３８を含む。環状配列１５２０がオリゴヌクレオチドバーコード１４３８に結合されている。ローリングサークル増幅反応を開始した後、バーコード１４３８のオリゴヌクレオチド配列は増幅され、すなわち繰り返し複製されて、オリゴヌクレオチドバーコード１４３８の複数のコピーを含むＤＮＡ１５２２の長い鎖を形成する。次いで、このコピーは、複数の蛍光標識オリゴヌクレオチド１５２４と結合する。
図１５ｃは、触媒レポーター沈着と呼ばれるプロセスにおける酵素反応の例として、蛍光シグナルがチラミドシグナル増幅によって増幅されるマーカー１５２６を示す。マーカー１５２６は、ラディッシュペルオキシダーゼ酵素１５３０を有する二次親和性試薬１５２８を含む。ラディッシュペルオキシダーゼ酵素１５３０は、蛍光色素１３２０に共有結合しているチラミド１５３２をチラミドラジカル１５３４に変換し、このチラミドラジカルは半減期が非常に短く、標的タンパク質または別の所定の構造１７０６～１７１４のチロシン側鎖１５３６に迅速にカップリングする。
図１６ａは、２つの蛍光色素１３２０ａ，１３２０ｂを示している。各蛍光色素１３２０ａ，１３２０ｂは、実線の境界線を有する円１６００，１６０２として描かれている。各円１６００，１６０２は、異なるハッチングを施した２つの半円１６０４～１６１０に分割されている。左半円１６０４，１６０８のハッチングの種類は、それぞれの蛍光色素１３２０ａ，１３２０ｂが励起可能な励起光を示し、すなわち、ハッチングが同じ種類の左半円１６０４，１６０８を有する蛍光色素１３２０ａ，１３２０ｂは、同じ波長スペクトルまたは同じ単一波長を有する励起光で励起可能である。右半円１６０６，１６１０のハッチングの種類は、蛍光色素１３２０ａ，１３２０ｂを同定するために使用することができるそれぞれの蛍光色素１３２０ａ，１３２０ｂの特徴的な特性を示す。特性には、例えば、それぞれの蛍光色素１３２０ａ，１３２０ｂの発光スペクトル、蛍光寿命、および励起フィンガープリントが含まれる。これは、ハッチングが同じ種類の右半円１６０６，１６１０を有する蛍光色素１３２０ａ，１３２０ｂが、同じまたは本質的に同じであり、すなわち区別できない特徴を有する。
図１６ｂは複数のマーカー１６１２を示す。複数のマーカー１６１２はさらにｎ組のマーカー１６１４～１６２０に分割される。分かりやすくするために、図１６には、第１のセット１６１４、第２のセット１６１６、第３のセット１６１８、および第ｎのセット１６２０のみが示されている。各セット１６１４～１６２０はｙ個のマーカーを含み、そのうち最初の４つのマーカーとｙ番目のマーカーのみが図６に示されている。
分かりやすくするために、単一のマーカー１６２２にのみ参照符号が付されている。１つのセット１６１４～１６２０内の全てのマーカー１６２２は、同じ波長スペクトルまたは同じ単一波長を有する励起光で励起され得る。これは、単一のセット１６１４～１６２０の全ての蛍光色素１３２０が、ハッチングが同じ種類の左半円１６０４，１６０８（図１６ａを参照のこと）を有することによって、図１６ｂに描かれている。これとは逆に、１つのセット１６１４～１６２０内の全てのマーカー１６２２は、それらの発光スペクトル、蛍光寿命、励起フィンガープリントのうちの少なくとも１つに基づいて、ステップＳ１０４のデータ取得に使用されるイメージングシステムによって区別することができる。はっきりと区別可能なマーカーの最大数ｙは、蛍光色素１３２０の特性、およびステップＳ１０４におけるデータ取得に使用されるイメージングシステムの特徴（利用可能な検出チャネルの数、スペクトル分解能、ならびに時間指定検出およびパルス光源の利用可能性を含むが、これらに限定されない）に依存する。
これは、単一のセット１６１４～１６２０の全ての蛍光色素１３２０が、ハッチングのタイプが異なる右半円１６０６，１６１０（図１６ａを参照のこと）を有することによって、図１６ｂに描かれている。さらに、示された全てのマーカー１６２２は、それぞれのマーカー１６２２に固有の特異的構造１７０６～１７１４に結合する親和性試薬１６２４を含む。これは、各親和性試薬１６２４が異なるタイプのハッチングを有することによって、図１６ｂに描かれている。
図１７は、生体試料１００２の一例としての全細胞１７００の概略図である。この細胞は核１７０２および細胞質１７０４を含み、各々が、抗体が付着するエピトープ１７０６，１７０８，１７１０として知られる構造を含む。これは、核１７０２および細胞質１７０４にそれぞれ位置するエピトープ１７０６に結合するシングルドメイン抗体１３００を含む２つのマーカー１４０２について例示的に示されている。両方のシングルドメイン抗体１３００は、同じ蛍光色素１３２０の分子にコンジュゲートしており、したがってマーカーの同じセット１６１４～１６２０に属している。別のマーカー１３０４は、同じ蛍光色素１３２０の２分子にコンジュゲート単一抗体１３１４を含む。このマーカー１７０４は細胞質１７０４のエピトープ１７０８に付着している。さらに別のマーカー１５０６は、同じ蛍光色素１３２０の２分子にコンジュゲートした一次抗体１３１４および二次抗体１５１４を含む。一次抗体１３１４は細胞質１７０４のエピトープ１７１０に付着しており、二次抗体１５１４は一次抗体１３１４に付着している。さらに、図１７は、蛍光標識オリゴヌクレオチド配列１３０９を含む２つのマーカー１３０９を親和性試薬として示している。これら２つのマーカー１３０９は、各々相補配列１７１２，１７１４に付着している。これら２つのマーカー１３０９うちの第１は、細胞質１７０４のＲＮＡ配列１７１２に付着している。２つのマーカー１３０９のうちの第２のマーカーは、核１７０２のＤＮＡ配列１７１４に付着している。毒素１３１９（例えばファロイジン）を親和性試薬として含むマーカー１３０９は、アクチンフィラメント１７１６に付着している。
本明細書で使用されるように、用語「および／または（かつ／または）」は、関連する記載項目のうちの１つまたは複数の項目のあらゆる全ての組み合わせを含んでおり、「／」として略記される場合がある。
いくつかの態様を装置の文脈において説明してきたが、これらの態様が、対応する方法の説明も表していることが明らかであり、ここではブロックまたは装置がステップまたはステップの特徴に対応している。同様に、ステップの文脈において説明された態様は、対応する装置の対応するブロックまたは項目または特徴の説明も表している。
３００，３０２ ダイアグラム
３０４，３０６，３０８，３１０，３１２ スペクトル
３１４，３１６，３１８，３２０，３２２ スペクトル
３２４ 線
３２６ 矢印
４００，４０２ ダイアグラム
４０４，４０６，４０８，４１０，４１２，４１４ スペクトル
４１６ 線
４１８ 矢印
５００，５０２，５０４，５０６ 減衰曲線
５０８，５１０，５１２，５１４ 寿命ゲート
６００，６０２ ダイアグラム
６０４，６０６，６０８，６１０ スペクトル
６１２，６１４，６１６ クラス
６１８ グループ
７００，７０２，７０４ ダイアグラム
７０６，７０８，７１０，７１２，７１４，７１６ バー
１０００ デバイス
１００２ 試料
１００４ 顕微鏡システム
１００６ 染色ユニット
１００８ 励起ユニット
１０１０ ビーム分割ユニット
１０１２ イメージングユニット
１０１４ 対物レンズ
１０１６ 検出ユニット
１０１８ プロセッサ
１１００ イメージングユニット
１１０２ 検出素子
１１０４ プリズム
１１０６ 蛍光光
１２００ イメージングユニット
１２０２ 検出素子
１２０４ 回折格子
１３００～１３０９ マーカー
１３１０，１３１２，１３１４ 抗体
１３１６ アプタマー
１３１８ オリゴヌクレオチド
１３１９ 毒素
１３２０ 蛍光色素
１４００～１４２２ マーカー
１４２４，１４２６，１４２８ 線
１４３０，１４３２，１４３４，１４３６ カラム
１４３８ オリゴヌクレオチドバーコード
１４４０ ペプチドタグ
１４４２ ハプテンタグ
１５００，１５０２，１５０４，１５０６，１５０８ マーカー
１５１０，１５１２，１５１４，１５１６ 抗体
１５１８ マーカー
１５２０ 配列
１５２２ ＤＮＡ
１５２４ オリゴヌクレオチド
１５２６ マーカー
１５２８ 親和性試薬
１５３０ ラディッシュペルオキシダーゼ酵素
１５３２ チラミド
１５３４ チラミドラジカル
１５３６ チロシン側鎖
１６００，１６０２ サークル
１６０４，１６０６，１６０８，１６１０ 半円
１６１２ 複数
１６１４，１６１６，１６１８，１６２０ セット
１６２２ マーカー
１６２４ 親和性試薬
１７００ 細胞
１７０２ 核
１７０４ 細胞質
１７０６，１７０８，１７１０ エピトープ
１７１２ ＤＮＡ配列
１７１４ ＲＮＡ配列
１７１６ アクチンフィラメント
３０４，３０６，３０８，３１０，３１２ スペクトル
３１４，３１６，３１８，３２０，３２２ スペクトル
３２４ 線
３２６ 矢印
４００，４０２ ダイアグラム
４０４，４０６，４０８，４１０，４１２，４１４ スペクトル
４１６ 線
４１８ 矢印
５００，５０２，５０４，５０６ 減衰曲線
５０８，５１０，５１２，５１４ 寿命ゲート
６００，６０２ ダイアグラム
６０４，６０６，６０８，６１０ スペクトル
６１２，６１４，６１６ クラス
６１８ グループ
７００，７０２，７０４ ダイアグラム
７０６，７０８，７１０，７１２，７１４，７１６ バー
１０００ デバイス
１００２ 試料
１００４ 顕微鏡システム
１００６ 染色ユニット
１００８ 励起ユニット
１０１０ ビーム分割ユニット
１０１２ イメージングユニット
１０１４ 対物レンズ
１０１６ 検出ユニット
１０１８ プロセッサ
１１００ イメージングユニット
１１０２ 検出素子
１１０４ プリズム
１１０６ 蛍光光
１２００ イメージングユニット
１２０２ 検出素子
１２０４ 回折格子
１３００～１３０９ マーカー
１３１０，１３１２，１３１４ 抗体
１３１６ アプタマー
１３１８ オリゴヌクレオチド
１３１９ 毒素
１３２０ 蛍光色素
１４００～１４２２ マーカー
１４２４，１４２６，１４２８ 線
１４３０，１４３２，１４３４，１４３６ カラム
１４３８ オリゴヌクレオチドバーコード
１４４０ ペプチドタグ
１４４２ ハプテンタグ
１５００，１５０２，１５０４，１５０６，１５０８ マーカー
１５１０，１５１２，１５１４，１５１６ 抗体
１５１８ マーカー
１５２０ 配列
１５２２ ＤＮＡ
１５２４ オリゴヌクレオチド
１５２６ マーカー
１５２８ 親和性試薬
１５３０ ラディッシュペルオキシダーゼ酵素
１５３２ チラミド
１５３４ チラミドラジカル
１５３６ チロシン側鎖
１６００，１６０２ サークル
１６０４，１６０６，１６０８，１６１０ 半円
１６１２ 複数
１６１４，１６１６，１６１８，１６２０ セット
１６２２ マーカー
１６２４ 親和性試薬
１７００ 細胞
１７０２ 核
１７０４ 細胞質
１７０６，１７０８，１７１０ エピトープ
１７１２ ＤＮＡ配列
１７１４ ＲＮＡ配列
１７１６ アクチンフィラメント
Claims (21)
- 生体試料（１００２）を分析する方法であって、
ａ）複数のマーカー（１６１２）を提供するステップであって、各マーカー（１３００～１３０９，１４００～１４２２，１５００～１５０８，１５１８，１５２６）は、前記マーカーに固有の蛍光色素（１３２０）と、前記マーカー（１３００～１３０９，１４００～１４２２，１５００～１５０８，１５１８，１５２６）に固有の親和性試薬（１３１０～１３１９）と、を含み、前記親和性試薬（１３１０～１３１９）は、前記試料（１００２）内の所定の構造（１７０６～１７１４）に付着するように構成されているステップと、
ｂ）前記複数のマーカー（１６１２）を前記試料（１００２）に導入することによって、前記試料（１００２）を染色するステップと、
ｃ）マーカーの第１のセット（１６１４）の前記蛍光色素（１３２０）を励起するために、第１の波長スペクトルを有する第１の励起光を前記試料（１００２）に向けるステップと、
ｄ）前記第１のセット（１６１４）の励起された色素によって発光された蛍光光から少なくとも１つの第１の画像を生成するステップであって、前記第１の画像は、少なくとも２つのチャネルを含み、各チャネルは、前記マーカーの第１のセット（１６１４）のうちの１つのマーカー（１３００～１３０９，１４００～１４２２，１５００～１５０８，１５１８，１５２６）に対応するステップと、
ｅ）マーカーの第２のセット（１６１６）の前記蛍光色素（１３２０）を励起するために、第２の波長スペクトルを有する少なくとも１つの第２の励起光を前記試料（１００２）に向けるステップであって、前記第２のセット（１６１６）は、前記第１のセット（１６１４）とは異なるステップと、
ｆ）前記第２のセット（１６１６）の励起された色素によって発光された蛍光光から少なくとも１つの第２の画像を生成するステップであって、前記第２の画像は、少なくとも２つのチャネルを含み、各チャネルは、前記マーカーの第２のセット（１６１６）のうちの１つのマーカー（１３００～１３０９，１４００～１４２２，１５００～１５０８，１５１８，１５２６）に対応するステップと、
を含む方法。 - 少なくとも１つのマーカー（１３００～１３０９，１４００～１４２２，１５００～１５０８，１５１８，１５２６）は、前記マーカー（１３００～１３０９，１４００～１４２２，１５００～１５０８，１５１８，１５２６）に固有の親和性試薬（１３１０～１３１９）にコンジュゲートした、前記マーカー（１３００～１３０９，１４００～１４２２，１５００～１５０８，１５１８，１５２６）に固有の少なくとも１つの蛍光色素（１３２０）を含み、前記親和性試薬（１３１０～１３１９）は、前記試料（１００２）内の所定の構造（１７０６～１７１４）に付着するように構成されている、
請求項１記載の方法。 - 少なくとも１つのマーカー（１３００～１３０９，１４００～１４２２，１５００～１５０８，１５１８，１５２６）は、前記マーカー（１３００～１３０９，１４００～１４２２，１５００～１５０８，１５１８，１５２６）に固有の少なくとも１つの蛍光色素（１３２０）と、前記マーカー（１３００～１３０９，１４００～１４２２，１５００～１５０８，１５１８，１５２６）に固有の一次親和性試薬（１３１０～１３１９）と、前記マーカー（１３００～１３０９，１４００～１４２２，１５００～１５０８，１５１８，１５２６）に固有の二次親和性試薬（１５１０～１５１８）と、を含み、前記少なくとも１つの蛍光色素（１３２０）は、前記二次親和性試薬（１５１０～１５１８）にコンジュゲートしており、前記一次親和性試薬（１３１０～１３１９）は、前記試料（１００２）内の所定の構造（１７０６～１７１４）に付着するように構成されており、前記二次親和性試薬（１５１０～１５１８）は、前記一次親和性試薬（１３１０～１３１９）に付着するように構成されている、
請求項１または２記載の方法。 - 前記方法は、前記複数のマーカー（１６１２）、マーカーの少なくとも１つのセット（１６１４～１６２０）および少なくとも１つのマーカー（１３００～１３０９，１４００～１４２２，１５００～１５０８，１５１８，１５２６）のうちの少なくとも１つを不活性化するさらなるステップを含む、
請求項１から３までのいずれか１項記載の方法。 - 不活性化する前記ステップは、前記少なくとも１つのマーカー（１３００～１３０９，１４００～１４２２，１５００～１５０８，１５１８，１５２６）に固有の前記蛍光色素（１３２０）を漂白することと、前記少なくとも１つのマーカーを前記試料（１００２）から除去することとのうちの少なくとも一方によって行われ、好ましくは、前記蛍光色素（１３２０）を前記親和性試薬（１３１０～１３１９）から解離もしくは切断すること、または、前記親和性試薬（１３１０～１３１９）を標的構造から解離することのうちの少なくとも一方によって行われる、
請求項４記載の方法。 - 前記試料（１００２）の一連の画像を作成するために、以下のステップ、すなわち、
追加的な複数のマーカー（１６１２）を提供するステップと、
前記追加的な複数のマーカー（１６１２）を前記試料（１００２）に導入することによって前記試料（１００２）を染色するステップと、
マーカーの別の第１のセット（１６１４）の前記蛍光色素（１３２０）を励起するために、前記第１の励起光を前記試料（１００２）に向けるステップと、
前記別の第１のセット（１６１４）の励起された色素によって発光された蛍光光から別の第１の画像を生成するステップであって、前記別の第１の画像は、少なくとも２つのチャネルを含み、各チャネルは、前記マーカーの別の第１のセット（１６１４）のうちの１つのマーカー（１３００～１３０９，１４００～１４２２，１５００～１５０８，１５１８，１５２６）に対応するステップと、
が少なくとも２回反復されるか、または、
請求項１のステップａ）～ｄ）が少なくとも２回反復される、
請求項４および５記載の方法。 - 前記試料（１００２）の一連の画像を作成するために、以下のステップ、すなわち、
マーカーの別の第２のセット（１６１４）の前記蛍光色素（１３２０）を励起するために、前記第２の励起光を前記試料（１００２）に向けるステップと、
前記別の第２のセット（１６１４）の励起された色素によって発光された蛍光光から別の第２の画像を生成するステップであって、前記別の第２の画像は、少なくとも２つのチャネルを含み、各チャネルは、前記マーカーの別の第２のセット（１６１４）のうちの１つのマーカー（１３００～１３０９，１４００～１４２２，１５００～１５０８，１５１８，１５２６）に対応するステップと、
が少なくとも２回反復されるか、または
請求項１のステップｅ）およびｆ）が少なくとも２回反復される、
請求項６記載の方法。 - 前記チャネルを生成するステップは、チャネルアンミキシング、スペクトルアンミキシング、前記蛍光色素（１３２０）の蛍光寿命および前記蛍光色素（１３２０）の励起フィンガープリントのうちの少なくとも１つに基づいている、
請求項１から７までのいずれか１項記載の方法。 - 前記方法は、前記試料（１００２）のハイパースペクトル画像をキャプチャするさらなるステップを含む、
請求項１から８までのいずれか１項記載の方法。 - 前記方法は、前記第１の励起光の後に前記第２の励起光を一時的に印加するさらなるステップを含む、
請求項１から９までのいずれか１項記載の方法。 - 前記第１の波長スペクトルおよび前記第２の波長スペクトルのうちの少なくとも一方は、５０ｎｍよりも小さい波長範囲、３０ｎｍよりも小さい波長範囲、１０ｎｍよりも小さい波長範囲または単一波長を含む、
請求項１から１０までのいずれか１項記載の方法。 - 前記マーカーの第１および／または第２のセット（１６１４，１６１６）における各マーカー（１３００～１３０９，１４００～１４２２，１５００～１５０８，１５１８，１５２６）に固有の前記蛍光色素（１３２０）は、本質的に１つの波長スペクトルによってまたは同じ波長スペクトルによって励起され得る、
請求項１から１１までのいずれか１項記載の方法。 - 前記マーカーの第１および／または第２のセット（１６１４，１６１６）における各マーカー（１３００～１３０９，１４００～１４２２，１５００～１５０８，１５１８，１５２６）に固有の前記蛍光色素（１３２０）は、少なくとも部分的に異なる波長範囲の発光スペクトルを含む、
請求項１から１２までのいずれか１項記載の方法。 - １つのマーカー（１３００～１３０９，１４００～１４２２，１５００～１５０８，１５１８，１５２６）にそれぞれ固有の少なくとも２つの蛍光色素（１３２０）は、異なる蛍光寿命を有する、
請求項１から１３までのいずれか１項記載の方法。 - 少なくとも１つのマーカーは、前記マーカー（１３００～１３０９，１４００～１４２２，１５００～１５０８，１５１８，１５２６）に固有の非蛍光色素（１４３８～１４４２）を含む、
請求項１から１４までのいずれか１項記載の方法。 - 請求項１から１４までのいずれか１項記載の方法を実施するように適合された、生体試料（１００２）を分析するためのデバイス（１０００）。
- 前記デバイス（１０００）は、前記第１の励起光を発光するように構成された第１の光源と、前記第２の励起光を発光するように構成された少なくとも１つの第２の光源と、前記第１および第２の励起光を発光するように構成された調整可能な光源と、のうちの少なくとも１つを含む、
請求項１６記載のデバイス（１０００）。 - 前記第１の励起光および前記第２の励起光のうちの少なくとも一方は、コヒーレント光である、
請求項１７記載のデバイス（１０００）。 - 前記第１および／または第２の画像を前記少なくとも２つのチャネルに分離することは、プリズム（１１０４）と少なくとも１つの検出器（１２０２）とを含む分光計または回折格子（１２０４）と少なくとも１つの検出器（１２０２）とを含む分光計のうちの少なくとも一方によって行われる、
請求項１６または１７記載のデバイス（１０００）。 - 前記第１および／または第２の画像を前記少なくとも２つのチャネルに分離することは、少なくとも１つの時間指定検出器によって行われる、
請求項１６から１８までのいずれか１項記載のデバイス（１０００）。 - 請求項１６から２０までのいずれか１項記載のデバイス（１０００）を含む顕微鏡システム（１００４）であって、
前記顕微鏡システム（１００４）は、好ましくは、レンズレス顕微鏡、ライトフィールド顕微鏡、ワイドフィールド顕微鏡、蛍光ワイドフィールド顕微鏡、ライトシート顕微鏡、走査型顕微鏡または共焦点走査型顕微鏡である、
顕微鏡システム（１００４）。
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