ES2968004T3 - Construcción de bibliotecas de sondas - Google Patents

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Abstract

La presente invención se refiere en general a sistemas y métodos para producir ácidos nucleicos. En algunos aspectos, se pueden producir cantidades relativamente grandes de oligonucleótidos y, en algunos casos, los oligonucleótidos pueden tener una variedad de secuencias y/o longitudes diferentes. Por ejemplo, se puede amplificar una cantidad relativamente pequeña de oligonucleótidos para producir una gran cantidad de nucleótidos. En un conjunto de realizaciones, los oligonucleótidos pueden amplificarse mediante PCR y luego transcribirse para producir ARN. A continuación, el ARN se puede transcribir de forma inversa para producir ADN y, opcionalmente, el ARN se puede degradar o eliminar selectivamente, con respecto al ADN. En un conjunto de realizaciones, los oligonucleótidos pueden modificarse químicamente. Estas modificaciones pueden incluir, entre otras, la adición de tintes fluorescentes u otras entidades de señalización. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Construcción de bibliotecas de sondas
Campo
La presente invención se refiere en general a un método para producir ácidos nucleicos.
Antecedentes
Las sondas de oligonucleótidos sintetizadas a medida se han convertido en una potente herramienta para la identificación y el aislamiento de dianas específicas de ácidos nucleicos mediante hibridación.
Las aplicaciones de tales conjuntos de sondas de hibridación abarcan desde la secuenciación de nueva generación, en la que dichas sondas se usan para enriquecer o agotar muestras en busca de dianas específicas de ácidos nucleicos, hasta la obtención de imágenes de muestras fijas, en las que las sondas de hibridación marcadas con fluorescencia permiten medir directamente el número y la organización espacial de las especies seleccionadas como diana.
En la actualidad existe una amplia gama de fuentes comerciales para tales sondas. A menudo, tales sondas se fabrican sintetizando cada miembro oligonucleótido mediante métodos convencionales de síntesis en fase sólida. Desafortunadamente, esto limita tanto el número de sondas dentro de un único conjunto como el número de conjuntos únicos, debido al requisito de que cada miembro oligonucleótido debe sintetizarse individualmente y por separado. Los métodos de amplificación de secuencias diana se divulgan en, por ejemplo, el documento W02008108843 A2, Binladenet al.,Plos ONE, 2, e197, 2007.
Los recientes avances de varias empresas en la síntesis de oligonucleótidos basada en matrices han reducido el coste de producción de oligonucleótidos. Sin embargo, estos enfoques también dan como resultado una cantidad de sondas de oligonucleótidos 1000 veces inferior a la necesaria para una única reacción de hibridación, lo que limita su utilidad. Por consiguiente, se necesitan mejoras en la producción de oligonucleótidos.
Sumario
La presente invención se define mediante las reivindicaciones adjuntas.
El método, según un conjunto de realizaciones, incluye amplificar al menos algunos de una pluralidad de oligonucleótidos usando PCR en tiempo real para producir oligonucleótidos amplificados, transcribirin vitroal menos algunos de los oligonucleótidos amplificados para producir ARN, transcribir inversamente el ARN para producir ADN transcrito, y degradar selectivamente el ARN en relación con el ADN transcrito.
En otro conjunto de realizaciones, el método incluye amplificar simultáneamente al menos algunos de una pluralidad de oligonucleótidos en una disolución común usando PCR para producir oligonucleótidos amplificados, transcribirin vitroal menos algunos de los oligonucleótidos amplificados para producir ARN, transcribir inversamente el ARN para producir ADN transcrito, y degradar selectivamente el ARN en relación con el ADN transcrito.
En otro conjunto de realizaciones, el método incluye actos de proporcionar una pluralidad de oligonucleótidos que tienen una longitud promedio de entre 10 y 200 nucleótidos e incluyen al menos 100 secuencias de oligonucleótidos únicas, producir oligonucleótidos amplificados que comprenden uno de la pluralidad de oligonucleótidos y un promotor usando PCR en tiempo real, transcribir al menos algunos de los oligonucleótidos amplificados para producir ARN usando una ARN polimerasa, transcribir inversamente el ARN para producir ADN usando un cebador que comprende una entidad de señalización, y reducir químicamente el ARN.
El método, en todavía otro conjunto de realizaciones, incluye actos de proporcionar una pluralidad de oligonucleótidos que tienen una longitud promedio de entre 10 y 200 nucleótidos e incluyen al menos 100 secuencias de oligonucleótidos únicas, producir oligonucleótidos amplificados en una disolución común que comprende una de la pluralidad de oligonucleótidos y un promotor usando PCR, transcribiendo al menos algunos de los oligonucleótidos amplificados para producir ARN usando una ARN polimerasa, transcribiendo inversamente el ARN para producir ADN usando un cebador que comprende una entidad de señalización, y reduciendo químicamente el ARN.
En otro aspecto, se engloban métodos de fabricación de una o más de las realizaciones descritas en el presente documento, tales como oligonucleótidos, incluyendo, pero sin limitarse a oligonucleótidos modificados tales como los descritos en el presente documento (por ejemplo, marcados con una entidad de señalización).
En todavía otro aspecto, se describen métodos de uso de una o más de las realizaciones descritas en el presente documento, por ejemplo, tales como oligonucleótidos, incluyendo, pero sin limitarse a oligonucleótidos modificados tales como los descritos en el presente documento (por ejemplo, marcados con una entidad de señalización).
Breve descripción de los dibujos
Las realizaciones no limitativas de la presente invención se describirán a modo de ejemplo con referencia a las figuras que se acompañan, que son esquemáticas y no pretenden ser dibujadas a escala. En las figuras, cada componente idéntico o casi idéntico ilustrado se representa normalmente por un solo número. Con fines de la claridad, no todos los componentes están marcados en todas las figuras, ni se muestran todos los componentes de cada realización de la invención cuando la ilustración no es necesaria para permitir que los expertos en la técnica comprendan la invención. En las figuras:
la figura 1 ilustra la producción de sondas de ADN, según un conjunto de realizaciones; y
la figura 2 ilustra una molécula molde (SEQ ID NO: 3) producida según una realización de la invención;
la figura 3 enumera cebadores optimizados del transcriptoma deE. coli,en otra realización de la invención (las secuencias, de arriba a abajo y de izquierda a derecha, por página, corresponden a las SEQ ID NO: 4-57, 58-111, 112-165, y 166-201); y
la figura 4 muestra diversas sondas según aún otra realización de la invención. Las secuencias en la figura 4, de arriba a abajo y de izquierda a derecha, por página, corresponden a las SEQ ID NO: 202-221, 222-243, 244-265, 266-287, 288-309, 310-331, 332-353, 354-375, 376-397, 398-419, 420-441, 442-463, 464-485, 486-507, 508-529, 530-551, 552-573, 574-595, 596-617, 618-639, 640-661,662-683, 684-705, 706-727, 728-749,750-771,772-793,794 815, 816-837, 838-859, 860-881, 882-903,904-925 y 926-937.
Descripción detallada
La presente invención se refiere en general a un método para producir ácidos nucleicos. En algunos aspectos, pueden producirse cantidades relativamente grandes de oligonucleótidos, y en algunos casos, los oligonucleótidos pueden tener una variedad de secuencias y/o longitudes diferentes. Por ejemplo, puede amplificarse una cantidad relativamente pequeña de oligonucleótidos para producir una gran cantidad de nucleótidos. En un conjunto de realizaciones, los oligonucleótidos pueden amplificarse mediante PCR y, a continuación, transcribirse para producir ARN. A continuación, el ARN puede transcribirse inversamente para producir ADN y, opcionalmente, el ARN puede degradarse o eliminarse selectivamente en relación con el ADN. En un conjunto de realizaciones, los oligonucleótidos pueden modificarse químicamente. Estas modificaciones pueden incluir, pero no se limitan a, la adición de colorantes fluorescentes u otras entidades de señalización.
Solicitud de patente provisional estadounidense con n.° de serie 62/031.062, presentada el 30 de julio de 2014, titulada “Systems and Methods for Determining Nucleic Acids”, de Zhuang,et al.
En un aspecto, la presente invención se refiere en general a métodosin vitrode amplificación de una pluralidad de oligonucleótidos. En algunos casos, puede amplificarse un número relativamente grande de oligonucleótidos únicos dentro de una pluralidad de oligonucleótidos. Por ejemplo, una pluralidad de oligonucleótidos que va a amplificarse puede incluir 10, 100, 1.000 o más secuencias únicas.
Además, en algunas realizaciones, los oligonucleótidos pueden amplificarse sin amplificación selectiva de algunos oligonucleótidos con respecto a otros, por ejemplo, debido a efectos competitivos. Aunque puede producirse cierta deriva, se desea que las razones relativas de los oligonucleótidos dentro de una pluralidad de oligonucleótidos permanezcan sustancialmente iguales después de la amplificación, al menos para algunas aplicaciones. Sin embargo, en muchas técnicas de amplificación, debido a diferencias en la unión o afinidad de diferentes oligonucleótidos, algunos oligonucleótidos pueden amplificarse en mayor grado que otros y, por tanto, es necesario utilizar técnicas específicas para reducir o eliminar este problema, por ejemplo, amplificando por separado cada uno de los oligonucleótidos antes de combinarlos para formar la pluralidad de oligonucleótidos. Por el contrario, tal como se comenta en el presente documento, en determinadas realizaciones, una pluralidad de oligonucleótidos puede amplificarse sin provocar alteraciones o cambios sustanciales en las razones de los oligonucleótidos, sin requerir la separación de los oligonucleótidos, el crecimiento separado de los oligonucleótidos u otras técnicas engorrosas. Refiriéndose ahora a la figura 1, se ilustra ahora un ejemplo de una realización de la invención. En esta figura, se proporciona una pluralidad de oligonucleótidos 10. Esto puede incluir 1, 10, 100, 1.000, 10.000, 100.000, o cualquier otro número adecuado de secuencias de oligonucleótidos únicas. Por supuesto, también puede haber más de una copia de cualquier oligonucleótido único particular dentro de la pluralidad de oligonucleótidos. Los oligonucleótidos únicos pueden tener la misma longitud o longitudes diferentes. En algunos casos, la pluralidad de oligonucleótidos tiene una longitud promedio global (promedio numérico o media aritmética) de menos de 200 nt (nucleótidos), aunque también son posibles longitudes promedio más largas en algunas realizaciones.
La pluralidad de oligonucleótidos 10 puede amplificarse inicialmente usando PCR (reacción en cadena de la polimerasa) u otro método adecuado de amplificación de oligonucleótidos para producir una pluralidad de oligonucleótidos 20 amplificados. En algunos casos, la PCR puede usarse para generar de miles a millones de copias por oligonucleótido dentro de la pluralidad de oligonucleótidos. En algunas realizaciones, la pluralidad de oligonucleótidos puede amplificarse mientras aún están contenidos en una disolución común, por ejemplo, sin requerir la separación de los oligonucleótidos antes de la amplificación, por ejemplo, tal como se requiere en determinadas técnicas tales como la PCR en emulsión.
Dentro de una disolución común, aunque es posible que diferentes oligonucleótidos de la pluralidad de oligonucleótidos se amplifiquen a diferentes velocidades (por ejemplo, dando lugar a una amplificación no uniforme de la pluralidad de oligonucleótidos, y la pérdida potencial de complejidad o especies dentro de la pluralidad de oligonucleótidos durante la amplificación), en determinadas realizaciones, esto puede reducirse o minimizarse mediante el uso de diversas estructuras de oligonucleótidos y/o mediante el uso de determinados tipos de técnicas de PCR, tal como se comenta en el presente documento.
A modo de ejemplo, en un conjunto de realizaciones, la pluralidad de oligonucleótidos puede elegirse para minimizar los efectos competitivos, por ejemplo, tales como los provocados por diferencias en la unión o afinidad de los oligonucleótidos a los reactivos dentro de la disolución común o la amplificación enzimática preferencial de algunas características de secuencia. Por ejemplo, en un conjunto de realizaciones, la pluralidad de oligonucleótidos puede elegirse para que tengan longitudes y/o secuencias similares.
Tal como se muestra en la figura 1, la pluralidad de oligonucleótidos puede contener cada uno una o más regiones de índice 15, 16 en uno o ambos extremos de los oligonucleótidos que pueden ser reconocidas por determinados reactivos. En algunos casos, los oligonucleótidos de la pluralidad de oligonucleótidos pueden tener una o más regiones de índice con las que pueden interactuar cebadores adecuados para permitir que se produzca la PCR u otro tipo de amplificación. En algunas realizaciones, estas regiones de índice pueden usarse para producir selectivamente sondas de ADN sólo a partir de un subconjunto de la pluralidad de oligonucleótidos 10.
Estas regiones de índice también pueden usarse en algunos casos para añadir secuencias adicionales a la de la pluralidad de oligonucleótidos, por ejemplo, tal como se muestra en la figura 1, el oligonucleótido 11 puede incluir una región de índice 15, a la que puede unirse una secuencia 17 que contiene un promotor T7 e introducirse en los oligonucleótidos amplificados (por ejemplo, como región 23). De este modo, pueden aplicarse diversas secuencias a la pluralidad de oligonucleótidos que incluyen una porción capaz de unirse a una región de índice. En algunos casos, si sustancialmente toda la pluralidad de oligonucleótidos contiene regiones de índice similares o idénticas, las afinidades relativas o la unión a las regiones de índice de los oligonucleótidos por enzimas tales como polimerasas pueden ser sustancialmente similares o idénticas, lo que puede permitir que se produzca una amplificación relativamente uniforme. La pluralidad de oligonucleótidos también puede contener otras regiones diferentes que pueden variarse para producir una pluralidad de oligonucleótidos únicos, por ejemplo, la región 12. Estas regiones pueden variar en cuanto a longitud y/o secuencia, etc.
En algunas realizaciones, la cantidad de amplificación que se produce puede controlarse cuidadosamente mediante la monitorización de la reacción de amplificación por PCR, por ejemplo, usando técnicas tales como PCR en tiempo real. Esto puede producirse, por ejemplo, usando oligonucleótidos que tienen regiones de índice común, longitudes y/o secuencias sustancialmente similares, etc., incluyendo los comentados previamente, o con otras pluralidades adecuadas de oligonucleótidos. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la reacción de PCR puede monitorizarse iluminando la disolución que contiene los oligonucleótidos con luz adecuada y determinando la cantidad de fluorescencia presente, que puede relacionarse con el ADN presente en la muestra. Las técnicas para monitorizar las reacciones de PCR, tales como las metodologías de PCR en tiempo real, son conocidas por los expertos en la técnica. La reacción de PCR también puede controlarse, en algunas realizaciones, controlando la cantidad y/o concentración de nucleótidos y/o cofactores presentes.
Después de la amplificación, la pluralidad de oligonucleótidos amplificados 20 puede transcribirse para producir una pluralidad de ARN 30, tal como se muestra en el ejemplo de la figura 1. Esto puede realizarse, por ejemplo, exponiendo los oligonucleótidos amplificados a una ARN polimerasa adecuada, tales como la ARN polimerasa T7, que puede transcribir los oligonucleótidos para producir el ARN correspondiente. La cantidad de producción de ARN puede controlarse en algunas realizaciones controlando la cantidad y/o concentración de nucleótidos y/o cofactores presentes, así como la duración de la reacción de transcripciónin vitro.
A continuación, la pluralidad de ARN 30 puede usarse para producir cantidades adicionales de ADN 40, por ejemplo, mediante transcripción inversa. Por ejemplo, puede usarse una enzima adecuada, tal como la transcriptasa inversa, para realizar la transcripción inversa. En algunos casos, pueden usarse cebadores para facilitar la transcripción y, en algunas realizaciones, los cebadores también pueden usarse para unir entidades adicionales al ADN. Por ejemplo, pueden unirse entidades de señalización, tal como se muestra con la entidad de señalización 48 en la figura 1. Alternativamente, también pueden unirse secuencias de ácido nucleico adicionales, que pueden servir para reclutar oligonucleótidos adicionales mediante el apareamiento de bases de Watson-Crick. La cantidad de ADN que se produce puede controlarse, por ejemplo, controlando la cantidad y/o concentración de nucleótidos y/o cofactores presentes, así como la duración y temperatura de la reacción de transcripción inversa.
En algunas realizaciones, pueden producirse múltiples copias de ADN a partir de cada molécula de ARN. Además, opcionalmente, el ARN puede eliminarse o degradarse selectivamente en relación con el ADN, por ejemplo, mediante hidrólisis alcalina, digestión enzimática u otras técnicas.
Por consiguiente, en determinados aspectos, la presente invención se refiere en general a un método de amplificación de una pluralidad de oligonucleótidos. En un conjunto de realizaciones, pueden producirse cantidades o masas relativamente grandes de oligonucleótidos tal como se comenta en el presente documento, por ejemplo, al menos de aproximadamente 10-3 pmol, al menos aproximadamente 10-2 pmol, al menos aproximadamente 10-1 pmol, al menos aproximadamente 100 pmol, al menos aproximadamente 101 pmol, al menos aproximadamente 102 pmol, al menos aproximadamente 103 pmol, etc. Además, en algunas realizaciones, la pluralidad de oligonucleótidos puede ser sustancialmente diversa. Por ejemplo, la pluralidad de oligonucleótidos puede incluir al menos aproximadamente 101, al menos aproximadamente 102, al menos aproximadamente 103, al menos aproximadamente 104, al menos aproximadamente 105, o al menos aproximadamente 106 secuencias únicas de oligonucleótidos, incluso después de la amplificación a las cantidades comentadas anteriormente. (También debe tenerse en cuenta que una pluralidad o población de oligonucleótidos puede incluir más de una copia de una secuencia de oligonucleótidos única dada). Por el contrario, determinadas técnicas de la técnica anterior son capaces de amplificar grandes cantidades de oligonucleótidos únicos, pero sólo a pequeñas cantidades o masas (por ejemplo, a cantidades de aproximadamente 10-3 pmol o menos), o son capaces de producir grandes cantidades o masas de oligonucleótidos, pero sólo para 1 o unas pocas secuencias únicas (por ejemplo, menos de 10 secuencias).
Tal como se comentó, en determinadas realizaciones, una pluralidad de oligonucleótidos, que puede incluir una pluralidad de secuencias únicas de oligonucleótidos tales como las descritas anteriormente, pueden amplificarse sin amplificación selectiva sustancial de algunas secuencias de oligonucleótidos con respecto a otras, por ejemplo, debido a efectos competitivos, a diferencia de muchas técnicas de la técnica anterior. Aunque puede producirse cierta deriva durante el procedimiento de amplificación, la deriva puede ser relativamente pequeña. Por ejemplo, en determinadas realizaciones, las razones o porcentajes de una secuencia de oligonucleótidos única representativa, en relación con la población global de partida, en promedio, pueden cambiar tras la amplificación en no más de aproximadamente el 10 %, no más de aproximadamente el 8%, no más de aproximadamente el 6%, no más de aproximadamente el 5 %, no más de aproximadamente el 4 %, no más de aproximadamente el 3 %, no más de aproximadamente el 2 %, no más de aproximadamente el 1 %, etc., en relación con la razón o porcentaje de partida de la secuencia de oligonucleótidos, antes de la amplificación. Sin embargo, debe tenerse en cuenta que la propia secuencia de oligonucleótidos, antes de cualquier amplificación, también puede presentar cierta variabilidad, que no se incluye en los números anteriores.
Los oligonucleótidos únicos dentro de una pluralidad de oligonucleótidos pueden tener longitudes iguales o diferentes. Si está presente más de un oligonucleótido único, los oligonucleótidos únicos pueden tener independientemente longitudes iguales o diferentes. Por ejemplo, en algunos casos, una pluralidad de oligonucleótidos puede tener una longitud promedio (promedio numérico) de al menos 5, al menos 10, al menos 15, al menos 20, al menos 25, al menos 30, al menos 35, al menos 40, al menos 50, al menos 60, al menos 65, al menos 75, al menos 100, al menos 125, al menos 150, al menos 175, al menos 200, al menos 250, al menos 300, al menos 350, al menos 400 o al menos 450 nucleótidos. En algunos casos, la longitud promedio puede ser no más de 500, no más de 450, no más de 400, no más de 350, no más de 300, no más de 250, no más de 200, no más de 175, no más de 150, no más de 125, no más de 100, no más de 75, no más de 60, no más de 65, no más de 60, no más de 55, no más de 50, no más de 45, no más de 40, no más de 35, no más de 30, no más de 20 o no más de 10 nucleótidos. También son posibles combinaciones de cualquiera de ellas, por ejemplo, la longitud promedio puede estar entre 10 y 30 nucleótidos, entre 20 y 40 nucleótidos, entre 5 y 50 nucleótidos, entre 10 y 200 nucleótidos, o entre 25 y 35 nucleótidos, entre 10 y 300 nucleótidos, etc.
En un conjunto de realizaciones, puede usarse cualquier técnica adecuada para amplificar la pluralidad de oligonucleótidos. En algunos casos, para cada oligonucleótido que va a amplificarse, pueden producirse al menos aproximadamente 100, al menos aproximadamente 300, al menos aproximadamente 500, al menos aproximadamente 1.000, al menos aproximadamente 3.000, al menos aproximadamente 5.000, al menos aproximadamente 10.000, al menos aproximadamente 30.000, al menos aproximadamente 50.000 al menos aproximadamente 100.000, al menos aproximadamente 300.000, al menos aproximadamente 500.000, al menos aproximadamente 1.000.000 de copias, al menos aproximadamente 3.000.000 de copias, al menos aproximadamente 5.000.000 de copias, al menos aproximadamente 10.000.000 de copias, al menos aproximadamente 30.000.000 de copias, al menos aproximadamente 50.000.000 de copias o al menos aproximadamente 100.000.000 de copias del oligonucleótido usando cualquiera de las técnicas de amplificación comentadas en el presente documento (por ejemplo, incluyendo amplificación por PCR, transcripciónin vitro,etc.).
Tal como se comentó, en algunos casos, la amplificación puede producirse sin amplificación selectiva sustancial de algunas secuencias de oligonucleótidos con respecto a otras.
Puede usarse cualquier técnica adecuada para generar la pluralidad de oligonucleótidos. Por ejemplo, la pluralidad de oligonucleótidos puede producirse sintéticamente, cultivarse dentro de una célula, cultivarse en un sustrato (por ejemplo, en una matriz), o similares. Las técnicas para producir oligonucleótidos son conocidas por los expertos en la técnica. En algunas realizaciones, la pluralidad de oligonucleótidos también puede diseñarse computacionalmente.
En una realización, los oligonucleótidos pueden amplificarse usando PCR (reacción en cadena de la polimerasa). En algunos casos, los oligonucleótidos pueden amplificarse mientras están contenidos en un líquido o disolución común. Esto debe contrastarse con determinadas técnicas de PCR, tales como PCR en emulsión o PCR digital, que requieren la separación de los oligonucleótidos, por ejemplo, en compartimentos o gotas separadas, antes de la amplificación para evitar que se produzca una amplificación relativamente selectiva de determinados oligonucleótidos. Sin embargo, sorprendentemente, se ha descubierto que tal separación no es necesaria, y que pueden usarse otras técnicas (tal como la descrita en el presente documento) para evitar o reducir la amplificación selectiva manteniendo los oligonucleótidos juntos dentro de una disolución común.
Tal como se mencionó, en algunos casos, mediante el uso de determinadas estructuras de oligonucleótidos y/o determinados tipos de técnicas de PCR, la cantidad de amplificación selectiva que puede producirse puede reducirse o eliminarse. Por ejemplo, en un conjunto de realizaciones, los oligonucleótidos se eligen para minimizar los efectos competitivos. Por ejemplo, los oligonucleótidos pueden tener sustancialmente las mismas longitudes, y/o compartir porciones o regiones idénticas o similares.
Por ejemplo, en un conjunto de realizaciones, los oligonucleótidos pueden tener una distribución de longitudes tal que no más de aproximadamente el 10 %, no más de aproximadamente el 5 %, no más de aproximadamente el 3 %, o no más de aproximadamente el 1 % de los oligonucleótidos tiene una longitud que es de menos de aproximadamente el 80 % o superior a aproximadamente el 120 %, de menos de aproximadamente el 90 % o superior a aproximadamente el 110 %, o de menos de aproximadamente el 95 % o superior a aproximadamente el 105 % de la longitud promedio global de la pluralidad de nucleótidos.
En otro conjunto de realizaciones, los oligonucleótidos pueden compartir una o más regiones, tales como las regiones de índice, que son idénticas o sustancialmente similares. Los oligonucleótidos que comparten regiones de índice u otras regiones pueden tener sustancialmente las mismas longitudes, tal como se comentó anteriormente, o longitudes diferentes. En algunas realizaciones, los oligonucleótidos pueden comprender al menos dos regiones de índice que son idénticas o sustancialmente similares, rodeando una región variable que tiene diferentes secuencias de nucleótidos y, opcionalmente, diferentes longitudes. Por ejemplo, los oligonucleótidos pueden incluir, en secuencia, una primera región que es idéntica o sustancialmente similar a los otros oligonucleótidos, una segunda región que no es idéntica, y opcionalmente, una tercera región que es idéntica o sustancialmente similar a los otros oligonucleótidos. En algunas realizaciones, la competencia de oligonucleótidos puede controlarse usando oligonucleótidos seleccionados para reducir el sesgo de amplificación. Por ejemplo, en algunos casos, los grupos de oligonucleótidos que tienen composiciones similares pueden amplificarse juntos.
En algunos casos, las regiones de índice pueden tener una longitud superior a 5, 7, 10, 12, 14, 16, 18 ó 20 nucleótidos, y/o tener una longitud de menos de 30, 28, 25, 22, 20, 18, 16, 14, 12 ó 10 nucleótidos. Por ejemplo, las regiones que son idénticas o sustancialmente similares pueden tener una longitud de entre 18 y 22 nucleótidos. Las regiones pueden ser idénticas o diferir en no más de 1, 2, 3, 4 ó 5 nucleótidos (de manera consecutiva o no consecutiva) dentro de la región.
En determinadas realizaciones, pueden añadirse secuencias cebadoras para facilitar la reacción de PCR. Por ejemplo, la secuencia de cebadores puede incluir secuencias sustancialmente complementarias a una región dentro de los oligonucleótidos, por ejemplo, una región de índice. Una variedad de tales secuencias adecuadas para la PCR o la transcripciónin vitropuede obtenerse de manera fácil comercialmente.
En algunas realizaciones, la secuencia del cebador también puede incluir otras secuencias, por ejemplo, secuencias promotoras u otras secuencias que pueden añadirse al oligonucleótido durante la amplificación por PCR, tal como se muestra en la figura 1 con un promotor T7. Por consiguiente, en determinados casos pueden producirse oligonucleótidos que comprenden la secuencia original y una o más secuencias promotoras. Además del promotor T7, otros promotores adecuados que pueden usarse incluyen, pero no se limitan a, promotores T3 o promotores SP6. Tales promotores pueden ser útiles, por ejemplo, para facilitar la transcripción para producir ARN, tal como se comenta con más detalle a continuación. Además, en algunas realizaciones, puede añadirse más de un promotor. En un conjunto de realizaciones, puede usarse más de una secuencia que contiene un cebador de PCR, por ejemplo, para amplificar diferentes subconjuntos de la pluralidad de oligonucleótidos. Si se usa más de una secuencia que contiene cebador, los cebadores de PCR contenidos en cada una de ellas pueden ser iguales o diferentes. Los ejemplos de cebadores de PCR adecuados incluyen los descritos en el presente documento. Por tanto, por ejemplo, en un conjunto de realizaciones, por ejemplo, la pluralidad de oligonucleótidos puede incluir diferentes subagrupaciones que tienen diferentes regiones de índice u otras regiones tal como se comentó anteriormente, que pueden amplificarse selectivamente mediante el uso de una secuencia adecuada que incluye un cebador de PCR. Puede crearse cualquier número adecuado de subagrupaciones para una pluralidad de oligonucleótidos. Por ejemplo, pueden amplificarse selectivamente al menos 1, 2, 4, 10, 20, 96, 100 ó 192 subagrupaciones de la pluralidad de oligonucleótidos, mediante el uso de cebadores de PCR específicos.
Por tanto, en algunos casos, los oligonucleótidos pueden formarse en “agrupaciones” o grupos o conjuntos de oligonucleótidos dentro de la pluralidad de oligonucleótidos que comparten una o más características comunes, tales como una región de índice u otra secuencia idéntica. Por ejemplo, la característica común en un grupo o conjunto de oligonucleótidos puede tener una secuencia idéntica de nucleótidos de al menos 5, 7, 10, 12, 14, 16, 18 ó 20 nucleótidos, y/o menos de 30, 28, 25, 22, 20, 18, 16, 14, 12 ó 10 nucleótidos. Por ejemplo, la región común que es idéntica o sustancialmente similar en un grupo de oligonucleótidos puede tener una longitud de entre 18 y 22 nucleótidos. Las regiones comunes pueden ser idénticas o diferir en no más de 1, 2, 3, 4 ó 5 nucleótidos (de manera consecutiva o no consecutiva) dentro de la región. En algunas realizaciones, cada grupo o agrupación puede contener dos (o más) regiones de índice únicas que no se usan en ninguna otra agrupación, por ejemplo, para reducir la contaminación de productos amplificados inespecíficos a partir de los productos de amplificación de otro. En determinadas realizaciones, la amplificación por PCR puede monitorizarse y controlarse para reducir o minimizar la amplificación selectiva. Por ejemplo, en un conjunto de realizaciones, pueden usarse técnicas de PCR en tiempo real. En algunas realizaciones, el alcance de la reacción de PCR puede monitorizarse o controlarse, por ejemplo, iluminando la disolución que contiene los oligonucleótidos con luz adecuada y determinando la cantidad de fluorescencia que está presente para monitorizar la reacción de PCR. Por consiguiente, por ejemplo, las condiciones de reacción pueden controlarse de manera que los oligonucleótidos reaccionen en condiciones que minimicen la cantidad de amplificación selectiva, por ejemplo, proporcionando un exceso de nucleótidos, iones (por ejemplo, Mg2+), enzima, etc. Una vez que las concentraciones de oligonucleótidos han alcanzado el punto en el que pueden empezar a producirse efectos competitivos, la reacción puede detenerse antes de que comience una amplificación selectiva significativa.
Después de la amplificación tal como se comentó anteriormente, los oligonucleótidos amplificados pueden entonces transcribirse para producir ARN. En esta etapa también puede producirse una amplificación adicional. Por ejemplo, en algunos casos, cada oligonucleótido puede usarse para producir, en promedio, al menos aproximadamente 50, al menos aproximadamente 100, al menos aproximadamente 300, al menos aproximadamente 500, al menos aproximadamente 1.000, al menos aproximadamente 3.000, al menos aproximadamente 5.000, al menos aproximadamente 10.000, al menos aproximadamente 30.000, al menos aproximadamente 50.000, al menos aproximadamente 100.000, al menos aproximadamente 300.000, al menos aproximadamente 500.000 o al menos aproximadamente 1.000.000 de moléculas de ARN transcritas. En algunos casos, la masa de ARN que se produce puede ser de al menos aproximadamente 10, al menos aproximadamente 20, al menos aproximadamente 30, al menos aproximadamente 50, al menos aproximadamente 100, al menos aproximadamente 200, al menos aproximadamente 300 o al menos aproximadamente 500 veces la masa de los oligonucleótidos. Por tanto, por ejemplo, un microgramo de oligonucleótidos puede convertirse en al menos 10 microgramos, al menos 30 microgramos o al menos 100 microgramos de a Rn .
En un conjunto de realizaciones, la transcripción puede tener lugarin vitroexponiendo los oligonucleótidos amplificados a una ARN polimerasa adecuada. Una variedad de ARN polimerasas están disponibles comercialmente, incluyendo ARN polimerasas T7, T3 o SP6. Otros ejemplos no limitativos de ARN polimerasas incluyen ARN polimerasa I, ARN polimerasa II, ARN polimerasa III, ARN polimerasa IV o ARN polimerasa V. La ARN polimerasa puede proceder de cualquier fuente adecuada, por ejemplo, bacterias, virus o eucariotas. En algunas realizaciones, puede usarse más de una ARN polimerasa. Además, tal como se comentó anteriormente, en algunas realizaciones, los oligonucleótidos amplificados pueden incluir secuencias promotoras, tal como una o más de las secuencias promotoras T7, T3 o SP6, que pueden usarse para facilitar el proceso de transcripción. Los expertos en la técnica conocerán las condiciones adecuadas para provocar la transcripciónin vitrousando ARN polimerasas. En algunas realizaciones, el sesgo de amplificación total puede reducirse cambiando la cantidad relativa de amplificación producida por la PCR y la transcripciónin vitro. Por ejemplo, la PCR puede usarse para producir cantidades más pequeñas de ADN que las que se producen normalmente en una PCR, para reducir el sesgo de amplificación de este procedimiento. Sin embargo, este menor rendimiento puede compensarse en algunos casos aumentando la duración de la reacción de transcripciónin vitro.
A su vez, el ARN puede transcribirse inversamente para producir ADN. En un conjunto de realizaciones, la transcripción inversa puede producirse exponiendo el ARN a una enzima transcriptasa inversa adecuada. En algunos casos, la transcriptasa inversa puede ser una transcriptasa inversa viral, por ejemplo, la transcriptasa inversa de M-MLV, la transcriptasa inversa de AMV o similares. Existe una gran variedad de enzimas de transcriptasa inversa disponibles comercialmente. Los expertos en la técnica conocerán las condiciones adecuadas para que se produzca la transcripción inversa.
En determinadas realizaciones, la transcripción inversa puede facilitarse mediante el uso de secuencias que contienen cebadores, por ejemplo, que contienen cebadores para la transcripción inversa. En algunos casos, las secuencias que contienen cebadores pueden contener también otras secuencias o entidades, aunque esto no es necesariamente un requisito. Las secuencias que contienen cebadores pueden añadirse en cualquier momento adecuado, por ejemplo, justo antes de iniciar la reacción de transcripción. Pueden obtenerse comercialmente cebadores de transcripción adecuados para realizar la transcripción inversa.
En un conjunto de realizaciones, la secuencia que contiene cebadores puede incorporarse al ADN durante la producción del ADN por la transcriptasa inversa. En algunos casos, la secuencia que contiene cebadores puede contener otras entidades, y/o secuencias adecuadas para unir otras entidades (por ejemplo, en los extremos 5' o 3', internamente, etc.). Por ejemplo, la secuencia que contiene cebadores puede contener un resto de ácido no nucleico, tal como un resto de digoxigenina, un resto de biotina, etc. situado en el extremo 5', el extremo 3', internamente, o similares. En algunos casos, la entidad de señalización que puede detectarse o determinarse posteriormente puede introducirse en el ADN. Por ejemplo, la entidad de señalización puede ser fluorescente, o una secuencia de nucleótidos específica que puede determinarse, por ejemplo, enzimáticamente. Los ejemplos de entidades de señalización se tratan con más detalle a continuación.
En algunos casos, el ARN puede purificarse antes de la transcripción inversa. Sin embargo, debe tenerse en cuenta que la purificación no es necesaria y, en otras realizaciones, el ARN puede transcribirse inversamente para formar ADN sin etapas intermedias de purificación. Si se purifica el ARN, puede hacerse mediante cualquier técnica adecuada, por ejemplo, pasando el ARN por una columna adecuada para eliminar los oligonucleótidos.
Opcionalmente, en algunas realizaciones, el ARN puede separarse del ADN o el ADN puede purificarse de alguna manera. Por ejemplo, el ARN puede degradarse selectivamente en relación con el ADN. En un conjunto de realizaciones, el<a>R<n>puede degradarse en relación con el ADN mediante hidrólisis alcalina. Por ejemplo, el pH de la disolución puede elevarse hasta al menos aproximadamente 8, al menos aproximadamente 9, al menos aproximadamente 10, etc. Puede usarse cualquier alcalino adecuado para elevar el pH. En algunos casos, después de la degradación del ARN, el pH también puede reducirse, por ejemplo, hasta aproximadamente 7, hasta aproximadamente 7,4, hasta condiciones fisiológicas, o similares. En algunos casos, pueden usarse técnicas como la degradación enzimática para degradar selectivamente el ARN, en relación con el ADN. El ADN también puede purificarse mediante técnicas como la purificación en columna, la precipitación con etanol y/o técnicas de inmovilización reversible en fase sólida. Además, en algunos casos, el ADN puede concentrarse, por ejemplo, mediante técnicas de evaporación.
Además, técnicas tales como las descritas anteriormente pueden ampliarse o “aumentarse en número” para producir mayores cantidades de material. Por ejemplo, un procedimiento puede repetirse usando técnicas de múltiples pocillos o ejecutando simultáneamente múltiples reacciones en paralelo, etc. para producir mayores cantidades o masas de oligonucleótidos. Como ejemplo no limitativo, en una realización, los procedimientos tales como los comentados en el presente documento pueden llevarse a cabo usando múltiples pocillos de una placa de microtitulación (por ejemplo, que tiene 96, 384, 1536, pocillos, etc.) para aumentar la producción.
El ADN puede usarse para una variedad de propósitos en diferentes realizaciones de la invención. Por ejemplo, en determinadas realizaciones, el ADN puede hibridarse con especies de ácido nucleico en muestras líquidas, por ejemplo, extraídas de una variedad de fuentes biológicas, incluyendo humanas. En algunos casos, el ADN puede usarse para separar físicamente un conjunto de ácidos nucleicos de otro, o como cebadores para PCR o transcripción inversa.
Además, tal como se comentó anteriormente, en algunos aspectos, las entidades de señalización se incorporan al ADN en algunas realizaciones. Las entidades de señalización pueden determinarse para una variedad de propósitos. Por ejemplo, el ADN que se produce puede usarse como sonda biológica, y las entidades de señalización pueden determinarse de alguna manera, por ejemplo, cuantitativa o cualitativamente, para determinar una característica o rasgo de la sonda. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a, la posición de la sonda, la actividad de la sonda, la concentración de la sonda, o similares.
En algunos casos, las entidades de señalización dentro de una muestra pueden determinarse, por ejemplo, espacialmente, usando una variedad de técnicas. En algunas realizaciones, las entidades de señalización pueden ser fluorescentes, y las técnicas para determinar la fluorescencia dentro de una muestra, tales como la microscopía de fluorescencia o la microscopía confocal, pueden usarse para identificar espacialmente las posiciones de las entidades de señalización dentro de una célula. En algunos casos, las posiciones de las entidades dentro de la muestra pueden determinarse en dos o incluso tres dimensiones.
En algunas realizaciones, las posiciones espaciales de las entidades de señalización pueden determinarse a resoluciones relativamente altas. Por ejemplo, las posiciones pueden determinarse a resoluciones espaciales mejores que aproximadamente 100 micrómetros, mejores que aproximadamente 30 micrómetros, mejores que aproximadamente 10 micrómetros, mejores que aproximadamente 3 micrómetros, mejores que aproximadamente 1 micrómetro, mejores que aproximadamente 800 nm, mejores que aproximadamente 600 nm, mejores que aproximadamente 500 nm, mejores que aproximadamente 400 nm, mejores que aproximadamente 300 nm, mejores que aproximadamente 200 nm, mejores que aproximadamente 100 nm, mejores que aproximadamente 90 nm, mejores que aproximadamente 80 nm, mejores que aproximadamente 70 nm, mejores que aproximadamente 60 nm, mejores que aproximadamente 50 nm, mejores que aproximadamente 40 nm, mejores que aproximadamente 30 nm, mejores que aproximadamente 20 nm o mejores que aproximadamente 10 nm, etc.
Existe una gran variedad de técnicas capaces de determinar o generar imágenes ópticas de las posiciones espaciales de las entidades, por ejemplo, mediante microscopía de fluorescencia. En algunos casos, las posiciones espaciales pueden determinarse a superresoluciones, o a resoluciones mejores que la longitud de onda de la luz. Los ejemplos no limitativos incluyen STORM (microscopía de reconstrucción óptica estocástica), STED (microscopía de agotamiento de emisión estimulada), NSOM (microscopía óptica de barrido de campo cercano), microscopía 4Pi, SIM (microscopía de iluminación estructurada), microscopía SMI (iluminación espacialmente modulada), RESOLFT (microscopía de transición de fluorescencia ópticamente lineal saturable reversible), GSD (microscopía de agotamiento del estado fundamental), SSEVI (microscopía de iluminación estructurada saturada), SPDM (microscopía de distancia de precisión espectral), microscopía de localización fotoactivada (PALM), microscopía de localización por fotoactivación de fluorescencia (FPALM), LIMON (microscopía de nanotamaño microscópica de luz 3D), imágenes de fluctuación óptica de súper resolución (SOFI), o similares. Véase, por ejemplo, la patente estadounidense n.° 7.838.302, publicada el 23 de noviembre de 2010, titulada “Sub-Diffraction Limit Image Resolution and Other Imaging Techniques,” por Zhuang,et al.;la patente estadounidense n.° 8.564.792, concedida el 22 de octubre de 2013, titulada “Sub-diffraction Limit Image Resolution in Three Dimensions,” de Zhuang,et al.;o la publicación de solicitud de patente internacional n.° WO 2013/090360, publicada el 20 de junio de 2013, titulada “High Resolution Dual- Objective Microscopy”, de Zhuang,et al.
Además, la entidad de señalización puede inactivarse en algunos casos. Por ejemplo, en algunas realizaciones, puede aplicarse una primera sonda secundaria de ácido nucleico que contiene una entidad de señalización a una muestra que pueda reconocer una primera secuencia de lectura y, a continuación, puede inactivarse la primera sonda secundaria de ácido nucleico antes de aplicar a la muestra una segunda sonda secundaria de ácido nucleico. Si se usan múltiples entidades de señalización, pueden emplearse las mismas técnicas o técnicas diferentes para inactivar las entidades de señalización, y pueden inactivarse algunas o todas las entidades de señalización múltiples, por ejemplo, secuencial o simultáneamente.
La inactivación puede producirse por eliminación de la entidad de señalización (por ejemplo, de la muestra, o de la sonda de ácido nucleico, etc.), y/o por alteración química de la entidad de señalización de alguna manera, por ejemplo, por fotoblanqueo de la entidad de señalización, blanqueo o alteración química de la estructura de la entidad de señalización, etc.). Por ejemplo, en un conjunto de realizaciones, una entidad de señalización fluorescente puede inactivarse mediante técnicas químicas u ópticas tales como oxidación, fotoblanqueo, blanqueo químico, lavado riguroso o digestión enzimática o reacción por exposición a una enzima, disociación de la entidad de señalización de otros componentes (por ejemplo, una sonda), reacción química de la entidad de señalización (por ejemplo, a un reactivo capaz de alterar la estructura de la entidad de señalización) o similares.
En algunas realizaciones, diversas sondas de ácido nucleico (incluyendo sondas de ácido nucleico primarias y/o secundarias) pueden incluir una o más entidades de señalización. Si se usa más de una sonda de ácido nucleico, las entidades de señalización pueden ser iguales o diferentes. En determinadas realizaciones, una entidad de señalización es cualquier entidad capaz de emitir luz. Por ejemplo, en una realización, la entidad de señalización es fluorescente. En otras realizaciones, la entidad de señalización puede ser fosforescente, radiactiva, absorbente, etc. En algunos casos, la entidad de señalización es cualquier entidad que pueda determinarse dentro de una muestra a resoluciones relativamente altas, por ejemplo, a resoluciones mejores que la longitud de onda de la luz visible. La entidad de señalización puede ser, por ejemplo, un colorante, una molécula pequeña, un péptido o una proteína, o similares. En algunos casos, la entidad de señalización puede ser una única molécula. Si se utilizan múltiples sondas de ácido nucleico secundarias, las sondas de ácido nucleico pueden comprender la misma entidad de señalización o entidades diferentes.
Los ejemplos no limitativos de entidades de señalización incluyen entidades fluorescentes (fluoróforos) o entidades fosforescentes, por ejemplo, colorantes de cianina (por ejemplo, Cy2, Cy3, Cy3B, Cy5, Cy5.5, Cy7, etc.), colorantes Alexa Fluor, colorantes Atto, colorantes fotosensibles, colorantes fotoactivables, colorantes fluorescentes, nanopartículas metálicas, nanopartículas semiconductoras o “puntos cuánticos”, proteínas fluorescentes tales como GFP (proteína fluorescente verde), o proteínas fluorescentes fotoactivables, tales como PAGFP, PSCFP, PSCFP2, Dendra, Dendra2, EosFP, tdEos, mEos2, mEos3, PAmCherry, PAtagRFP, mMaple, mMaple2 y mMaple3. Los expertos en la técnica conocen otras entidades de señalización adecuadas. Véase, por ejemplo, la patente estadounidense n.° 7.838.302 o la solicitud de patente estadounidense con n.° de serie 61/979.436.
Tal como se usa en el presente documento, el término “luz” se refiere en general a la radiación electromagnética, que tiene cualquier longitud de onda adecuada (o equivalentemente, frecuencia). Por ejemplo, en algunas realizaciones, la luz puede incluir longitudes de onda en el rango óptico o visual (por ejemplo, con una longitud de onda de entre 400 nm y 700 nm, es decir, “luz visible”), longitudes de onda infrarrojas (por ejemplo, con una longitud de onda de entre 300 micrómetros y 700 nm), longitudes de onda ultravioletas (por ejemplo, con una longitud de onda de entre 400 nm y 10 nm), o similares. En algunos casos, tal como se detalla más adelante, puede usarse más de una entidad, es decir, entidades que son químicamente diferentes o distintas, por ejemplo, estructuralmente. Sin embargo, en otros casos, las entidades pueden ser químicamente idénticas o al menos sustancialmente idénticas desde el punto de vista químico.
En un conjunto de realizaciones, la entidad de señalización es “conmutable”, es decir, la entidad puede conmutarse entre dos o más estados, al menos uno de los cuales emite luz con una longitud de onda deseada. En el/los otro(s) estado(s), la entidad puede no emitir luz o emitir luz con una longitud de onda diferente. Por ejemplo, una entidad puede ser “activada” a un primer estado capaz de producir luz con una longitud de onda deseada, y “desactivada” a un segundo estado no capaz de emitir luz de la misma longitud de onda. Una entidad es “fotoactivable” si puede ser activada por luz incidente de una longitud de onda adecuada. Como ejemplo no limitativo, el Cy5 puede conmutarse entre un estado fluorescente y un estado oscuro de manera controlada y reversible mediante luz de diferentes longitudes de onda, es decir, la luz roja de 633 nm (o 642 nm, 647 nm, 656 nm) puede conmutar o desactivar el Cy5 a un estado oscuro estable, mientras que la luz verde de 405 nm puede conmutar o activar el Cy5 de vuelta al estado fluorescente. En algunos casos, la entidad puede conmutarse reversiblemente entre los dos o más estados, por ejemplo, tras la exposición a los estímulos adecuados. Por ejemplo, puede usarse un primer estímulo (por ejemplo, una primera longitud de onda de luz) para activar la entidad conmutable, mientras que puede usarse un segundo estímulo (por ejemplo, una segunda longitud de onda de luz) para desactivar la entidad conmutable, por ejemplo, a un estado no emisor. Puede usarse cualquier método adecuado para activar la entidad. Por ejemplo, en una realización, puede usarse luz incidente de una longitud de onda adecuada para activar la entidad para que emita luz, es decir, la entidad es “fotoconmutable”. Por tanto, la entidad fotoconmutable puede conmutarse entre diferentes estados emisores o no emisores de luz mediante luz incidente, por ejemplo, de diferentes longitudes de onda. La luz puede ser monocromática (por ejemplo, producida mediante un láser) o policromática. En otra realización, la entidad puede activarse al ser estimulada por un campo eléctrico y/o magnético. En otras realizaciones, la entidad puede activarse tras la exposición a un entorno químico adecuado, por ejemplo, ajustando el pH, o induciendo una reacción química reversible que implique a la entidad, etc. Del mismo modo, puede usarse cualquier método adecuado para desactivar la entidad, y los métodos de activación y desactivación de la entidad no tienen por qué ser los mismos. Por ejemplo, la entidad puede desactivarse al exponerla a una luz incidente de una longitud de onda adecuada, o puede desactivarse esperando un tiempo suficiente.
Normalmente, una entidad “conmutable” puede ser identificada por un experto en la técnica mediante la determinación de las condiciones en las que una entidad en un primer estado puede emitir luz cuando se expone a una longitud de onda de excitación, cambiando la entidad del primer estado al segundo estado, por ejemplo, tras la exposición a la luz de una longitud de onda de conmutación, mostrando entonces que la entidad, mientras está en el segundo estado ya no puede emitir luz (o emite luz a una intensidad mucho menor) cuando se expone a la longitud de onda de excitación.
En un conjunto de realizaciones, tal como se comentó, una entidad conmutable puede conmutarse al exponerse a la luz. En algunos casos, la luz usada para activar la entidad conmutable puede proceder de una fuente externa, por ejemplo, una fuente de luz tal como una fuente de luz láser, otra entidad emisora de luz próxima a la entidad conmutable, etc. La segunda entidad emisora de luz, en algunos casos, puede ser una entidad fluorescente y, en determinadas realizaciones, la segunda entidad emisora de luz puede ser también una entidad conmutable.
En algunas realizaciones, la entidad conmutable incluye una primera porción emisora de luz (por ejemplo, un fluoróforo) y una segunda porción que activa o “conmuta” la primera porción. Por ejemplo, tras la exposición a la luz, la segunda porción de la entidad conmutable puede activar la primera porción, haciendo que la primera porción emita luz. Los ejemplos de porciones activadoras incluyen, pero no se limitan a, Alexa Fluor 405 (Invitrogen), Alexa Fluor 488 (Invitrogen), Cy2 (GE Healthcare), Cy3 (GE Healthcare), Cy3B (GE Healthcare), Cy3.5 (GE Healthcare), u otros colorantes adecuados. Los ejemplos de porciones emisoras de luz incluyen, pero no se limitan a, Cy5, Cy5.5 (GE Healthcare), Cy7 (GE Healthcare), Alexa Fluor 647 (Invitrogen), Alexa Fluor 680 (Invitrogen), Alexa Fluor 700 (Invitrogen), Alexa Fluor 750 (Invitrogen), Alexa Fluor 790 (Invitrogen), DiD, DiR, YOYO-3 (Invitrogen), YO-PRO-3 (Invitrogen), TOT-3 (Invitrogen), TO-PRO-3 (Invitrogen) u otros colorantes adecuados. Estos pueden unirse entre sí, por ejemplo, covalentemente, por ejemplo, directamente, o a través de un ligador, por ejemplo, formando compuestos tales como, pero no limitados a, Cy5-Alexa Fluor 405, Cy5-Alexa Fluor 488, Cy5-Cy2, Cy5-Cy3, Cy5-Cy3.5, Cy5.5- Alexa Fluor 405, Cy5.5-Alexa Fluor 488, Cy5.5-Cy2, Cy5.5-Cy3, Cy5.5-Cy3.5, Cy7- Alexa Fluor 405, Cy7 -Alexa Fluor 488, Cy7-Cy2, Cy7-Cy3, Cy7-Cy3.5, Alexa Fluor 647-Alexa Fluor 405, Alexa Fluor 647-Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 647-Cy2, Alexa Fluor 647-Cy3, Alexa Fluor 647-Cy3.5, Alexa Fluor 750-Alexa Fluor 405, Alexa Fluor 750-Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 750-Cy2, Alexa Fluor 750-Cy3 o Alexa Fluor 750- Cy3.5. Los expertos en la técnica conocerán las estructuras de estos y otros compuestos, muchos de los cuales están disponibles comercialmente. Las porciones pueden estar unidas mediante un enlace covalente o un ligador, tales como los que descritos con detalle a continuación. Otras porciones activadoras o emisoras de luz pueden incluir porciones que tengan dos átomos de nitrógeno cuaternizados unidos por una cadena de polimetina, donde cada nitrógeno es independientemente parte de una molécula heteroaromática, tal como pirrol, imidazol, tiazol, piridina, quinoina, indol, benzotiazol, etc., o parte de una amina no aromática. En algunos casos, puede haber 5, 6, 7, 8, 9 o más átomos de carbono entre los dos átomos de nitrógeno.
En determinados casos, la porción emisora de luz y las porciones activadoras, cuando están aisladas entre sí, pueden ser cada una fluoróforos, es decir, entidades que pueden emitir luz de una determinada longitud de onda de emisión cuando se exponen a un estímulo, por ejemplo, una longitud de onda de excitación. Sin embargo, cuando se forma una entidad conmutable que comprende el primer fluoróforo y el segundo fluoróforo, el primer fluoróforo forma una primera porción emisora de luz y el segundo fluoróforo forma una porción activadora que conmuta y que activa o “conmuta” la primera porción en respuesta a un estímulo. Por ejemplo, la entidad conmutable puede comprender un primer fluoróforo unido directamente al segundo fluoróforo, o la primera y la segunda entidad pueden estar conectadas mediante un ligador o una entidad común. Puede comprobarse si un par de porción emisora de luz y porción activadora produce una entidad conmutable adecuada mediante métodos conocidos por los expertos en la técnica. Por ejemplo, puede usarse luz de diversas longitudes de onda para estimular el par y puede medirse la emisión de luz de la porción emisora de luz para determinar si el par produce una entidad de conmutación adecuado.
Como ejemplo no limitativo, Cy3 y Cy5 pueden unirse para formar una entidad de este tipo. En este ejemplo, Cy3 es una porción activadora capaz de activar a Cy5, la porción emisora de luz. Por tanto, la luz en o cerca del máximo de absorción (por ejemplo, cerca de 532 nm de luz para Cy3) de la porción de activación o segunda porción de la entidad puede provocar que esa porción active la primera porción emisora de luz, provocando así que la primera porción emita luz (por ejemplo, cerca de 647 nm para Cy5). Véase, por ejemplo, la patente estadounidense n.° 7.838.302. En algunos casos, la primera porción emisora de luz puede desactivarse posteriormente mediante cualquier técnica adecuada (por ejemplo, dirigiendo luz roja de 647 nm a la porción Cy5 de la molécula).
Otros ejemplos no limitativos de porciones activadoras potencialmente adecuadas incluyen 1,5 IAEDANS, 1,8-ANS, 4-metilumbeliferona, 5-carboxi-2,7-diclorofluoresceína, 5-carboxifluoresceína (5-FAM), 5-carboxinaftofluoresceína, 5-carboxitetrametilrhodamina (5-TAMRA), 5-FAM (5-carboxifluoresceína), 5-HAT (hidroxitriptamina), 5-hidroxitriptamina (HAT), 5-ROX (carboxi-X-rodamina), 5-TAMRA (5-carboxitrotetrametilrodamina), 6-carboxirodamina 6G, 6-<c>R 6G, 6-JOE, 7-amino-4-metilcumarina, 7-aminoactinomicina D (7-AAD), 7-hidroxi-4-metilcumarina, 9-amino-6-cloro-2-metoxiacridina, ABQ, fucsina ácida, ACMA (9-amino-6-cloro-2-metoxiacridina), naranja de acridina, rojo de acridina, amarillo de acridina, acriflavina, acriflavina Feulgen SITSA, Alexa Fluor 350, Alexa Fluor 405, Alexa Fluor 430, Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 500, Alexa Fluor 514, Alexa Fluor 532, Alexa Fluor 546, Alexa Fluor 555, Alexa Fluor 568, Alexa Fluor 594, Alexa Fluor 610, Alexa Fluor 633, Alexa Fluor 635, Alizarin Complexon, rojo de alizarina, AMC, AMCA-S, AMCA (aminometilcumarina), AMCA-X, aminoactinomicina D, aminocumarina, aminometilcumarina (AMCA), azul de anilina, estearato de antrocilo, APTRA-BTC, APTS, Astrazon rojo brillante 4G, Astrazon Naranja R, Astrazon Rojo 6B, Astrazon Amarillo 7 GLL, atabrina, ATTO 390, ATTO 425, ATTO 465, ATTO 488, ATTO 495, ATTO 520, ATTO 532, ATTO 550, ATTO 565, ATTO 590, ATTO 594, ATTO 610, ATTO 61 IX, ATTO 620, ATTO 633, ATTO 635, ATTO 647, ATTO 647N, ATTO 655, ATTO 680, ATTO 700, ATTO 725, ATTO 740, ATTO-TAG CBQCA, ATTO-TAG FQ, auramina, aurofosfina G, aurofosfina, BAO 9 (bisaminofeniloxadiazol), BCECF (pH alto), BCECF (pH bajo), sulfato de berberina, bimano, bisbenzamida, bisbenzimida (Hoechst), bis-BTC, Blancophor FFG, Blancophor SV, BOBO -1, BOBO -3, Bodipy 492/515, Bodipy 493/503, Bodipy 500/510, Bodipy 505/515, Bodipy 530/550, Bodipy 542/563, Bodipy 558/568, Bodipy 564/570, Bodipy 576/589, Bodipy 581/591, Bodipy 630/650-X, Bodipy 650/665-X, Bodipy 665/676, Bodipy Fl, Bodipy FL ATP, Bodipy Fl-ceramida, Bodipy R6G, Bodipy TMR, Bodipy TMR-X conjugado, Bodipy TMR-X, SE, Bodipy TR, Bodipy TR<a>TP, Bodipy TR-X SE, B<o>-PRO-1,<b>O-PRO-3, sulfoflavina brillante FF, BTC, BTC-5N, calceína, azul de calceína, Calcium Crimson, Calcium Green, colorante de Ca2+ Calcium Green-1, Calcium Green-2 Ca2+, Calcium Green-5N Ca2+, Calcium Green-C18 Ca2+, Calcium Orange, blanco de calcoflúor, Carboxi-X-rodamina (5-ROX), Cascade Blue, Cascade Yellow, catecolamina, CCF2 (GeneBlazer), CFDA, cromomicina A, cromomicina A, CL-NERF, CMFDA, faloidina de cumarina, CPM metilcumarina, CTC, CTC Formazan, Cy2, Cy3.1 8, Cy3.5, Cy3, Cy5.1 8, fluorosensor de AMP cíclico (FiCRhR), dabcilo, dansilo, dansilamina, dansilcadaverina, cloruro de dansilo, dansil DHPE, fluoruro de dansilo, DAPI, dapoxilo, dapoxil 2, dapoxil 3' DCFDA, DCFH (diacetato de diclorodihidrofluoresceína), DDAO, DHR (dihidrorodamina 123), di-4-An EPPS, Di-8-ANEPPS (no razón), DiA (4-DM6-ASP), diacetato de diclorodihidrofluoresceína (DCFH), trazador lipofílico DiD, DiD (DiIC18(5)), DIDS, dihidrorodamina 123 (DHR), Dil (DiIC18(3)), dinitrofenol, DiO (DiOC18(3)), DiR, DiR (DiIC18(7)), DM-NERF (pH alto), DNP, dopamina, DTAF, DY-630-NHS, DY-635-NHS, DyLight 405, DyLight 488, DyLight 549, DyLight 633, DyLight 649, DyLight 680, DyLight 800, ELF 97, eosina, eritrosina, eritrosina It C, bromuro de etidio, homodímero de etidio -1 (EthD-1), eucrisina, Euko Light, cloruro de europio (III), Fast Blue, FDA, Feulgen (pararosanilina), FIF (fluorescencia inducida por formaldehído), FITC, Flazo Orange, Fluo-3, Fluo-4, fluoresceína (FITC), diacetato de fluoresceína, Fluoro -Emerald, Fluoro-Gold (hidroxiestilbamidina), Fluor-Ruby, FluorX, FM 1-43, Fm 4-46, Fura Red (pH alto), Fura Red/Fluo-3, Fura-2, Fura-2/BCECF, rojo brillante de genacrilo B, amarillo brillante de genacrilo 10GF, rosa de genacrilo 3G, amarillo de genacrilo 5GF, GeneBlazer (CCF2), ácido gloxálico, azul granular, hematoporfirina, Hoechst 33258, Hoechst 33342, Hoechst 34580, HPTS, hidroxicumarina, hidroxiestilbamidina (FluoroGold), hidroxitriptamina, Indo-1, alto en calcio, Indo-1, bajo en calcio, indodicarbocianina (DiD), indotricarbocianina (DiR), Intrawhite Cf, JC-1, JO-JO-1, JO-PRO-1, LaserPro, Laurodan, LDS 751 (ADN), LDS 751 (ARN), Leucophor PAF, Leucophor SF, Leucophor WS, Lissamine rodamina, Lissamine rodamina B, homodímero de calceína/etidio, LOLO-1, LO-PRO-1, amarillo Lucifer, Lyso Tracker Blue, Lyso Tracker Blue-White, Lyso Tracker Green, Lyso Tracker Red, Lyso Tracker Yellow, LysoSensor Blue, LysoSensor Green, LysoSensor Yellow/Blue, Mag Green, Magdala Red (floxina B), Mag-Fura Red, Mag-Fura-2, Mag-Fura-5, Mag-Indo-1, Magnesium Green, Magnesium Orange, verde malaquita, Marina Blue, Maxilon Brilliant Flavin 10 GFF, Maxilon Brilliant Flavin 8 GFF, merocianina, metoxicumarina, Mitotracker verde FM, Mitotracker naranja, Mitotracker rojo, mitramicina, monobromobimano, monobromobimano (mBBr-GSH), monoclorobimano, MPS (metil pironina verde estilbeno), NBD, NBD amina, rojo Nilo, nitrobenzoxadidol, noradrenalina, Nuclear Fast Red, Nuclear Yellow, Nylosan Brilliant lavin E8G, Oregon Green, Oregon Green 488-X, Oregon Green, Oregon Green 488, Oregon Green 500, Oregon Green 514, Pacific Blue, pararosanilina (Feulgen), PBFI, floxina B (Magdala Red), Phorwite AR, Phorwite BKL, Phorwite Rev, Phorwite RPA, fosfina 3R, PKH26 (Sigma), PKH67, PMIA, Pontochrome Blue Black, POPO-1, POPO-3, PO-PRO-1, PO-PRO-3, Primuline, Procion Yellow, Propidium lodid (PI), PyMPO, pireno, pironina, pironina B, Pyrozal Brilliant Flavin 7GF, QSY 7, Quinacrine Mustard, Resorufin, RH 414, Rhod-2, rodamina, rodamina 110, rodamina 123, rodamina 5 GLD, rodamina 6G, rodamina B, rodamina B 200, rodamina B extra, rodamina BB, rodamina BG, rodamina verde, rodamina falicidina, rodamina falidina, rodamina roja, rodamina WT, rosa de Bengala, S65A, S65C, S65L, S65T, SBFI, serotonina, Sevron rojo brillante 2B, Sevron rojo brillante 4G, Sevron rojo brillante B, Sevron naranja, Sevron amarillo L, SITS, SITS (primulina), SITS (ácido estilbenisotiosulfónico), SNAFL calceína, SNAFL-1, SNAFL-2, SNARF calceína, SNARF1, Sodium Green, SpectrumAqua, SpectrumGreen, SpectrumOrange, Spectrum Red, SPQ (6-metoxi-N-(3-sulfopropil)quinolinio), estilbeno, sulforodamina B can C, sulforodamina extra, SYTO 11, SYTO 12, SYTO 13, SYTO 14, SYTO 15, SYTO 16, SYTO 17, SYTO 18, SYTO 20, SYTO 21, SYTO 22, SYTO 23, SYTO 24, SYTO 25, SYTO 40, SYTO 41, SYTO 42, SYTO 43, SYTO 44, SYTO 45, SYTO 59, SYTO 60, SYTO 61, SYTO 62, SYTO 63, SYTO 64, SYTO 80, SYTO 81, SYTO 82, SYTO 83, SYTO 84, SYTO 85, SYTOX Blue, SYTOX Green, SYTOX Orange, tetraciclina, tetrametilrodamina (TAMRA), rojo Texas, conjugado rojo Texas-X, tiadicarbocianina (DiSC3), rojo tiazina R, naranja tiazol, tioflavina 5, tioflavina S, tioflavina TCN, tiolito, naranja tiozol, tinopol CBS (blanco de calcoflúor), TMR, TO-PRO-1, TO-PRO-3, TO-PRO-5, TOTO-1, TOTO-3, TRITC (isotiocianato de tetrametilrodamina), True Blue, TruRed, Ultralite, Uranine B, Uvitex SFC, WW 781, X-rodamina, XRITC, naranja de xileno, Y66F, Y66H, Y66W, YO-PRO-1, YO-PRO-3, YOYO-1, YOYO-3, SYBR Green, naranja de tiazol (tintes interquelantes), o combinaciones de los mismos.
En algunos aspectos, los nucleótidos pueden usarse para estudiar una muestra, tal como una muestra biológica. Por ejemplo, los nucleótidos pueden usarse para determinar ácidos nucleicos dentro de una célula u otra muestra. La muestra puede incluir un cultivo celular, una suspensión de células, un tejido biológico, una biopsia, un organismo o similar. La muestra también puede estar libre de células, pero contener ácidos nucleicos. Si la muestra contiene una célula, la célula puede ser una célula humana o cualquier otra célula adecuada, por ejemplo, una célula de mamífero, de pez, de insecto, de planta o similar. En algunos casos puede haber más de una célula presente.
Los ácidos nucleicos que van a determinarse pueden ser, por ejemplo, ADN, ARN u otros ácidos nucleicos presentes en una célula (u otra muestra). Los ácidos nucleicos pueden ser endógenos a la célula o añadirse a la célula. Por ejemplo, el ácido nucleico puede ser viral o creado artificialmente. En algunos casos, el ácido nucleico que va a determinarse puede ser expresado por la célula. En algunas realizaciones, el ácido nucleico es ARN. El ARN puede ser codificante y/o no codificante. Los ejemplos no limitativos de ARN que pueden estudiarse dentro de la célula incluyen ARNm, ARNip, ARNr, miARN, ARNt, ARNInc, ARNpno, ARNpn, ARNex, piARN, o similares. En algunas realizaciones, por ejemplo, al menos algunos de la pluralidad de oligonucleótidos son complementarios a una porción de una secuencia cromosómica específica, por ejemplo, de un cromosoma humano.
En algunos casos, puede estudiarse una parte significativa del ácido nucleico presente en la célula. Por ejemplo, en algunos casos, puede determinarse suficiente ARN presente en una célula para producir un transcriptoma parcial o completo de la célula. En algunos casos, se determinan al menos 4 tipos de ARNm dentro de una célula, y en algunos casos, al menos 3, al menos 4, al menos 7, al menos 8, al menos 12, al menos 14, al menos 15, al menos 16, al menos 22, al menos 30, al menos 31, al menos 32, al menos 50, al menos 63, al menos 64, al menos 72, al menos 75, al menos 100, al menos 127, al menos 128, al menos 140, al menos 255, al menos 256, al menos 500, al menos 1.000, al menos 1.500, al menos 2.000, al menos 2.500, al menos 3.000, al menos 4.000, al menos 5.000, al menos 7.500, al menos 10.000, al menos 12.000, al menos 15.000, al menos 20.000, al menos 25.000, al menos 30.000, al menos 40.000, al menos 50.000, al menos 75.000, o al menos 100.000 tipos de ARNm pueden determinarse dentro de una célula.
En algunos casos, puede determinarse el transcriptoma de una célula. Debe entenderse que el transcriptoma generalmente abarca todas las moléculas de ARN producidas dentro de una célula, no sólo el ARNm. Por tanto, por ejemplo, el transcriptoma también puede incluir ARNr, ARNt, etc. En algunas realizaciones, puede determinarse al menos el 5 %, al menos el 10 %, al menos el 15 %, al menos el 20 %, al menos el 25 %, al menos el 30 %, al menos el 40 %, al menos el 50 %, al menos el 60 %, al menos el 70 %, al menos el 80 %, al menos el 90 % o el 100 % del transcriptoma de una célula.
La determinación de uno o más ácidos nucleicos dentro de la célula u otra muestra puede ser cualitativa y/o cuantitativa. Además, la determinación también puede ser espacial, por ejemplo, la posición del ácido nucleico dentro de la célula u otra muestra puede determinarse en dos o tres dimensiones. En algunas realizaciones, pueden determinarse las posiciones, el número y/o las concentraciones de ácidos nucleicos dentro de la célula (u otra muestra).
Un ejemplo no limitativo de un sistema de este tipo puede encontrarse en la solicitud de patente provisional estadounidense con n.° de serie 62/031,062, presentada el 30 de julio de 2014, titulada “Systems and Methods for Determining Nucleic Acids”, de Zhuang,et al.
La patente estadounidense n.° 7.838.302, concedida el 23 de noviembre de 2010, titulada “Sub-Diffraction Limit Image Resolution and Other Imaging Techniques”, de Zhuanget al.;la patente estadounidense n.° 8.564.792, concedida el 22 de octubre de 2013, titulada “Sub-diffraction Limit Image Resolution in Three Dimensions”, de Zhuang,et al.;y la publicación de solicitud de patente internacional n.° WO 2013/090360, publicada el 20 de junio de 2013, titulada “High Resolution Dual-Objective Microscopy”, de Zhuang,et al.La solicitud de patente provisional estadounidense con n.° de serie 62/031.062, presentada el 30 de julio de 2014, titulada “Systems and Methods for Determining Nucleic Acids”, de Zhuang,et al.;la solicitud de patente provisional estadounidense con n.° de serie 62/050.636, presentada el 15 de septiembre de 2014, titulada “Probe Library Construction”, de Zhuang,et al.;la solicitud de patente provisional estadounidense n.° 62/142.653, presentada el 3 de abril de 2015, titulada “Systems and Methods for Determining Nucleic Acids”, de Zhuang,et al.;y una solicitud PCT presentada en la misma fecha que la presente, titulada “Systems and Methods for Determining Nucleic Acids”, de Zhuang,et al.
Se pretende que los siguientes ejemplos ilustren determinadas realizaciones de la presente invención, pero no ejemplifiquen el alcance total de la invención.
EJEMPLO 1
Este ejemplo ilustra la construcción de hibridación de alto rendimiento de sondas de ADN, según determinadas realizaciones de la invención.
Resumen. Este protocolo utiliza bibliotecas complejas de oligonucleótidos como moldes para la construcción enzimática de grandes cantidades de moléculas de ADN monocatenario que pueden marcarse químicamente y que están diseñadas para hibridarse con conjuntos específicos de dianas de ácidos nucleicos que pueden variar significativamente en complejidad, es decir, el número de secuencias diana únicas. El uso de este protocolo implica varias etapas básicas: 1) diseño computacional y optimización de un conjunto de secuencias de oligonucleótidos que servirán como regiones de hibridación en la muestra de interés; 2) diseño computacional y optimización de un gran conjunto de secuencias cortas de oligonucleótidos que servirán como cebadores de PCR altamente específicos; 3) construcción computacional de las moléculas molde; 4) síntesis de las moléculas molde para crear la biblioteca de moldes; 5) selección de un subconjunto de moléculas moldein vitroa partir de una biblioteca de moldes mediante PCR; 6) amplificación basada en transcripciónin vitrode las moléculas moldein vitropara dar ARN, que sirve como molde final para las sondas de hibridación; 7) transcripción inversa del ARN de nuevo en ADN usando cebadores modificados químicamente; 8) eliminación del ARN mediante hidrólisis alcalina; y 9) purificación de las moléculas de ADNmc modificadas químicamente, denominadas sondas en este ejemplo. Estas etapas se detallan a continuación. Construcción de sondas. Selección de regiones de hibridación. En este ejemplo se usó el software OligoArray 2.0 para diseñar un amplio conjunto de posibles regiones de hibridación en el transcriptoma deE. coli.En resumen, este software selecciona las regiones de hibridación que se encuentran dentro de los intervalos especificados por el usuario en cuanto a longitud y temperatura de fusión. Este software también examina la hibridación inespecífica, así como la estructura secundaria potencial. Este software se usó para generar regiones de hibridación de 30 nt de longitud, un intervalo de temperatura de fusión de 80-85 °C, un contenido de GC de entre el 50 y el 60 %, y un umbral de fusión de estructura secundaria y temperatura de fusión de hibridación cruzada de 75 °C usando todos los ARNm transcritos y anotados enE. coli(K-12 mgl655; NC90013.2).
Diseño de cientos de cebadores ortogonales. El conjunto general de sondas de hibridación puede requerir muchas menos secuencias únicas que las proporcionadas por los complejos conjuntos de oligonucleótidos normalmente generados por la síntesis basada en matrices: la agrupación de oligonucleótidos. Para explotar esta disparidad en complejidad y reducir significativamente el coste por experimento, este ejemplo usa un método para incrustar un gran número de conjuntos de moldes únicos dentro de una única agrupación de oligonucleótidos. Brevemente, cada molécula de molde fue flanqueada por un par único de cebadores de PCR comunes sólo a las moléculas de molde para todas las sondas dentro de un conjunto dado. Para facilitar la incrustación de cientos de conjuntos de moldes de sondas únicas dentro de una única agrupación de oligonucleótidos, se creó un protocolo para construir cientos de cebadores de PCR ortogonales.
Específicamente, el protocolo comienza truncando los miembros de una biblioteca existente de 240.000 oligonucleótidos semiortogonales de 25-mer a una longitud de 20 nt y seleccionando los oligos en función de parámetros óptimos para la PCR: un rango estrecho de temperatura de fusión prevista (65-70 °C) y contenido de GC (50-60 %); la ausencia de tramos contiguos de la misma base de más de 4, es decir, AAAA; y la presencia de un pinzamiento de GC en 3', es decir, 2-3 G/C dentro de los 5 nt finales. A continuación, se ejecutó BLAST con estos cebadores optimizados frente a todos los ARN anotados en el transcriptoma deE. coli,así como el promotor T7 (TAATACGACTCACTATAGGG) (SEQ ID NO. 1) y una región de cebado común (P9: CAGGCATCCGAGAGGTCTGG) (SEQ ID NO. 2) y se eliminaron los cebadores potenciales con coincidencias con el transcriptoma con 12 nt o más de homología, o con una coincidencia de cualquier longitud dentro de los 3 nt del extremo 3' del cebador potencial. Por último, se examinaron los cebadores restantes en busca de homología entre ellos, de nuevo usando BLAST. Se eliminó cualquier cebador con más de 11 nt de homología o con cualquier homología dentro de 3 nt del extremo 3' de otro cebador. Estos cortes redujeron los 240.000 oligos originales a 198 cebadores altamente optimizados para el transcriptoma deE. coli.El conjunto final de 198 cebadores se muestra en la figura 3.
Si fuera necesario, podrían generarse más cebadores usando técnicas establecidas para crear un conjunto mayor de oligonucleótidos iniciales, o relajando la rigurosidad de los cortes descritos anteriormente. Por último, al cambiar el transcriptoma usado para seleccionar los cebadores, este enfoque también puede generalizarse a la generación de cebadores de índice óptimos para cualquier organismo.
Construcción de moldes. Para diseñar las bibliotecas de moldes usadas para crear los conjuntos de sondas, en primer lugar, se seleccionaron las dianas de ARN deseadas para teñirlas simultáneamente. Las moléculas de molde individuales se diseñaron concatenando las siguientes secuencias: i) el primero de los dos cebadores únicos para el grupo de ARNm apropiado, ii) el cebador común P9, iii) el sitio para la enzima de corte Nb.BsmI, iv) el complemento inverso de la región de hibridación con la diana, v) el complemento inverso de la enzima de corte Nb.BsrDI, y vi) el complemento inverso del segundo cebador único para el grupo de ARNm dado. La figura 2 muestra esta organización. Se combinaron múltiples conjuntos de moldes de sondas en grandes agrupaciones de oligonuleótidos y estas agrupaciones se sintetizaron mediante CustomArray.
La figura 2 muestra una secuencia molde de ejemplo que contiene una sonda el ARNm, acnB. Subrayada al principio está la secuencia del primer cebador, no subrayado está el sitio de cebado común P9, luego subrayado está el sitio Nb.BsmI, no subrayado está el complemento inverso de la región de hibridación para acnB, el siguiente subrayado es el complemento inverso del sitio Nb.BsrDI, y la porción final no subrayada es el segundo cebador único. Este molde es uno de las 736 usados para crear sondas para teñir todos los ARNm expresados en el intervalo de número de copias de 1-10 por célula transcritos del locus genómico deE. colicorrespondiente a pares de bases de 1-100 kb. Véase en la figura 4 las secuencias de las 736 sondas.
PCR de índice. Los moldes para conjuntos de sondas específicos se seleccionaron de la agrupación de oligonucleótidos compleja mediante PCR de ciclo limitado. Se combinaron de 0,5 a 1 ng de la agrupación de oligonucleótidos compleja con 0,5 micromolar de cada cebador. El cebador directo correspondía a la secuencia de cebado del subconjunto deseado, mientras que el cebador inverso era una concatenación de extremo 5' de esta secuencia con el promotor T7. Para evitar la generación de G-cuadrupletes, que pueden ser difíciles de sintetizar, las G terminales requeridas en el promotor T7 se generaron a partir de G situadas en el extremo 5' de la región de cebado cuando procedía. Todos los cebadores se sintetizaron mediante IDT. Se amplificó un volumen de reacción de 50 microlitros usando el kit de amplificación de bibliotecas en tiempo real KAPA (KAPA Biosystems; KK2701) o mediante una mezcla de qPCR casera que incluía EvaGreen 0,8X (Biotum; 31000-T) y la polimerasa Phusion de arranque en caliente (New England Biolabs; M0535S). La amplificación se siguió en tiempo real usando el MX300P de Agilent o el CFX Connect de Biorad. Se eliminaron muestras individuales antes de la meseta de amplificación, a menudo a concentraciones aproximadamente 10 veces inferiores a las que corresponderían a esta meseta, para minimizar la distorsión de la abundancia del molde debido a la sobreamplificación. Los moldes individuales se purificaron con columnas siguiendo las instrucciones del fabricante (Zymo DNA Clean and Concentrator; D4003) y se eluyeron en agua desionizada libre de ARNasa.
Amplificación mediante transcripciónin vitro.A continuación, se amplificó el molde mediante transcripciónin vitro.Brevemente, de 0,5 a 1 microgramos de ADN molde se amplificaron para dar de 100 a 200 microgramos de ARN en una única reacción de 20-30 microlitros con una ARN polimerasa de alto rendimiento (New England Biolabs; E2040S). Las reacciones se complementaron con un inhibidor de la ARNasa IX (Promega RNasin; N2611). La amplificación se realizó normalmente durante de 2 a 4 horas a 37 °C para maximizar el rendimiento. El ARN no se purificó después de la reacción y se almacenó a -80 °C o se convirtió inmediatamente en ADN tal como se describe a continuación.
Transcripción inversa. Se crearon 1-2 nmol de sonda de ADNmc marcada con fluorescencia a partir de las reacciones de transcripciónin vitroanteriores usando la transcriptasa inversa Maxima H- (Thermo Scientific; EP0751). Se usó esta enzima debido a su mayor procesividad y resistencia a la temperatura, lo que permitió la conversión de grandes cantidades de ARN en ADN dentro de pequeños volúmenes a temperaturas que desfavorecen la formación de estructuras secundarias. El ARN no purificado creado anteriormente se complementó con 1,6 mM de cada dNPT, 1-2 nmol de cebador P9 marcado con fluorescencia, 300 unidades de Maxima H-, 60 unidades de RNasin y una concentración final 1X del tampón Maxima RT. El volumen final de 75 microlitros se incubó a 50 °C durante 60 minutos.
Selección y purificación de la cadena. El ARN molde de la reacción anterior se eliminó del ADN mediante hidrólisis alcalina. Se añadieron 75 microlitros de una disolución de EDTA 0,25 M y NaOH 0,5 N a cada reacción de transcripción inversa, y la muestra se incubó a 95 °C durante 10 minutos. La reacción se neutralizó inmediatamente purificando la sonda de ADNmc con una versión modificada del protocolo Zymo Oligo Clean and Concentrator. Específicamente, la columna de 5 microgramos de capacidad se sustituyó por una columna de ADN de 100 microgramos de capacidad, según fuera apropiado. El resto del protocolo se realizó según las instrucciones del fabricante. La sonda se eluyó en 100 microlitros de agua desionizada libre de ARNasa y se evaporó en un concentrador de vacío. El sedimento final se resuspendió en 10 microlitros de agua libre de ARNasa y se almacenó a -20 °C. La electroforesis en gel de poliacrilimida desnaturalizante y la espectroscopia de absorción revelaron que este protocolo suele producir una incorporación del 90-100 % del cebador fluorescente en la sonda de longitud completa y una recuperación del 60-75 % de la sonda fluorescente total. Por tanto, sin superar un volumen de reacción de 150 microlitros, este protocolo puede usarse para crear ~2 nmol de sonda fluorescente. Los pequeños volúmenes de reacción favorecían el uso de técnicas de manipulación de fluidos de alto rendimiento y reducían significativamente el coste de esta reacción en comparación con enfoques alternativos. Por tanto, pudieron construirse 24-96 sondas en paralelo, con un tiempo mínimo de trabajo práctico, a lo largo de dos días, por un coste final de ~14 dólares por 2 nmol de cada conjunto de sondas.
Todas las definiciones, tal como se definen y se usan en el presente documento, deben entenderse que prevalecen sobre las definiciones de diccionario, las definiciones de los documentos y/o los significados ordinarios de los términos definidos.
Los artículos indefinidos “un” y “una”, tal como se usan en la memoria descriptiva del presente documento y en las reivindicaciones, a menos que se indique claramente lo contrario, deben entenderse en el sentido de “al menos uno”. La expresión “y/o”, tal como se usa en la memoria descriptiva y en las reivindicaciones, debe entenderse en el sentido de “uno o ambos” de los elementos así combinados, es decir, elementos que están presentes conjuntamente en algunos casos y disyuntivamente en otros. Los elementos múltiples enumerados con “y/o” deben interpretarse de la misma manera, es decir, “uno o más” de los elementos así combinados. Opcionalmente, pueden estar presentes otros elementos distintos de los identificados específicamente por la cláusula “y/o”, ya estén relacionados o no con los elementos identificados específicamente. Por tanto, como ejemplo no limitativo, una referencia a “A y/o B”, cuando se usa junto con un lenguaje abierto tal como “que comprende” puede referirse, en una realización, sólo a A (incluyendo opcionalmente elementos distintos de B); en otra realización, sólo a B (incluyendo opcionalmente elementos distintos de A); en otra realización, tanto a A como a B (incluyendo opcionalmente otros elementos); etc. Tal como se usa en la presente memoria descriptiva y en las reivindicaciones, debe entenderse que “o” tiene el mismo significado que “y/o”, tal como se definió anteriormente. Por ejemplo, al separar elementos en una lista, “o” o “y/o” se interpretará como inclusivo, es decir, la inclusión de al menos uno, pero también incluyendo más de uno, de un número o lista de elementos y, opcionalmente, elementos adicionales no incluidos en la lista. Sólo los términos que indiquen claramente lo contrario, tales como “sólo uno de” o “exactamente uno de”, o, cuando se use en las reivindicaciones, “que consiste en”, se referirán a la inclusión de exactamente un elemento de un número o lista de elementos. En general, el término “o”, tal como se usa en el presente documento, sólo se interpretará en el sentido de que indica alternativas excluyentes (es decir, “uno u otro, pero no ambos”) cuando vaya precedido de términos de exclusividad, tales como “o bien”, “uno de”, “sólo uno de” o “exactamente uno de”. “Que consiste esencialmente en”, cuando se usa en las reivindicaciones, tendrá su significado ordinario tal como se usa en el campo del derecho de patentes.
Tal como se usa en la presente memoria descriptiva y en las reivindicaciones, la expresión “al menos uno”, en referencia a una lista de uno o más elementos, debe entenderse en el sentido de al menos un elemento seleccionado de uno cualquiera o más de los elementos de la lista de elementos, pero sin incluir necesariamente al menos uno de todos y cada uno de los elementos específicamente enumerados en la lista de elementos y sin excluir ninguna combinación de elementos de la lista de elementos. Esta definición también permite que, opcionalmente, puedan estar presentes elementos distintos de los elementos específicamente identificados dentro de la lista de elementos a los que se refiere la frase “al menos uno”, ya estén relacionados o no con los elementos específicamente identificados. Por tanto, como ejemplo no limitativo, “al menos uno de A y B” (o, equivalentemente, “al menos uno de A o B”, o, equivalentemente “al menos uno de A y/o B”) puede referirse, en una realización, a al menos uno, incluyendo opcionalmente más de uno, A, sin que esté presente B (y opcionalmente incluyendo elementos distintos de B); en otra realización, a al menos uno, incluyendo opcionalmente más de uno, B, sin que esté presente A (y opcionalmente incluyendo elementos distintos de A); en aún otra realización, a al menos uno, incluyendo opcionalmente más de uno, A, y al menos uno, incluyendo opcionalmente más de uno, B (y opcionalmente incluyendo otros elementos); etc.
También debe entenderse que, a menos que se indique claramente lo contrario, en cualquier método reivindicado en el presente documento que incluya más de una etapa o acto, el orden de las etapas o actos del método no se limita necesariamente al orden en el que se recitan las etapas o actos del método.
En las reivindicaciones, así como en la memoria descriptiva anterior, todas las expresiones transicionales tales como “que comprende”, “que incluye”, “que porta”, “que tiene”, “que contiene”, “que implica”, “que retiene”, “se compone de” y similares deben entenderse como abiertas, es decir, que significan que incluyen, pero no se limitan a. Sólo las expresiones transicionales “que consiste en” y “que consiste esencialmente en” serán expresiones transicionales cerradas o semicerradas, respectivamente.

Claims (7)

  1. REIVINDICACIONES
    i. Método de producción de ADN mediante amplificación de una pluralidad de oligonucleótidos de secuencias únicas, que comprende:
    amplificar al menos alguna de una pluralidad de oligonucleótidos contenidos en una disolución común usando PCR en tiempo real para producir oligonucleótidos amplificados, en el que la pluralidad de oligonucleótidos comprende al menos un primer conjunto de oligonucleótidos que tienen una primera región de índice común complementaria a uno o más cebadores de PCR, en el que la primera región de índice común comprende una secuencia idéntica que tiene una longitud de más de 5, 7, 10, 12, 14, 16, 18 ó 20 nucleótidos;
    transcribirin vitroal menos alguno de los oligonucleótidos amplificados para producir ARN;
    transcribir inversamente el ARN para producir ADN transcrito; y
    degradar selectivamente el ARN en relación con el ADN transcrito.
  2. 2. Método según la reivindicación 1, en el que la primera región de índice común comprende una secuencia idéntica que tiene una longitud de más de 5, 7, 10, 12, 14, 16, 18 ó 20 nucleótidos, y que tiene una longitud de menos de 30, 28, 25, 22, 20, 18, 16, 14, 12 ó 10 nucleótidos.
  3. 3. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, en el que la pluralidad de oligonucleótidos incluye al menos 10 secuencias de oligonucleótidos únicas, preferiblemente al menos 100 secuencias de oligonucleótidos únicas, preferiblemente al menos 1.000 secuencias de oligonucleótidos únicas, preferiblemente al menos 10.000 secuencias de oligonucleótidos únicas, preferiblemente al menos 100.000 secuencias de oligonucleótidos únicas.
  4. 4. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que las secuencias de oligonucleótidos únicas comprenden, cada una, una primera región que es idéntica en las secuencias de oligonucleótidos únicas, y una segunda región que no es idéntica en las secuencias de oligonucleótidos únicas, preferiblemente en el que las secuencias de oligonucleótidos únicas comprenden, cada una, una tercera región que es idéntica en las secuencias de oligonucleótidos únicas, en el que la segunda región separa la primera región y la tercera región.
  5. 5. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que la amplificación de al menos alguna de la pluralidad de oligonucleótidos comprende exponer al menos alguna de la pluralidad de oligonucleótidos a secuencias que contienen cebadores, preferiblemente en el que al menos algunas de las secuencias que contienen cebadores comprenden además un promotor, en el que el promotor se añade a al menos algunos de los oligonucleótidos amplificados.
  6. 6. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en el que al menos uno de los oligonucleótidos amplificados contiene un promotor, preferiblemente un promotor<t>7, un promotor T3 o un promotor SP6.
  7. 7. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en el que al menos alguna de la pluralidad de oligonucleótidos comprende además un segundo conjunto de oligonucleótidos que tienen una segunda región de índice común distinguible de la primera región de índice común, preferiblemente:
    (a) que comprende amplificar el primer conjunto de oligonucleótidos, pero no el segundo conjunto de oligonucleótidos; y/o
    (b) en el que la pluralidad de oligonucleótidos comprende al menos 2 conjuntos de oligonucleótidos que tienen regiones de índice común distinguibles, preferiblemente 4 conjuntos de oligonucleótidos que tienen regiones de índice común distinguibles, preferiblemente 10 conjuntos de oligonucleótidos que tienen regiones de índice común distinguibles, preferiblemente al menos 20 conjuntos de oligonucleótidos que tienen regiones de índice común distinguibles, preferiblemente al menos 96 conjuntos de oligonucleótidos que tienen regiones de índice común distinguibles, preferiblemente al menos 100 conjuntos de oligonucleótidos que tienen regiones de índice común distinguibles, preferiblemente al menos 192 conjuntos de oligonucleótidos que tienen regiones de índice común distinguibles.
    8. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en el que amplificar al menos alguna de la pluralidad de oligonucleótidos comprende producir oligonucleótidos amplificados que comprenden un oligonucleótido de la pluralidad de oligonucleótidos y el promotor.
    9. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en el que la transcripción de al menos algunos de los oligonucleótidos amplificados comprende:
    (a) producir una masa de ARN que es al menos 100 veces mayor que la masa de oligonucleótidos amplificados; y/o
    (b) exponer los oligonucleótidos amplificados a una ARN polimerasa, preferiblemente en el que la ARN polimerasa es una ARN polimerasa T7; una ARN polimerasa T3; una ARN polimerasa SP6; una ARN polimerasa I; una ARN polimerasa II; una ARN polimerasa III; una ARN polimerasa IV o una ARN polimerasa V; o una ARN polimerasa viral; y/o
    (c) producir, en promedio, al menos 10 copias de ARN de cada uno de los oligonucleótidos amplificados, preferiblemente al menos 100 copias de ARN, preferiblemente al menos 1.000 copias de ARN, preferiblemente al menos 100.000 copias de ARN.
    Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en el que se transcribe inversamente el ARN: (a) comprende exponer el ARN a una transcriptasa inversa, preferiblemente en el que la transcriptasa inversa es una transcriptasa inversa viral; y/o
    (b) se produce sin purificar en primer lugar el ARN de los componentes usados para producir el ARN; y/o (c) comprende la transcripción inversa del ARN para producir ADN transcrito usando una secuencia que contiene un cebador de transcripción, preferiblemente en el que la secuencia contiene un cebador de transcripción:
    (i) se incorpora al ADN transcrito; y/o
    (ii) comprende además un resto de biotina; y/o
    (iii) comprende además un resto de digoxigenina; y/o
    (iv) comprende además un fluoróforo; y/o
    (v) comprende además un resto de ácido no nucleico; y/o
    (vi) comprende además una entidad de señalización unida a la misma, preferiblemente en el que la entidad de señalización es (A) fluorescente y/o (B) fotoconmutable entre un primer estado capaz de emitir luz a una primera longitud de onda, y un segundo estado no capaz de emitir luz a la primera longitud de onda, y/o (C) fotoactivable, y/o (D) una secuencia de ácido nucleico, preferiblemente en el que la secuencia de ácido nucleico es capaz de hibridarse selectivamente con una segunda secuencia de ácido nucleico que contiene una entidad de señalización adicional mediante apareamiento de bases de Watson-Crick.
    Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-10, que comprende además purificar el ARN de los componentes usados para producir el ARN antes de transcribir inversamente el a Rn para producir ADN transcrito.
    Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-11, en el que la degradación selectiva del ARN con respecto al ADN transcrito comprende:
    (a) reducir químicamente el ARN; y/o
    (b) exponer el ARN a un pH de al menos aproximadamente 9; y/o
    (c) someter el ARN a hidrólisis alcalina; y/o
    (d) digerir enzimáticamente el ARN.
    Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-12, que comprende además purificar el ADN transcrito, comprendiendo preferiblemente purificar el ADN transcrito mediante:
    (a) purificación en columna; y/o
    (b) precipitación con etanol; y/o
    (c) inmovilización reversible en fase sólida.
    14. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, que comprende además concentrar el ADN transcrito, preferiblemente por evaporación.
    15. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-14, en el que la pluralidad de oligonucleótidos :
    (a) son diseñados computacionalmente; y/o
    (b) son producidos sintéticamente, y/o
    (c) se produce sobre un sustrato, preferiblemente en el que la pluralidad de oligonucleótidos se produce en una matriz sobre un sustrato.
    16. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-15, que comprende además separar un subconjunto del ADN, y/o en el que cada oligonucleótido de un subconjunto de los oligonucleótidos comprende una porción de índice que es idéntica, y/o en el que cada ADN transcrito de un subconjunto de los oligonucleótidos comprende una porción de índice que es idéntica, comprendiendo el método además separar el subconjunto del ADN transcrito basándose en las porciones de índice idénticas.
    17. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-16, en el que la pluralidad de oligonucleótidos tiene una distribución de longitudes tal que no más del 10 % de los oligonucleótidos tiene una longitud que es de menos del 80 % o de más del 120 % de la longitud promedio global de la pluralidad de nucleótidos, preferiblemente de tal manera que no más del 10 % de los oligonucleótidos tiene una longitud de menos del 90 % o de más del 110 % de la longitud promedio global de la pluralidad de nucleótidos, preferiblemente de tal manera que no más del 10 % de los oligonucleótidos tiene una longitud que es de menos del 95 % o de más del 105 % de la longitud promedio global de la pluralidad de nucleótidos.
    18. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-17, en el que la primera región de índice común comprende una secuencia idéntica de entre 18 y 22 nucleótidos.
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