ES2624562T3 - Obtención de imágenes de moléculas de ARNm individuales, usando múltiples sondas marcadas con un solo marcador - Google Patents

Abstract

Un método para detectar una primera secuencia diana de moléculas de ARNm individuales en una célula permeabilizada fijada, y dicho método comprende: sumergir la célula permeabilizada fijada en una solución de hibridación que contiene un exceso de un primer conjunto de al menos 30 sondas de hibridación de ácidos nucleicos no solapadas, que tienen secuencias complementarias de dicha primera secuencia diana, que tienen de 7 a 30 nucleótidos de longitud y que se marcan con un solo marcador: el mismo primer marcador fluoróforo de un primer color; lavar la célula fijada para retirar las sondas no unidas; y detectar los puntos de dicho primer fluoróforo en la célula fijada lavada.

Description

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DESCRIPCION

Obtencion de imagenes de moleculas de ARNm individuals, usando multiples sondas marcadas con un solo marcador

Relacion con solicitudes anteriores

Esta solicitud reivindica prioridad sobre una Solicitud provisional estadounidense, 61/191.724, registrada el 10 de septiembre de 2008.

Campo de la invencion

Esta invencion se refiere de manera general a metodos para la deteccion de secuencias de acidos nucleicos. Antecedentes

A medida que ha ido quedando cada vez mas claro que la expresion genica en las celulas, tomadas de una en una, se aleja significativamente del comportamiento promedio de las poblaciones de celulas, se precisa de metodos nuevos que proporcionen recuentos exactos, en forma de numeros enteros, de los numeros de copias de ARNm contenidos en cada celula. En el caso idoneo, dichos metodos debenan asimismo revelar las localizaciones intracelulares de los ARNm, puesto que la localizacion del ARNm es a menudo usada por las celulas para restringir espacialmente el gen de actividad.

La hibridacion in situ, seguida de analisis mediante microscopfa, es una manera bien establecida de estudiar la expresion genica. La primera generacion de hibridaciones in situ se llevo a cabo con sondas radiactivas. Pronto se introdujeron mejoras en las que se uman las sondas a enzimas que catalizan reacciones cromogenicas o fluorogenicas. Sin embargo, dado que los productos de dichas reacciones eran pequenas moleculas o precipitados que se alejan, por difusion, de la sonda, no podfa determinarse con precision la localizacion de las moleculas diana. Y si bien las sondas marcadas directamente con unos pocos fluoroforos manteman la resolucion espacial, la sensibilidad que se puede lograr con ellas es relativamente escasa.

Robert Singer et col. desarrollaron un procedimiento de hibridacion in situ que no solo era lo suficientemente sensible para posibilitar la deteccion de moleculas unicas de ARNm, sino que, ademas, restringfa las senales a las cercamas mas inmediatas de las dianas. Hibridaron cinco sondas de oligonucleotidos simultaneamente con cada ARNm diana; cada sonda tema unos 50 nucleotidos de longitud y se marco con cinco fracciones fluoroforo. Pese a que los autores demostraron convincentemente que se obtema sensibilidad a un nivel de molecula unica, y pese a que otros grupos han usado de manera satisfactoria estas sondas, el sistema no ha sido adoptado ampliamente. Uno de los motivos de la no adopcion de dicho procedimiento es la dificultad de la smtesis y purificacion de oligonucleotidos abundantemente marcados. Habitualmente, las fracciones fluoroforo se introducen mediante grupos amino primario que se incorporan a los oligonucleotidos durante la smtesis de estos ultimos. Cuando se introducen varios grupos amino en el mismo oligonucleotido, algunos se pierden a causa de reacciones secundarias tales como la transamidacion. La union de los fluoroforos a los grupos amino que quedan es ineficiente y exige llevar a cabo varias reacciones de union consecutivas; ademas, resulta diffcil purificar, a partir de oligonucleotidos unidos parcialmente, oligonucleotidos en los que todos los sitios disenados esten unidos a fluoroforos. Asimismo, cuando algunos fluoroforos estan presentes en forma de varias copias en el mismo oligonucleotido, interaccionan entre sf, de modo tal que alteran las caractensticas de hibridacion de los oligonucleotidos y realizan una severa autosupresion. Estos problemas se evitanan si cada sonda tuviese unicamente un solo grupo amino terminal que sirviese de sitio de union.

Otro problema que surge cuando se usan cantidades pequenas de sondas abundantemente marcadas es que se pierde una porcion significativa de fluorescencia por cada sonda que no se une a la diana; ademas, cada instancia de union no espedfica aumenta el “ruido de fondo” (o “fondo”). Esto conduce a una distribucion mas diseminada del numero de sondas unidas a cada ARNm diana. Por ejemplo, Femino et al. calcularon que, cuando se usaban 5 sondas fluorescentes que teman como diana un unico ARNm, la mayona de los puntos fluorescentes observados teman intensidades que indicaban la presencia de tan solo 1 o 2 sondas. Science 280, 585-590 (1998). Ello dificulta la identificacion no ambigua de dichos puntos fluorescentes como moleculas de ARNm, puesto que es imposible determinar si la deteccion de una sonda individual se deriva de una union deseada al ARNm diana o de una union no espedfica. Estos problemas de “procesamiento mediante umbrales” limitan la capacidad de dichos metodos para proporcionar recuentos fiables de los numeros de moleculas de ARNm presentes en una celula concreta.

Por ello, existe la necesidad de lograr metodos mejorados que proporcionen recuentos fiables de los numeros de moleculas de ARNm presentes en celulas individuales, asf como la necesidad de lograr sondas que sean faciles de sintetizar y de purificar.

Resumen de la invencion

Esta invencion da a conocer un metodo para detectar moleculas de ARNm individuales en celulas permeabilizadas fijadas, usando varias sondas de hibridacion de acidos nucleicos que se marcan fluorescentemente con un solo

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marcador, como, por ejemplo, con el mismo fluoroforo. Los inventores han descubierto algo sorprendente: que si al menos 30, preferiblemente de 40 a 60, y muy preferiblemente 48 sondas diferentes, todas marcadas con el mismo fluoroforo, se hibridan simultaneamente con una secuencia diana de una molecula de ARNm, se crea un punto fluorescente que puede detectarse a partir de las fluorescencias combinadas de las multiples sondas. Las sondas no se solapan; es decir, que la region de la secuencia diana con la que se hibrida cada sonda es unica (no se solapa con otra de tales regiones). Las sondas, de un conjunto de 30 o mas, destinadas a hibridarse con una secuencia diana seleccionada, pueden disenarse de modo que se hibriden, de manera adyacente o no adyacente entre sf, con tramos de la secuencia diana (desde con un solo nucleotido hasta con cien nucleotidos o mas) no complementarios de ninguna de las sondas. Por consiguiente, en uno de sus aspectos, la invencion da a conocer un metodo para detectar una primera secuencia diana de moleculas de ARNm individuales en una celula permeabilizada fijada; dicho metodo comprende sumergir la celula permeabilizada fijada en una solucion de hibridacion que contiene un exceso de un primer conjunto de al menos 30 sondas de hibridacion de acidos nucleicos no solapadas, que tienen secuencias complementarias de dicha primera secuencia diana, que tienen de 7 a 30 nucleotidos de longitud y que se marcan con un solo marcador: el mismo primer marcador fluoroforo de un primer color; lavar la celula fijada, para retirar las sondas no unidas; y detectar los puntos de dicho primer fluoroforo en la celula fijada lavada.

Las sondas utiles en esta invencion pueden ser ADN, ARN o mezclas de ADN y ARN. Pueden incluir nucleotidos no naturales, asf como uniones internucleotido no naturales. Los nucleotidos no naturales que incrementan la afinidad de union de las sondas incluyen 2'-O-metil-ribonucleotidos. Las longitudes de sonda utiles en esta invencion son: de 7 a 30 nucleotidos en el caso de las sondas tfpicas de ADN o ARN con afinidad de union promedio. Las longitudes preferidas de las sondas de ADN y de ARN estan comprendidas en el intervalo de 15 a 30 nucleotidos; mas preferiblemente, en el intervalo de 17 a 25 nucleotidos; y aun mas preferiblemente, en el intervalo de 17 a 22 nucleotidos. Los inventores han construido las sondas de modo que tengan unos 20 nucleotidos de longitud. Si se incluyen formas de aumentar la afinidad de union una sonda, la sonda puede ser mas corta (de tan solo siete nucleotidos), como comprenderan los entendidos en la materia. Puede acoplarse un fluoroforo a una sonda en cualquier posicion; por ejemplo, entre otras posibilidades, en un extremo de una sonda; preferiblemente, en el extremo 3'. Pueden incluirse las sondas en una solucion de hibridacion que contenga un exceso de las multiples sondas; comunmente, en el intervalo de 0,2 nanogramos a 1 nanogramo por microlitro. Se anade suficiente solucion para cubrir y humedecer la celula de modo que esta quede sumergida en la solucion que contiene las sondas.

Se pueden aplicar simultaneamente a una sola celula sondas para multiples secuencias diana de ARNm: para mas de una secuencia diana de una molecula de ARNm, o para una o mas secuencias de diferentes moleculas de ARNm. Ademas, puede aplicarse, a una secuencia diana de una molecula de ARNm, mas de un conjunto de sondas, y cada uno de esos conjuntos se marca con un fluoroforo distinguible, y los fluoroforos son distinguibles entre sf. Por ejemplo, al aplicar sondas a la secuencia de un gen, se pueden usar al menos 30 sondas marcadas en verde que tengan una porcion de la secuencia del gen como su secuencia diana, asf como al menos 30 sondas marcadas en rojo que tengan una porcion diferente de la secuencia del gen como su secuencia diana. El uso de mas de un color para cada una de varias dianas permite usar esquemas de codificacion por colores en los metodos de aplicacion de multiples sondas conformes con esta invencion.

Los metodos de esta invencion pueden incluir la simple comprobacion de si estan presentes uno o mas puntos que representan una secuencia diana. Ademas, los metodos conformes con esta invencion incluyen contar los puntos de un color determinado, correspondientes a una especie de ARNm determinada. En los casos en los que se desea detectar mas de una especie de ARNm, se pueden usar, en la misma mezcla para hibridacion, diferentes conjuntos de sondas marcadas con fluoroforos distintos. Contando los puntos de diferentes colores se elabora un perfil de expresion genica correspondiente a cada especie de ARNm.

Los puntos pueden detectarse utilizando microscopfa. No resulta necesario usar un microscopio confocal; basta con un microscopio de fluorescencia de campo amplio. A fin de distinguir los puntos que reflejan indudablemente una secuencia diana a partir de los puntos difusos que pueden reflejar fluorescencia de fondo o uniones no espedficas, los metodos conformes a esta invencion incluyen la deteccion. En una realizacion, la deteccion comprende filtrar las imagenes mediante un filtro Laplaciano de la funcion Gaussiana (filtro LoG) lineal tridimensional y aplicar un umbral de deteccion. Si se representa graficamente el numero de puntos en tres dimensiones, correspondientes a todos los umbrales que oscilan entre cero y la intensidad de pixel maxima, de la imagen filtrada, se observa una meseta ancha, indicativa de una region en la que el numero de puntos detectado no es sensible al umbral. Asf, el metodo comprende, ademas, representar graficamente el numero de puntos, determinar los lfmites de una region meseta y seleccionar el umbral (preferiblemente, dentro de esa region).

En otro de sus aspectos, esta invencion incluye conjuntos de sondas para hibridacion in situ que permiten detectar moleculas de ARNm individuales presentes en las celulas. Las sondas hacen que cada molecula devenga tan intensamente fluorescente que puede ser vista, en forma de pequeno punto fluorescente, mediante microscopfa de fluorescencia.

Se puede usar un programa informatico para identificar y contar todas las moleculas de ARNm presentes en la celula, a partir de la imagen de microscopio. Las hibridaciones in situ que se llevan a cabo con los conjuntos de sondas de la invencion que se han descrito hasta aqrn permiten el analisis exacto y sencillo de la expresion genica, asf como la deteccion de patogenos y de estados patogenicos tales como el cancer.

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Por consiguiente, en otro aspecto de esta invencion se da a conocer un metodo para determinar si un compuesto de prueba afecta a la cantidad o a la distribucion de una primera secuencia diana de moleculas de ARNm presentes en una celula, y dicho metodo comprende (a) incubar la celula con el compuesto de prueba durante un tiempo suficiente para generar una respuesta; (b) permeabilizar la celula; (c) sumergir dicha celula permeabilizada en una solucion de hibridacion que contiene un exceso de un primer conjunto de al menos 30 sondas de hibridacion de acidos nucleicos no solapadas, que tienen secuencias complementarias de dicha primera secuencia diana, que tienen una longitud de 7-30 nucleotidos, y que se marcan con un solo marcador: el mismo primer marcador fluoroforo, de un primer color; (d) lavar dicha celula a fin de retirar las sondas no unidas; (e) detectar una cantidad o una distribucion de puntos de dicho primer fluoroforo; y (f) comparar dicha cantidad o dicha distribucion con la obtenida de un control tratado de modo similar, pero sin el compuesto de prueba.

Se puede usar un soporte legible por un ordenador, que comprenda instrucciones para: obtener una pila 3-D de imagenes fluorescentes 2-D; filtrar dicha pila 3-D usando un filtro para 3-D; contar un numero total de puntos 3-D en dicha pila 3-D filtrada, correspondientes a cada uno de una diversidad de umbrales de intensidad; obtener un umbral de intensidad optimo, representativo de una region meseta, en una representacion grafica de dicho numero total de puntos 3-D frente al umbral de intensidad al que se conto dicho numero total; y usar el numero total de puntos 3-D obtenido con dicho umbral optimo como representativo de un numero de partmulas fluorescentes detectadas en dicha pila 3-D.

Puede usarse un kit que, en general, comprenda el conjunto de sondas y los soportes legibles por ordenador, como se ha descrito anteriormente.

Breve descripcion de los dibujos

La Figura 1 muestra la deteccion simultanea de una sola secuencia, y de una secuencia repetida, en moleculas de ARNm individuales. La Figura 1A es una ilustracion esquematica del constructo empleado. Las 48 sondas usadas para detectar la secuencia codificadora de la GFP (protema fluorescente verde) fueron marcadas con Alexa-594, y las cuatro sondas diferentes usadas para detectar la repeticion en tandem en la UTR (region no traducida) 3' fueron marcadas con TMR (tetrametilrodamina). La Figura 1B ilustra las fusiones de intensidad maxima de un par de pilas z de imagenes fluorescentes de celulas CHO (celulas ovaricas de hamster chino), tomadas en el canal del Alexa-594 (izquierda) y en el canal de la TMR (derecha), correspondientes a las sondas de la region codificadora de la GFP y de la UTR, respectivamente. La Figura 1C ilustra una fusion, en color falso, de las imagenes de la Figura 1B, circundadas por los recuadros de color rojo (GFP) y verde (UTR), con drculos de color rojo que representan partmulas de ARNm de GFP, identificadas informaticamente, drculos de color verde que representan partmulas de la UTR, y drculos de color amarillo que representan partmulas situadas en los mismos lugares (“colocalizadas”). Todas las barras de escala son de 5 pm de longitud.

La Figura 2 muestra el analisis de intensidades de los puntos colocalizados. Las intensidades de punto correspondientes a las sondas que tienen como diana la GFP (canal del Alexa 594, eje y) y a las sondas multimericas que tienen como diana la UTR (canal de la TMR, eje x) se calcularon restando, de la intensidad maxima presente en la region de puntos identificada informaticamente, la intensidad media de una region anular que rodea al punto. Los histogramas de los margenes muestran las distribuciones de las intensidades de punto correspondientes a la GFP (derecha) y a la UTR (parte superior).

La Figura 3 muestra la sensibilidad del metodo en funcion de los diferentes numeros de sondas empleados. La Figura 3A ilustra la intensidad de punto (definida como intensidad maxima dentro del punto, menos la intensidad de fondo media registrada en una region anular que rodea al punto), como funcion del numero de sondas elegido. Las intensidades correspondientes a las sondas 12 y 24 “presentan artefacto” (ruido), en cuanto a que no se podfa identificar sin dificultades los puntos en esos casos, por lo que los puntos identificados se sesgaban hacia una mayor brillantez. La Figura 3B ilustra el numero de puntos (es decir, componentes conectados) encontrado al establecer umbrales para la imagen filtrada; dicho numero de puntos se representa como funcion del valor umbral (que oscila entre 0 y la intensidad maxima de la imagen filtrada [normalizada a 1]), correspondiente a diferentes numeros de sondas. La barra gris indica el umbral usado para el analisis de la Figura 3A.

La Figura 4 muestra una comparacion con el metodo de deteccion de ARNm empleado en Femino et al. (Science 1998). La Figura 4A es un esquema que ilustra el metodo que se describe en este manuscrito, con 48 sondas marcadas con un solo marcador (izquierda), y el metodo de Femino et al., en el que cada sonda de 45 pb (pares de bases) contiene cinco fluoroforos y tiene como diana un elemento de secuencia que se repite 32 veces en la UTR 3' del ARNm diana que se expresa a partir de un transgen en celulas ovaricas de hamster chino. La Figura 3B ilustra una comparacion de las intensidades de punto que se obtienen usando 48 sondas marcadas con un solo marcador o usando una sonda de 45 pb marcada con cinco fluoroforos. Las barras de error representan una desviacion estandar.

La Figura 5 muestra la identificacion informatica de los puntos de ARNm. La Figura 5A ilustra los datos de la imagen sin procesar (fusion de intensidad maxima) obtenidos al tomar imagenes de partmulas de ARNm de FKBP5 (protema 5 de union a FK506) en celulas A549 inducidas con dexametasona. La Figura 5B ilustra la MAGE (fusion maxima) obtenida al filtrar los datos sin procesar mediante un filtro Laplaciano de la (funcion) Gaussiana a fin de mejorar los

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puntos. La Figura 5C ilustra el numero de puntos (es dedr, componentes conectados) encontrados al procesar mediante umbrales la imagen filtrada de la Figura 5B, representados como funcion del valor umbral, que oscila entre 0 y la intensidad maxima de la imagen filtrada (normalizada a 1). La Figura 5D es una imagen que muestra los resultados del uso del umbral representado por la lmea gris de la Figura 5C; a cada punto bien diferenciado se le asigna un color al azar. Todas las barras de escala son de 5 pm de longitud.

La Figura 6 muestra la toma de imagenes simultanea de moleculas unicas de tres ARNm diferentes en celulas de mairnfero. Las Figuras 6A-6C ilustran imagenes que muestran partmulas de ARNm de FLJ11127, Cox-2 y FKBP5, en el mismo conjunto de celulas A549, no tratadas con dexametasona. Las Figuras 6D-6F ilustran imagenes que muestran partmulas de FLJ11127, Cox-2 y FKBP5, en celulas tratadas durante 8 horas con dexametasona 24 nM. La Figura 6G ilustra la induccion (multiplicacion por un numero de veces) de la totalidad de los tres genes, conforme a lo medido mediante FISH (hibridacion in situ fluorescente) y mediante RT-PCR (reaccion en cadena de la polimerasa con transcripcion inversa) en tiempo real; las barras de error correspondientes a la FISH se obtuvieron mediante “bootstrapping” (remuestreo de datos), y las correspondientes a la RT-PCR se obtuvieron mediante repeticion, conforme a lo descrito en la informacion suplementaria. Todas las imagenes son fusiones maximas de una pila z de imagenes fluorescentes que abarcan la extension de las celulas con contratincion nuclear con DAPI en morado, y todas las barras de escala tienen 5 pm de longitud.

La Figura 7 muestra el examen de la “bleedthrough” (transferencia no intencionada) de los puntos fluorescentes. La Figura 7A es una ilustracion de las imagenes de un punto de ARNm de FLJ11127 marcado con TMR, tal y como se ve a traves los canales de filtrado TMR, Alexa 594 y Cy5. Debajo se proporcionan digitalizaciones lineales de la intensidad fluorescente correspondiente a la lmea que atraviesa la imagen; las diferentes digitalizaciones lineales son las correspondientes a las mediciones tomadas al aumentar z (espaciado de 0,25 pm). La digitalizacion lineal verde es la correspondiente al corte z que aparece en la imagen en sf. Se realizo un analisis similar respecto de un punto de ARNm de Cox-2 marcado con Alexa 594 (Figura 7B) y respecto de una partmula de ARNm de FKBP5 marcada con Cy5 (Figura 7C). En todas las mediciones de la intensidad de las digitalizaciones lineales, se resto la intensidad de fondo de la camara; dichas mediciones oscilan entre 0 y 200 unidades de fluorescencia arbitrarias.

La Figura 8 ilustra la demostracion de que el captador de oxfgeno incrementa la fotoestabilidad del Cy5. La Figura 8A ilustra la media de la fluorescencia de punto maxima de una serie de ARNm de FLJ11127 marcados usando sondas conjugadas con TMR; se represento dicha fluorescencia como funcion del numero de exposiciones de 2 segundos usando un filtro espedfico para TMR. Se generaron curvas correspondientes a las imagenes tomadas tanto con (azul) como sin (rojo) el sistema captador de oxfgeno. Se realizo un analisis similar respecto de ARNm de Cox-2 marcados usando sondas conjugadas con Alexa-594, con exposiciones de 2 segundos (Figura 8B) y respecto de ARNm de FKBP5 marcados usando sondas conjugadas con Cy5, con exposiciones de 2,5 segundos (Figura 8C). La Figura 8D ilustra el porcentaje de blanqueado por exposicion (en unidades de fraccion de fluorescencia perdida por exposicion) correspondiente a las sondas conjugadas con TMR, Alexa-594 y Cy5 (Figuras 8A-8C), tanto con como sin el sistema anti-blanqueado captador de oxfgeno. El porcentaje de blanqueado se calculo ajustando la curva de degradacion de cada partmula individual a un exponencial y tomando la media de las constantes de degradacion ajustadas. Las barras de error corresponden a una desviacion estandar. Se selecciono un mmimo de 6 partmulas en cada condicion.

La Figura 9 muestra la obtencion de imagenes de ARNm localizados en C. elegans y en D. melanogaster. La Figura 9A es una ilustracion de moleculas de ARNm (rojo) de elt-2 en un embrion en estadfo temprano (estadfo de ~100 celulas) de C. elegans; los nucleos han sido contratenidos con DAPI (azul). La Figura 9B es una ilustracion de moleculas de ARNm de elt-2 en una larva L1 (larva de primer estadfo) de C. elegans. Dentro del recuadro azul, se muestra un solo plano focal en el que resulta visible el tracto intestinal. La Figura 9C es una ilustracion esquematica de la expresion de los genes dpp y engrailed en los discos imaginales alares de larvas de tercer estadm de D. melanogaster. La Figura 9D es una imagen que muestra las ubicaciones de las moleculas de ARNm de dpp (drculos de color azul claro) y de la expresion de Engrailed detectadas mediante inmunofluorescencia (azul oscuro), identificadas informaticamente. La Figura 9E es una imagen que contiene senales mejoradas de moleculas de ARNm de dpp (azul claro) y de la expresion mejorada de la protema Engrailed detectadas mediante inmunofluorescencia (azul oscuro). Todas las imagenes, excepto la porcion recuadrada de la Figura 9B, son fusiones maximas de una pila z de imagenes fluorescentes, y todas las barras de escala tienen 5 pm de longitud.

La Figura 10 muestra las imagenes obtenidas de moleculas unicas de ARNm en levaduras y en neuronas. La Figura 10A y la Figura 10B ilustran partmulas de ARNm de STL1 tanto en celulas inalteradas (Figura 10A) como en celulas sometidas a un choque de sal con NaCl 0,4M durante 10 minutos, con contratincion nuclear mediante DAPI en color morado (Figura 10B). La Figura 10C ilustra la expresion de ARNm de p-actina (verde) y de Map2 (rojo) en neuronas de hipocampo de rata en un cultivo de neuronas disociadas. La Figura 10D ilustra una imagen, ampliada y con contraste, de un segmento de una dendrita, que en la Figura 10C aparece rodeado por el recuadro rojo. Todas las barras de escala son de 5 pm de longitud.

La Figura 11 es una ilustracion de las secuencias diana y sondas empleadas en la presente invencion.

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Descripcion detallada de la invencion

Esta invencion se refiere, en parte, a la concepcion de un algoritmo de analisis de imagenes que hace uso de una estrategia rigurosa, objetiva, de procesamiento mediante umbrales, y demuestra que podemos identificar y contar, de manera exacta y no ambigua, todas las moleculas de ARNm diana presentes en la celula. La simplicidad y robustez de este enfoque permite la deteccion fiable de tres especies diferentes de ARNm dentro de las mismas celulas. Empleando un conjunto riguroso de criterios, los inventores han demostrado que el metodo permite obtener imagenes extremadamente espedficas de ARNm unicos, en un amplio espectro de tipos de celulas y de organismos modelo.

Los inventores han aprovechado la disponibilidad de los sintetizadores de ADN de 96 pocillos para sintetizar muchas sondas mas pequenas, marcadas en el extremo, diferentes, que tienen establecida la misma diana. Los resultados obtenidos muestran que, cuando un conjunto de al menos 30, preferiblemente de al menos 40, mas preferiblemente, de unos 48 (la mitad de una placa de 96 pocillos que se usa para la smtesis de grandes cantidades de ADN), o de mas sondas, marcadas con un solo marcador, se unen a la misma molecula de ARNm, la tornan lo suficientemente fluorescente para que se pueda ver como un punto, limitado por difraccion, en un microscopio de campo amplio. Los sitios no espedficos unicamente se asocian con una sonda o con unas pocas sondas, y producen senales difusas, mientras que las dianas deseadas (espedficas) se unen a la totalidad de las sondas, o a la mayona de las sondas, y producen un punto claramente detectable correspondiente a cada molecula de ARNm.

Ademas, los inventores han concebido y desarrollado un algoritmo de analisis de imagenes que hace uso de una estrategia de procesamiento mediante umbrales rigurosa, objetiva, y que demuestra que es posible identificar y contar de manera exacta y no ambigua todas las moleculas de ARNm diana presentes en la celula. La simplicidad y robustez de este enfoque permite la deteccion fiable de tres especies diferentes de ARNm dentro de las mismas celulas. Empleando un conjunto riguroso de criterios, los inventores demuestran que el metodo permite obtener imagenes extremadamente espedficas de ARNm unicos, en un amplio espectro de tipos de celulas y de organismos modelo.

Por lo tanto, 48 o mas sondas de oligonucleotidos marcadas con un solo marcador permiten detectar moleculas de ARNm individuales. Las moleculas de ARNm se visualizaron como puntos limitados por difraccion que se pueden detectar facilmente mediante una configuracion de microscopfa de campo amplio estandar. Los puntos eran lo suficientemente brillantes para poder contarlos de manera exacta mediante el algoritmo de procesado de imagenes para deteccion de puntos que aqrn se describe.

Los inventores obtuvieron recuentos cuantitativos de tres especies de moleculas de ARNm diferentes, dentro de celulas individuales. Tal analisis facilita la determinacion exacta de multiples perfiles de expresion genica de incluso genes que apenas se expresan, en una minada de organismos modelo.

La base de la especificidad del sistema que aqrn se describe es que la mayona de las sondas, o la totalidad de las mismas, se unen al ARNm diana deseado, y producen una senal particulada, mientras que los sitios de union no espedfica del resto de la celula se unen con una cantidad menor de moleculas de sonda y producen una senal difusa que el algoritmo de recuento de puntos ignora. Ello viene a subrayar una ventaja clave del presente metodo frente a otros metodos de hibridacion in situ, en los que se usan sondas abundantemente marcadas, tales como los dendnmeros. Si cada molecula de sonda es detectable, cada instancia de union no espedfica ocasionara un falso positivo y todo ARNm al que no se una la sonda ocasionara un falso negativo. En cambio, la probabilidad de falsos negativos y falsos positivos disminuye a medida que se incrementa el numero de sondas y, en general, cuando se tiene una eficiencia de hibridacion dada, aumentar el numero de sondas diferentes estrecha la distribucion de las sondas unidas por molecula. El analisis de imagenes conforme a la presente invencion mostro que, aumentando el numero de sondas se obtiene una robusta deteccion de puntos que no depende de umbrales elegidos arbitrariamente. Ello resulta crucial para contar con exactitud el numero de ARNm por celula, que es una caractenstica clave del metodo de la invencion.

Una cuestion relacionada es el diseno de la sonda configurada; en dicho diseno, un posible factor es la uniformidad en las afinidades de hibridacion. Puesto que la afinidad de los oligonucleotidos esta dominada en gran medida por su contenido relativo en GC, los inventores han creado un programa informatico con el que disenar un conjunto de sondas con un contenido total en GC optimamente uniforme. Dicho programa informatico esta a la disposicion del publico.

Desde un punto de vista practico, el metodo aqrn reivindicado proporciona ademas notables ventajas frente al metodo FISH para moleculas unicas de ARNm que se conoda anteriormente, tanto en terminos de tiempo como en terminos de coste. Gracias a los avances logrados en la smtesis en general, los investigadores pueden comprar, con facilidad y a un coste bajo, grandes cantidades de oligonucleotidos con modificadores amino 3'. Despues, se puede agrupar, acoplar y purificar en masa dichos oligonucleotidos, lo que reduce notablemente el tiempo y la mano de obra asociados a los multiples acoplamientos y a las multiples purificaciones necesarias para generar una sonda marcada con multiples marcadores. La simplicidad y la rentabilidad resultantes del presente metodo facilitaran los estudios de nivel genomico en los que haya que detectar muchos ARNm diferentes. Ademas, la flexibilidad del procedimiento de hibridacion permite combinar este con otras tecnicas estandar como, por ejemplo, la

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inmunofluorescencia.

En otra realizacion, se pueden incorporar los fluoroforos a las sondas durante la smtesis automatizada de ADN.

Otros metodos para la cuantificacion del numero de ARNm en celulas individuales son, entre otros, la RT-PCR de una sola celula y la RT-PCR digital. Uno de los problemas que presentan dichos metodos lo constituyen las dificultades practicas asociadas al ensamblaje de grandes cantidades de reacciones individuales que exigen usar dispositivos microflmdicos o roboticos. Ademas, dichos metodos adolecen de problemas en cuanto a las variaciones estocasticas en la amplificacion exponencial, cuando las entradas diana son unicamente unas pocas moleculas. Tal comportamiento estocastico complica el analisis de la expresion de los genes de una sola celula, y dicha expresion en s^ esta sujeta a fuerzas estocasticas. Asimismo, dichos metodos no proporciona informacion alguna sobre la ubicacion espacial de los ARNm.

Dada la simplicidad y la amplia capacidad de aplicacion de nuestro metodo de deteccion de moleculas de ARNm unicas, dicho metodo resulta adecuado para una amplia diversidad de estudios. Obteniendo recuentos exactos de ARNm en celulas individuales, se pueden realizar determinaciones exactas, tanto de las diferencias en la expresion en condiciones diferentes, como en la variabilidad entre celulas en cuanto a la expresion genica. Dado que este metodo proporciona mediciones cuantitativas, espaciales de los ARNm individuales en celulas individuales, resulta valioso en muchos estudios de los ambitos de la biologfa de sistemas, la biologfa celular, la neurobiologfa y la biologfa del desarrollo.

De igual modo, este metodo puede utilizarse en multitud de ensayos, incluido, entre otros, un ensayo de determinacion. En una realizacion, el ensayo de determinacion determina si un compuesto de prueba afecta a una cantidad o a una distribucion de una secuencia diana de moleculas de acido ribonucleico mensajero (moleculas de ARNm); dicha secuencia diana incluye al menos 30 regiones, de 7-30 nucleotidos, no solapadas, de union a sondas, en una celula. En general, el ensayo comprende los siguientes pasos: incubar una celula con un compuesto de prueba durante un penodo de tiempo suficiente para generar una respuesta; permeabilizar la celula; sumergir dicha celula en un exceso de al menos 30 sondas de hibridacion de acidos nucleicos (cada una de dichas sondas se marca con un solo marcador -el mismo marcador fluorescente-, y cada una de dichas sondas contiene una secuencia de acidos nucleicos que es complementaria de una region de union a sondas diferente de dicha secuencia diana); lavar dicha celula fijada, a fin de retirar las sondas no unidas; detectar una cantidad de fluorescencia, o una distribucion de la fluorescencia, a partir de dichas sondas (las unidas); comparar dicha cantidad o dicha distribucion con una cantidad o una distribucion, respectivamente, obtenida a partir de una celula de control tratada de manera igual a la descrita, salvo por el hecho de que no se incuba con el compuesto de prueba.

Los compuestos que resultan adecuados como compuestos de prueba son, entre otros posibles, los siguientes: compuestos basados en peptidos (por ejemplo, anticuerpos o nanocuerpos), compuestos que interfieren con el ARN (por ejemplo, ARNsi, ARNsh, ARNmi, etc.), y pequenas moleculas. Todos estos compuestos se pueden producir de conformidad con los metodos conocidos en este campo del conocimiento. Por ejemplo, Naito (US 20080113351) y Khvorova (US 20070031844) proporcionan metodos para seleccionar compuestos que interfieren activamente con el ARN. Asimismo, pueden prepararse anticuerpos mediante tecnicas conocidas como, entre otras posibles, las siguientes: uso de hibridomas, seleccion de anticuerpos monoclonales, uso de bibliotecas de exposicion a fagos, humanizacion de anticuerpos y otras tecnicas similares.

Los compuestos “pequenas moleculas” pueden seleccionarse mediante analisis de las bibliotecas adecuadas. En un aspecto, se sintetizan bibliotecas de pequenas moleculas conforme a metodos bien conocidos y puestos en practica rutinariamente en este campo del conocimiento. Vease, por ejemplo, Thompson y Ellman, Chem. Rev. 1996, 96, 555-600, Shipps, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 94, paginas 11833-11838, octubre de 1997, y Combinatorial Library Design and Evaluation - Principles, Software Tools and Applications in Drug Discovery, Ghose y Viswanadhan (eds), Marcel Dekker 2001. Como alternativa, se pueden obtener bibliotecas de pequenas moleculas de cualquiera de una serie de fuentes que incluye, por ejemplo, el “NIH Molecular Libraries Small Molecule Repository” (repositorio de pequenas moleculas de las bibliotecas moleculares del NIH [Instituto Nacional de la Salud] estadounidense). Otras fuentes alternativas son, entre otras, las siguientes: AnalytiCon Discovery GmbH (Potsdam, Alemania), que comercializa MEGAbolite®, bibliotecas de pequenas moleculas obtenidas de productos naturales puros, y NatDiverseTM, bibliotecas de pequenas moleculas obtenidas de productos semisinteticos analogos de productos naturales; Quantum Pharmaceuticals Ltd. (Moscu, Federacion Rusa); y Praecis Pharmaceuticals Incorporated (Waltham, Massachusetts, Estados Unidos).

Puede usarse software que ponga en practica el algoritmo de procesamiento mediante umbrales ya descritos en esta invencion. Asf, un soporte legible por un ordenador puede comprender instrucciones para: obtener una pila 3-D de imagenes fluorescentes en 2-D; filtrar dicha pila 3-D usando un filtro para 3-D; contar un numero total de puntos 3-D en dicha pila 3-D filtrada, correspondientes a cada uno de una diversidad de umbrales de intensidad; obtener un umbral de intensidad optimo, representativo de una region meseta, en una representacion grafica de dicho numero total de puntos 3-D frente al umbral de intensidad al que se conto dicho numero total; y usar el numero total de puntos 3-D obtenido con dicho umbral optimo como representativo de un numero de partfculas fluorescentes detectadas en dicha pila 3-D.

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El procesamiento mediante umbrales puede llevarse a cabo usando un filtro Laplaciano de la (funcion) Gaussiana (filtro LoG) lineal tridimensional.

Un kit puede comprender un soporte legible por un ordenador que ponga en practica el algoritmo de procesamiento mediante umbrales, de la manera descrita, y un conjunto de sondas que tengan establecida como diana una secuencia diana previamente seleccionada. Las sondas descritas en relacion con el metodo reivindicado son tambien adecuadas para dicho kit.

A continuacion se describen, en los siguientes ejemplos, realizaciones concretas conformes con los metodos de la presente invencion. Los ejemplos son meramente ilustrativos y no tienen como finalidad limitar el resto de la especificacion/invencion en modo alguno.

Ejemplos

Ejemplo 1: Materiales y metodos

Los procedimientos que se describen en esta seccion son aplicables a la totalidad de los ejemplos, a menos que se indique lo contrario.

Diseno de las sondas

Se disenaron conjuntos de sondas de manera tal que comprendiesen al menos 48 oligonucleotidos cada una, con longitudes que oscilasen entre 17 y 22 nucleotidos, y una modificacion amino 3' (se aplicaron sondas a ARNm de FKBP5, FLJ11127 y Map2 usando 63, 53 y 72 oligonucleotidos respectivamente). Ademas, se mantuvo el contenido en GC de los oligonucleotidos lo mas cercano posible a un 45%. Se agruparon los oligonucleotidos y se acoplaron a un fluoroforo, todo ello en una sola reaccion; despues, los oligonucleotidos no acoplados y los fluoroforos libres restantes se retiraron mediante purificacion con HPLc.

Hibridacion in situ fluorescente

De cara a la FISH (hibridacion in situ fluorescente), se fijaron todas las muestras en formaldehudo al 3,7% y se permeabilizaron con etanol. La hibridacion se llevo a cabo usando tampones y condiciones similares a los que se describen en Femino et al., con una diferencia principal: la astringencia de la hibridacion, que se redujo reduciendo la cantidad de formamida al 10%. Se determino empmcamente la concentracion de sonda que proporcionaba una senal optima.

Obtencion de imagenes y analisis de los datos

Todas las imagenes se adquirieron usando un microscopio de fluorescencia de campo amplio estandar. La deteccion y el recuento de partfculas, asistidos por ordenador, se llevaron a cabo con filtros lineares disenados para mejorar las senales particuladas.

Ejemplo 2: Aplicacion de sondas a secuencias repetidas y unicas presentes en la misma molecula de ARNm

Utilizando pequenas sondas de oligonucleotidos marcadas con una sola fraccion fluoroforo, los inventores han demostrado que las moleculas de ARNm individuales disenadas de manera que contengan 32-96 copias en tandem de una secuencia que se une a sondas pueden detectarse mediante hibridacion in situ. Ademas, los inventores demostraron que los puntos individuales que aparecen en la imagen representan moleculas unicas de ARNm; para ello, emplearon una serie de enfoques diferentes, entre ellos, correlacionar el numero medio de copias de ARNm obtenido mediante recuento directo de los puntos limitados por difraccion con una medicion del numero de moleculas diana obtenidas mediante RT-PCR en tiempo real. Asf, si se utilizan muchas sondas diferentes, y cada una de ellas tiene como diana una region distinta de un ARNm natural, sena posible obtener sensibilidad a un nivel de molecula unica sin tener que hacer uso de genes “disenados”.

Para la prueba inicial de esta hipotesis, los inventores construyeron un gen controlado por doxiciclina que produda un ARNm que codificaba la denominada “protema fluorescente verde” (GFP, por sus siglas en ingles) y que presentaba 32 secuencias repetidas en tandem, cada una de ellas, de 80 nucleotidos de longitud, en su UTR 3'; despues, este gen “disenado” se integro de manera estable en el genoma de una lmea celular de celulas ovaricas de hamster chino. Al ARNm expresado a partir de este gen se le aplicaron simultaneamente 48 oligonucleotidos diferentes, cada uno de ellos, complementario de una region unica (una sola region) de la secuencia codificadora, asf como un conjunto de cuatro oligonucleotidos, cada uno de ellos con una secuencia complementaria en el motivo repetido (un total de 128 sondas unidas) (Figura 1A). Cada oligonucleotido del conjunto de sondas que era espedfico de la secuencia codificadora se marco con un solo fluoroforo Alexa-594, y cada oligonucleotido del conjunto, espedfico de la secuencia repetida, se marco con un solo fluoroforo tetrametilrodamina (TMR). El uso de los conjuntos de filtros adecuados garantizo que la fluorescencia emitida por los fluoroforos TMR no se detectaba en el canal del Alexa-594, y viceversa, como se describe a continuacion.

Tras efectuar FISH con estas sondas, los inventores descubrieron que muchas “partfculas” con un diametro de unos 0,25 micrometres eran visibles tanto en el canal de la TMR como en el canal del Alexa-594 (Figura 1B). Las

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partfculas se identificaron informaticamente usando un programa de procesamiento de imagenes (que se describe en la siguiente seccion) que categoriza las partfculas como marcadas con las sondas que tienen como diana la secuencia codificadora de la GFP (TMR), o como marcadas con las sondas espedficas de UTR (Alexa-594), o como marcadas con ambos tipos de sondas (Figura 1C). Tras identificar y localizar las partfculas en cuatro campos de vision similares a los que se ilustran en la Figura 1C, se conto un total de 599 partfculas correspondientes a las sondas que tienen como diana la secuencia codificadora de la GFP, y de 565 partfculas correspondientes a las sondas espedficas de UTR. De dichas partfculas, el 85% de las “partfculas de la UTR” estaban localizadas en el mismo lugar que (“colocalizadas con”) las “partfculas de la GFP”; a su vez, el 81% de las partfculas de la GFP estaban colocalizadas con las partfculas de la UTR. El elevado grado de colocalizacion entre las partfculas detectadas mediante el metodo de deteccion de la repeticion en tandem determinada previamente y las partfculas detectadas mediante aplicacion simultanea de sondas (48 oligonucleotidos diferentes marcados con un solo marcador) demuestra la validez del uso de multiples sondas marcadas con un solo marcador, para la deteccion de transcriptos endogenos. Es probable que la fraccion de partfculas que no mostraban colocalizacion se corresponda a moleculas de ARNm que hadan perdido su secuencia codificadora o su UTR 3' en el transcurso de los procesos naturales de degradacion del ARNm.

Los inventores analizaron tambien la intensidad de la fluorescencia de los puntos colocalizados, tanto en el canal de la TMR como en el canal del Alexa-594, y descubrieron que las intensidades de punto mostraban una distribucion unimodal (Figura 2); argumentan que las partfculas detectadas no son grupos de muchos ARNm, sino moleculas individuales. Las intensidades de punto mostraron una fuerte correlacion entre ambos canales (Figura 3). Puesto que no hay comunicacion/contacto entre ambos canales, la fuerte correlacion observada indica que la variabilidad en cuanto a la intensidad de punto no se debfa principalmente a una variabilidad aleatoria en la hibridacion de las sondas (que no estana correlacionada entre diferentes conjuntos de sondas), sino a otros factores, tales como la integridad o accesibilidad del ARNm, que afectan a ambos tipos de sondas por igual.

Ademas, los inventores exploraron como la intensidad de senal variana en funcion del numero de sondas; para ello, efectuaron hibridaciones in situ usando las primeras 12, 24 o 36 sondas, o la totalidad de las 48 sondas del conjunto. En el caso de este ARNm diana concreto, se descubrio que se podfa detectar las partfculas con numeros (cantidades) menores de sondas, si bien la intensidad disminma (Figura 3A). No obstante, el algoritmo de deteccion automatica de puntos (que se describe detalladamente en la siguiente seccion [en el siguiente Ejemplo]) proporciono un rendimiento particularmente bueno con 48 sondas: detecto el mismo numero de puntos usando un amplio intervalo de umbrales (Figura 3B, vease informacion detallada adicional en la siguiente seccion). Sin embargo, es probable que el numero de sondas necesario para obtener una senal robusta dependa de la secuencia diana, puesto que los inventores han obtenido senales de ARNm claras usando cantidades de sondas menores: por ejemplo, con tan solo 30 sondas. Cuando se comparo el metodo de la presente invencion con el metodo de Femino et al. mediante el uso de un oligonucleotido de 45 pb de longitud marcado con 5 fluoroforos y complementario de una secuencia repetida 32 veces en la UTR 3' de un gen, lo que produda 160 fluoroforos por ARNm (Figura 4A), se descubrio que la relacion senal/fondo era mas o menos igual en ambos metodos (Figura 4B), lo que indica que el metodo reivindicado en la presente invencion es como mmimo igual de sensible, pese a que en el se usan menos fluoroforos.

Ademas, celulas CHO que caredan del gen informador no produjeron senal alguna, mientras que con celulas CHO con el gen informador, que se desactivo mediante adicion de doxiciclina, se obtuvieron partfculas de ARNm en tan solo unas pocas celulas, lo que indica que las senales observadas eran espedficas.

Ejemplo 3: Algoritmo informatico para la deteccion de puntos

A fin de identificar fiablemente numeros altos de moleculas de ARNm, los inventores concibieron un algoritmo informatico semiautomatizado para la deteccion de puntos en una pila tridimensional de imagenes fluorescentes. Una de las dificultades asociadas a la deteccion de puntos es el “ruido de fondo” (o “fondo”) no uniforme derivado de la autofluorescencia celular y de los niveles bajos de hibridacion no espedfica de las sondas. Para superar estas dificultades, los inventores filtraron pilas de imagenes usando un filtro Laplaciano de la (funcion) Gaussiana (filtro LoG) lineal tridimensional disenado para mejorar las senales tipo punto del tamano y de la forma geometrica correctos (Figura 5A y Figura 5B) y que, a la vez, elimina el fondo que vana con lentitud. En un paso posterior en el algoritmo, los inventores aplicaron un umbral a la imagen filtrada, a fin de definir los puntos. Para poder elegir racionalmente un umbral, se conto el numero de puntos en tres dimensiones correspondiente a todos los umbrales de un intervalo comprendido entre cero y la intensidad de pixel maxima presente en la imagen filtrada. Cuando los inventores representaron graficamente el numero de partfculas como funcion del umbral, se observo una meseta ancha, lo que indica que hay una region por encima de la cual el numero de partfculas detectado es bastante independiente del (no es sensible al) umbral concreto elegido (Figura 5C). Cuando se elige un umbral dentro de esa region, los puntos detectados se corresponden muy bien con los que se identifican visualmente, lo que demuestra la eficacia del algoritmo de deteccion de puntos (Figura 5D).

Ejemplo 4: Determinacion de los perfiles de expresion genica de tres especies de ARNm diferentes

Un posible uso del metodo reivindicado en la presente invencion es la deteccion simultanea de moleculas unicas de multiples ARNm en celulas individuales. A fin de demostrar que el metodo tiene esa capacidad, los inventores

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disenaron sondas espedficas de tres ARNm codificadores de FKBP5, de Cox-2 y de FLJ11127 en la lmea celular de carcinoma humano A549. Dichas sondas se acoplaron a los fluoroforos espectralmente distintos Cy5, Alexa 594 y TMR, respectivamente. Al efectuar FISH con la totalidad de las tres sondas simultaneamente, fueron visibles puntos individuales en los tres canales de fluorescencia diferentes (Figuras 6A-6F); un analisis de intensidades revelo que los puntos fluorescentes no se transfieren a los otros canales (Figura 7).

Para demostrar que el metodo reivindicado de deteccion del ARNm era espedfico y cuantitativo, se incubaron las celulas con el glucocorticoide dexametasona, que atraviesa la membrana celular; con ello, se aumento la expresion de FKBP5 y de FLJ1127, y se redujo ligeramente la expresion de Cox-2 en esta lmea celular concreta Los inventores descubrieron que el numero medio de ARNm de FKBP5 y de FLJ1127, medido combinando FISH con el algoritmo de deteccion de puntos de la presente invencion, aumento; en cambio, el numero medio de ARNm de Cox- 2, medido de la forma indicada, disminuyo (comparense las Figuras 6A-6C con las Figuras 6D-6F). Estos numeros se correspondfan bien con las mediciones, efectuadas mediante RT-PCR, de la induccion (multiplicacion por un numero de veces) y represion (division por un numero de veces) de la expresion de estos genes llevadas a cabo con las mismas muestras, lo que demuestra que los puntos fluorescentes son los ARNm correctos y que con los metodos reivindicados en la presente invencion (Figura 6G) se detecto la mayona de las moleculas de ARNm. Ademas, ello supone una demostracion adicional de la eficacia del metodo de deteccion de puntos en lo referente a la cuantificacion exacta de la expresion genica.

Una dificultad tecnica que surgio a la hora de obtener imagenes de varios ARNm simultaneamente fue la fotolabilidad del fluoroforo; en particular, la del Cy5. A fin de obtener imagenes de la totalidad de las moleculas de ARNm presentes dentro de una sola celula, se adquirieron de 10 a 30 imagenes de un “corte z” por cada campo visual d, utilizando una exposicion de uno a tres segundos para cada imagen y un objetivo de alta apertura numerica. Solo la TMR y, en un grado menor, el Alexa-594, fueron capaces de soportar esta exposicion intensa y relativamente prolongada a la luz; Cy5, por ejemplo, se mostro extremadamente fotolabil en estas condiciones (Figura 8). A fin de superar este problema, los inventores emplearon un medio de montaje especial en el que los fluoroforos son mucho mas fotoestables (un metodo que se adapto de Yildiz et al., con modificaciones de escasa importancia). En dicho medio, una mezcla de catalasa, glucosa oxidasa y glucosa retira enzimaticamente el oxfgeno molecular del medio, con lo que se inhiben las rutas iniciadas por la luz, dependientes de oxfgeno, que destruyen a los fluoroforos. El uso de esas enzimas conduce a un aumento espectacular, de x10, en la fotoestabilidad del Cy5, y no perjudica la obtencion de imagenes con TMR y Alexa-594, lo que facilita la adquisicion de multiples cortes z cuando se efectua la obtencion de imagenes con tres colores.

Ejemplo 5: deteccion de ARNm en organismos y tipos celulares modelo

Uno de los usos aceptados de la hibridacion in situ ha sido la deteccion de la localizacion del ARNm durante el desarrollo. Los inventores probaron la eficacia del metodo aqrn reivindicado en dos sistemas de desarrollo que se estudian frecuentemente: el nematodo Caenorhabditis elegans y la mosca de la fruta Drosophila melanogaster. En el nematodo, los inventores construyeron sondas con las que detectar las moleculas de ARNm del gen elt-2, un factor de transcripcion que solo se expresa en el intestino del nematodo y solo despues de que el embrion del nematodo se ha desarrollado hasta alcanzar el estadm de 45 celulas. Tras la hibridacion del conjunto de sondas en embriones y en larvas, se observo que las moleculas de ARNm de elt-2 solo estaban presentes dentro de la region del intestino (Figura 9A), tanto en los embriones como en las larvas (Figura 9B), si bien, de conformidad con lo conocido sobre el momento de la aparicion de la expresion en los embriones, solo se detectaron ARNm de elt-2 en el intestino de los embriones con una edad superior al estadm de 45 celulas, lo que de nuevo subraya la especificidad del metodo reivindicado en la presente invencion. Ademas, en esos estadms tempranos, solo se detectaron unos pocos transcriptos, lo que demuestra que este metodo es lo suficientemente sensible para detectar incluso cantidades pequenas de transcriptos en tejidos complejos.

En la mosca de la fruta, que es uno de los ejemplos mejor estudiados de la localizacion de la expresion genica, esta ultima aparece durante el desarrollo de los discos imaginales alares. Los discos alares de las larvas de la mosca de la fruta muestran un conjunto muy interesante de patrones de expresion genica; uno de dichos patrones es la formacion de una banda de expresion del gen dpp en respuesta a los gradientes de las protemas “Hedgehog” y “Engrailed”. En particular, Engrailed, que regula a la baja (reduce) la smtesis de ARNm de dpp, esta presente en cantidades altas en el compartimento posterior del disco alar, y en cantidades bajas en el compartimento anterior del disco alar. De manera similar, Hedgehog, que regula al alza (aumenta) la smtesis de ARNm de dpp, esta presente en cantidades altas en el compartimento posterior del disco alar, y en cantidades bajas en el compartimento anterior del disco alar. Sin embargo, hay una region, situada entre la region posterior y la region anterior, en la que los niveles de Hedgehog son lo suficientemente altos para activar a dpp, pero no lo suficientemente altos para activar a engrailed, lo que ocasiona la smtesis de ARNm de dpp en forma de una banda estrecha (Figura 9C).

Para comprobar si se pueden obtener imagenes de esta estrecha banda de smtesis de ARNm de dpp, los inventores construyeron un conjunto de sondas marcadas con un solo marcador que teman como diana ARNm de dpp, y llevaron a cabo hibridacion in situ en discos imaginales alares aislados de larvas de tercer estadm. Ademas, combinaron este procedimiento in situ con inmunofluorescencia dirigida contra la protema Engrailed (se muestra en color azul). La Figura 9D muestra una imagen completa, en la que las localizaciones de las moleculas de ARNm identificadas algontmicamente se presentan en forma de drculos azules; y la Figura 9E muestra una porcion

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agrandada de la imagen, con las senales del ARNm aumentadas. Las imagenes muestran que solo se encontraron moleculas de ARNm a nivel del borde anterior del area de expresion de Engrailed, lo que viene a confirmar, una vez mas, la especificidad de la deteccion.

Ademas, los inventores probaron el metodo aqm reivindicado en Saccharomyces cerevisae; para ello, disenaron un conjunto de sondas que teman como diana transcriptos diana del gen STL1. STL1 es un gen, de entre una serie de genes de levaduras, cuya expresion aumenta notablemente cuando se anade sal al medio de crecimiento. Se descubrio que las celulas no sometidas a choque de sal no contienen practicamente ninguna molecula de ARNm de STL1 (Figura 10A), mientras que las celulas no sometidas a un choque de sal 0,4M de diez minutos de duracion presentaban numeros altos de moleculas de ARNm de STL1 (Figura 10B).

Otro tipo de celulas en las que se estudia comunmente la localizacion del ARNm son las neuronas. Para demostrar la eficacia del metodo aqm reivindicado en ese sistema, los inventores obtuvieron imagenes de ARNm de p-actina y de ARNm de Map2 (protema 2 asociada a los microtubulos) en neuronas hipocampicas en cultivo. La Figura 10C muestra que un conjunto de sondas que tienen como diana la p-actina (marcadas con TMR) y un conjunto de sondas que tienen como diana la Map2, coloreadas con un color diferente (marcadas con Alexa-594), pueden usarse para obtener imagenes de sus dianas, y para distinguir dichas dianas, con una resolucion tan grande que se distingue una molecula individual. Una fraccion de estos ARNm migra hasta partes distantes de las dendritas (Figura 10D). Los recuentos de partfculas indicaron que el 14% de las 791 moleculas de ARNm de p-actina estaban localizadas en las dendritas, y que el 37% de las 140 moleculas de ARNm de Map2 estaban localizadas en las dendritas; dichas cifras son similares a las distribuciones que se habfan notificado con anterioridad.

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   REIVINDICACIONES

   1. Un metodo para detectar una primera secuencia diana de moleculas de ARNm individuales en una celula permeabilizada fijada, y dicho metodo comprende:

   sumergir la celula permeabilizada fijada en una solucion de hibridacion que contiene un exceso de un primer conjunto de al menos 30 sondas de hibridacion de acidos nucleicos no solapadas, que tienen secuencias complementarias de dicha primera secuencia diana, que tienen de 7 a 30 nucleotidos de longitud y que se marcan con un solo marcador: el mismo primer marcador fluoroforo de un primer color;

   lavar la celula fijada para retirar las sondas no unidas; y

   detectar los puntos de dicho primer fluoroforo en la celula fijada lavada.
2. 2. El metodo de la reivindicacion 1, en el que las sondas del conjunto tienen secuencias complementarias de diana que tienen 15-30 nucleotidos de longitud.
3. 3. El metodo de las reivindicaciones 1 o 2, en el que todas las sondas del conjunto se marcan, en su extremo 3', con un fluoroforo.
4. 4. El metodo de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el paso de deteccion de puntos incluye obtener imagenes con un microscopio de fluorescencia.
5. 5. El metodo de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el paso de deteccion de puntos incluye obtener imagenes de la celula fijada lavada, de manera que se observen los puntos del primer marcador fluoroforo, procesar la imagen a fin de mejorar los puntos, y analizar los puntos mejorados mediante el uso de un umbral de intensidad al que el numero de puntos detectado no es sensible al valor umbral.
6. 6. El metodo de la reivindicacion 5, en el que la imagen se procesa filtrando la imagen mediante un filtro Laplaciano de la (funcion) Gaussiana (filtro LoG) lineal tridimensional.
7. 7. El metodo de la reivindicacion 1, en el que la solucion de hibridacion contiene un exceso de un segundo conjunto de al menos 30 sondas de hibridacion de acidos nucleicos no solapadas, que tienen secuencias complementarias de una segunda secuencia diana, que tienen de 7 a 30 nucleotidos de longitud y que se marcan con un mismo segundo marcador detectable, de un segundo color, que es distinguible del primer marcador fluoroforo.
8. 8. Un metodo para determinar si un compuesto de prueba afecta a la cantidad o a la distribucion de una primera secuencia diana de las moleculas de ARNm presentes en una celula, y dicho metodo comprende:

   (a) incubar la celula con el compuesto de prueba durante un tiempo suficiente para generar una respuesta;

   (b) permeabilizar la celula;

   (c) sumergir dicha celula permeabilizada en una solucion de hibridacion que contiene un exceso de un primer conjunto de al menos 30 sondas de hibridacion de acidos nucleicos no solapadas, que tienen secuencias complementarias de dicha primera secuencia diana, que tienen una longitud de 7-30 nucleotidos, y que se marcan con un solo marcador: el mismo primer marcador fluoroforo, de un primer color;

   (d) lavar dicha celula a fin de retirar las sondas no unidas;

   (e) detectar una cantidad o una distribucion de puntos de dicho primer fluoroforo; y

   (f) comparar dicha cantidad o dicha distribucion con la obtenida de un control tratado de modo similar, pero sin el compuesto de prueba.
9. 9. El metodo de la reivindicacion 8, en el que las sondas del conjunto tienen secuencias complementarias de diana que tienen 15-30 nucleotidos de longitud.
10. 10. El metodo de las reivindicaciones 8 o 9, en el que todas las sondas del conjunto se marcan, en su extremo 3', con un fluoroforo.
11. 11. El metodo de cualquiera de las reivindicaciones comprendidas entre la 8 y la 10, en el que el paso de deteccion incluye el procesamiento a fin de mejorar la distribucion y analizar la distribucion mejorada, mediante el uso de un umbral de intensidad al que el analisis no es sensible al valor umbral.
12. 12. El metodo de la reivindicacion 8, en el que la solucion de hibridacion contiene un exceso de un segundo conjunto de al menos 30 sondas de hibridacion de acidos nucleicos no solapadas, que tienen secuencias

    complementarias de una segunda secuencia diana, que tienen de 7 a 30 nucleotidos de longitud y que se marcan con un mismo segundo marcador detectable, de un segundo color, que es distinguible del primer marcador detectable.
13. 13. El metodo de la reivindicacion 8, en el que el paso de deteccion incluye contar los puntos

    5 correspondientes a moleculas unicas de ARN mensajero (ARNm), a fin de obtener un perfil de expresion genica.

    imagen1

    FUSION

    32

    GFP

    UTR 3'

    • TV

    FIGURA 1

    48 sondas

    uiu^ m-nf

    128 sondas

    tt

    Secuencia codificadora de la GFP

    Repeticion de 80 nt

    UTR 3'

    imagen2

    °0 10 20 SO 40 50

    Maximo de puntos de UTR (u.a.)

    FIGURA 2

    a

    b

    imagen3

    con un solo marcador

    imagen4

    Umbral (normalizado)

    FIGURA 3

    48 sondas (20 pb, un solo marcador)

    32 sondas (45 pb, 3-5 marcadores cada una)

    »—•

    O-OOCh

    32x

    Secuencia codificadora de la GFP

    UTR 3', secuencia repetida

    c

    (/>

    o =

    ■M „ = °

    o. E

    O) o

    T3 ^ O <1>

    ■i -8

    X CD

    kCu 4_>

    s to ^ a>

    imagen5

    48 sondas de 20 nt, marcadas con un solo marcador

    32 sondas de 45 nt, 3-5 marcadores cada una

    FIGURA 4

    imagen6

    Umbral (normalizado)

    FIGURA 5

    a

    d

    ,n®i 127

    b

    &

    i

    l'OS-2

    c ;

    llilyill 1

    -■■■■■■. ■ >■

    j ■■ ■■ | y. | . 1 ■ - v\-.; .a . - : .

    . ' ■■ *

    Sin dexametasona

    Con dexametasona 24 nM

    Represion (division por Induccion (multiplicacion un numero de veces) por un numero de veces) 2 1 0 10 20

    9

    FISH

    FLJ11127

    RT-PCR

    imagen7

    FIGURA 6

    a

    b C

    Particula de ARNm de FLJ1127 Particula de ARNm de Cox-2

    Particula de ARNm de FKBP5

    Canal:

    TMR A594 Cy5 TMR A594 Cy5

    imagen8

    200'

    0

    200

    3 o

    ^ 200

    0

    5 0

    § 200

    1 d

    200

    0

    imagen9

    . ''" _ ' C - -" I'' I' ' ■ I' I . ''''' ' '

    imagen10

    FIGURA 7

    Aumento en Z

    Media de la fluorescencia de punto maxima

    NJ

    NJ

    O

    c

    7J

    >

    oo

    imagen11

    D>

    CD

    D>

    Q_

    O

    3

    >

    o

    n

    i

    imagen12

    Porcentaje de blanqueado (fraction por exposition) o o

    PO

    FKBP5 (Cy-5)

    Numero de exposiciones Numero de exposiciones

    Media de la fluorescencia de punto maxima

    K> OJ

    O O O

    Q O O ©

    imagen13

    
    i-1 ro u»

    
    o o o

    
    o o o

    imagen14

    C=J

    imagen15

    FIGURA 9

    imagen16

    Sin sal

    FIGURA 10

    NaCI 0,4 M

    TCGACGCGGAGACCACGCTC-GGCIT GTCT T TCQCGCGCAA-TGCGACGCACGCGGATAGTT-AGCTG AGCTGC GCCTCTGGTGCGAG CCGAACAGAAAGCGCGCGT T ACGCTGCGTGOSCCTATCAA TCGAC

    CGGCGACGAGCCAC C

    GC CGCTGCTCCGTGG

    ftlQGaiTGACGATJixCGCrGCGCxO3TCSTCGACAflO0GCTOCOGCArGrGCARGCCCOQCTTCSC

    CAGCTGT TGCCGAGGCCGTA C-TXCCGGCCG AAGCG

    GGGCGACGftTGCTCCCCGGGCCGTCTTCCCCTCCATCGTGGGCCeCCCTAGGC^CAGG&TGTGArGGTGCGTAT CCCGC TACGAQGGGCCCGGCAGAAG AGGTAGCACCCGOCGGGATC GGTCCCACACTACCACCCAT

    SGGTCAGAAUGBlCTCCTAOGlGaGOGftCCSAlGGOOCAGABCAAGftGlftOGCMOCTCftCCCTGWGTACCOCATTGA CAGTCTTCC TGAjGG ATGCAC CTGC1CCGGGTCTCGTTCTC G T AGGAC 7GGGAC ITCATGG AACT

    ACACGGCATTG TCACCAACTGGGACCATATG&AGAAGATTTGGCACCACAC TTTCTAC AATGAGC TGCGtGtGGC rGtSC CGTaACaGtGG AjCOCTGCTATaCCTCTXCTA CGTGGTGTGAAAGATC-TrAC AOGCAjCACCG

    CCCTGAGGAGCACCCTG1GCTGCTCACCGAGGCCCCTCT6AACCCTAAGGCCAACCGTGAAAAGATGACCCAGAT GGGACTCCTC GGACACGACGAGTGQCTCCG AGACT TGGGATTCCGGT TGG TTTTCTACTGGGTCTA

    CATGCTTGAGACCTTCAACACCCCAGCCATGTACGTAGCCATCCAGGCTGTGTTGTCCCTG TATGOCTCTGGTCG GXAiC CTC TGG AAjGttSI GGGGtCG CATGCaTCQGtAGGTCCGAC ACAC-GGACATACGGaSaCCA

    TACCACTGGCATTGTGATGGACTCCGGAGACGGGGTCADCCACACTGTGCCCATCTATGAGGGI TACGCGCTCCC rGGTGACCGTAACACTACCr GCCTCTGCCCCAGTGGCTGT ACCGGTAGATACTCCCAArG GAGCG

    TCATGCCATCCTGCGXCTGGACCTGGC TGGCCGGGACCrGACAGACTACC TCATGAAGATCC TGACCGAGCGTGG TMCtTACCCTAjCCaCCC CCTCCAjCCCACCCCCC’CTCC ctctcatccactacttctac tcoctcccacc

    CTACAGCTTCACCACCACAGCTGAGAGGGAAATOGTGCGTGACATTAAAGAGAAGCTGTGCTArGTTGCCCTAGA GATGTCGRA GTGGTtTCGAtTtTCCCTTr A0GC ACTGrAATTTCTCT UC ACGATACAACGGGAtCt

    CTTCGAGCAAGAGATGGCCACTGCCGCATCGTCrTCCTCCCTGGAGAAGAGCTATGiAGCTGCCTGACGGTCRGGT GAA CGTTCTCTACCGGtGACGGC GGACAaGGAGGGACCTCTTC ATACTCGACGGACTGCCAGT

    CATCACTATCGGCAATGAGCGGTTCCGATGCCCCGAGGCTCTCrTOCAGCC TTCC TTCC TGGGTATGGAATCCTG GtaGtGataGCCGttaCtCG aGGCtACGGGGCtCCGaGaG GcCGGaaggaaggaccCata taggaC

    IGCCAxCCAtGAAACTACATTCAATTCCATCATGAAGTGTGACGTTGACArCCGTAAAC-ACCrCTATGCCAACAC ACCGTAGGTACTTT GTAACTTAAGGTAGTACTTC CTGCAACTGTAGGCATTTCT CArACGGTrGTG

    MTGCTGTrCTGOIGQCACCAOCMeTAOCCAGCJCltrTgCTQflCAOeATGCAGAAGGAQATTACTigoCCTGGCTCC

    tcacgaca caccgtggtggtacatggGt taacgactgtcCtacgtctt ctaatgacgcgaccgaisg

    TAI5CACCATgASi5MCAA3ATCATTOCTOCTrCTGAGCgCAK3TACTCTGTGTGGATTGGTI3GCTCTATaCT6GC AT GGUACTTCTAGTTCTAGTAA GGAGGACTCGCGTTCATGAG CACCTAACCACCGAGATAGG g

    C’TCACTGTCCACGTTCC'AGCAIjA.TGtGGaTCaGCAAIjCaGGaGTaCGAtGAiGTCCGGCCCCTCCAT'CGtGCaCCG GAGTGACAGGTGGAAGGTC TACACCTAGTCGTTCGrCCT GCTACTCAGGCCGGGGAGGT ACGTGGC

    CAAATQCTTCTAG

    GTTTACGAftGATC

    at«c tcgcccgc sc cctgc tgct gt sc scggt cc rggcoct cagc catacagcaaatcc tt gc tg

    C&JjGCGGGCGCGGGACGACG TGTCGTTTAGGAACGAC

    rTCCCACCCATGT CAAAACCGAGG TGTATGTATGAGTGT GGGAT TTGACCAGT ATAAG TO CQM T^TAC CC GG AC AAG ttGCCtCCaCataCataCtC aactcgtcataitcacgcta

    AGGAT TCTATG GAGAAAAC TCC TCAACACCGGAAT TT TTGACAlAGAAT^iAAM' TAT T TC TGAAACCCPiCTCC AAA ACC TCTTTTGACGAGTTGIG AAGACTTTGGGTGAGGTT T

    CACAIJTtJCACTACA TACTTACCCACITC AAjGGQATTT TGGAACCT TGICflATAftCJUTCCC TTCCT tCGAAATGC G TG AATGGGT GAAGT T CCC TA AGGGAAGGAAGCTTTACG

    AATTRrGAGrTATGTGTTGiCATCCAGATCACArTrGATTGACAGTCCACCAACTTACAATGCTGACTATGGCTA TT ACACAAC T6TAG GT C TAGTG AC TGTCAGGTGGT TGAATGT ACO0AT

    CAAAAGCTGGGAAGCCTTCTCTAACCTCTCCTATTATACTAGAGCCCTTCCTCCTGTGCCTGATGATTGCCCGAC GTTTTCGACCCTTC AArATGATC TC GGGAAGGAG

    TCCCTTGGG TG TC AAAG G TAAAAAGCAGC TTCC TGATTCAAATGAQAIIGIGGAAAAATTGCxICTAAGAAGAAA rCCATTTTTCGTCGAAGGAC ACrCTAACACCTITTTAACG TCTTCTTT

    GtTtATtCCTGATCCtCAGCGCTCAAAC; ATtjATGTXTGCAT TC IT TGCCC AlGCAC TTCACGCATCAGT TT TTCAA CAAGTAGGGACT ACGTAAGAAACGGG TCGTGA AAGTT

    GaGACtATC ATAAGCG AGCCCC AiGCTTTC ACCAACGGGCTGGGCCATG&GG T&GAC ITAAATCATAT TTACGGT6A CrGTCTAGTATTCGC AGTGGTTQCCCGACOCGGTA TAAATGCCACT

    AACTCTGGCTAGACAGCGTAAACTGCGCCTTTTCAAGGATC-GAAAAATGAAATATCAGATAArTGATGGAGAGAT TTGAGAGCG TTGACGCGGaAaaGttCCta ACTACCTCTCTA

    G rA TCCTCCCACAG TCAAAGATACTCAGG CAGACATgatc TACC C TC C TCAACtCC C T £AGC ATC I ACC GTT TGC CATAQGM3 TCTATGAGTCCGTCTCTACT

    TGT GGGGCAGGAGGTCT TTGGTCTGGTGtC TGGTCTG ATG ATGTATCCC ACAATC TC-GCT<5CGGGAAC AC A ACAG ACC AlGACCACGGACCAG AC T AG ACCGAGGCCCT TGTGTTG

    AST AT GC GATGTGC TTAAACAG GAGCA TC ClGAATGGGGTGATGAGCAGITGTTC CAGACAAGCAGGC TAATACT ACGCTACACGAAT TTGTCCT ACCCCACTACrCGTCAACAA TAIGA

    GATAGGAGAGACTATTAAGAT TGIGATTGAAGATTATGTCCAACACTTGAG TGGC TATCACT TCAAACTGAAATT CTATCCTGTCTGATA ATACACGTTGTGAACTCACC TGACTTTAA

    TGACCCAGAACTACTTTTCAACAAACAATTCGAGTACCAAAATCGTATTGCTGCTGAATTTAACACCCTCTATCA ACTGGGtCTTG AGlTGTTT-GirAAGGTCATG AC GACGACITAAAT TGTGGG

    CTGGCATCCCCTTCTGCCTGACACCTrTCAAATrCATGftCCAGAAATACAACTATCAACAGnrATCTACAACAA

    AAGTACTGGTCTTTATGTTG

    CTCTATATTGC TGGAACATCGAAT TACCCAGTTTG TTGAATCAT TCACCAGGCAAAT TGCIGGCaGGGT TQCTGG AGGACGTTGTACCTTAArGG AC AACT T AGTAAjGTGGTCCG