JP2012501679A - 1個だけで標識された多種類のプローブを用いるmRNA単一分子の画像化 - Google Patents
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Abstract
【選択図】なし
Description
本出願は、その全体が引用により本明細書に取り込まれる、2008年9月10日出願の米国仮出願第61/191,724号を基礎とする優先権を主張する。
この章で説明される手順は、特記がない限り、全ての実施例に適用される。
プローブの組は、少なくとも48種類のオリゴヌクレオチドからなるように設計され、該オリゴヌクレオチドは、それぞれ、長さがヌクレオチド17個から22個までのばらつきがあり、3’アミノ基修飾剤(amine modifiers)を含む(FKBP5 mRNAは63種類のオリゴヌクレオチドを用いて、FLJ11127 mRNAは53種類のオリゴヌクレオチドを用いて、Map2 mRNAは、72種類のオリゴヌクレオチドを用いて、それぞれ標識された)。また、前記オリゴヌクレオチドのGC含量は、できるだけ45%近くに設定された。前記オリゴヌクレオチドは、プールされ、1回の反応で蛍光色素と結合され、その後、未結合のオリゴヌクレオチドと未反応の蛍光色素とはHPLC精製により除去された。
FISHに備え、サンプルは全て、3.7%ホルムアルデヒドで固定され、エタノールで透過処理が施された。Feminoらにより概要が示されたのと同様の緩衝剤及び条件を用いてハイブリダイゼーションが実施されたが、重要な相違点は、使用するホルムアミドの量を10%まで減少させることにより、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーをより低下させることである。最適なシグナルを発生する前記プローブの濃度は、経験的に決定された。
全ての画像は標準的な広視野蛍光顕微鏡を用いて取得された。コンピューターによる検出と、粒子の計数とは、粒子のシグナルを強調するために設計された線形フィルターを用いて実施された。
単一の蛍光色素原子団で標識された小さなオリゴヌクレオチドプローブを用いたとき、プローブ結合配列の32−96回の縦列コピーを含むように改変されたmRNA単一分子が、in situ ハイブリダイゼーションで検出可能であることを本件の発明者らは明らかにした。また、回折限界のスポットを直接計数することにより得られたmRNAコピー数の平均を、リアルタイムRT−PCRにより得られた標的分子の数の計数値と関連付けることを含む多数の異なる手法を用いて、画像内の個々のスポットがmRMA単一分子を表すことを発明者らは証明した。したがって、多数の異なるプローブを使用し、該プローブが、それぞれ、天然mRNAの明確に異なる領域を標的とする場合、改変された遺伝子を用いることなしに、単一分子感度を得ることが可能となるであろう。
多数のmRNA分子を確実に同定するために、本件の発明者らは、蛍光画像の3次元スタック内のスポットを確認するためのコンピューターによる半自動アルゴリズムを開発した。スポット検出に関する問題点の1つは、細胞自家蛍光と、低レベルの非特異的プローブハイブリダイゼーションとに起因する不均一なバックグラウンドである。かかる問題を解決するために、本件の発明者らは、わずかに変動するバックグラウンドを除去しながら、適当な大きさ及び形のスポット様シグナルを強調するように設計された3次元線形ラプラシアン・オブ・ガウシアンフィルターを用いて、画像スタックをフィルター処理した(図5A及び図5B)。前記アルゴリズムの次のステップでは、発明者らは、前記スポットを規定するために、フィルターで処理された画像に閾値を適用した。閾値を合理的に選択するために、前記フィルターで処理された画像で、0から最大画素強度までの範囲の閾値全てについて、3次元でのスポットの数が計数された。発明者らが粒子の数を閾値に応じてプロットしたとき、検出された粒子の数が選択された特定の閾値に全く反応しない領域を示す広いプラトーが存在した(図5C)。前記領域で閾値が選択されるとき、検出された前記スポットは目で確認されるスポットと非常によく一致することから、スポット検出アルゴリズムの有効性が実証された(図5D)。
本発明の方法は、個々の細胞内の多種類のmRMA単一分子の同時検出に使用される可能性がある。かかる可能性を実証するために、ヒト癌細胞株A549内のFK506結合タンパク質5(FKBP5)と、Cox−2と、FLJ11127とをコードする3種類のmRNAに特異的な数種類のプローブを、本件の発明者らは設計した。前記数種類のプローブは、スペクトルが区別できる蛍光色素Cy5、Alexa 594及びTMRにそれぞれ結合された。同時に全3種類のプローブを用いてFISHを実施すると、個々のスポットが3種類の異なる蛍光チャネルで視覚化され(図6A−図6F)、強度解析により、蛍光スポットは他のチャネルへとにじみ出さないことがわかった(図7)。
in situ ハイブリダイゼーションの標準的な用途の1つは、発生段階でのmRNA局在の検出である。本件の発明者らは、広く研究された2種類の発生システムである線虫、シノラブディス・エレガンス及びショウジョウバエ、ドロソフィラ・メラノガスターにおいて本発明の方法の有効性を試験した。前記線虫では、本件の発明者らは、線虫の胚が45細胞期に発生した後でのみ線虫の腸だけで発現される、転写因子elt−2遺伝子からmRNAを検出するためのプローブを構築した。前記プローブの組を胚及び幼虫の両方とハイブリダイゼーションさせると、該胚及び幼虫(図9B)の両方の腸の領域内(図9A)だけでelt−2 mRNA分子が存在することがわかった。しかし、発現が開始する既知のタイミングと一致して、elt−2 mRNAは45細胞期より発達した胚の腸でだけ検出されたことから、本発明の方法の特異性が再び強調された。さらに、初期の段階で、ほんの数個の転写産物が検出されたことから、本発明の方法は複雑な組織内の少数の翻訳さえも検出できるほど感度が高いことがわかった。
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Claims (41)
- 固定され膜透過処理が施された細胞内における、メッセンジャーリボ核酸分子(mRNA分子)の標的配列に対するプローブ処理方法であって、前記細胞を少なくとも30種類の過剰の核酸ハイブリダイゼーションプローブに浸すステップと、未結合のプローブを除去するために、前記固定された細胞を洗浄するステップと、前記プローブからの蛍光を検出するステップとを含み、前記標的配列は、ヌクレオチド15−100個で、少なくとも30種類の重複しないプローブ結合領域を含み、前記プローブのそれぞれは同一の蛍光標識1個だけで標識され、かつ、前記プローブのそれぞれは前記標的配列の異なるプローブ結合領域に相補的である核酸配列を含むことを特徴とする、プローブ処理方法。
- 前記プローブ結合領域及び前記プローブの種類は40種類ないし60種類であることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 少なくとも30種類のプローブは、ヌクレオチド7−40個の長さで標的配列に相補的な配列を有することを特徴とする、請求項1又は2に記載の方法。
- 少なくとも30種類のプローブは、ヌクレオチド15−30個の長さで標的配列に相補的な配列を有することを特徴とする、請求項1ないし3のいずれか1つに記載の方法。
- 少なくとも30種類のプローブは、ヌクレオチド17−25個の長さで標的配列に相補的な配列を有することを特徴とする、請求項1ないし4のいずれか1つに記載の方法。
- 少なくとも30種類のプローブは、ヌクレオチド17−22個の長さで標的配列に相補的な配列を有することを特徴とする、請求項1ないし5のいずれか1つに記載の方法。
- 前記プローブは、3’末端を蛍光色素で標識されることを特徴とする、請求項1ないし6のいずれか1つに記載の方法。
- 前記各プローブは、1マイクロリットル当り0.2−1.0ナノグラムの濃度で前記細胞内に添加されることを特徴とする、請求項1ないし7のいずれか1つに記載の方法。
- 前記プローブは、デオキシリボヌクレオチドか、リボヌクレオチドか、デオキシリボヌクレオチド及びリボヌクレオチドの混合物かを含むことを特徴とする、請求項1ないし8のいずれか1つに記載の方法。
- 前記プローブのうち少なくとも一部は、2’−O−メチルリボヌクレオチド等の非天然ヌクレオチドを含むことを特徴とする、請求項1ないし9のいずれか1つに記載の方法。
- 前記固定された細胞は、ホルムアルデヒド固定により調製されることを特徴とする、請求項1ないし10のいずれか1つに記載の方法。
- 前記検出するステップは、広視野蛍光顕微鏡を用いて画像化するステップを含むことを特徴とする、請求項1ないし11のいずれか1つに記載の方法。
- 前記検出するステップは、3次元線形ラプラシアン・オブ・ガウシアンフィルターを用いて画像をフィルタリングするステップと、選択された閾値に検出が反応しない領域で検出閾値を適用するステップとを含むことを特徴とする、請求項1ないし12のいずれか1つに記載の方法。
- 前記少なくとも30種類のプローブは、第1の蛍光標識1個だけで標識された少なくとも30種類のプローブと、第2の蛍光標識で標識された少なくとも30種類のプローブとを含むことを特徴とする、請求項1ないし13のいずれか1つに記載の方法。
- 前記標的配列は同一のmRNA分子内に少なくとも2個の標的配列を含み、各標的配列に対する前記蛍光標識は識別可能であることを特徴とする、請求項1ないし14のいずれか1つに記載の方法。
- 遺伝子発現プロファイルを得るために、mRNA単一分子に対応する蛍光スポットを計数することを含むことを特徴とする、請求項1ないし15のいずれか1つに記載の方法。
- 前記標的配列は異なるmRNA分子内に少なくとも2個の標的配列を含み、各標的配列に対する前記蛍光標識は識別可能であることを特徴とする、請求項1ないし16のいずれか1つに記載の方法。
- 試験化合物がメッセンジャーリボ核酸分子(mRNA分子)の標的配列の分布又は量に影響を与えるかどうかを確認する検定方法であり、該標的配列は、ヌクレオチド15−100個で、少なくとも30種類の重複しない細胞内のプローブ結合領域を含み、前記検定方法は、
a)試験化合物を用いて、応答が起こるのに十分な期間、細胞を培養するステップと、
b)該細胞に透過処理を施すステップと、
c)前記細胞を少なくとも30種類の過剰の核酸ハイブリダイゼーションプローブに浸すステップと、
d)未結合のプローブを除去するために、前記固定された細胞を洗浄するステップと、
e)前記プローブからの蛍光の量又は分布を検出するステップと、
f)該量又は分布を、上記(b)ないし(e)の処理を施された対照細胞から得られる量又は分布とそれぞれ比較するステップとを含み、
前記プローブのそれぞれは同一の蛍光標識1個だけで標識され、かつ、前記プローブのそれぞれは前記標的配列の異なるプローブ結合領域に相補的である核酸配列を含むことを特徴とする、検定方法。 - 前記プローブ結合領域及び前記プローブの種類は40種類ないし60種類であることを特徴とする、請求項18に記載の方法。
- 少なくとも30種類のプローブは、ヌクレオチド7−40個の長さで標的配列に相補的な配列を有することを特徴とする、請求項18又は19に記載の方法。
- 少なくとも30種類のプローブは、ヌクレオチド15−30個の長さで標的配列に相補的な配列を有することを特徴とする、請求項18ないし20のいずれか1つに記載の方法。
- 少なくとも30種類のプローブは、ヌクレオチド17−25個の長さで標的配列に相補的な配列を有することを特徴とする、請求項18ないし21のいずれか1つに記載の方法。
- 少なくとも30種類のプローブは、ヌクレオチド17−22個の長さで標的配列に相補的な配列を有することを特徴とする、請求項18ないし22のいずれか1つに記載の方法。
- 前記プローブは、3’末端を蛍光色素で標識されることを特徴とする、請求項18ないし23のいずれか1つに記載の方法。
- 前記各プローブは、1マイクロリットル当り0.2−1.0ナノグラムの濃度で前記細胞内に添加されることを特徴とする、請求項18ないし24のいずれか1つに記載の方法。
- 前記プローブは、デオキシリボヌクレオチドか、リボヌクレオチドか、デオキシリボヌクレオチド及びリボヌクレオチドの混合物かを含むことを特徴とする、請求項18ないし25のいずれか1つに記載の方法。
- 前記プローブのうち少なくとも一部は、2’−O−メチルリボヌクレオチド等の非天然ヌクレオチドを含むことを特徴とする、請求項18ないし26のいずれか1つに記載の方法。
- 前記固定された細胞は、ホルムアルデヒド固定により調製されることを特徴とする、請求項18ないし27のいずれか1つに記載の方法。
- 前記検出するステップは、広視野蛍光顕微鏡を用いて画像化するステップを含むことを特徴とする、請求項18ないし28のいずれか1つに記載の方法。
- 前記検出するステップは、3次元線形ラプラシアン・オブ・ガウシアンフィルターを用いて画像をフィルタリングするステップと、選択された閾値に検出が反応しない領域で検出閾値を適用するステップとを含むことを特徴とする、請求項18ないし29のいずれか1つに記載の方法。
- 前記少なくとも30種類のプローブは、第1の蛍光標識1個だけで標識された少なくとも30種類のプローブと、第2の蛍光標識で標識された少なくとも30種類のプローブとを含むことを特徴とする、請求項18ないし30のいずれか1つに記載の方法。
- 前記標的配列は同一のmRNA分子内に少なくとも2個の標的配列を含み、各標的配列に対する前記蛍光標識は識別可能であることを特徴とする、請求項18ないし31のいずれか1つに記載の方法。
- 遺伝子発現プロファイルを得るために、mRNA単一分子に対応する蛍光スポットを計数することを含むことを特徴とする、請求項18ないし32のいずれか1つに記載の方法。
- 前記標的配列は異なるmRNA分子内に少なくとも2個の標的配列を含み、各標的配列に対する前記蛍光標識は識別可能であることを特徴とする、請求項18ないし33のいずれか1つに記載の方法。
- 前記細胞は、哺乳類細胞か、無脊椎動物細胞か、酵母細胞か、細菌かであることを特徴とする、請求項1ないし34のいずれか1つに記載の方法。
- 前記細胞はニューロンであることを特徴とする、請求項35に記載の方法。
- コンピューターで読み取り可能な媒体であって、
2次元蛍光画像の3次元スタックを得るための指示と、
3次元フィルターを用いて、前記3次元スタックをフィルタリングするための指示と、
複数の強度閾値それぞれについて、フィルタリングした前記3次元スタックでの3次元スポットの総数を計数するための指示と、
該総数が計数された強度閾値に対する3次元スポットの前記総数のプロットにおける、プラトー領域の代表的な最適強度閾値を得るための指示と、
前記3次元スタックで検出された蛍光粒子の代表的な数として、前記最適閾値で得られる3次元スポットの前記総数を用いるための指示とを含むことを特徴とする、媒体。 - 2値化は、3次元線形ラプラシアン・オブ・ガウシアンフィルターを用いるステップを含むことを特徴とする、請求項37に記載の方法。
- a)2次元蛍光画像の3次元スタックを得るための指示と、
3次元フィルターを用いて、前記3次元スタックをフィルタリングするための指示と、
複数の強度閾値それぞれについて、フィルタリングした前記3次元スタックでの3次元スポットの総数を計数するための指示と、
該総数が計数された強度閾値に対する3次元スポットの前記総数のプロットにおける、プラトー領域の代表的な最適強度閾値を得るための指示と、
前記3次元スタックで検出された蛍光粒子の代表的な数として、前記最適閾値で得られる3次元スポットの前記総数を用いるための指示とを含むコンピューターで読み取り可能な媒体と、
b)ヌクレオチド15−100個で、少なくとも30種類の重複しないプローブ結合領域とを含み、
前記細胞を少なくとも30種類の過剰の核酸ハイブリダイゼーションプローブに浸すステップを含み、前記プローブのそれぞれは同一の蛍光標識1個だけで標識され、かつ、前記プローブのそれぞれは予め決定された標的配列の異なるプローブ結合領域に相補的である核酸配列を含むことを特徴とする、キット。 - 前記少なくとも30種類のプローブは、第1の蛍光標識1個だけで標識された少なくとも30種類のプローブと、第2の蛍光標識で標識された少なくとも30種類のプローブとを含むことを特徴とする、請求項39に記載のキット。
- 前記標的配列は同一のmRNA分子内に少なくとも2個の標的配列を含み、各標的配列に対する前記蛍光標識は識別可能であることを特徴とする、請求項39又は40に記載のキット。
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