BR112013028985A2 - expressão de kiaa 1456 que prevê a sobrevida em pacientes com câncer de cólon - Google Patents

Abstract

EXPRESSÃO DE KIAA1456 QUE PREVÊ A SOBREVIDA EM PACIENTES COM CÂNCER DO CÓLON. A invenção se refere a métodos para decidir sobre a terapia em um indivíduo que sofre de câncer colorretal bem como para prever o resultado clínico de um paciente que sofre de câncer colorretal com base no nível de expressão de KIAA1456 compreendendo determinar o nível de expressão do gene KIAA 1456. A invenção se refere também a kits e usos do mesmo compreendendo reagentes adequados para a determinação do nível de expressão do gene KIAA1456.

Description

"EXPRESSÃO DE KIAA1456 QUE PREVÊ A SOBREVIDA EM PACIENTES COM CÂNCER DO CÓLON"

[001] CAMPO DA INVENÇÃO íO02] A invenção se refere ao campo de 5 diagnóstico, especificamente a um método de fornecimento de diagnóstico personalizado para pacientes com câncer do cólon com base na expressão de determinados biornarcaciores erri uma amostra a partir dos ditos pacientes.

[003] ANTECEDENTES DA INVENÇÃO IO [004] O câncer colorretal, também denominado câncer de cólon ou câncer de intestino grosso inclui tumores cancerígenos no cólon, reto e apêndice. Com 655 mil mortes no mundo por ano, é a terceira forma mais comum de câncer e a segunda causa de morte por câncer no mundo ocidental. Acredita-se que muitos cânceres colorretais ocorram a partir de pólipos adenornatosos no cólon. Estes crescimentos em forma de cogumelo são geralmente benignos, mas alguns podem se transformar ern câncer com o tempo. A maioria das vezes, o diagnóstico do câncer do cólon localizado é realizado por meio de colonoscopia.

[005] A intervenção cirúrgica é o principal modo de tratarnento para pacientes em estágios iniciais (do estágio I ao III). No entanto, conforrne o estágio do turnor aumenta em termos de profundidade de penetração do tumor nas camadas intestinais e envolvimento dos gânglios linfáticos, a possibilidade de uma cura apenas por cirurgia diminui sendo necessárias a quimioterapia e radioterapia.

[006] Destacam-s entre os fatores moleculares estudados que parecern ser clinicamente relevantes: os níveis do antígeno carcino embrionário {CEA) e do antígeno de carboidrato CA19-9 no soro [Yamashita K, Watanabe M.

Cabcer Science Cancer 2009; 100: 195 - 199], a perda de heterozigose clo cromossomo 18q e alta instabilidade de microssatélites (MSI) [Compton CC. e outros; College of American Pathologists Consensus Statement 1999. Archives of Pathology & Laboratory Medicine 2000; 124:979-994].

[007] Um trabalho recente de Yamashita e outros 5 analisa a relevância clinica dos marcadores tumorais emergentes no CRC [Yamashita K, Watanabe M. Cancer Science 2009; 100: 195-199]. Os autores resumem os possíveis marcadores de prognóstico de acordo com o estágio do tumor, uma vez que a sobrevida do paciente em geral, depende lO destes estágios. [0081 A detecção dos marcadores de prognóstíco é crucial no estágio II, especialmente para nielhorar a seleção de pacientes que devern receber quimioterapia adjuvante após a cirurgia, para prevenir a recorrência, uma vez que os pacientes serão sensíveis ao dito tratamento. Neste sentido, verificou-se que a aneuploidia, especificamente a contagem específica dos alelos 8p e 18q, pode prever a recorrência em pacientes no estágio II [Zhou W. e outros, Lancet 2002, 359:219-225]. Além disso, um perfil de 23 genes alterados ern pacientes de Dukes B que predizern recorrência também foi demonstrado por rríeio de uma análise do transcriptoma por microarranjos de DNAC [Wang Y.

e outros, J. Clin. Oncol, 2004, 22: 1564-1571]. No entanto, um consenso não foi alcançado nestes resultados, devido à variabilidade das plataformas de arranjo utilizadas.

Portanto, nenhum dos marcadores de expressão gênica identificado foi implementado para uma aplicação clínica.

l009j Marcadores de prognóstico para o estágio III também ainda não foram identificados. A detecção dos mesmos seria muito importante, especialmente quando da seleção de pacientes que devem receber os tratamentos de quimioterapia mais potentes e caros, assim como para o desenvolvimento de novos alvos terapêuticos para o tratamento de pacientes com recidiva e resistência às terapias convencionais. Neste sentido, tem sido dernonstrado que a mutação K-ras em tumores primários indica um prognóstico pior nos pacientes desse estágio [Andreyev H.J. e outros; British journal of 5 Cancer 2001; 85: 692-696]. Alérn disso, foi verificado que esta mutação deve ser utilizada para prever o efeito terapêutico do receptor do inibidor do fator de crescimento epidérmico (EGFR) cetuximab ou panitumumab, uma vez que os pacientes com CCR afetados pela mutação K-ras são insensíveis ao tratamento por inibição de EGFR fBenvenuti S. e outros; Cancer Research 2007; 67: 2643-2648:. Mais uma vez, no momento, nenhum marcador prognóstico para o estágio III de CRC foi ainda aplicado à prática clínica. [o1oj Em pacientes erri estágio IV, foi detectado que os níveis elevados de preCA19-9 (níveis pré-operatórios do CA19-9) são um biomarcador de pior prognóstico. Não há prognóstico molecular ou fatores de resposta consolidados para a sua aplicação clínica até a data.

[011] A presença de células tumorais nos gânglios linfáticos regionais em pacientes no estágio III prevê 60% de recorrência em 5 anos. O tratamento com quimioterapia desses pacientes após a intervenção cirúrgica reduz a recorrência de 40% a 50% e é atualmente o tratamento padrão dado aos pacientes em estágio III.

[012] Pacientes nos estágios I e II não apresentam gânglios linfáticos afetados ou metástase distal e, portanto, eles apresentam um prognóstico melhor. A intervenção cirúrgica é altamente eficaz quando a doença é localizada, no entanto, uma proporção de 25-30% dos pacientes no estádio II experimenta recorrência e morre devido a esta doença. O benefício da quimioterapia pós- operatória não é claro para este último grupo de pacientes. vários estudos ciernonstraram que não há diferença na sobrevida entre os pacientes do estágio II tratados com quimioterapia adjuvante e aqueles que não foram tratados corn a mesma íj. Clin. Oncol. 1999, 17: 1356-1363]. Por outro lado, uma revisão do National Surgical Adjuvant 5 Breast and Bowel project estabelece que a quimioterapia adjuvante não melhora a sobrevida em determinados pacientes no estágio II [Mamounas E. e ouros, J. Clin. Oncol. 1999; 17: 1349-1355]. 1013] A detecção de marcadores prognósticos em 10 pacientes no estágio II é fundamental para determinar os pacientes que estão predispostos a experimentar recorrência e que serão sensível ao tratamento corn quimioterapia. A redução do número de pacientes que apresentam efeitos colaterais da quimioterapia, sem obter qualquer efeito 15 terapêutico, poderia também obtida com esta seleção.

Portanto, ainda existe urna necessidade de novos marcadores úteis para prever o resultado clínico de pacientes com câncer do cólon e os pacientes do estágio II.

[014] SUMÁRIO DA INVENÇÃO 20 [015] Em urn primeiro aspecto, a invenção se refere a um método para decidir sobre a terapia em um indivíduo que sofre de câncer colorretal que compreende a determinação cio nível de expressão do gene KIAA1456 em uma amostra do dito indivíduo, onde o nível de expressão gênica 25 alterado quando comparado com um nível de referência é indicativo de que a dita terapia é adequada ao dito . paciente.

[016] Em outro aspecto, a invenção se refere a um método para prever o resultacio clínico de um paciente que 30 sofra de câncer colorretal que compreende a determinação do nível de expressão do gene KIAA1456 em uma amostra do dito paciente, em que um aumento do nível da expressão do gene KIAA1456 na dita amostra, quando em comparação com um nivel de referência, é indicativo de um prognóstico clinico fraco ou em que o mesuno ou uma diminuição do nível de expressão do gene de KIAA1456 na dita amostra, em comparação com urn nível de referência é indicativa de um bom resultado 5 clínico. ío17l Em outro aspecto, a invenção se refere a um kit que compreende um conjunto de reagentes capazes de detectar especificarnente o nível de expressão de KIAA1456 e, opcionalrnente, urrt gene de manutenção ou a proteína codificada pelo dito gene de manutenção.

[018] Ainda ern outro aspecto, a invenção se refere ao emprego do kit de acordo com a invençào, para determinação da necessidade de tràtamento com um agente terapêutico ou uma combinação de agentes terapêuticos de um indivíduo ou para previsão do resultado clínico de um indivíduo que sofre de câncer colorretal.

[019] BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[020] Fígura 1. Níveis de expressão gêníea de KIAA1456 ísoforma L em 80 amostras de pacíentes com CRC em estágío II. A) O valor de RQ de cada amostra de tumor {barras cinza) e do tecido normal de controle {indicado pela linha preta e barra). B) O padrão de expressão gênica de KIAA1456 calculado pelo método de RQ e rnostrado cornO Log10 RQ, em que o valor de 0 representa a expressão no tecido normal, os valores da expressão inferiores a zero indicam um silenciamento, enquanto valores positivos indicam superexpressão em relação ao tecido normal utilizado como uma referência.

[021] Fígura 2. Correlação entre a expressão de KIAA1456 expressão e os parâmetros c1íníco-pato1Ógicos. A) Comparação média entre o valor de RQ de KIAA1456 nas amostras tumorais e invasão perineural (p = 0,004, teste de Mann-Whitney). B) Comparação média entre o valor de RQ de

KIAA1456 nas amostras tumorais e obstrução/perfuração intestinal no momento do diagnóstico (p = 0,003, teste de Mann-Whitney). 1022] Fígura 3. Sobrevída de aeordo com a 5 superexpressão gêníea transcrícíonal de KIAA1456 em paeientes com CRC no estágío II. Curva de Kaplan-Meier em que os pacientes são agrupados de acordo com a expressão de KIAA1456 e a sobrevida livre de doença é colocada em gráfico em relação ao tempo de acompanhamento (p = 0,05).

Linha sólida preta indica baixa expressão de KIAA1456 e linha cinza pontilhada indica alta expressão de KIAA1456. [023j Fígura 4. Sobrevída de acordo eom os casos de invasão não vascular ou períneural. A análise de Kaplan- Meier foi realizada estratificando os pacientes quanto à presença ou ausência de invasão vascu!ar ou perineural. A), B) As curvas de Kaplan-Meier para a sobrevida isenta de recidiva dos pacientes quando os valores AQ da expressão de KIAA1456 foram correlacionados com o resultado dos pacientes. C), D) A5 curvas de Kaplan-Meier para a sobrevida isenta de recidiva dos pacientes quando cs valores de RQ da expressão . de KIAA1456 foram co,rrelacionados com o resultado dos pacientes. [024j Figura 5. Sobrevída de aeordo eom a estratífícação de superexpressão sígnifícatíva de KIAA1456 de aeordo com se ou não os pacíentes receberam químíoterapía adjuvante. A) Análise da sobrevida global dos pacientes de acordo com superexpressão significativa de KIAA1456 se os pacientes não receberam quimioterapia (p = 0,01) ou se receberarn (B). Análise da sobrevida livre de doença dos pacientes de acordo com supressão significativa de KIAA1456 dependendo se os pacientes receberam quimioterapia (D) ou não receberam (C) (p = 0,012). A linha sólicia preta indica baixos níveis de KIAA1455 e a cinza linha pontilhada indica altos niveis de KIAA1455.

[025] Figura 6. Sobrevída de acordo eom a estratífícação de superexpressão maíor de KIAA1456 de 5 aeordo com se ou rião os pacientes receberam químíoterapía adjuvante. A) Curva de Kaplan-Meier da sobrevida global ao longo do ternpo de acompanharnento em que os pacientes são agrupados de acorcio corri superexpressão de KIAA1456 {estabelecimento de um ponto de corte arbitrário de 69 10 percentil) e dependendo se os pacientes não receberam quimioterapia (p = 0,031) ou se receberam {B) (não- significativo). C) Curva de Kaplan-Meier da sobrevida livre de doença ao longo do tempo de acompanhamento em que os pacientes são agrupados de acordo corn a superexpressão de 15 KIAA1456 (estabelecendo um ponto de corte arbitrário de 64 percentil), dependendo se os pacientes não receberarn quimioterapia (p = 0,025) ou se receberam (D) {não- siqnificativo). A linha sólida preta indica os níveis de expressão de KIAA1456 abaixo do ponto de corte e a linha 20 tracejada cinza indica níveis de expressão de KIAA1456 em relação ao ponto de corte.

[026] DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[027] Os autores da presente invenção descobriram que o resultado clínico dos pacientes que sofrem do câncer 25 do cólon se correlaciona estreitamente com o nível de expressão de KIAA1456 {vide figuras 3 a 6), e que o aumento do nível da expressão de KIAA1456 é um marcador de prognóstico clínico do paciente (vide iiiguras 3-6). Estes resultados permitem determinar se um paciente que sofre de 30 câncer está em risco de desenvolver complicações, assim, é um candidato a ser tratado com uma determinada terapia.

[028] Método ?ara decidir sobre a terapia de um individuo .

«' .u 1029] Em um primeiro aspecto, a invenção se refere a um rnétodo (doravante o primeiro método da invenção) para "i decidir sobre a terapia ern urn indivíduo que sofre de câncer colorretal que compreende a determinação do nível de 5 expressão gênica de KIAA1456 uma amostra do dito indivíduo, em que o nível de expressão alterado do dito gene quando comparado a um nível de referência é indicativo de que o dito tratamento é adequado ao dito paciente, ou onde o mesmo nível cie expressão do gene KIAA1456 na dita arnostra 10 de expressão quando comparado a um nível de referência é indicativo de que o dito tratamento não é suficiente para c) dito paciente.

[030] Tal como empregado no presente ciocumento, o termo "decidir" siçnifica realizar uma avaliação sobre a 15 conveniência do tratamento de um paciente com uma determinada terapia. O versado na técnica entenderá que os pacientes previstos para terem urrt resultado clínico desfavorável serão candidatos a receber uma terapia, considerando-se que os pacientes com baixo risco de 20 apresentarem um resultado clínico desfavorável podem ser poupados os efeitos indesejáveis da terapia. Como será entendido pelos versados na técnica, tal avaliação norrnalmente não se destina a ser correta para todos (ou seja, 100 por cento) dos indivíduos a serem identificado. O 25 termo, no entanto, requer que uma porção significativa de inclividuos possa ser identificada (por exemplo, um çrupo em urrt estudo). Se uma porção for estatisticamente significativa pode ser determinada mais rapidamente pelo versado na técnica utilizando diversas ferramentas de 30 estatística de avaliação conhecidas, por exemplo, a determinação dos intervalos de confiança, determinação do valor p, teste t de Student, de Mann-Whitney, etc. Detalhes são encontrados em Dowdy and Wearden, Statistics for kkj, Research, John Wiley and Sons, New York 1983. Intervalos de confiança preferidos são pelo menos 90 por cento, pelo f4 menos, 95 por cento, pelo menos, 97 por cento, pelo menos, 98 por cento ou pelo menos 99 por cento. Os valores de p 5 são, de preferência, 0,1, 0,05, 0,01, 0,005, ou 0,0001. Mais preferencialmente, pelo rnenos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80% ou pelo menos 90% dos indivíduos de uma população podem ser corretamente identificados pelo método da presente invenção.

10 [031] Tal como empregado no presente documento, o termo "terapia", com relação ao câncer colorretal, se refere a qualquer tentativa de reparação ou prevenção do aparecimento de câncer colorretal ou de uma metástase do mesmo e inclui, sem limitação, a radioterapia, 15 quimioterapia, imunoterapia e cornbinações as mesmas.

[032] O termo "radioterapia" é geralmente definido como o uso de radiação de alta energia de raios-X, raios gama, neutrons, prótons e de outras fontes para exterminar as células cancerígenas e encolher tumores.

20 [033] O termo "quimioterapia", tal como empregado no presente documento se refere ao tratamento do câncer utilizando agentes químicos ou medicamentos específicos que são destrutivos das células malignas e tecidos. No caso específico de câncer colorretal, agentes químicos que são 25 habitualrnente utilizados incluem, sem limitação, medicamentos de platina, rnedicamentos antimetabolito de pirimidina, leucovorina e cornbinações dos mesmos.

[034] O termo "imunoterapia" se refere a uma variedade cle estratégias de tratamento com base no conceito 30 de modulação do sistema imunitário para atingir urri objetivo profilático e/ou terapêutico. Em uma modalidade específica, a imunoterapia envolve a utilização de anticorpos anti-VEGF e, mais preferencialmente, o bevacizumab.

[035] O termo "medicamentos de platina" se refere a qualquer composto anticancerígeno que inclui platina. Em '« uma modalidade, o medicamento anticancerígeno pode ser selecionado a partir de cisplatina (CDDP ou cis- 5 iaminadicloroplatina(ll)), carboplatina, oxaliplatina, e combinações das mesmas. "Oxaliplatina" (Eloxatin®) é urrt medicamento de quimioterapia à base de platina da mesrna família da cisplatina e carboplatina. Equivalentes para oxaliplatina são conhecidos na técnica e incluem, mas não 10 estão limitados a cisplatina, carboplatina, aroplatina, lobaplatina, nedaplatina e JM-216.

1036] O medicamento antimetabolito priminidina ou terapia inclui, sem limitaçáo fluorouracil (5 - FU), que pertence à família dos medicamentos para terapia 15 denominados antimetabolitcs à base de pirimidina. 5-FU é um análogo da pirimidina que é transformado em diferentes metabolitos citotóxicos que são depois incorporados ao DNA e RNA, deste modo induzindo a parada do ciclo celular e apoptose. Os equivalentes químicos são análogos de 20 pirimidina que resultam na ruptura da replicação do DNA. Equivalentes químicos inibem a progressão do ciclo celular no estágio S resultando na perturbação do ciclo celular e, consequentemente, na apoptose. Os equivalentes ao 5-FU incluem pró-fármacos, análogos e derivados dos mesmos, tais 25 corno 5'-desoxi-5-fluorouridina (doxifluroidina), 1- tetrahidrofuranila-5-fluorouracil (ftorafur), capecitabina (Xeloda), S-I (MBMS-247616, que consistem em tegafur e dois moduladores, um 5-cloro-2, 4-dihidroxipiridina e oxonato de potássio), ralititrexed (Tomudex), nolatrexed (Thymitaq, 30 AG337), LY231514 e ZD9331, como descrito por exemplo em Papamicheal {1999), The Oncologist 4:478 -487. Para os fins da presente invenção, os medicamentos antimetabolito de pirimidina incluem a terapia adjuvante à base de 5-FU.

R

[037] Capecitabina é urn pró-fármaco de {5-FU), que é convertido na sua forma ativa pela enzima específica para "y tumor PynPase seguindo a via de três etapas enzimáticas e dois metabólitos intermediários, 5'-desóxi-5- 5 fluorocitidina (5'-DFCR) e 5'-desóxi-5-fluorouridina (5'- DFUR). Capecitabina é comercializada pela Roche sob a denominação comercial Xeloda®.

[038] Leucovorina (ácido folínico) é um adjuvante utilizado na terapia do câncer. A mesma é utilizacia em 10 combinação sinérgica com 5-FU para melhorar a eficácia do agente quimioterapêutico. Sem estar Limitado pela teoria, acredita-se que a adição de Leucovorina aumente a eficácia de 5-FU ao inibir a timidilato sintase. A mesma tem sido usada como um antídoto para proteger as células normais das 15 elevadas doses do medicamento anticâncer metotrexato e para aumentar os efeitos antitumorais de fluorouracila (5-FU) e teçjafur-uracila. É também conhecida corno fator de citrovorum e Wellcovorin. Esse composto tem a designação química de sal de cálcio do ácido L-glutâmico [4[[92-amino- 20 5-formil,1,4, 5,6,7,8 hexaidro4-oxo-6- pteridinil)metil]arnino]benzoil) (1:1). [039j "FOLFOX" é uma abreviatura para um tipo de terapia de combinação que é usada para tratar o câncer.

Essa terapia inclui 5-FU, oxaliplatina e leucovorina.

25 "FOLFIRI" é uma abreviatura para um tipo de terapia de combinação que é utilizado o tratamento do câncer e . compreende, ou consiste alternativa e essencialmente em ou ainda mais consiste em 5-FU, leucovorina e irinotecan.

Informações sobre estes tratamentos estão disponíveis no 30 site do Instituto Nacional do Câncer, cancer.gov, acessado pela última vez em 16 de janeiro de 2008.

[040] Equivalentes de FOLFOX/BV significa que um ou mais dos componentes da composição são substituíclos por um equivalente, por exemplo, urrt equivalente de 5-FU e/ou oxaliplatina. "d

[041] "XELOX/BV" é outra terapia de combinação utilizada no tratamento do câncer colorretal, que 5 compreende o pró-fárrnaco de 5-FU, conhecido corno capecitabina (Xeloda) em combinação com oxaliplatina e bevacizumab. O termo equivalentes de XELOX/BV é empregado quancio um ou mais dos componentes da composição são substituícios por um equivalente, por exemplo, urn 10 equivalente de bevacizumab e/ou oxaliplatina. Inforrnações relacionadas a esses tratamentos estão disponíveis no site do Instituto Nacional do Câncer, cancer.gov ou no site da National Comprehensive Cancer Network, nccn.org, acessado pela última vez ern 27 de maio de 2008.

15 [042] O terrno "câncer de cólon" ou "câncer colorretal" se refere a um tumor do cólon e inclui qualquer subtipo histológico, que normalmente aparece no câncer de cól'on, como carcinomas de células transicionais, carcinoma de células escamosas e adenocarcinoma, qualquer subtipo 20 . clínico, tal comc, câncer rnúsculo-invasivo ou metastático superficial em qualquer estáçfio.

[0431 Estadiamento do câncer de cólon é uma estirnativa da quantidade de penetração de um tipo específico de câncer. A mesma é realizada para fins de 25 diagnóstico e pesquisa, e para determinar o melh.or método de tratamento. Os sistemas de estadiamento de câncer colorretal dependem cia extensão da invasão local, grau de cornprometimento dos gânglios linfáticos e se há metástases à distância.

30 [044] O sistema de estadiamento mais comurn é o TNM (para tumores/nodos/metástases) do sistema, do American Joint Committee on Cancer (AJCC). O sistema TNM atribui um número com base em três cateçorias. "T" indica o grau de invasão da parede intestinal, "N" indica o grau de envolvimento de gânglics linfáticos, e "M" indica o grau cie '4 metástase. O estáçio mais amplo de um câncer é geralmente citado como um número I, II, III, IV, derivado cio valor TNM 5 agrupado por prognóstico, um número superior indica urrt câncer mais avançado e provavelmente um resultado pior. Os detalhes deste sistema se encontram na Tabela 1.

[045] Tabela 1: Sisterna de TNM para estadiamento do câncer colorretal Estágío AJCC Estágío TNM Crítéríos do Estágío TNM para Câncer CoLorretal Estágio 0 Tis NO MCl Tis: Tumor confinado na jmucosa; câncer in situ Estágio I Tl NO MO Tl: Tumor invade a submucosa I Estágio I |T2 NO MQ ) T2: Tumor invade muscularj I própria Estágio II-A T3 NO MO T3: Tumor invade a subserosa I ou além (sem outros órgãosj I envolvidos) jEstágio ii-b |t4 no MO jT4: Tumor invade órgãosj jadjacentes ou perfura O| I peritônio visceral Estágio III Tl 2 Nl MO Nl: Metástase para 1 a 3 |A I I gânglios linfáticos regionaisj I Tl ou T2. jEstágio iii)t3-4 Nl MO |N1: Metástase para 1 a 3) jB I I gânglios linfáticos regionaisj |T3 ou T4. Estágio III- Qualquer T, N2: Metástase para 4 çânçlios |C |N2 MO l linfáticos regionais. Qualquerj | T. I Estágio IV jQualquer t, |M1: Presença de metástase à)

qualquer N, distância. Qualquer T, Ml qualquer N. ·y

[046] No contexto da presente invenção, o paciente é urrt indivíduo que sofre de câncer do cólon. Em uma 5 modalidade específica, o câncer do cólon é qualquer subtipo histológico que normalmente aparece no câncer do cólon, tal como, carcinomas de células transicionais, carcinoma de células escamosas e adenocarcinoma, qualquer subtipo clínico, tal como, câncer músculo-invasivo ou metastático 10 superficial e qualquer estágio TMN incluindo TO-T4, NO-N2 e tumores MO-MI. Além disso, a presente invenção também pode ser aplicável a um indivíduo que sofre de qualquer estágio do câncer do cólon (estágios 0, IA, IB, IIA, IIB, IIIA, IIIB cu IV). No entanto, em uma mocialidade especifica, o 15 estádio cio câncer do cólon é II. [047j O termo "indivíduo", como empregado no presente documento se refere a todos os animais classificados como mamíferos e inclui, mas não está limitado aos animais dornésticos e de fazenda, prirnatas e 20 seres humanos, por exemplo, seres humanos, primatas não humanos, vacas, cavalos, porcos, ovinos, caprinos, cães, gatos ou roedores. De preferência, o paciente é um ser humano do sexo masculino ou feminino, de qualquer idade ou raça. 25 [048] Em outra modalidade específica, o paciente foi submetido à resseção cirúrgica do tumor. O termo "resseção cirúrgica", tal corno empregado no presente documento, inclui tanto a excisão local em que só o tumor e algum tecido são removidos ou a resseção em que de toda a 30 parte do cólon ou do reto é removida. Resseção inclui, sem limitação, a colectomia parcial, colectomia direita

(ileocolectomia), resseção abdominoperineal, proctosigrnoidectomia, colectomia abdominal total e ta" proctocolectomia total.

[049] Vários fatores de risco clínico padrão foram 5 descritos, os quais são c)s marcadores para o prognóstico da doença, corno a doença T4; tumor de obstrução ou perfuração; tumores pouco diferenciados (grau 3); recuperação de <12 gânglios linfáticos (recornendações ASCO); altos níveis de CEA pré-operatório; invasão vascular, linfática e 10 perineural e margens cirúrgicas positivas, de acordo com o College of American Pathologists consensus statement. Além disso, qs inventores descobriram que os pacientes com ausência de invasão vascular {figuras 4A e C) ou invasão perineural (figuras 4B e d), ou seja, os casos com 15 prognóstico muito melhor mostram uma diminuição signifícativa na sobrevida livre de recidiva se eles superexpressarem KIAA1456 (Figura 4), sugerindo que a superexpressão de KIAAI456 correlaciona-se com um resultado clínico pior, mesmo quando os fatores de risco padrão 20 indicam um bom prognóstico.

[050] Assirn, em uma modalidade preferida do método da invenção, o paciente não exibi um ou mais das fatores acima associados ao risco clínico. Ern urna modalidade ainda mais preferida, o paciente não apresenta obstrução 25 neoplásica intestinal, invasão vascular e/ou perineural. [0511 A expressão "obstrução neoplásica intestinal", tal como empregado no presente documento, se refere a uma obstrução mecânica ou funcional do intestino, evitando a passagem normal dos produtos da digestão. Isso 30 pode ocorrer em qualquer nivel distal para o duodeno, a partir do intestino delgado e está associado a um neoplasma benigno ou rnaligno.

10521 O neoplasrna é entendido corno uma massa anormal ou tecido como um resultado da neoplasia. A '%' neoplasia é a proliferação anormal de células. O crescirnento deste clone de células excede e é descoordenado 5 com aquele dos tecidos normais em torno dele. O mesrno geralmente causa um nódulo ou tumor. Neoplasmas podem ser benignos, pré-malignos ou malignos.

[053] Dependendo do nível de obstrução, a obstrução intestinal pode se apresentar com dor abdorninal, 10 distensão abdominal, vômitos, vômito fecal e constipação. A obstrução pode se dever a causas dentro do lúmen do intestino, no interior da parede do intestino ou externa ao intestino (tal como, compressão, encapsulamento ou volvulus). As principais ferramentas para medir a obstrução 15 neoplásica intestinal são exames de sangue, raios-X do abdômen, tomografia computadorizada e/ou ultrassom. Os sinais radiológicos de obstrução intestinal incluem distensão das alças intestinais e a presença de múltiplos (mais de seis) níveis de fluido de gás no supino e 20 radioçrafias abdorninais do reto. Enema de contraste ou séries do intestino delgado ou TC podem ser realizados para definir o grau de obstrução, mesmo que a obstrução seja parcial ou completa, e para ajudar a definir a causa da obstrução. A colonoscopia, a investigação do intestino 25 delgado com tubo e cârnera ingeridos ou endoscopia por pressão e laparoscopia são outras opções de diagnóstico.

[054] A expressão "invasão vascular", tal como é empregada no presente documento, se refere à presença de células malignas no interior dos vasos sanguíneos 30 revestidos por células endoteliais além da muscular prÓpria. É possível detectar a invasão vascular extra paredes com MRI.

[055] A expressão "perineural" tal como é empregada no presente documento, é entendida como o '¶' crescimento de um tumor ao longo do nervo (perineural). A infiltração dos espaços perineurais por um tumor maligno 5 (geralmente um carcinoma) indica que o tumor é infiltrante e invade um espaço de baixa resistência entre o sisterrta nervoso periférico e tecido conjuntivo circundante. O estado da invasão perineural pode ser determinado à primeira vista por microscopia óptica, através da análise lO da hematoxilina e cortes histológicos manchados com eosina.

[056] Em uma primeira etapa, o primeiro método da invenção envolve a determinação cio nível de expressão gênica de KIAA1456 em uma amostra do paciente.

[057j O termo "gene KIAA1456" tal como utilizado 15 na p.resente invenção, se refere ao gene KIAA1456 humano, bem como aos ortólogos do mesmo, provenientes de outras espécies, como o chimpanzé (XM 001138361.1 SEQ ID NO: 1, XM

001138208.1 SEQ ID NO: 2, XM 001138449.1 SEQ ID NO: 3) cão (XM 540002,2 SEQ ID NO: 4), rato (NM 176952.4 SEQ ID NO: 20 5), rato (NM 001107314 SEQ ID NO: 6) e semelhantes. No entanto, em urna rnodalidade preferida, o gene de KIAA1456 que é determinado de acordo com os métodos da presente invenção é o gene KIAA1456 humano.

1058] O gene KIAA1456 humano (FLJ36980 ou 25 MGC43113) está localizado no cromossoma 8, na região 8p22. O mesmo tem duas variantes de transcritos ou variantes de recomposição, que resultam da recomposição alternativa de urrt único pré-RNAm, dando origem a duas isoformas da proteina. A primeira variante de transcrição (variante do 30 transcrito 1) (NM 020844.2 SEQ ID NO: 7) codifica a isoforma 1 (NP 065895.2 SEQ ID NO: 8), escolhida como a sequência canônica, possui 454 aminoácidos, a sua função é ainda desconhecida embora em nivel estrutural, possui urrt dornínio de homologia com a atividade de metiltransferase. A segunda variante de transcrição (variante de transcrição 2) {NM 001099677.1, SEQ ID NO: 9) codifica a isoforma 2 (NP

001093147.1, SEQ ID NO: 10) que tem várias diferenças com 5 respeito à isoforma 1, devido à ausência de vários éxons em sua extremidade 5. Estas diferenças produzern uma região 5'UTR menor e causarn uma origem de tradução por trás do códon de iniciação da variante 1, dando origem a uma proteína rnenor de 328 arninoácidos, que não tem os primeiros lO 127 aminoácidos na extremidade N-terminal. A função desta isoforma sem domínios de homologia funcionais é também desconhecida. [0591 Em uma modalidade preferida, a invenção envolve a deterrninação do nível de expressão da isoforma de KIAAI456 1.

[060] O termo "amostra", tal como empregado no presente documento, se refere a qualquer amostra que possa ser obtida a partir do paciente. O presente método pode ser aplicado a qualquer tipo de amostra biológica a partir de um paciente, tal como uma amostra de biópsia, FNAB {biópsia de aspiração de aguíha fina), urri tecido, célula ou fluido (soro, saliva, sêmen, saliva, fluido cerebrospinal (CSF), lágrimas, muco, suor, leite, extratos de cérebro, lavagem brônquica, células epiteliais descamadas, obtidos a partir de fezes tal como descrito por Nechvatal e outros, (J. Microbiol. Methods, 2008, 72: 124-132.) e semelhantes. Em uma modalidade específica, a dita amostra é uma amostra de tecido de tumor ou parte da mesma. Em uma modalidade mais especifica, a dita amostra de tecido tumoral é uma amostra de tecido de tumor colorretal de um paciente que sofre de câncer colorretal. A dita amostra pode ser obtida por rnétodos convencionais, por exernplo, biópsia, utilizando rnétodos bem conhecidos dos versados na técnica comum na arte médica correlata. Os métodos para obtenção da amostra a partir da biópsia incluem determinação em bruto de uma massa, ou microdisseção ou outros métodos de separação de células conhecidos na técnica. As células turnorais podem 5 ainda ser obtidas a partir de citologia aspirativa por agulha fina. A fim de simplificar a conservação e manuseio das amostras, essas podern ser fixadas em formalina e embebidas em parafina ou primeiro congeladas e depois incorporadas em um meio criossolidificável, tal como ccmposto OCT, através de imersão em um meio altamente criogênico que permite o congelamento rápido.

[061] O método pode ser usado em pacientes que sofrem de câncer colorretal em qualquer uma dos estágios do tumor. Em uma modalidade preferida, o paciente é um paciente que sofre de um câncer do cólon tipo II.

[062] O termo "nívêl de expressão", tal como é empreçado no presente documento, se refere ao valor de um parâmetro que mede o nível de expressão de um determinado gene. O ciito valor pode ser determinado através da medição cío nível de RNAm codificado pelo gene de interesse, ou medindo a quantidade da proteína codificada pelo dito gene.

[063] O nível de expressão do gene KIAA1456 pode ser deterrninado por qualquer método conhecido do versado na técnica, incluindo a determinação do nível de RNArn de KIAA1456 ou da proteína codificada pelo gene KIAA1456.

[064j Em uma modalidade preferida, a determinação do nível de expressão do gene KIAA1456 pode ser realizada através da medição do nível de RNAm codificado pela expressão gênica de KIAA1456. Para este efeito, a amostra biolóçica pode ser tratada física, química ou mecanicamente ou romper a estrutura celular do tecido, para liberar componentes intracelulares em uma solução aquosa ou orgânica para preparar os ácidos nucléicos, para posterior análise. Os ácidos nucléicos são extraídos da amostra por meio de processos conhecidos do versado na técnica e comercialmente disponíveis. O RNA é então extraído a partir de amostras frescas ou congeladas por qualquer um dos 5 métodos comuns na técnica, por exemplo, Sambrook, Fischer e Maniatis, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, {2" ed.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nova Iorque, {1989).

De preferência, deve-se tomar cuidado para evitar a degradação do RNA durante o processo de extração.

lO [065j Em uma modalidade específica, o nível de expressão de mRNA é determinado utilizando RNAm obtido a partir de uma amostra de tecido fixada em formalina, embebida em parafina. O mRNA pode ser isolado a partir de uma amostra de biópsia ou patológica de arquivo que é a primeira amostra pré-parafinizada. Urn método de desparafinização exemplar envolve lavagem da amostra prafinizada com um solvente orgânico, tal como xileno, por exemplo. As amostras desparafinizadas podem ser reidratadas com uma solução aquosa de um álcool inferior. Alcoóis inferiores adequados incluem, por exemplo, metanol, etanol, propanÓis e butanóis. As amostras desparafinizadas podem ser reidratadas com lavaqens sucessivas com soiuções alcoólicas inZeríores de concentração diminuída, por exemplo. Alternativamente, a amostra é simultaneamente desparafinizada e reidratada. A arnostra é, em seguida, lisada e o RNA é extraído a partir da amostra.

[0661 A determinação dos níveis de RNAm de KIAA1456 pode ser efetuada por qualquer método conhecido na arte, tal como RT-PCR, seguido de qPCR, Northern blot, dot blot, TaqMan, os métodos com base em marcadores, tais como a análise erri série da expressão gênica (SAGE) incluindo variantes, tais como, LongSAGE e SuperSAGE. A determinação dos níveis de RNAm de KIAA1456 pode também ser efetuada por hibridação in situ em fluorescência, incluindo variantes, tais como, FIow-FISH, qFiSH e FISH de fusão dupla (D-FISE) tal corrio descrito em WO2010030818, Femino e outros, Science, 1998, 280:585-590), Levsky e outros {Science, 5 2002, 297:836-840) ou Raj e outros (PLOS Biology, 2006, 4: e309).

[067] Em uma modalidade preferida, o nível de expressão de mRNA do gene é muitas vezes determinado pela reação em cadeia da polinierase de transcrição reversa (RT- lO PCR). A detecção pode ser efetuada em amostras individuais ou em microarranjos de tecido. Em urna modalidade ainda mais preferida, ·0 nivel de expressão do gene KIAA1456 é determinado pela medição do nível de RNAm da variante de um transcrito do gene KIAA1456 humano.

[068] A fim de normalizar os valores da expressão de RNArn entre as diferentes amostras, é possível comparar o nível de expressão cio RNAm de interesse nas amostras de teste com a expressão de um RNA de controle. O "RNA de controle", tal como empregacio no presente documento, se refere a um rna cuja expressão de nível não muda ou se altera apenas em quantidades limitadas em células tumorais ern relação a células não tumorigênicas. De preferência, os RNA de controle são derivados de mRNA dos genes de manutenção e que codificam as proteínas que são expressas constitutivamente e realizam funções.celulares essenciais.

[069] Genes de manutenção preferidos para utilização na presente invenção incluem j3-2-microglobulina, GAPDH, PSMB4 (subunidade de proteassoina, tipo beta, 4), ubiquitina, receptor de transferrina, 18-S RNA ribossômico, ciclofilina, tubulina, j3 actina e tirosina, proteína de ativação da 3-monooxigenase/triptofano S-mono-oxiçenase {YWHAZ). Em uma modalidade preferida, o RNA de controle é RNAm j3-2-microglobulina. Em uma modalidade relativa, a quantificação da expressão gênica é calculada de acordo com o método de Ct comparativo utilizando Y2-rnicroglobulina, 18S RNA ribossômico, GAPDH e PSMB4 como controles de gene endógeno e controles de RNA (tecido normal a partir de 5 doadores saudáveis e/ou de tecido normal adjacente a partir do tumor do mesmo paciente) como calibradores. Os resultados finais são determinados de acordo com a fórrnula 2-(amostra LjCT-calibrador LjCt), onde os valores de LJCT dos calibradores e amostras são determinados subtraindo o valor CT do gene alvo a partir do valor da média çeométrica dos três genes de manutenção utilizados.

j070] Em outra modalidade, o nível de expressão do gene KIAA1456 é determinado através da rriedição da expressão da proteína de KIAA1456. A determinação do nível cie expressão da proteína de KIAA1456 pode ser reaiizada por técnicas imunolóçjicas, tais como, por exemplo, ELISA, Western blot ou imunofluorescência. Western blot baseia-se na detecção de proteínas previamente decompostas por eletroforese em gel sob condições desnaturantes e irnobilizadas sobre uma membrana, çeralmente, através da incubação de nitrocelulose cojn um anticorpo específico e de um sistema de desenvolvimento (por exemplo, quimioluminescente). A análise por irnunofluorescência requer o uso de urn anticorpo específico para a proteina alvc para a' análise da expressão e localização subcelular por microscopia. Geralmente, as células estudadas são previamente fixadas com aldeido parafÓrmico e permeabilizadas com um detergente não iônico. ELISA baseia- se na utilização de antígenos ou anticorpos marcados com enzimas, de tal modo que os conjuçjados formados entre o antígeno alvo e anticorpos rnarcados resultem na formação de complexos enzimaticamente ativos. Uma vez que um dos componentes (o antíçeno ou o anticorpo marcado) são imobilizados sobre um suporte, os complexos anticorpo- antígeno são imobilizados sobre c suporte e, portanto, podem ser detectados pela adição de um substrato que é convertido pela enzima para uma produto que é detectável 5 por exemplo, por espectrofotometria ou fluorimetria. Esta técnica não permite que a localização exata da proteínaL alvo ou a determinação do seu peso molecular, mas permite urna detecção muito sensível e altamente específica da proteína alvo em uma variedade de amostras biológicas IO (soro, plasma, homogeneizados de tecidos, sobrenadantes pós-nucleares, ascite e semelhantes). Em uma modalidade preferida, a proteína de KIAA1456 é detectada por análise irnuno-histoquimica (IHC), utilizando seções finas da amostra biológica imobilizadas ern lâminas revestidas. As seções são então desparafinizadas, se forem provenientes de uma amostra de tecido parafinizado e tratadas de modo a recuperar o antígeno. A detecção pode ser efetuada em amostras individuais ou em microarranjos de tecido.

[071] Qualquer anticorpo ou reagente conhecicio por se ligar com elevada afinidade à proteína alvo pocie ser usado para detectar a quantidade de proteína alvo. É preferível, no entanto, a utilização de anticorpos, por exemplo, soros policlonais, sobrenadantes de hibridoma ou anticorpos monoclonais, fragrnentos de anticorpos, Fv, Fab, Fab' y F(ab')2, SCFV, diacorpos, triacorpos, tetracorpos e anticorpc's humanizados.

{072] Ainda em uma outra modalidade, a determinação do nível de expressão de proteína de KIAA1456 pode ser realizada através da construção de um microarranjo tecidual (TMA), que contém as amostras reunidas de pacientes, e a determinação do nivel de expressão da proteína de KIAAI456 por técnicas de imuno-histoquímica. A intensidade de imunocoloração pode ser avaliada por dois

'4p ;< patologistas diferentes e classificacia utilizando critérios uniformes e limpos de ponto de corte, a fim de manter a reprodutibilidade do método. Discrepâncias podem ser resolvidas por reavaliação simultânea. Resumidamente, c 5 resultado da coloração irnunológica pode ser registrado como expressão negativa (0) versus expressão positiva e baixa expressão {1 +) versus expressão moderada (2 +) e alta {3 +), levando erri conta a expressão em células tumorais e c) corte especifico para cada marcador. Como critério geral, 10 foram selecionados os pontos de corte, a fim de facilitar a reprodutibilidade, e, quando possivel, para traduzir os eÒentos biológicos.

[073] A determinação do nível de expressão da proteína de KIAA1456 deve ser correlacionada com os valores 15 de referência que podem corresponder ao valor mediano ou valor ponderado do nível de expressão da proteína de KIAA1456 medido em uma coleta de amostras de indivíduos norrnais (ou seja, as pessoas sem diaçnÓstico de câncer do cólon), ou a partir de tecido normal do mesmo paciente 20 (isto é, sem o tecido de células tumorais). Uma vez que este valor médio for estabelecido, o nível do dito rriarcador e:'presso nos tecidos tumorais de pacientes pode ser comparado com esse valor médio, e, assim, ser atribuído urn nível "baixo" ou "diminuído", "norrnal" ou "o mesmo" ou 25 "alto" ou "aumentado".

[074] Em uma modalidade específica, um aumento na expressão da proteína acima cio valor de referência de pelo menos 1,1 vezes, 1,5 vezes, 5 vezes, 10 vezes, 20 vezes, 30 vezes, 40 vezes, 50 vezes, 60 vezes, 70 vezes, 80 - vezes, 30 90 vezes, 100 vezes ou ainda mais em comparação com o valor de referência é considerado como "aurnento" de expressão. Em uma modalidade especifica, uma diminuição na expressão da proteína abaixo do valor de referência, em vezes, de pelo menos 0,9, 0,75, 0,2, 0,1, 0,05, 0,025, 0,02, 0,01, 0,005 ou até rnesmo menos, em comparação corn o valor de referência é considerado como "diminuição" da expressão no contexto.

O termo "o mesmo nível de expressão", tal como é empregado no 5 presente documento, se refere aos níveis de expressão que são substancialmente inalterados ern relação ao valor de referência.

Por exemplo, a expressáo, na amostra em estudo é considerada ccmo sendo a mesma que na amostra de referência em que (js níveis não diiierem em mais de 0,1%, no rriáximo 0,2%, no máximo, 0,3%, não mais de 0,4%, não mais de 0,5%, não mais de 0,6%, não mais de 0,7%, não mais de 0,8%, não mais de 0,9%, não mais de 1°5, não mais de 2%, não mais de 3%, não mais de 4%, não mais de 5%, não mais de 6%, não mais de 7%, não mais de 8%, não mais de 9°5, não mais de 10% ou rnais que o valor da porcentagem que é o mesmo que o erro relacionado com o método experimental utilizado na determinação. [075j Devido à variabilidade inter-indivíduos (por exemplo, aspectos relacionados com a idade, raça, etc.), é muito difícil (se não praticamente impossível) estabelecer valores de referência absolutos para KIAA1456. Assim, em uma modalidade específica, os valores de referência para "aurnentada", "reduzida" ou o "a mesma" expressão de KIAA1456 são determinacios pelo cálculo percentis por meios convencionais que envolvem o teste de um grupo de amostras isoladas a partir de indivíduos normais (ou seja, as pessoas serri o diagnóstico de câncer do cÓlon), para o nível de expressão do gene KIAA1456. O nivel "aumentado" pode, então, ser aplicado, de preferência, nas amostras em que o nível de expressão para o gene KIAA1456 é igual ou superior ao percentual de 50 da população normal, incluindo, por exerrtplo, o nível de expressão igual ou superior a 60% na população normal, igual ou superior a 70% da população normal, igual ou superior a 80% da população normal, igual ou superior a 90% da população normal, e igual ou superior a 95% na população normal. [076j Em uma modalidade preferida, o nível de 5 expressão do gene KIAA1456 é determinado pela medição do nível de proteína da isoforma I de KIAA1456 ou medindo o nível de RNAm da variante de um transcrito do gene KIAA1456 usando qualquer um dos rriétodos acima mencionados. Em uma modalidade mais preferida, o nível de expressão do gene KIAA1456 é deterrninado pela medição do nível de proteína da Isoforma I de KIAA1456 hurnano ou medindo o nível de RNAm da variante 1 de um transcrito do gene KIAA1456 humano.

[077] Uma vez que o nível de expressão do gene KIAA1456 é determinado, o primeiro método da invenção envolve a comparação do ciito nível de expressão com uma amostra de referência. [078j A determinação do nível de expressão do RNAm codificado pelo çjene KIAA1456 deve ser correlacionada com os valores de referência, que correspondem ao valor médio do nívei de expressão do RNAm codificado pelo gene KIAA1456 medido em uma coleta de amostra de pacientes normais {ou seja, as pessoas sem c) diagnóstico do câncer do cÓlon), ou a partir de tecido norrnall do ínesrno paciente (isto é, tecido sem as células tumorais). Ern qualquer caso, pode conter um número diferente de amostras.

[079] Uma vez que a comparação foi realizada, o primeiro método da invenção permite tomar uma decisão sobre a conveniência da administração de uma terapia a um paciente com base se o nível de expressão foi modificado em relação ao dito nível de referência.

[080] O termo "nível de expressão alterado", tal como empregado no presente documento se refere a urrí nível aumentado ou um nível diminuído na atividade de uma sequência de ácido nucléico e/ou na quantidade de proteína resultante da expressão da sequência de ácido nucléico ou por meio de urn exemplo, com em comparação com um nível de referência. Dependendo se o nível de expressão alterado for 5 aumentado, diminuído ou o mesmo com respeito ao nível de referência, o nível de expressão do gene KIAA1456 pode ser designado como sendo "baixo" ou "diminuído", "normal ou "alto" ou "aumentado" no que diz respeito a uma amostra de referência. Em uína modalidade específica, um aumento no nível de expressão de RNAin acima do valor de referência de pelo menos 1,1 vezes, 1,5 vezes, 5 vezes, 10 vezes, 20 vezes, 30 vezes, 40 vezes, 50 vezes, 60 vezes, 70 vezes, 80 vezes, 90 vezes, 100 vezes ou ainda mais em comparação com o valor de referência é considerado como expressão "aumentada". Em urria modalidade específica, uma diminuição no nível de expressão de RNAm abaixo do valor de referência, em vezes, de pelo menos 0,9, 0,75, 0,2, 0,1, de 0,05, 0,025 vezes, 0,02, 0,01, 0,005, ou rriesrno menos, em comparação com o valor de referência é considerada como expressão "diminuída".

[081] Em uma modalidade preferida, o nível de expressão aumentado é indicativo de que uma terapêutica é adequada ao dito paciente. Em outra modalidade preferida, a diminuição do nível de expressão é indicativa de que uma terapia nâo é adequada ao ditc paciente.

í082j Métocio para previsão do resultado clínico de um paciente

[083] Em um segundo aspecto, a invenção se refere a um rrtétodo para previsão do resultado clínico em um paciente que sofre de câncer colorretal (doravante segundo método da invenção), que compreende a determinação do nível de expressão do gene KIAA1456 em uma amostra do dito paciente, em que o nível de expressão aumentado do gene

KIAA1456 na dita arnostra, quando comparado com o nível de referência é indicativo de um resultado clínico fraco ou onde o mesmo ou um nível de expressão diminuído do gene KIAA1456 na dita amostra quando comparado com o nível de 5 referência de um resultado clínico born.

[084j A expressào "previsão do resultado clínico", tal como empregada no presente documento, pode ser obtida por meio de quaisquer medições de terminais utilizadas em oncologia e conhecidas do versado na técnica. Parârnetros de 10 ponto final úteis para descrever a evolução de uma doença incluem: 1085] - a sobrevida livre de doença que, como empregada no presente docurnento, se refere ao intervalo de tempo desde a data da última dose de quimioterapia até a 15 data da recidiva, morte ou último acompanhamento de sobrevida global que, conforme empregado no presente documento, [0861 - sobrevida global que, conforme ernpregada no presente documento, se refere ao tempo de entrada no estudo até a morte ou censura na análise de sobrevida,

[087] - livre de progressão da doença, que, tal como é empregado no presente documento, descreve a porcentagern de pacientes em remissão completa que não [ tiveram recorrência da doença durante q período de tempo estudado,

[088] - resposta objetiva que, tal como utilizada na presente invenção, descreve a proporção das pessoas tratadas nas quais uma resposta completa ou parcial é observada, 1089] - controle do tumor que, tal como utilizado na presente invenção, se refere a proporção das pessoas tratadas nas quais a resposta completa, uma resposta parcial, resposta menor ou doença estável igual ou superior a 6 meses é observada.

[090] - Sobrevida livre de progressão que, tal como empregada no presente documento, é definida corno o 5 tempo desde o início do tratamento até a primeira mecíição do crescimento cio câncer.

[091] - sobrevida livre de progressão de seis meses ou taxa de PFS6" que, tal como empregada no presente documento, se refere a porcentagem de pessoas livres de progressão nos primeiros seis meses após o início da teràpia e [092) - sobrevida mediana que, como empregada no presente documento, se refere ao tempo no qual 50% dos pacientes incluídos no estudo aincia estão vivos.

1093] Em uma modalidade, a previsão do resultado clínico é medida como a sobrevida livre de doença e/ou sobrevida global.

[094] Como será entendido pelos versados na técnica, a previsão do resultado clínico geralmente não pode ser correta para 100% dos indivíduos a serem diagnosticadas. O termo, no entanto, requer que uma porção significativa de indivíduos possa ser diagnosticada adequadarnente. Se uma porção for estatisticamente significativa poderá ser determinada pelo versado na técnica utilizando diversas ferramentas de avaliação estatística conhecidas, por exemplo, a determinação dos intervalos de confiança, deterrninação do valor p, teste t de Student, teste de Mann-Whitney, etc. Detalhes são encontrados em Statistics for Research, John Wiley & Sons, New York 1983. Intervalos de confiança preferidos são pelo rnencjs de 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%. Os valores de p são, de preferência, 0,2, 0,1, e 0,05.

[0951 Em urn primeira etapa, o primeiro método da invenção compreende a deterrninação do nível de expressão do gene KIAA1456 em uma amostra a partir do paciente.

[096] Os termos "nível de expressào", "paciente", 5 "amostra" "gene KIAA1456", "câncer colorretal", têm sido ciescritos em detalhes acima e são utilizados corrt o mesmo significado no contexto cio segundo método da invenção.

[097j Em uma modalidade preferida, o nível de expressão do gene KIAA1456 é determinado medindo-se o nível de RNAm codificado pelo gene KIAA1456 ou o nível de proteína de KIAA1456. Ainda em outra modalidade, o nível de expressão de KIAA1456 é determinado pela medição do nível ' de RNAm da variante 1 do transcrito do gene KIAA1456 humano. A determinação pode ser realizada utilizando qualquer um dos rnétodos acima mencionados.

[098] Em cutra modalidade, a amostra em que a determinação do nível de expressão do gene KIAA1456 é uma biópsia do tumor.

[099] Em outra modalidade, o paciente é urrí paciente humano. Em outra concretização, o paciente foi submetido Èl resseção cirúrgica do tumor. Ainda em outra modalidade, o paciente sofre de câncer colorretal de estágio II. Os terrríos "resseção cirúrgica" e "estágio II" foram definidos acima.

[100] Ainda em outra modalidade do método de acordo com a invenção é realizado em pacientes que não apresentam fatores de risco clínico adicionais. Em uma modalidade preferida, o paciente não apresenta obstrução intestinal neoplásica, invasão vascular e/ou perineural.

[101] Os autores da presente invenção observararrt que o valor do nível de expressão do gene KIAA1456 como marcador preditivo para o resultado clínico de pacientes que sofrem de câncer colorretal aumenta em pacientes que não receberam quimioterapia adjuvante ou radioterapia após a cirurgia. Como mostrado no exemplo 4 da presente invenção, o prognóstico dos pacientes que não são tratados com quimioterapia adjuvante é radicalmente pior nos 5 pacientes com superexpressão do gene (p = 0,010 para a sobrevida global e p = 0,012 para a sobrevida sem recidivas) (figuras 5A e 5C e 6A e 6C). Essas diferenças não são observadas em pacientes tratados corn quimioterapia em que o prognóstico é muito melhor para ambos os casos (figuras 5B e 5D e 6B e 6D). Assim, ainda em outra modalidade, o paciente não foi tratado corri terapia neoadjuvante ou adjuvante.

[102] O termo "terapia adjuvante", tal como é ernpregado no presente documento, se refere a um tratamento adicional, normalmente administrado apÓs a cirurgia, onde toda a doença detectável tenha sido removida, mas em que continua a existir um risco de recidiva estatistica devido à doença oculta. O termo "terapia neoadjuvante", tal como é empregado no presente documento, se refere ao tratamento farmacológico sistêmico ou radioterapia administrada a pessoas com câncer antes da cirurgia, cujo objetivo é reduzir o tamanho ou extensão do câncer antes de receber a cirurgia, tornando assim os procedirnentos rnais sirnpíes e mais prováveis de serem bem sucedidos, e diminuindo as consequências de urna cirurgia mais extensa que deveria ser feita se o tumor não fosse reduzido em tamanho ou extensão.

[103] Em uma seçunda etapa, o segundo método de acordo com a invenção envolve a comparação do nível de expressão cio gene KIAA1456 na amostra com o nível de referência. Os termos "nível de expressão" e "nível de referência" têm sido descritos em detalhes acima e são empreçados, no contexto do segundo rnétodo da invenção, no mesmo contexto.

[104] Por último, o segundo método da invenção compreende ainda deterrninação se o paciente terá um resultado clínico fraco ou botn resultado clínico com base nc nível de expressão relativo do gene KIAA1456, em que um 5 aurnento do nível de expressão do çene KIAA1456 na dita amostra, quando cornparado com o nível de referência nível é indicativo de resultacio clínico fraco ou em que a mesma ou nível de expressão diminuído do gene KIAA1456 na dita amostra, quando comparado com o nível de referência é 10 indicativo de um borrt resultado clínico.

[105] Os termos " nível de expressão diminuído", "nível de expressão aumentado", "mesmo nível de expressão" e "nivel de referência" têm sido descritos em detalhes acima e são usacíos, no contexto do segundo método da 15 invenção, no mesmo contexto. [106j O termo "resultado clínico fraco" se refere a um agravamento ou aumento da frequência cios sintomas clínicos associados com a doença, tal como determinado utilizando os rnétodos de diagnóstico conhecidos ou 20 utilizando quaisquer rnedições de terminais utilizados em oncologia e conhecidos do versado na técnica, tal como definicio acima.

[107] O termo "resultado clínico positivo" se refere a qualquer melhoria, ou uma diminuição da frequência 25 dos sintomas clínicos associados com a doença, tal como determinadc utilizando os métodos de diagnóstico conhecidos ou utilizando quaisquer medições de terminais utilizadas em t7 oncologia e conhecicias do versado na técnica, tal como definido acima. 30 [108] Kits e usos dos mesmos

[109] Em outro aspecto, a invenção se refere a um kit útil para a aplicação da metodologia descrita no presente documento.

[11oj No contexto da presente invenção "kit" é entendido como um produto que contenha os diversos reagentes necessários para a realização cios rnétodos da invenção embalados cie modo a permitir o seu transporte e 5 armazenamento. Os materiais adequados para a embalagem dos componentes do kit incluern cristais de plástico (polietileno, polipropilenc, policarbonato e outros semelhantes), garrafas, frascos, papel, envelopes e semelhantes. Além disso, os kits da invenção podem conter instruções para a utilização simultânea, sequencial ou separada dos diferentes componentes que estão no kit. Ditas instruções podem estar na forma de material impresso ou na forma de um suporte eletrônico capaz de armazenar essas instruções que podem ser lidas por um individuo, tais como meios de armazenarnento eletrônicos {discos magnéticos, fitas e semelhantes), meios ópticos {CD-ROM, DVD) e semelhantes. Adicional ou alternativamente, a mídia pode conter endereços de Internet que fornecem essas instruções.

fll1] Assirn, o kit da presente invenção cornpreende um conjunto de açentes capazes de detectar especificarnente o nível de expressão de KIAA1456 e, opcionalmente, um reagente para a detecção de um gene de manutenção ou a proteína codificada pelo dito qene de rnanutenção. Em urna modalidade específica, a isoforma de KIAA1456 detectada é a , isoforma I.

[112! "Reagente que permite a determinação do nível de expressão de um çjene" significa um composto ou conjunto de compostos que permitern a determinação do nível de expressão de um gene, tanto por meio da determinação do nível de RNAm tanto por meio da determinação do nível de proteína. Assirn, os reagentes do primeiro tipo incluem sondas capazes de hibridar especificamente com os RNAm cociificados pelos ditos genes. Os reagentes do segundo tipo incluem compostos que se ligam especificamente com as proteínas codificadas pelos genes marcadores e de preferência incluem anticorpos, embora possam ser aptâmeros específicos. Em uma modalidade preferida, o reagente que 5 permite a determinação do nível da forma de expressão do gene KIAA1456, pelo mencs, inclui pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo rrtenos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo rnenos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% da quantidade total de reagentes que formam o kit. j113] Em uma modalidade específica do kit da presente invenção, os reagentes do kit são um ácido nucléico que é capaz de detectar especificamente o nível de mRNA de KIAA1456 e/ou nem o nível da proteína de KIAA1456. Os ácidos nucléicos capazes de hibridar especificamente com o gene KIAA1456 podem ser um ou mais pares de oligonucleotídeos iniciadores específicos para a amplificação de fragmentos de RNAm {ou seus DNAC correspondentes) do dito çene.

[114] Em urna modalidade preferida, o primeiro componente do kit da presente invenção compreende uma sonda que pode hibridar especificarnente com o gene KTAA1456.

[115] As sondas estão incluídas no kit que é capaz de hibridar os ácidos nucléicos e podem ser ácidos nucléicos ou seus análogos que mantêm a capacidade de hibridação tal como, por exemplo, os ácidos nucléicos em que a ligação fosfodiéster foi substituida com um fosforotioato, metilimina, metilfosfonato, fosforamidato, ligação de guanidina e semelhantes, ácidos nucléicos, em que a ribose dos nucleotídeos é substituída por outra hexose, ácidos nucléicos peptídicos (PNA). O comprimento das sondas pode ser de 7, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45,

50, 55, 60, 65, 70, 75, 100 nucleotideos que variam no intervalo entre 10 e 1.000 nucleotideos, de preferência na Ílaixa de 15 a 150 nucleotídeos, mais preferivelrrtente na faixa de 15 a 100 nucleotideos e pode ser de cadeia sirnples 5 ou de ácidos nucléicos cie cadeia dupla.

[116] A seleção das sondas específicas para os diferentes genes alvo é realizada de tal mcdo que elas se iigam especificamente ao ácido nucléico alvo com um mínimo de hibridação aos genes não relacionados. No entanto, lçl existem sondas de 20 nucleotídeos que não são únicas para um deterrninado RNAm. Assim, as sondas direciona'das aos as ditas sequências mostrarão uma hibridação cruzada com sequências idênticas que aparecem no RNAm de genes não relacionados. Aíérri disso, existern sondas que não hibridam especificamente com os genes alvo nas condições utilizadas (por causa de estruturas secundárias ou de interações corn o substrato do arranjo). Esse tipo de sonda não deve ser incluído no arranjo. Portanto, o versado na técnica observará que as sondas que vão ser incorporadas errí uma determinada arranjo devem ser otimizadas antes da sua incorporação no arranjo. A otimizaçãc das sondas é geralmente realizada através da geração de um arranjo que contém uma pluralidade de sondas direcionadas às diferentes regiões de urn determinado polinucleotídeo alvo. Este arranjo é colocado em contato em primeiro lugar com uma amostra contendo o ácido nucléico alvo em uma forma isolada e, ern segundo luçar, com uma mistura complexa de ácidos nucléicos. As sondas que mostram uma hibridização altamente específica com o ácido nucléico alvo, porém pouca ou nenhuma hibridação com o cornplexo da amostra são, assim, selecionadas pela sua incorporação aos arranjos da invenção. Alérri disso, é possivel incluir no arranjo, os controles de hibridação de arranjo para cada uma das sondas que será estudada. Em uma modalidade preferida, c)s controles de hibridação contêm uma posição alterada na região central da soncia. No caso em que o nível elevado de hibridação é observado entre a sonda estudada e o seu 5 controle de hibridação, a sonda não é incluída no arranjo.

[117] A "estringência" das reações de hibridação é facilmente determinacia por um versado na técnica comum e geralmente é um cálculc empírico que depende do comprimento da sonda, temperatura de lavagem e concentração de sal. Em geral, sondas mais longas requerern temperaturas mais altas para hibridação correta, enquanto que sondas mais curtas necessitarn de ternperaturas mais baixas. A hibridação geralmente depende da capacidade do DNA desnaturado para recombinação quando estão presentes cadeias complementares em um ambiente abaixo da sua temperatura de fusão. Quanto maior o grau de homoloçia desejado entre a sonda e a sequência hibridizável, temperatura relativa mais elevada pode ser utilizada. Como resultado, segue-se que temperaturas relativas mais elevadas tenderiam a tornar as condições de reação mais rigorosas, enquanto que temperaturas mais baixas tornariam as rnesrrías menos rigorosas. Para obter detalhes adicionais e explicação do rigor das reações de hibridização, vide Ausubel e outros, Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, (1995). [1181 Os termos "condições estringentes" ou "condições de estringência elevada", como definidos no presente docurnento, tipicamente: {1) empregam baixa resistência iônica e temperatura elevada para lavagem, por exemplo, 0,015 m de cloreto de sódio/O,0015 M de citrato de sódio/0,l% de dodecil sulfato de sódio e sódio a 50°C; (2) empregam durante a hibridação um agente desnaturante, tal como formamida, por exemplo, forrnamida a 50% {v/v) com albumina de soro bovino/0,l% Ficoll/0,l% polivinilpirrolidona/50 rrtM de tampão de fosfato de sódio em pH 6,5 com 750 mM de cloreto de sódio, 75 mM de citrato de sódio a 42°C; ou (3) empregarn 50% de Eormamicia, 5 vezes.

5 SSC (0,75 M NaCl 0,75 M, citrato de sódio), fosfato de sódio 50 mM (pH 6,8), 0,1% de pirofosfato de sódio,

5.times. Solução de Denhardt, DNA de esperma de salmão sonicado {50. rnu.g/ínL), 0,1% SDS, e sulfato de dextrano a 10% a 42°C, ccm lavagens a 42°C, em 0,2 vezes.SSC (cloreto de sódio/citrato de sódio) e formamida a 50%, segundo por uma lavagem erri estringência alta consistindo em 0.1. vezes. SSC contendo EDTA a 5,5°C.

[119] As "condições moderadamente estringentes" podem ser identificadas como descrito por Sambrook e outros, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press, 1989, e incluem a utilização de solução de lavagem e condições de hibridação (por exemplo, temperatura, resistência iônica e %" de SDS) menos estringentes que as descritas acima. Um exemplo de condições moderadamente estringentes é a incubação durante a noite a 37°C em uma solução compreendendo: formamida a 20%, 5. vezes. SSC (NaCl 150 rnM, citrato trissÓdico 15 mM), fosfato de sódio 50 rnM (pH 7,6), 5. vezes. Solução de Denhardt, sulfato de dextrano a 10%, e 20 mçj/rnL d DNA de esperma de salmão desnaturado, seguido de lavagem dos filtros em 1. vezes. SSC a cerca de 37-50°C. O versado na técnica reconhecerá como ajustar a temperatura, resistência iônica, etc., conforme necessário para acornodar fatores, tais como, comprimento da sonda e semelhantes.

[120] Em outra modificação preferida, as sondas ou os anticorpos que constituem o kit da invenção estão acoplados a um arranjo.

[121] Os microarranjos compreendem uma pluralidacle de ácidos nucléicos que estão distribuídos espacialmente e associados de forma estável a um suporte {por exemplo, um biochip). Os ácicios nucléicos que possuem urna 5 ccmplementariedade de sequência em determinadas subsequências dos genes cuja expressão deve ser detectada, portanto, são capazes de hibridar com os ditos ácidos nucléicos. Nos rnétodcs da invenção, urrí microarranjo que compreende um arranjo de ácidos nucléicos é colocado em contato com uma preparação de ácidos nucléicos isolados a partir do paciente objeto do estudo. A incubação do rnicroarranjo com a preparação de ácidos nucléicos é realizada em condições adequadas para a hibridação.

Subsequentemente, após a eliminação dos ácidos nucléicos que não foram retidos nc suporte, o padrão de hibridação é detectado, o qual fornece informações sobre o perfil genético da amostra analisada. Embora os microarranjos sejarn capazes de fornecer inforrnação qualitativa e quantitativa dos ácidos nucléicos presentes em uma amostra, a invenção requer a utilização de arranjos e metodologias capazes de proporcionar informação quantitativa.

[122] A invenção contempla uma variedade de arranjos no que diz respeito ao tipo de sondas e com relação ao tipo de suporte utilizado.

[123j Em urria modalidade preferida, a arranjo contérri uma pluralidade de sondas complementares às subsequências do ácido nucléico alvo de um comprimento constante ou variável em um intervalo de 5 a 50 nucleotídeos. O arranjo pode conter tocias as sondas específicas de um determinado RNAm de um certo comprimento, ou pode incluir sondas selecionadas a partir de diferentes regiões de um RNAm. Cada sonda é ensaiada em paralelo com uma sonda com uma base alterada, preferencialmente em uma posição central da sonda. O arranjo é colocado em contato com uma amostra contendo ácidos nucléicos com sequências complementares às sondas da arranjo e o sinal de hibridização com cada uma das sondas e com os controles 5 correspondentes de hibridação é determinado. Aquelas sondas errí que urrta diferença maior é observada entre o sinal de hibridação com a sonda e o seu controle de hibridação são selecionadas. O prccesso de optimização pode incluir uina segunda rodada de optimização em que o arranjo de hibridação é hibridado com uma amostra que não contém as sequências complerríentares para as sondas cio arranjo. Após a segunda rodada de seleção, aquelas soncias com sinais de hibridização inferiores a um limite serão selecionadas.

Assim, as sondas que passam ambos os controles, isto é, que mostram um nível mínimo de hibridação inespecífica e um nivel máxirrto de hibridação específica com o ácido nucléico alvo são selecionadas.

[124: Os microarranjos da invenção contêm não apenas sondas específicas para cs polinucleotídeos que indicam uma determinada situação fisiopatológica, mas também contém uma série de sondas de controle, que podem ser de três tipos: controles de normalização, os controles do nível de expressão e os controles de hibridação.

Controles de norrnalização são oligonucleotídeos que são perfeitamente complementares às sequências de referência marcadas, que são adicionadas à preparação de ácidos nucléicos a serem analisadas. Os sinais prcvenientes do controle após normalizaçâo da hibridação proporcionam uma indicação das variações das condições de hibridação, a intensidade do rnarcador, a eficiência de detecção e outra série de fatores que pode conduzir a uma variação do sinal de hibridação entre diferentes rrticroarranjos. Os sinais detectados a partir do restante das sondas de arranjo são,

de preferência, divididos pelo sinal emitido pela sonda de controle, assim normalizando as rnedições. Virtualmente qualquer sonda pode ser usada como controle de normalizaçãc. No entanto, sabe-se que a eficiência da 5 hibridação varia de acordo com a composição de nucíeotídeos e o comprirnento da sonda. Portanto, as sondas de normalização preferidas são aquelas que representarn q comprimento médio das sondas presentes no arranjo, embora possam ser selecionadas de forma a incluir uma gama de comprimentos que refletem o restante de sondas presentes no arranjo. As sondas de normalização podem ser concebidas de tal modo que refíetern a cornposição média de nucleotídeos do restante das sondas presentes no arranjo. Um número limitado de sondas de normalização é selecionado preferencialmente, de tal forma que elas hibridizam adequadamente, isto é, elas não têm uma estrutura secundária e não mostram semelhança de sequência com qualquer uma das sondas de arranjo sendo usada. As sondas de normalização podem ser localizadas em qualquer posição no arranjo, ou em várias posições no arranjo para controlar eficientemente variações na eficiência de hibridação relacionadas com a estrutura do arranjo. Os controles de norrnalização estão de preferência localizados em cantos do arranjo e/ou no seu centro.

[125] Os controles de expressão são as sondas que hibridizam específicamente com os genes que são expressos de forma constitutiva na amostra que é analisada. Os controles de nível de expressão são concebidos para controlar o estado fisiolóçico e a atividade metabólica da célula. A análise cla covariância do controle do nível de expressão corn o nível de expressão do ácido nucléico alvo indica se as variações no nível de expressão são devidas a alterações no nível de expressãc ou devidas a alterações na taxa de transcrição global na célula ou na sua atividade rnetabólica geral. Assim, no caso de células que têm deficiências em um determinado metabolito essencial para a viabilidade celular, a observação de uma diminuição tanto 5 no nível do gene alvo quanto do nível da expressão de controle de expressãc é esperada. Por outro lado, se um aurnento na expressão do gene alvo e cío gene de controle for observado, provavelmente será devido a um aumento da atividade metabólica da célula e não a um aumento lO diferencial na expressão do gene alvo. Qualquer soncia que corresponda a um çene expresso constitutivamente, tais corrio genes que codificam proteínas que exercem funções celulares essenciais, tais como, j3-2-microglobulina, ubiquitina, proteína ribosômica 18S, ciclofilina A, proteína de ativação tirosina 3-monooxigenase/triptofano S- monooxigenase (YWHAZ), PSMB4 (subunidade do proteassoma, tipo beta, 4), receptor de transferrina, tubulina, beta- actina, GAPDH e semelhantes podem ser usados. Em uma modalidade preferida, os controles de nivel de expressão são GAPDH, proteina de ativação tirosina 3- mo.nooxigenase/triptofano S-monooxigenase (YWHAZ), proteína ribossômica 18S, ubiquitina, beta-actina 'e j3-2- microglobulina.

[126] Controles de hibridação podem ser incluídos, tanto para as sondas direcionadas aos genes alvo e para as sondas direcionadas ao nivel de expressáo ou para os controles de normalização. Controles cie erro são sondas de oliçjonucleotídeos idênticas às sondas direcionadas aos genes alvo, mas que contêm mutações em um ou vários nucleotídeos, isto é, que contêm nucleotideos em determinadas posições que não hibridam com o nucleotídeo correspondente no gene alvo. Os controles de hibridação são selecionados de tal modo que, aplicando-se as condições de hibridação adequadas, o gene alvo deve hibridar com a sonda específica, mas não com a hibridação de controle ou com uma eficiência reduzida. Os controles de hibridização contêm preferencialmente uma ou várias posições modificadas no 5 centro da sonda. Os controles de hibridação, por conseguinte, fornecem uma indicação do grau de hibridação inespecífica cu de hibridação cruzada com urn ácido nucléico na amostra com uma sonda diferente daquela que contém a sequência de ccunplementaridade exata.

[127] Os arranjos da invenção podem também conter os controles de amplificação e preparação da amostra que são complementares às sondas de genes de controle das subsequências selecionadas porque normalmente não aparecem na amostra biológica objeto do estudo, tais como sondas para genes bacterianos. A amostra RNA é suplementada corri uma quantidade conhecida de um ácido nucléico que hibrida ccm a sonda de controle selecionada. A determinação da hibridação com a dita sonda indica o grau de recuperação dos ácidos nucléicos durante a sua preparação, bern como uma estimativa da alteração causada nos ácidos nucléicos durante o processamento da amostra.

[128] Uma vez que são fornecidos um conjunto de sondas mostrando a especificidade adequada e Lllü conjunto de sondas de controle, estes são dispostos em arranjo em uma posição conhecida, tal que, apÓs as etapas de hibridação e de detecção, é possível estabelecer uma correlação entre uma sinal positivo de hibridação e o gene específico, a partir das coordenadas da arranjo em que se detecta o sinal positivo de hibridação.

[129] Os rnicroarranjos podem ser arranjc's cíe alta densidade com milhares de oligonucleotídeos obtidos por meio de fotolitografia em métodos de síntese in situ {Fodor e outros, 1991, Science, 767-773). Este tipo de sonda é geralmente redundante, isto é, inclui várias sondas para cada RNAm que deverá ser detectado. Em uma modalidade preferida, os arranjos são arranjos de baixa densidade ou lda contendo menos que 10.000 sondas por centímetro 5 quadrado. Nos ditos arranjos de baixa densidade, as diferentes sondas são aplicadas manualmente, com o auxílio de uma pipeta em locais diferentes de um suporte sólido (por exempio, uma superfície de cristal, uma membrana). O suporte utilizado para fixar as sondas pode ser obtido a IO partir de uma grande variedade de materiais, incluindo plástico, cerâmica, metais, géis, membranas, cristais e afins. Os microarranjos podem ser obtidos através de qualquer método conhecido do versado na técnica.

[130] Depois da hibridação, nos casos em que o ácido nucléico não hibridizado é capaz de emitir um sinal na etapa de detecção, uma etapa de lavagem é necessária para eliminar o dito ácido nucléico não hibridizado. A etapa de lavagem é realizada através de métodos e soluções conhecidos pelo versado na técnica.

[131) Nc caso ern que a marcação no ácido nucléico não for diretamente detectável, é possível ligar o microarranjo que compreende os ácidos nucléicos alvo ligados ao arranjo com os outros componentes do sistema necessários para provocar a reação dando origem a um sinal detectável. Por exemplo, se os ácidos nucléicos alvo forem rnarcados com biotina, a arranjo será colocado em contato com a estreptavidina conjugada com um reagente fluorescente em condições adequadas de modo que a ligação entre a biotina e a estreptavidina ocorra. Após a incubação de microarranjo com o sistema que gera o sinal detectável, é necessário realizar uma etapa de lavagern para eliminar todas as moléculas que não se ligaram especificamente ao arranjo. As condições de lavagem serão determinadas pela pessoa especializada na técnica, utilizando as condições adequadas de acordo com o sistema que gera o sinal detectável, e que são bem conhecidas do versado na técnica.

[132] O padrão de hibridação resultante pode ser 5 visto ou detectado de várias maneiras diferentes, dita detecção sendo determinada pelo tipo de sistema utilizado no microarranjo. Assim, a detecção do padrão de hibridação pode ser realizada por meio de contagem de cintilações, autorradiografia, determinação de um sinal fluorescente, as determinações de calorimetria, detecção de urri sinal de luz e afins.

[133] Antes cia etapa de detecção, é possível tratar os microarranjos corn uma endonuclease específica para o DNA de filamento único, de tal mocio que o DNA que não tenha ligado especificamente ao arranjo é eliminado, enquanto que o DNA duplo filamentado resultante da hibridação das sondas cie arranjo com os ácidos nucléicos da amostra objeto de estudo permanece inalterado. Endonucleases adequadas para este tratamento incluem a nuclease Sl, a nuclease de feijão mungo e semelhantes. No caso do tratamento corn a endonuclease ser realizado erri um ensaio em que o ácido nucléico alvo não está rnarcado com uma molécula diretamente detectável (por exemplo, ern urn ensaio em que o ácido nucléico alvo é biotinilado), q tratamento com a endonuclease ser efetuado antes de colocar o microarranfc' em contato com os outros mernbros do sistema de produção dci sinal detectável. í134l Após a hibridização e possíveis processos de lavagem e tratamento posteriores, o padrâo de hibridação é detectado e quantificado, para o qual q sinal correspondente a cada ponto de hibridação no arranjo é comparado a um valor de referência que corresponde ao sinal emitido por um número conhecido de ácidos nucléicos terminalrnente rotulados, a fim de obter, assim, um valor absoluto do núrnero de cópias de cada um de ácido nucléico que é hibridado em um determinado ponto do microarranjo.

[135j No caso em que o nível de expressão da 5 proteína KIA1456 precisar ser determinado, c) kit da presente invenção compreenderá pelo menos um anticorpo específico para a dita proteína.

[136] Para este fim, qs arranjos de anticorpos tais como os descritcs por De wildt e outros {2000) Nat.

lO Biotechnol. 18:989-994; Lueking e outros (1999) Anal. Biochem. 270: 103-111; Ge e outros (2000) Nucleic Acids Res. 28, e3, I-VII; Mac8eath e Schreiber (2000) Science 289:1760-1763; WO 01/40803 e WO 99/51773Al são úteis. Os anticorpos dc arranjo incluem qualquer agente capaz de ligação imunológica a um ligando com elevada afinidade, incluindo IgG, IgM, IQA, IgO e IgE, bem como as moléculas semelhantes aos anticorpos que apresentam um sítio de ligação ao antigeno, tais como fab', Fab, F(ab')2, anticorpos de único domínio ou DABS, Fv, SCFV e semelhantes. As técnicas para a preparação dos ditos anticorpos são bem conhecidas do versado na técnica e incluem os métodos descritos por Ausubel e outros (Current Protocols in Molecular Biology, Eds. Ausubel e oueoa, john Wiley & Sons (1992)).

[137) Os anticorpos do arranjo podem ser aplicados erri alta velocidade, por exemplo, utilizando sistemas robo.tizados comercialmente disponíveis {por exemplo, aqueles produzidos por Genetic Microsystems ou Biorobotics). O substrato do arranjo pode ser nitrocelulose, plástico, cristal ou pode ser de um material poroso, como por exemplc', acrilamida, agarose ou outro polímero. Eni outra modalidade, é possível utilizar células que produzem os anticorpos específicos para a detecção das proteínas da invenção por meio da sua cultura em filtros de arranjo. Após a indução da expressão dos anticorpos, estes são imobilizados no filtro, na posição do arranjo em que a célula produtora foi localizada 5 [138] Um arranjo de anticorpos pode ser colocado , em contato com um alvo marcado e o nível de ligação do alvo com os anticorpos imobilizados pode ser determinado. Se o alvo não for marcado, urrt ensaio do tipo sanduíche pode ser utilizado, no qual um segundo anticorpo marcado específico para o polipeptídeo que se liga ao polipeptídeo que está imobilizado no suporte será usado. A quantificação do polipeptídeo presente na amostra em cada ponto do arranjo pode ser armazenada em uma base de dados como um perfil de expressão. O arranjo de anticorpos pode ser produzido em duplicata e pode ser utilizado para comparar os perfis de ligação de duas amostras diferentes.

[1391 Anticorpos, ou um fragmento dos mesmos, capaz de detectar um antígeno, capaz de se ligar especificamente Èl proteína KIAA1456 ou as suas variantes são, por exemplo, anticorpos monoclonais e policlonais, fragmentos de anticorpos, Fv, Fab, Fab'y F(ab')2, SCFV, diacorpos, triacorpos, tetracorpos e anticorpos humanizados. Em uma modalidade preferida, os reagentes do kit são sondas de DNA ou RNA ou anticorpos.

[140] Ditos reagentes, especificamente, as sondas e os anticcrpos, podem ser fixados a um suporte sólido, tal como uma membrana, um plástico ou um vidro, opcionalmente tratado, a fim de facilitar a fixação das ditas sondas ou anticorpos ao apoio. O dito suporte sólicio que compreende, pelo menos, um conjunto de anticorpos capaz de se ligar especificamente à proteína KIAA1456 ou variantes dos mesmos, e/ou sondas especificarnente hibridizadas com o gene

KIAA1456, podem ser utilizadas para a detecção cio nivel de expressão por meio de tecnologia de arranjo.

[141j Os kits da presente invenção compreendem, opcionalrnente, reagentes adicionais para a detecção do 5 polipeptídeo codificado um gene de manutenção ou o RNArn codificado pelos ditos genes de manutenção. A disponibilidade do dito reagente adicional permite a normalização das medições efetuadas em amostras diferentes (por exemplo, a amostra de teste e a amostra de controle) lC) para exclusão, de modo que as diferenças na expressão dos diversos biomarcadores são devidas a uma quantidade diferente de proteína total na amostra, etn vez das diferenças reais em relação ao nível de expressão. Mais de um gene de manutenção pode ser usado. Genes de manutenção, tal como empregado no presente documento, se refere aos çenes que codificam proteínas que são expressas constitutivamente e realizarn funções celulares essenciais.

Genes de manutenção preferidos para utilização na presente invenção incluem j3-2-microglobulina, GAPDH, PSMB4 (subunidade do proteassoma, tipo beta, 4), ubiquitina, receptor cie transferrina, 18-S RNA ribossômico, ciclofilina, tubulina, j3-actina e proteína de ativação tirosina 3monooxigenase/triptofano S-monooxiqenase {YWHAZ).

·[142j Em outra modalidade, a invenção se refere à utilizaçâo de um agente para prever o resultado clínico de um indivíduo que sofre de câncer colorretal, em que os ditos agentes detectam um nível elevado de expressão do gene KIAA1456, em relação aos valores de referência, assim o resultado clínico do indivíduo é fraco.

[143] Os métodos para detecção do nivel de expressão de KIAA1456 e os métodos para a determinação, bem como os valores de referência padrão foram descritos anteriorrnente.

[144j Em outro aspecto, a invenção se refere ao uso de urn kit da invenção para o diagnóstico de câncer 5 colorretal ou para a determinação do estágio de um tumor colorretaí.

[145: Os exemplos que se seguem são fornecidos meramente como ilustração e não devem ser interpretados como limitando o âmbitc da invenção.

lO [146] EXEMPLOS

[147] Metodología

[148] Amostras de paeíentes [149j A análise do nível de expressão de RNAm da isoforma 1 do gene KIAA1456 foi realizada em urn total de 98 amostras teciduais, tumorais, de câncer colorretal estágio II de pacientes submetidos a cirurgia no Hospital Universitário de La Paz de Madrid, entre os anos de 2000 e

2005. O comitê de ética do Hospital La Paz aprovou este estuclo. O Departamento de Patologia cio Hospital Universitário de La Paz examinou e determinou o estágio em nível local das amostras, cie acordo com os critérios estabelecidos pela AJCC e UICC. No total 80 amostras foram selecionadas para a análise estatística subsequente, em razão de apresentarem RNA de boa qualidade. Um conjunto de 10 amostras de tecido normal adjacente a alguns dos tumores incluídos no estudo e um conjunto de quatro amostras de tecidos normais foram utilizados como referências de tecidos normais.

[150] As variáveis clinicopatológicas destes 80 casos foram determinadas de acordo com critérios bem conhecidos e encontram-se resurnidas na Tabela 2. Tabela 2 I Total n = 80

Parâmetro

Idade (anos) I Médía ± SD |67,130 ± 10,63

I Sexo n (%) I Homem I 45 (56,3) I Mulher I 35 (43,8)

Tumor prímárío (T), n (%) T3 ) 57 (71,2)

T4 I 22 (27,5)

Nenhum dado disponível |1 (1,3.)

Invasão períneural n (%) NÂO I 63 (78,8)

SIM I 14 (17,5)

Nenhum dado dispcmível |3 (3,7)

Obstrução íntestínal n (%) NÃO l 69 (86,2)

SIM |11 (13,8)

Desmoplasia n (%) NÃO I 37 (46,2)

SIM I 25 (31,3)

Nenhum dado disponível I 18 (22,5)

CIassíficação histopatolÓgíea n (%) Gl I 5 (6,3) G2 69 (86,2)

G3 |5 (6,3) Nerihurn dddo disponívei )1 (1,2) Típo de caneer eo1orreta1, n (%) n (%) Cólon i 41 (51) Retal I 25 (31) Sigína I 14 (17) Invasão 'vascular n (%) NÃO I 53 (66,2)

SIM I 24 (30) Nenhum dado disponível I 3 (3,8) Quimíoterapía n (%) NÃO I 28 (35)

SIM I 52 (65)

Reeorrêneía n (%) NÃO I 59 (73,8) SIM I 21 (26,2) L46 pacientes receberam 6 ciclos de UFT-LV e 6 pacientes receberam xeloda.

[151] Os períodos de observação dos pacientes variaram de 3 meses a 109 meses, com um acornpanhamento médio de 59 meses. No mojuento da análise, 21 dos 80 pacientes apresentaram recaída (26,2%) e 12 deles (15°õ) 5 haviam morrido.

[152] Nc) total 28 pacientes (35%) não receberam quimioterapia adjuvante, o restante deles (52, 65%) receberam a monoterapia com um fluoropirimidina (UFT-LV ou xéloda). IO [153] Isolamento de RNA total a partír de amostras de tecidos humanos parafínados

[154] para a extração do RNA total a partir de amostras clínicas parafinadas, o rnaterial de partida foi constitaído de 10 seções de 7 micra por peça. Como uma etapa antes do isolamento do RNA, as seções de tecido foram desparafinizadas e reidratadas por meio de passagens através de xilol e alcoóis de forma decrescente {100%, 90% e 70%). Em seguida, para isolar o RNA, o kit de purificação de RNA MasterPure (Epicentro) foi utilizado de acordo com as indicações do fabricante, o qual, além da purificação do RNA, incluiu um tratamento com DNAase para elirninar quaisquer vestígios de DNA genômico contarninante.

[155] Transcrição reversa e PCR em tempO real (qPCR)

[156] E'ara obtenção do DNAC, o material de partida foi constituído de 1 µg do RNA total de amostras de tecidos de pacientes. A transcrição inversa foi realizada a 37°C por 2 horas utilizando o kit Archive DNAC de alta capacidade {Applied Biosystems). Cada DNAc foi então analisado em triplicata usando o Detector de Sequência ABI PRISM 7700 (Applied Biosystems). A PCR foi realizada utilizando a rrtistura de reação Taqman Universal PCR (Applied Biosysterns), que continha o reagente ROX para padronizar as emissões. As sondas utilizadas para a amplificação específica da isoforma 1 do gene KIAA1456 foram adquiridas na Applied Biosysterns corno Ensaio de Expressão Gênica Taqman {ensaio ID: HsO0332747 ml). Por 5 meio da informação disponível na Applied Biosystems, verificou-se que dita sonda só reconheceu isoforma l e não isoforma 2.

[157] Os genes de 3-2 rnicroglobulina (ID Applied Biosystems: HS99999907 ml), PSMB4 (ID Applied Biosysterns: HsO0160598_ml) ou GAPDH (ID Applied Biosystems: HS99999905 ml) foram ampliados como controles internos.

Como a estabilidade dos três genes é muito elevada, a média geométrica dos três genes foi selecionada como o fator de normalização. Os ciclos de temperatura PCT foram: 10 minutos a 95°C, 40 ciclos de 15 segundos a 95°C e 1 minuto a 60"C.

[1581 A quantificação relativa da expressão de KIAA1456 foi calculada tanto pelo método 2"ââct e pelo método 2""' íLivak KJ, Schmittgen TD: Análise dos dados da expressão gênica relativa utilizando PCR quantitativa em tempo real e o rnétodo 2(-delta delta C{t)), Methods (San Diego, Calif 2001; 25:402-408j. O. rnétodo 2"^"' {User Bulletin No. 2 of Applied Biosystems (P/N 4303859)), que será doravante denorninado "RQ", consiste em calcular a expressão gênica de KIAA1456 padronizado na arnostra de tecido tumoral com relação à expressão padronizada do mesmo çene na amostra de referência que, nesse caso, é constituída pelas arnostras de tecido normal adjacente. Os dados são apresentados como a "mudança em tempos de expressão" (QR) de KIAA1456 padronizado com a média geométrica dos genes de referência e em relação a uma amostra de tecido norrnal de controle. O método 2_Act, que doravante será referido como "AQ", consiste em utilizar os níveis normalizados das amostras tumorais sem relacioná-los corn a amostra de controle de tecido normal. Os dados são apresentados como os níveis relativos do RNA mensageiro do gene em estudo padronizado com a média geométrica dos genes 5 de referência e multiplicado por 10'.

[159] Anáííse estatístíea [160j Gerenciamento de clados foi realizado por meio do software SPSS, versão 15.0 (Inc, Chicago, Illinois) e todas as análises foram realizadas corn o pacote estatístico gratuito R (versão 2.9.1) (R Development Core Team, 2009).

1161] Considerando-se que a sobrevida foi definida como o tempo decorrido desde o diagnóstico até à morte, a sobrevida sem recidivas foi entendicío como o tempo decorrido desde o diagnóstico até a primeira recorrência {em todos os casos existe censura direita, uma vez que nem todos os pacientes morrem, eles também podem não apresentar recidiva).

[162] Para cada gene e ambas a sobrevida e sobrevida sem recidivas, um ponto de corte na expressão gênica foi determinado como sendo aquele ponto da expressão (normalizado) do gene em que o valor preditivo foi maximizado. Foi entendido que isto foi obtido, quando a área sob a curva ROC (AUC) foi a máxima, o que proporcionaria uma combinação ideal de sensibilidade e de especificidade.

[163] As curvas ROC foram construídas utilizando, em cada caso, o indicador de morte (ou recidiva) e o valor esperado obtido a partir de urn modelo Andersen-Gill (modelo AG) [Andersen PK, Gill DR. Annals of Statistics 1982; 10: 1100-1120; Andersen PK. e outros; Statistical Models based on Counting Processes, New York: Springer-Verlag, 1993]. Nos estágios anteriores da análise verificou-se que, para qualquer uma das categorizações dos valores da expressão gênica (em especial, em "sub" e "super" expressão), bem como para as categorias de determinadas covariáveis (especialmente a idade e classificação patológica), os 5 riscos podem não ser proporcionais. Por este motivo, e tendo em vista a obtenção de estimativas consistentes, foram utilizados modelos AG. Este rrtodelo permite a avaliação das variáveis dependentes do tempo que podem ser explicativas do risco. Neste caso, as estimativas das curvas de sobrevida são cbtidas por meio do cálculo de Aalen-johansen, construídas errí volta da estimativa das intensidades acumuladas cie transição [Andersen PK e outros; Statistical Models based on Counting Processes. New York: Springer-Verlag, 1993!. Borgan [Borgan O. Encyclopaedia of Bioestatistics. John Wiley & Sons, 1998j mostra que essa estimativa não é mais do que uma versão do arranjo da estimativa de Kaplan-Meier.

[164] Então, nÓs representamos para todas as amostras com valores de expressão gênica (pacironizados) acima e abaixo do ponto de corte, as curvas de sobrevida (amboa, em geral e sobrevida livre de recidiva), estratificando pelas covariáveis de interesse. A diferença estatística entre as curvas foi testada por rneio de Harrington and Fleming G-rho family [Harrington DP, Fleming TR. Biometrika, 1982; 69:553-566].

[165l Para avaliar o efeito da expressão gênica na no controle da sobrevida quanto a possíveis confusões, vários modelos AG [Andersen PK, Gill DR. Annals of Statistics 1982; 10: 1100-1120; Andersen PK. e outros; Statistical Models based on Counting Processes, New York: Springer-Verlag, 1993] foram ajustados. Em todos os casos, nós controlarnos a presença de falsos positivos por meio de estatística não paramétrica [Efron B, Tibshirani R. An introduction to Bootstrap. Nueva York, Londres: Chapman and Eall, 1993].

[166] EXEMPLO 1

[167] Níveís de expressão transcríeíonal da 5 isoforma 1 do gene KIAA1456 em pacíentes eom câncer coIorretal no estágío II

[168] Após a realização da PCR quantitativa, foram selecionadas amostras de Ct do gene de controie B2- microglobulina de menos de 27,3, uma vez que valores maiores indicam uma qualidade RNA pobre. Por fim, 80 das 98 arnostras disponíveis apresentaram uma ampliação do gene endógeno de boa qualidade e forarrt os analisadas para estudar os niveis de transcrição de KIAA1456 (figura IA).

Através da comparação dos níveis de tumor em relação ao conjunto de tecidos normais utilizados corrto referência, um silenciamento significativo foi encontrado ern 17 casos (21%, RQ <0,5), que também foi detectado em 30 amostras ocorrendo uma superexpressão significativa (38%, RQ > 1,5) em relação ao tecido normal de controle, ao passo que no restante dos casos (33, ou seja, 41%) não houve alterações no que diz respeito ao tecido normal (figura IB).

[169] EXEMPLO 2

[170] Correlação entre os parâmetros cIíníeopatológícos e os níveís de expressão de KIAA1456 em tecídos tumoraís

[171] Após a análise de correlação entre os parâmetros clinicopatológicos disponíveis e os níveis de expressão de KIAA1456 nas amostras clínicas, verificou-se que havia uma correlação estatisticarnente significativa com invasão perineural (p = 0,004) e síndrome de obstrução intestinal (p = 0,003) (figuras 2A e 2B, respectivamente).

[172] A presença da invasão perineural corresponde a uma categoria de fatores, com um valor de prognóstico,

que não fci ainda suficientemente estudada, de modo a ser capaz de estabelecer que elas tenham o dito valor. [173j Há uma variedade de análises sobre o valor prognóstico da obstrução intestinal neoplásica, onde os 5 autores afirmam que a obstrução é o melhor preditor clínico com uma redução da sobrevida a longo prazo [Ratto C. e outros; Doenças CiÇi cólon e reto de 1998; 41 : 1033-1049]. Em nossa série de pacientes nós confirmamos esses ciados observando uma significância estatística entre a obstrução lO necplásica e um pior prognóstico {dados não mostrados).

[174] EXEMPLO 3

[175] Análíse do valor prognÓstíco da expressão de KIAA1456 em paeíentes no estágío II

[176] Análise do valor prognóstico da superexpressão de KIAA1456 em amostras clínicas [177j Foi testado se a superexpressão de KIAA1456 seria relevante para o prognóstico do paciente (figura 3). Foi estabelecida como superexpressão para RQ um valor superior a 1,5 (100% de sensibilidade, especificidade de 81% para a sobrevida global e 95% de sensibilidade, 66% de especificidade para a sobrevida livre de doença).

[178] Como mostrado na figura 3, uma asscciaçào estatisticamente significativa é observada eritre a superexpressão de KIAA1456 e a recorrência dos pacientes medida como a sobrevida sem recidivas (p = 0,05). [179! Análise do valor proqnóstico dos casos de superexpressão maior cie KIAA1456 em amostras clinicas [i80j é sabido que certos pacientes com doença de estádio II tem pior prognóstico. Trata-se de pacientes com pelo menos urn dos seguintes fatores de risco clínicos: doença T4; obstrução de tumor ou perfuração; tumores pouco diferenciados (classificação 3); recuperação de <12 gânglios linfáticos (recomendações ASCO); altos níveis de

CEA pré-operatórios; invasão vascular, linfática e perineural, e margens cirúrgicas positivas, de acordo corn a declaração de consenso do College of American Pathologists. Com relação a estes fatores, verificou-se que os pacientes 5 com ausência de invasão vascular (figura 4 A e C) ou invasão perineural (figura B e D), ou seja, casos com prognóstico muito melhor, mostraram uma diminuição significativa na sobrevida livre de recidiva se fossem KIAA1456 superexpresso (fiçura 4), sugerindo que KIAA1456 está correlacionado a um pior prognóstico clínico, mesmo quando fatores de risco padrão indicam um bom proçjnóstico.

[181] Portantc, todos estes dados demonstram que a superexpressão da isoforma 1 do gene KIAA1456 indica um pior prognóstico de pacientes em estágio II, propondo este gene como marcador prognóstico no estágio II de CRC. .[182] EXEMPLO 4

[183] Estudo do valor predítívo de KIAA1456 expressão em pacíentes CRC estágío II [184: Os resultados cbtidos nas secções anteriores indicam que KIAA1456 pode funcionar como um marcador de prognóstico para estes pacientes. No entanto, o que é mais interessante para os pacientes do presente estágio, tal corno já foi indicado, é a identificação de fatores preditivos, que permitem a seleção de pacientes que serão mais sensíveis ao tratamento de quimioterapia adjuvante convencional, obtendo um efeito terapêutico que melhora a sobrevida dos mesmos. Uma vez que este tipo de fator de previsão de resposta ainda não está disponível, não há critérios de seleção consistentes para o tratamento adjuvante nestes pacientes com câncer colorretal em estágio II, e a necessidade de administrar quimioterapia ou não está sendc muito questionada (J. Clin. Oncol. 1999, 17: 1356-1363 e Mamounas e outros, J. Clin. Oncol. 1999, 17:

1349-1355). Estima-se que o possível aumento de sobrevida, que é obtido com a quimioterapia após a cirurgia em comparação com a não administração de quimioterapia está na melhor das hipóteses em 2-4%.

5 [1851 Uma vez que informações sobre a recorrência e morte de ambos os pacientes que tinham sido tratadcs e pacientes que não haviam sido tratados estavam disponíveis erri nossa série de pacientes, queríamos verificar se o tratamento com quimioterapia melhorou a sobrevida destes pacientes. [i86l Portanto, o objetivo do estudo a seguir consistiu em estratificar os pacientes, de acordo com o fato de terem ou não recebido quimioterapia adjuvante após a cirurgia e realizancio um estudo do prognóstico desses pacientes de acordo corn a expressão KIAA1456. Os pontos de corte de expressão de KIAA1456 foram escolhidos de acordo com a superexpressão significativa para os valores de RQ e 69° (sobrevída çlobal), 64" (sobrevida livre de doença) percentis para os valores AQ de KIAA1456.

[187] Como mostrado na fiqura 5, o prognóstico dos pacientes que não são tratados com quimioterapia adjuvante é radicalmente pior nos pacientes com superexpressão do gene (p = 0,01 para a sobrevida do câncer do cólon e p = 0,012 para a sobrevida sem recidivas) (figuras 5A e 5C).

Estas diferenças não são observadas em pacientes tratados corn quirnioterapia, em que o prognóstico é muito melhor errt ambos çís casos (figuras 5B e 5D).

[188] Estes dados foram confirmados ao usar c) ponto de corte de 69° (sobrevida global) e 64° (sobrevida livre de doença) percentis para os valores AQ de KIAA1456 (figura 6). Os pacientes que não são tratados mostraram tanto uma sobrevida global menos significativa (p = 0,03) e sobrevida livre de doença (p = 0,025) quando superexpressando KIAA1456. Mais urrta vez, estas diferenças não são observadas em pacientes tratados com quimioterapia.

[189] A análise multivariada ajustada para sexo, idacie, çjrau patológico, invasão vascular e perineural, 5 obstrução/perfuração mostrou a expressão de KIAA1456 como um fator prognóstico independente e significativo (HR 4,68, p = 0,059 para a sobrevida livre de recidiva e HR 4,8, p = 0,078 para sobrevida global).

[190] Estes resultados demonstram que a expressão de KIAA1456 pode ser empregada como um fator preditivo em pacientes com CRC em estádio II. Esta constatação é útil porque urna identificação precisa da pequena percentagem de 20-30% dos pacientes que sofrem de CRC em estágio IT e que mostrarn recidiva {normalmente 20-30%) não havia sido possível até agora.

Claims (16)

REIVINDICAÇÕES

1. Método para decidir sobre a terapia em um . indivíduo que sofre de câncer colorretal compreendendo a determinação do nível de expressão do gene KIAA1456 em uma 5 amostra do indivíduo, em que o nível de expressão alterado do gene, quando comparado com um nível de referência é indicativo de que o tratamento é adequado para o paciente ou ern que o mesmo nível de expressão do gene KIAA1456 na amostra, quando comparada COKl um nível de referência é 10 indicativo de que a terapia não é adequada para o paciente.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, em que o nível de expressão alterado é ou aumento do nível de expressão ou diminuição do nível de expressão.

3. Método para prever o resultado clínico de um 15 paciente que sofre de câncer colorretal compreendendo a determinação do nível de expressão do gene KIA.A1456 em uma amostra do paciente, em que aumento do nível de expressão do gene KIAA1456 na amostra quando comparada com um nível de referência é indicativo de um fraco resultado clínico, 20 ou em que o mesmo ou a diminuição do nível de expressão do gene KIAA1456 na arnostra quando comparada com urri nível de referência é indícativo de urn boin resultado clínico.

4. Método, de acordo com a reivindicação 3, em que a previsão do resultado clínico é medida como sobrevida 25 livre de doença e sobrevida global.

5. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 ou 4, em que o paciente não foi tratado com terapia neoadjuvante ou adjuvante.

6. Método, de acordo com qualquer uma das 30 reivindicações 1, 2, 3, 4 ou 5, em que a amostra é uma biopsia do tumor.

7. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5 ou 6, em que o nível de r expressão do gene KIAA1456 é determinado pela medição do nível de mRNA codificado pelo gene KIAA1456 ou o nível de proteína de KIAA1456.

8. Método, de acordo com a reivindicação 7, em que o 5 nível de mRNA da variante 1 transcrita do gene KIAA1456 humano é determinado.

9. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8, em que o paciente é um humano.

10. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ou 9, em que o paciente foi submetido a ressecção cirúrgica do tumor.

11. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10, em que o paciente sofre de fase II de câncer colorretal.

12. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou 11, em que o paciente não apresenta obstrução neoplásica intestinal, invasão vascular e/ou perineural.

13. Kit compreendendo um conjunto de reagentes capazes de detectar especificamente o nível de expressão do KIAA1456 e, opcionalmente, urn gene de rnanutençao ou a proteína codificada pelo gene de manutenção.

14. Kit, de acordo com a reivindicação 13, em que os reagentes do kit são capazes de detectar especificamente o nível de mRNA de KIAA1456 e/ou o nível de proteína de KIAAI456.

15. Kit, de acordo com a reivindicação 14, em que os reagentes do kit são sondas de DNA ou RNA e anticorpos.

16. Uso do kit conforme qualquer uma das reivindicações 13 a 15 para determinar a necessidade de tratamento com um agente terapêutico ou uma combinação de agentes terapêuticos de um indivíduo ou para prever o resultado clínico de um indivíduo que sofre de câncer colorretal.