ES2657923T3 - Un método para detectar simultáneamente la estructura cromosómica y la expresión génica en células sueltas - Google Patents

Abstract

Un método in vitro para la determinación de la conformación estructural de un cromosoma en una célula, que comprende la hibridación de numerosas secuencias diana de ARN en la célula con miembros de al menos un conjunto de sondas oligonucleotídicas marcadas con fluorescencia, en donde las numerosas secuencias diana de ARN se transcriben desde porciones de al menos un cromosoma, y en donde el patrón de las sondas marcadas con fluorescencia que se hibridan con las secuencias diana de ARN es indicativo de la conformación estructural del cromosoma; en donde el ARN diana es ARNm; y en donde la secuencia de ARNm hibridada selectivamente es al menos una porción de un intrón de la secuencia de ARNm.

Description

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DESCRIPCION

Un método para detectar simultáneamente la estructura cromosómica y la expresión génica en células sueltas Antecedentes de la invención

EL ADN de una única célula humana, si se extiende completamente, tendría una extensión aproximada de unos dos metros. Sin embargo, cada célula compacta estas moléculas poliméricas increíblemente largas dentro del núcleo de la célula, un espacio de tan solo unos pocos micrómetros. Los investigadores están encontrando cada vez más que esta conformación compactada no es solo una «pelota de cuerda», sino que más bien está muy organizada y su regulación es dinámica (Cremer et al., 2001, Nat Rev Genet 2: 292-301). El desarrollo de un mejor conocimiento de esta forma compactada proporcionará un conocimiento profundo clave sobre la manera en que la organización espacial de la información genética en el núcleo afecta a su lectura a través de la expresión génica.

La expresión génica implica la transcripción de moléculas de ARNm desde el genoma seguida de la exportación de estos ARNm al citoplasma. Existen datos que indican que la estructura de los cromosomas, organizados por lo general en territorios diferentes en el núcleo (Cremer et al., 2001, Nat Rev Genet 2: 292-301), tiene su importancia en ambos procedimientos (Fraser et al., 2007, Nature 447: 413-417; Misteli, 2007, Cell 128: 787-800; Papantonis et al., 2010, Curr Opin Cell Biol. 22(3): 271-6). En realidad, un recuento numérico de la transcripción revela que la abundancia de los complejos enzimáticos grandes que son necesarios para la polimerización del ARN y el ayuste oscila entre cientos y miles por célula, la cual debe transcribir de algún modo las muchas decenas de miles de genes que hay en el núcleo (Jackson et al., 1998, Mol Biol Cell 9: 1523-1536; Osborne et al., 2004, Nat Genet 36: 10651071; Wansink et al., 1993, J Cell Biol 122: 283-293). Algunos datos sugieren que cada conjunto de genes que se transcribe activamente está localizado en «factorías de transcripción» (Iborra et al., 1996, J Cell Sci 109: 1427-1436; Schoenfelder et al., 2010, Nat Genet 42: 53-61; Sexton et al., 2007, Semin Cell Dev Biol 18: 691-697). La formación transitoria de estas fábricas y su escasa accesibilidad podría ser el motivo de la naturaleza intermitente de la expresión génica que nosotros y otros investigadores hemos observado (Raj et al., 2006, PLoS Biol 4: e309; Raj et al., 2008, Cell 135: 216-226).

Mientras tanto, durante muchos años, los investigadores razonaron que la alta densidad de los materiales poliméricos que hay en el núcleo haría que la difusión del ARN fuera prohibitivamente lenta, lo que conduce a la hipótesis de la «compartimentación génica» (Blobel, 1985, Proc Natl Acad Sci USA 82: 8527-8529), en la que los genes por sí mismos deben desplazarse a la periferia nuclear para que la exportación del ARN sea razonablemente eficaz. De hecho, existen algunas pruebas de ello, al verse que algunos genes se desplazan a la periferia tras la activación y se asocian físicamente con el complejo de los poros nucleares (Brown et al., 2007, Curr Opin Genet Dev 17: 100-106; Capelson et al., 2010, Cell 140: 372-383; Casolari et al., 2004, Cell 117: 427-439; Kalverda et al., 2010, Cell 140: 360-371). Sin embargo, los análisis biofísicos han demostrado que la difusión del ARN en el núcleo es más bien rápida y que, por lo tanto, no es limitante (Vargas et al., 2005, Proc Natl Acad Sci USA 102: 17008-17013), y que la mayoría de genes permanecen en el interior nuclear (que a menudo, de hecho, aparecen silenciados en la periferia (Chuang et al., 2006, Curr Biol 16: 825-831; Kosak et al., 2002, Science 296: 158-162)).

Por desgracia, no contamos con un panorama claro de la estructura los cromosomas ni de la expresión de sus genes, que se entronca en la falta de herramientas eficaces para medir simultáneamente la estructura genética y la función en una única célula. La mayoría de los ensayos convencionales por toma de imágenes para la estructura de los cromosomas se centran solo en la posición de uno o dos locus a la vez, mientras que las estrategias bioquímicas globales proporcionan mediciones indirectas promediadas sobre poblaciones de muchos miles a millones de células. En cualquier caso, los datos de expresión génica son difíciles de obtener. Por estas razones, todavía quedan incógnitas relacionadas con cómo es la organización o desorganización espacial de la expresión génica en los cromosomas en interfase, o relacionadas con la variabilidad de las configuraciones de los cromosomas, y cómo estos contribuyen a la variabilidad de la expresión génica.

En la actualidad se utilizan a grandes rasgos dos clases de métodos para estudiar la estructura de los cromosomas. Un método es la captura de conformación del cromosoma (3C) (Dekker et al., 2002, Science 295: 1306-1311) y sus variantes, lo más notablemente Hi-C (Duan et al., 2010, Nature 465 (7296):363-7; Lieberman-Aiden et al., 2009, Science 326: 289-293). La 3C es una técnica bioquímica que mide la frecuencia de las interacciones físicas directas entre los locus genómicos en las poblaciones de células. Aunque la encarnación de Hi-C del método produce información sobre todo el genoma en estas interacciones, tiene una serie de inconvenientes. Por ejemplo, no produce datos a partir de una única célula, no da ninguna información sobre la expresión, y solo ofrece la probabilidad de una interacción en vez de la estructura cromosómica per se.

La otra estrategia es la FISH en el ADN, que implica la detección de sondas marcadas con fluorescencia que se hibridan selectivamente con regiones pequeñas o grandes de ADN (o incluso cromosomas enteros). Esta estrategia es más directa, pero los estudios hasta ahora se han centrado tan solo en unos pocos locus, lo que limita su alcance. Más importante aún, las duras condiciones necesarias para desnaturalizar el ADN cuando se prepara para la FISH en el aDn provocan la degradación significativa del ARN, lo que imposibilita por lo general su combinación con métodos de FISH en el ARN, salvo para las dianas muy abundantes (Chaumeil et al., 2006, Genes Dev 20: 2223-2237), o la utilización de métodos de amplificación de la señal que son difíciles de multiplexar (Takizawa et al.,

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2008, Genes Dev 22: 489-498).

Existe la necesidad de un método que permita medir la expresión génica de uno o varios genes a través de FISH en el ARN mientras que se obtiene simultáneamente información estructural cromosómica relacionada con los cromosomas. La presente invención satisface esta necesidad.

Breve compendio de la invención

La presente invención hace referencia a un método in vitro para determinar la conformación estructural de un cromosoma en una célula. El método in vitro incluye la etapa de hibridación de numerosas secuencias diana de ARN en la célula con miembros de al menos un conjunto de sondas oligonucleotídicas marcadas con fluorescencia, en donde las numerosas secuencias diana de ARN se transcriben desde porciones de al menos un cromosoma, y en donde el patrón de las sondas marcadas con fluorescencia que se hibridan con las secuencias diana de ARN es indicativo de la conformación estructural del cromosoma, en donde el ARN diana es ARNm, y en donde la secuencia de ARNm diana es al menos una porción de un intrón de la secuencia del ARNm. En una realización, la localización de las sondas hibridadas es indicativa a la vez de la localización cromosómica de la expresión génica del ARN transcrito. En otra realización, el número, la intensidad, o las dos cosas, de las sondas fluorescentes es indicativo del nivel de expresión génica en la localización cromosómica. Aún en otra realización, cada conjunto de conjuntos de sondas oligonucleotídicas marcadas con fluorescencia están marcadas con un fluoróforo diferente, lo que da lugar a un color diferente y diferenciable cuando se mide la fluorescencia. Aún en otra realización, el método in vitro incluye la etapa de contar los puntos fluorescentes que corresponden a moléculas únicas del ARN diana para obtener un perfil de expresión génica que se corresponde con la conformación cromosómica asociada que se determina a la vez. En otra realización, las sondas no están solapadas. En otra realización, la hibridación de la sonda se produce en el núcleo de la célula. En otra realización, la célula es una célula viva. En otra realización, las secuencias diana de ARN son de ARN endógeno. En otra realización, la célula es una célula de mamífero, una célula de invertebrado, una célula de levadura o una bacteria. En otra realización, la célula es una célula de humano. En otra realización, la célula es una célula cancerosa. En otra realización, el ARN diana es ARNm. En otra realización, el ARNm diana es al menos una porción de un intrón de la secuencia del ARNm. En otra realización, el ARN diana es un ARN no codificante (ncRNA, por su nombre en inglés). También se describe un ensayo para determinar la conformación estructural de un cromosoma en una célula. El ensayo incluye la hibridación de numerosas secuencias diana de ARNm en la célula con miembros de numerosos conjuntos de sondas oligonucleotídicas marcadas con fluorescencia, en donde cada conjunto de sondas utiliza un color distinguible, las numerosas secuencias diana de ARNm se transcrben desde porciones de al menos un cromosoma, y el patrón de sondas marcadas con fluorescencia que están hibridadas a las secuencias diana de ARNm es indicativa de la conformación estructural del cromosoma. En una realización, el ensayo incluye la localización de las sondas hibridadas es indicativa a la vez de la localización cromosómica de la expresión génica del ARNm transcrito. En otra realización, el número, la intensidad, o las dos cosas, de las sondas fluorescentes es indicativo del nivel de expresión génica en la localización cromosómica. Aún en otra realización, el ensayo incluye la etapa de contar los puntos fluorescentes que corresponden a moléculas únicas del ARNm diana para obtener un perfil de expresión génica que se corresponde con la conformación cromosómica asociada que se determina a la vez. En otra realización, las sondas no están solapadas. En otra realización, la hibridación de la sonda se produce en el núcleo de la célula. En otra realización, la célula es una célula viva. En otra realización, las secuencias diana de ARNm se transcriben desde un gen endógeno. En otra realización, la célula es una célula de mamífero, una célula de invertebrado, una célula de levadura o una bacteria. En otra realización, la célula es una célula de humano. En otra realización, la célula es una célula cancerosa. En otra realización, la secuencia del ARNm diana es al menos una porción de un intrón de la secuencia del ARNm.

Breve descripción de los dibujos

Con el propósito de ilustrar la invención, en los dibujos se representan determinadas realizaciones de la invención. No obstante, la invención no está limitada a las organizaciones concretas ni a la intermediación de las realizaciones representadas en los dibujos.

En la figura 1, que compre las figuras 1A a 1C, se representa la detección de la estructura cromosómica y la expresión génica en una única célula. En la figura 1A se representan los intrones marcados en el sitio de transcripción, lo que produce información sobre la localización del gen diana, así como sobre su nivel de expresión. Al emplear un esquema codificado de combinación de colores (con seudocolores), se pueden detectar docenas, o incluso cientos, de genes por separado a lo largo del cromosoma. En la figura 1B se representan 18 genes del cromosoma 19 sobre los que se ha actuado selectivamente. El primer tercio del cromosoma está en rojo, el tercio central en verde, y el último tercio en fucsia. Los dos cromosomas tienen una configuración parecida en el núcleo, en la que el primer tercio está alojado entre los tercios central y final. En la figura 1C se representa la hibridación selectiva y simultánea del cromosoma 19 (azul verdoso) y los ARN mensajeros de EEF2 (fucsia) en la misma célula, lo que demuestra la capacidad para detectar a la vez cromosomas, genes y una única molécula de ARN en una única célula.

La figura 2, que comprende las figuras 2A y 2B, es una representación de la detección en una única molécula de translocaciones cromosómicas y del transcrito de fusión resultante. En la figura 2A se representan los transcritos de

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una célula normal y los transcritos de fusión de una célula cancerosa. Al marcar ambos extremos de la fusión con colores diferentes, los transcritos de fusión se pueden detectar directamente in situ al mismo tiempo que se detecta la anomalía cromosómica que lo ocasiona (figura 2B).

En la figura 3, que comprende las figuras 3A a 3I, se representa una demostración de un esquema de seudocoloreado para medir la actividad transcripcional y la posición de 20 genes a la vez. En la figura 3A se representa un esquema para la marcación única de varios genes diferentes a lo largo de un cromosoma dentro de una única célula mediante el uso de combinaciones de fluoróforos para los oligonucleótidos. En la figura 3B se representa un esquema para la marcación única de 20 genes diferentes mediante el uso de combinaciones de 2 o 3 fluoróforos de una paleta de 5 fluoróforos distintos desde el punto de vista espectral. En la figura 3C se representa una tinción del núcleo con DAPI. En las figuras 3D a 3H se representan imágenes de fluorescencia bruta en los 5 canales de color verdadero para los 20 genes marcados con el esquema de seudocoloreado de la figura 3B. En la figura 3I se representa la imagen con DAPI del núcleo superpuesta sobre los puntos seudocoloreados resultantes que se han identificado por ordenador. El color de los puntos representa en qué lugar del cromosoma está localizado el gen concreto.

En la figura 4, que comprende las figuras 4A a 4C, se representa un esquema para medir directamente la transcripción de los cromosomas translocados. En la figura 4A se representa un diagrama que muestra el cariotipo del cromosoma 19 en las células HeLa, las cuales contienen dos copias intactas del cromosoma 19 y una copia que se ha dividido, con una sección fusionada al cromosoma 13 y la otra fusionada al cromosoma 6. En la figura 4B se representa la medición de la actividad transcripcional instantánea por cromosoma a través del aislamiento de cada uno de los cromosomas y fragmentos de cromosoma. En la figura 4C se representa un cuadro que muestra la actividad transcripcional medida para los 20 genes a lo largo del cromosoma 19. La tasa de transcripción de los genes de la porción del cromosoma 19 fusionada al cromosoma 13 se halló que era mayor que la de los genes del cromosoma 19 intacto, mientras que la porción del cromosoma 19 que está fusionada con el cromosoma 6 se halló que se transcribía aproximadamente lo mismo que dichos genes en el cromosoma 19 intacto.

En la figura 5, que comprende las figuras 5A a 5D, se representa la imagen en vivo de una molécula de ARN endógeno. En la figura 5A se representa una célula S2 de Drosophila melanogaster viva, en donde el núcleo y el ARN de roX2 son tal y como está marcado, en la cual se han introducido las sondas contra roX2 en la célula. En la figura 5B se representa la tinción con DAPI (núcleo) de estas células S2 después de la fijación. En la figura 5C se representan las señales de FISH que corresponden a roX2 en las mismas células fijadas que en la figura 5B. En la figura 5D se representa la señal de la imagen en vivo que permanece en las mismas células fijadas que en las figuras 5B a 5C.

En la figura 6, que comprende las figuras 6A a 6B, se representa una demostración de la detección de un sitio de transcripción de ARN endógeno con sondas introducidas en las células vivas. En concreto, se ha actuado selectivamente sobre el ARN del gen de MtnA. En la figura 6A se representan los puntos que corresponden a los sitios de transcripción de MtnA seleccionados con la sonda. En la figura 6B se representan los mismos transcritos de MtnA marcados con sondas para FISH en el ARN después de la fijación. La intensa colocalización demuestra que se están hibridado selectivamente los transcritos correctos.

En la figura 7 se representa la rápida degradación con el tiempo de los puntos de ARN intrónico en las células HeLa mediante la inhibición de la transcripción con actinomicina D. Prácticamente, todo el ARN intrónico desapareció o disminuyó enormemente su intensidad al cabo de de 30 minutos de exposición a la actinomicina D. El ARNm maduro se observó en todos los puntos de tiempo, lo que indica que las células todavía estaban vivas y que el tratamiento no afectó al propio ARN. Juntos, los resultados demuestran que el ARN intrónico se degrada rápidamente; así pues, la presencia de un punto de ARN intrónico indica que el gen deseado está activo desde el punto de vista transcripcional.

En la figura 8 se representa cómo la marcación del ARNm de la ciclina A2 permite la detección de las células en las fases S, G2 y M del ciclo celular. Se incubó Click-iT EdU en el interior de las células antes de la fijación para demostrar que las células con alta tasa de expresión estaban en la fase S-M, y se halló que cada célula que muestra la señal de Click-iT EdU tenía niveles altos del ARNm de ciclina A2. Este resultado muestra que el ARNm de la ciclina A2 proporciona un marcador fuerte para determinadas fases del ciclo celular. Las células con poca cantidad de ciclina A2 se seleccionaron para el estudio, ya que no se habían replicado.

Descripción detallada

La presente invención hace referencia a métodos in vitro para medir la estructura cromosómica y la expresión génica, tal y como está definido en las reivindicaciones adjuntas. También se describe un ensayo para determinar la organización espacial de la expresión génica en el núcleo. El ensayo se puede utilizar junto con entornos de trabajo computacional y analítico. En otra realización, el ensayo se puede utilizar para determinar la función que desempeña la organización espacial de la expresión génica en las enfermedades.

La presente invención también incluye un método in vitro basado en la hibridación in situ con fluorescencia (FISH, por su nombre en inglés) que produce a la vez información sobre la posición física y sobre la expresión de cada uno

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de los genes. Al iluminar un gran número de dianas en un cromosoma concreto mediante el uso de un esquema con código de colores, se puede determinar la estructura a gran escala de un cromosoma entero. En una realización, el método in vitro incluye la medición de la expresión de genes concretos o seleccionados, mientras que se determina a la vez la estructura del cromosoma, lo que proporciona una «matriz de expresión posicional in situ» a mesoescala. Los métodos in vitro de la presente invención también se pueden comparar con los modelos biofísicos para la estructura de un cromosoma, mientras que también se desarrollan herramientas analíticas para conocer la relación entre la estructura y la expresión génica. Los métodos también se pueden utilizar in vivo y de esta forma dar a conocer, para la detección de ambos, una descripción dinámica detallada de la estructura de un cromosoma junto con la expresión de muchos genes en las células vivas, en donde se pueden detectar en las células humanas vivas una gran cantidad de locus cromosómicos y someterlos al análisis al microscopio a cámara rápida. Así pues, la presente invención hace referencia a un método in vitro de FISH en el ARN con código de colores que está dirigido selectivamente a los locus de ADN del cromosoma, lo que produce simultáneamente y con eficacia datos sobre la estructura de un cromosoma y la expresión de muchos genes.

Definiciones

A menos que se defina de otra manera, todos los términos técnicos y científicos utilizados en la presente memoria tienen el mismo significado que entiende habitualmente el experto en la técnica a la que pertenece esta invención. Aunque cualquier método y material parecidos o equivalentes a los descritos en la presente memoria se puede utilizar para poner en práctica o para comprobar la presente invención, se describen los métodos y materiales preferidos.

Tal y como se emplea en esta memoria, cada uno de los siguientes términos tiene el significado asociado a él en este apartado.

Los artículos «un» y «una» se utilizan en la presente memoria para hacer referencia a uno o más de uno (a saber, a al menos uno) del objeto gramatical del artículo. A modo de ejemplo, «un elemento» significa un elemento o más de un elemento.

«Aproximadamente», tal y como se emplea en esta memoria cuando se hace referencia a un valor medible tal como una cantidad, una duración temporal, y similares, se entiende que abarca variaciones de ±20% o ±10%, más preferiblemente de ±5%, incluso más preferiblemente de ±1%, y aún más preferiblemente de ±0,1%, del valor especificado, ya que tales variaciones son adecuadas para realizar los métodos descritos.

«Codificar» y «que codifica» hacen referencia a la propiedad inherente de determinadas secuencias de nucleótidos en un polinucleótido, tal como un gen, un ADNc o un ARNm, que las hace servir como plantillas para la síntesis de otros polímeros y macromoléculas en los procesos biológicos que tienen una secuencia definida de nucleótidos (a saber, ARNr, ARNt y ARNm) o bien una secuencia definida de aminoácidos, y las propiedades biológicas que resultan de ellas. Así pues, un gen codifica una proteína si la transcripción y la traducción del ARNm que corresponde al gen produce la proteína en una célula u otro sistema biológico. Se puede hacer referencia tanto a la hebra codificante, cuya secuencia de nucleótidos es idéntica a la secuencia del ARNm y que normalmente se da a conocer en listas de secuencias, como a la hebra no codificante, utilizada como plantilla para la transcripción de un gen o ADNc, por codificar la proteína u otro producto del gen o el ADNc.

«Homólogo», tal y como se emplea en esta memoria, hace referencia a la similitud de secuencia de las subunidades entre dos moléculas poliméricas, p. ej., entre dos moléculas de ácido nucleico, p. ej., dos moléculas de ADN o dos moléculas de ARN, o entre dos moléculas de polipéptidos. Cuando una posición de la subunidad en las dos moléculas está ocupada por la misma subunidad monomérica, p. ej., si una posición en cada una de las dos moléculas de ADN está ocupada por adenina, entonces son homólogas en esa posición. La homología entre dos secuencias es una función directa del número de posiciones concordantes u homólogas, p. ej., si la mitad (p. ej., cinco posiciones en un polímero de diez subunidades de longitud) de las posiciones en dos secuencias del compuesto son homólogas, entonces las dos secuencias tienen una homología del 50%, si el 90% de las posiciones, p. ej., 9 de 10, concuerdan o son homólogas, las dos secuencias comparten una homología del 90%. A modo de ejemplo, las secuencias de ADN 3-ATTGCC-5' y 3-TATGGC-5' comparten una homología del 75%.

Tal y como se emplea en esta memoria, la terminología «gen» y «gen recombinante» hace referencia a las moléculas de ácido nucleico que comprenden un marco abierto de lectura que codifica un polipéptido de la invención. Tales variaciones alélicas naturales pueden dar lugar típicamente a una variación del 1 al 5% de la secuencia de nucleótidos de un gen dado. Los alelos alternativos se pueden identificar mediante la secuenciación del gen de interés en una serie de individuos diferentes. Esto se puede llevar a cabo con facilidad con sondas de hibridación para identificar el mismo locus genético en una serie de individuos. Se pretende que estén dentro del alcance de la invención cualquiera y todas las variaciones de nucleótidos y los polimorfismos o variaciones de aminoácido resultantes que son el resultado de una variación alélica natural y que no altera la actividad funcional.

Una «región codificante» de un gen consiste en los restos nucleotídicos de la hebra codificante del gen y los nucleótidos de la hebra no codificante del gen que son homólogos o complementarios, respectivamente, a la región codificante de una molécula de ARNm que se produce por la transcripción del gen.

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Una «región codificante» de una molécula de ARNm también consiste en los restos nucleotídicos de la molécula de ARNm que concuerdan con una región anticodón de una molécula de ARN de transferencia durante la traducción de la molécula de ARNm, o que codifica un codón de parada. Así pues, la región codificante podría incluir restos nucleotídicos que corresponden a los restos aminoacídicos que no están presentes en la proteína madura codificada por la molécula de ARNm (p. ej., restos aminoacídicos de una secuencia señal de exportación de proteínas).

«Codificar» y «que codifica» hacen referencia a la propiedad inherente de determinadas secuencias de nucleótidos en un polinucleótido, tal como un gen, un ADNc o un ARNm, que las hace servir como plantillas para la síntesis de otros polímeros y macromoléculas en procesos biológicos que tienen una secuencia definida de nucleótidos (a saber, ARNr, ARNt y ARNm) o una secuencia definida de aminoácidos, y las propiedades biológicas que resultan de ellas. Así pues, un gen codifica una proteína si la transcripción y la traducción del ARNm que corresponde al gen produce la proteína en una célula u otro sistema biológico. Se puede hacer referencia tanto a la hebra codificante, cuya secuencia de nucleótidos es idéntica a la secuencia del ARNm y que normalmente se da a conocer en las listas de secuencias, como a la hebra no codificante, utilizada como plantilla para la transcripción de un gen o ADNc, por codificar la proteína u otro producto del gen o del ADNc.

A menos que se especifique de otra manera, una «secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos» incluye todas las secuencias de nucleótidos que son versiones sinónimas de cada una de ellas y que codifican la misma secuencia de aminoácidos. Las secuencias de nucleótidos que codifican proteínas y ARN podrían incluir intrones.

Un «ácido nucleico aislado» hace referencia a un segmento o fragmento de ácido nucleico que ha sido separado de las secuencias que lo flanquean en el estado en que aparece de una forma natural, p. ej., un fragmento de ADN que se ha retirado de las secuencias que normalmente están adyacentes al fragmento, p. ej., las secuencias adyacentes al fragmento en un genoma en el que aparece de forma natural. La terminología también se aplica a los ácidos nucleicos, que se han purificado sustancialmente de otros componentes, que acompañan de manera natural al ácido nucleico, p. ej., ARN o ADN o proteínas, que los acompañan de forma natural en la célula. Por lo tanto, la terminología incluye, por ejemplo, un ADN recombinante que está incorporado en un vector, en un plásmido o virus que se replica de manera autónoma, o en el ADN genómico de un procariota o eucariota, o que existe como una molécula independiente (p. ej., como un ADNc o un fragmento genómico o de ADNc producido por PCR o por digestión con enzimas de restricción) independiente de otras secuencias. También incluye un ADN recombinante, que es parte de un gen híbrido que codifica una secuencia polipeptídica adicional.

Una «enfermedad» es un estado de salud de un animal, preferiblemente un mamífero, y más preferiblemente un humano, en el que el animal no puede mantener la homeostasia, y en donde si la enfermedad no mejora, entonces la salud del animal continúa deteriorándose.

En cambio, un «trastorno» en un animal es un estado de salud en el que el animal es capaz de mantener la homeostasia, pero en el que el estado de salud del animal es menos favorable de lo que lo sería en ausencia del trastorno. Si se deja sin tratar, un trastorno no necesariamente ocasiona un empeoramiento adicional del estado de salud del animal.

Una enfermedad o trastorno se «alivia» si se reduce la intensidad de un síntoma de la enfermedad o trastorno, la frecuencia con la que un paciente experimenta un síntoma, o ambas.

Una «cantidad eficaz» o una «cantidad terapéuticamente eficaz» de un compuesto es la cantidad de compuesto que es suficiente para proporcionar un efecto beneficioso al sujeto al cual se administra el compuesto. Una «cantidad eficaz» de un vehículo de administración es la cantidad suficiente para que se fije o administre con eficacia un compuesto.

Tal y como se emplea en esta memoria, el término «fragmento», tal y como se aplica a un ácido nucleico, hace referencia a una subsecuencia de un ácido nucleico más grande. Un «fragmento» de un ácido nucleico puede ser de al menos aproximadamente 15 nucleótidos de longitud; por ejemplo, de al menos aproximadamente 50 nucleótidos a aproximadamente 100 nucleótidos; de al menos aproximadamente 100 a aproximadamente 500 nucleótidos, de al menos aproximadamente 500 a aproximadamente 1000 nucleótidos, de al menos aproximadamente 1000 nucleótidos a aproximadamente 1500 nucleótidos; o de aproximadamente 1500 nucleótidos a aproximadamente 2500 nucleótidos; o de aproximadamente 2500 nucleótidos (y cualquier valor de entero entre ellos).

Tal y como se emplea en esta memoria, el término «fragmento», tal y como se aplica a una proteína o péptido, hace referencia a una subsecuencia de una proteína o péptido más grande. Un «fragmento» de una proteína o péptido puede ser de al menos aproximadamente 20 aminoácidos de longitud; por ejemplo, al menos aproximadamente 50 aminoácidos de longitud; al menos aproximadamente 100 aminoácidos de longitud, al menos aproximadamente 200 aminoácidos de longitud, al menos aproximadamente 300 aminoácidos de longitud y al menos aproximadamente 400 aminoácidos de longitud (y cualquier valor entero entre ellos).

Una «porción» de un polinucleótido significa al menos aproximadamente de quince a aproximadamente cincuenta restos nucleotídicos secuenciales del polinucleótido. Se entiende que una porción de un polinucleótido podría incluir todos los restos nucleotídicos del polinucleótido.

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Tal y como se emplea en esta memoria, un «material didáctico» incluye una publicación, un registro, un diagrama o cualquier otro medio de expresión que se pueda utilizar para comunicar la utilidad de un compuesto, composición, vector o sistema de administración de la invención en el kit para efectuar el alivio de las diferentes enfermedades o trastornos citados en la presente memoria. Facultativamente, o como alternativa, el material didáctico puede describir uno o varios métodos para aliviar las enfermedades o trastornos en una célula o tejido de un mamífero. El material didáctico del kit de la invención puede, por ejemplo, ir adjunto a un envase que contiene el compuesto identificado, composición, vector o sistema de administración de la invención, o se puede expedir junto con un envase que contiene el compuesto identificado, composición, vector o sistema de administración. Como alternativa, el material didáctico puede estar expedido por separado del envase con la intención de que el material didáctico y el compuesto se utilicen cooperativamente por el destinatario.

«Aislado» significa que está alterado o retirado del estado natural. Por ejemplo, un ácido nucleico o un péptido presente de forma natural en un animal vivo no está «aislado», pero el mismo ácido nucleico o péptido separado parcialmente o por completo de los materiales coexistentes de su estado natural está «aislado». Un ácido nucleico o proteína aislados pueden existir en forma sustancialmente purificada, o pueden existir en un entorno no nativo tal como, por ejemplo, una célula hospedadora.

«Que se produce de forma natural», tal y como se emplea en esta memoria, describe una composición que se puede hallar en la naturaleza como diferente de la que se produce de manera artificial. Por ejemplo, se produce de forma natural una secuencia de nucleótidos presente en un organismo, que se puede aislar de una fuente en la naturaleza y que no se ha modificado de manera intencionada por una persona en el laboratorio.

A menos que se especifique de otra manera, una «secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos» incluye todas las secuencias de nucleótidos que son versiones sinónimas de cada una ellas y que codifican la misma secuencia de aminoácidos. La frase secuencia de nucleótidos que codifica una proteína o un ARN podría también incluir intrones hasta el punto de que la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína podría en alguna versión contener uno o más intrones.

El término «polinucleótido», tal y como se emplea en esta memoria, se define como una cadena de nucleótidos. Además, los ácidos nucleicos son polímeros de nucleótidos. Así pues, los ácidos nucleicos y los polinucleótidos, tal y como se emplean en esta memoria, son intercambiables. El experto en la técnica tiene el conocimiento general de que los ácidos nucleicos son polinucleótidos, que se pueden hidrolizar en los «nucleótidos» monoméricos. Los nucleótidos monoméricos se pueden hidrolizar en nucleósidos. Tal y como se emplea en esta memoria, los polinucleótidos incluyen, pero sin limitarse a ellas, todas las secuencias de ácido nucleico que se obtienen por cualquiera de los medios disponibles en la técnica, que incluyen, sin limitación, medios recombinantes, a saber, la clonación de secuencias de ácido nucleico de una genoteca recombinante o un genoma celular, con el uso de la tecnología de clonación habitual y PCR™, y similares, y mediante medios sintéticos.

Tal y como se emplea en esta memoria, la terminología «péptido», «polipéptido» y «proteína» se utilizan indistintamente y hacen referencia a un compuesto que comprende restos aminoacídicos unidos covalentemente mediante enlaces peptídicos. Una proteína o péptido debe contener al menos dos aminoácidos y no se coloca ninguna limitación en el número máximo de aminoácidos que puede comprender una secuencia de proteína o de péptido. Los polipéptidos incluyen cualquier péptido o proteína que comprende dos o más aminoácidos unidos uno al otro mediante enlaces peptídicos. Tal y como se emplea en esta memoria, la terminología hace referencia a ambas cadenas cortas, que también se suelen denominar en la técnica péptidos, oligopéptidos y oligómeros, por ejemplo, y a cadenas más largas, que por lo general se denominan en la técnica proteínas, de las que hay muchos tipos. «Polipéptidos» incluye, por ejemplo, fragmentos biológicamente activos, polipéptidos sustancialmente homólogos, oligopéptidos, homodímeros, heterodímeros, variantes de polipéptidos, polipéptidos modificados, derivados, análogos, proteínas de fusión, entre otros. Los polipéptidos incluyen péptidos naturales, péptidos recombinantes, péptidos sintéticos, o una combinación de los mismos.

La terminología «paciente», «sujeto», «individuo», y similares, se utiliza indistintamente en la presente memoria y hace referencia a cualquier animal o células del mismo, tanto in vitro como in situ, que se prestan a los métodos descritos en la presente memoria. Preferiblemente, el paciente, sujeto o individuo es un mamífero y más preferiblemente un humano.

La terminología «tratamiento», tal y como se utiliza dentro del contexto de la presente invención, pretende incluir el tratamiento terapéutico, así como las medidas profilácticas o supresoras para la enfermedad o el trastorno. Así pues, por ejemplo, el término tratamiento incluye la administración de un agente antes o después del comienzo de una enfermedad o trastorno, y gracias a ello se previene o se retiran todos los signos de la enfermedad o trastorno. Como otro ejemplo, la administración del agente después de la manifestación clínica de la enfermedad para combatir los síntomas de la enfermedad comprende el «tratamiento» de la enfermedad.

Un tratamiento «terapéutico» es un tratamiento que se administra a un sujeto que presenta signos de enfermedad, con el propósito de disminuir o eliminar los signos.

Tal y como se emplea en esta memoria, «tratar una enfermedad o trastorno» significa la reducción de la frecuencia

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con la que un paciente experimenta un síntoma de la enfermedad o trastorno. Enfermedad y trastorno se utilizan indistintamente en la presente memoria.

«Variante», como terminología que se emplea en esta memoria, es una secuencia de ácido nucleico o secuencia peptídica cuya secuencia difiere de una secuencia de referencia de ácido nucleico o una secuencia peptídica de referencia, respectivamente, pero que conserva las propiedades esenciales de la molécula de referencia. Los cambios en la secuencia de una variante de ácido nucleico podrían no alterar la secuencia de aminoácidos de un péptido codificado por el ácido nucleico de referencia, o podría dar lugar a sustituciones, adiciones, deleciones, fusiones y truncamientos de aminoácidos. Los cambios en la secuencia de las variantes peptídicas típicamente son escasos o conservativos, de manera que la secuencia del péptido de referencia y de la variante son muy similares de manera global y, en muchas regiones, idénticas. Un péptido variante y de referencia pueden diferir en la secuencia de aminoácidos por una o varias sustituciones, adiciones, deleciones en cualquier combinación. Una variante de un ácido nucleico o péptido puede ser uno que aparece en la naturaleza, tal como una variante alélica, o puede ser una variante que no se sabe si aparece en la naturaleza. Las variantes de ácidos nucleicos y péptidos que no aparecen de forma natural se podrían fabricar mediante técnicas de mutagénesis o por síntesis directa.

Para la comparación de secuencias, típicamente una secuencia actúa como secuencia de referencia, con la que se podrían comparar las secuencias problema. Cuando se utiliza un algoritmo de comparación de secuencias, las secuencias problema y de referencia se introducen en un ordenador, posteriormente se les designan las coordenadas, si es necesario, y se designan los parámetros del programa con el algoritmo para las secuencias. A continuación, el algoritmo de comparación de secuencias calcula el porcentaje de identidad de secuencia para la secuencia o secuencias problema con respecto a la secuencia de referencia, basándose en los parámetros designados para el programa.

Márgenes: a lo largo de esta descripción, se pueden presentar diferentes aspectos de la invención en formato de márgenes. Se debe saber que la descripción en formato de márgenes es simplemente por comodidad y brevedad, y no se debe considerar como una limitación inflexible del alcance de la invención. De acuerdo con esto, la descripción de un intervalo se debe considerar que tiene todos los subintervalos posibles descritos específicamente, así como cada uno de los valores numéricos dentro del intervalo. Por ejemplo, la descripción de un intervalo, tal como de 1 a 6, se debe considerar que tiene los subintervalos descritos específicamente, tales como de 1 a 3, de 1 a 4, de 1 a 5, de 2 a 4, de 2 a 6, de 3 a 6 etc., así como cada uno de los números contenidos en ese intervalo, por ejemplo, 1, 2, 2,7, 3, 4, 5, 5,3 y 6. Esto se aplica independientemente de la amplitud del intervalo.

Descripción

Los métodos in vitro de la presente invención permiten iluminar directamente la estructura y la función del núcleo de una célula viva en directo mediante el uso de herramientas basadas en la fluorescencia, y utilizar después estas herramientas para construir un modelo cuantitativo y exhaustivo de la relación entre estructura y función. Las aplicaciones para la presente invención son muchas y pueden dar a conocer un mayor conocimiento de la enfermedad y del diagnóstico clínico.

La presente invención combina la riqueza de datos de imagen de una única molécula, lo que da unos datos con una calidad muy alta sobre la abundancia, localizaciones y dinámica de las biomoléculas, con la capacidad de generar más panoramas biológicos globales al medir la expresión y las posiciones de numerosos genes, lo que incluye decenas e incluso centenas de genes al mismo tiempo, mientras que también se realizan perturbaciones sistemáticas a escala genómica. Además, la generación y el análisis de la información espacial intracelular representa una nueva dirección de la biología de sistemas, dado que la inmensa mayoría de los estudios hasta la fecha se concentran principalmente en la abundancia global del ARNm o de la proteína. Mediante los métodos in vitro de la presente invención, se pueden generar los mapas espaciales de la estructura cromosómica y se puede crear un nuevo paradigma en el conocimiento de la importancia biológica de la organización espacial.

En el caso de los experimentos in situ descritos en la presente memoria, la presente invención deja el sistema sin perturbaciones en el sentido de que no se requieren modificaciones genéticas. Esto permite el cambio y la amplia adopción en una serie de contextos y, en concreto, puede mejorar el potencial de uso de los métodos in vitro de la presente invención en el diagnóstico clínico.

Medición de la expresión génica y determinación de la estructura cromosómica

La presente invención incluye los métodos in vitro para determinar la organización espacial de la expresión génica en el núcleo. El control espacial de la estructura cromosómica es una peculiaridad reguladora crítica para el control de la expresión génica, ya que puede influir de manera variable en la expresión génica de una célula a otra. El control espacial de la estructura cromosómica puede incluso dar a conocer una base estructural para la coordinación de los módulos de redes de genes dentro del núcleo. La presente invención, en combinación con marcos de trabajo computacionales y analíticos, puede dar a conocer también una nueva base para incorporar la información espacial en el conocimiento de la regulación y de la organización de la información genética, y puede expandir enormemente el conocimiento de la función que la organización espacial de la expresión génica realiza en la enfermedad y en el diagnóstico clínico.

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La presente invención utiliza la visualización directa, mediciones cuantitativas y el modelado analítico y computacional para elucidar la función biológica. En una realización, la presente invención incluye un método in vitro basado en la hibridación in situ con fluorescencia (FISH) que produce al mismo tiempo información sobre la posición física así como sobre la expresión de cada uno de los genes.

Por ejemplo, al iluminar al mismo tiempo un gran número de estas dianas en un cromosoma concreto mediante el uso de un esquema con código de colores, se puede extraer con eficacia la estructura a gran escala de un cromosoma entero al mismo tiempo que también se mide la expresión de dichos genes, lo que da a conocer una «matriz de expresión posicional in situ» a mesoescala (figura 1A). En una realización, el número de dianas puede estar en el intervalo de aproximadamente 1 a 1000 dianas únicas. En otra realización, el número de dianas puede estar en el intervalo de aproximadamente 5 a 200 dianas únicas. Aún en otra realización, el número de dianas puede estar en el intervalo de aproximadamente 10 a 100 dianas únicas. Como alternativa, el número de dianas puede ser de más de 1.000, de más de 5.000 o incluso de más de 10.000.

En una realización, estas regiones diana corresponden a la localización de un gen en un cromosoma concreto. El método in vitro de la presente invención permite la marcación simultánea de muchos genes y muchas localizaciones génicas al mismo tiempo, «pintando» con eficacia los cromosomas diana. En una realización, el número de genes que se puede marcar simultáneamente podría estar entre 1 y 100. En otra realización, el número de genes marcados puede estar entre 5 y 50. Aún en otra realización, el número de genes marcados puede estar entre 10 y 30. Por ejemplo, el sitio de transcripción de 20 genes únicos a lo largo de un único cromosoma en una única célula se puede detectar con sondas codificadas con colores, tal y como está descrito en otra parte de la presente memoria (figuras 1 y 4). En otra realización, estos datos sobre los puntos para 20 genes se pueden utilizar para reconstruir la conformación cromosómica de los genes que se transcriben activamente (figura 4). La presente invención da a conocer una tasa de identificación de puntos falsos por debajo del 10%, preferiblemente por debajo del 5%, e incluso más preferiblemente por debajo del 4%, por debajo del 3%, por debajo del 2%, e incluso por debajo del 1%.

La presente invención incluye los métodos in vitro para medir la expresión génica. La presencia o ausencia de un punto para un gen concreto indica si el gen se transcribe activamente en un momento concreto de tiempo. No todos los genes se expresan en cada célula porque la transcripción es en sí misma un proceso pulsátil. En una realización, la tasa global de la transcripción de un gen concreto se puede determinar mediante la cuantificación de tanto (o solo una) la frecuencia con la que se observa un punto sobre un conjunto de células, o la intensidad de los puntos observados. De principio a fin de la segregación espacial del cromosoma, la localización de cada punto y, por lo tanto, de cada gen o porción del mismo, se puede asignar a un cromosoma concreto. Con la repetición de este procedimiento para un gran número de células, la frecuencia de transcripción y la expresión génica (que es proporcional a la tasa de transcripción) se pueden determinar para cada cromosoma. Así pues, la presente invención da a conocer un mecanismo para medir la expresión génica de determinados cromosomas.

En otra realización, la expresión génica se puede medir para un fragmento cromosómico. Aún en otra realización, la expresión génica se puede medir para un fragmento cromosómico de resultas de la translocación de cromosomas. Por ejemplo, un fragmento cromosómico translocado se puede comparar con la copia intacta de cromosoma para determinar si la expresión génica del fragmento cromosómico es la misma o es diferente.

La presente invención también incluye los métodos in vitro para perfilar la expresión génica para cada cromosoma. Esto permite el análisis de los niveles de expresión específicos de la copia del cromosoma y, así pues, un método para el análisis de la expresión de los SNP (polimorfismos mononucleotídicos) en una única célula, lo que hasta la fecha ha sido muy difícil de conseguir. Por ejemplo, en las células normales, la diferencia entre las copias materna y paterna de un cromosoma se determina por los genes sellados. Se ha demostrado que estos genes, de los cuales los científicos solo han aislado un número pequeño, solo se transcriben de la copia materna o bien de la copia paterna, pero nunca de ambas. Tales genes se pueden utilizar como marcadores para determinar qué copia de un cromosoma concreto de interés es la copia materna y cuál es la copia paterna. En una realización, la expresión génica se puede medir en los genes sellados. Por ejemplo, al utilizar los genes sellados como marcadores, se puede determinar qué copia de un cromosoma concreto de interés es la copia materna y cuál es la copia paterna.

Los métodos in vitro de la presente invención también se pueden comparar con los modelos biofísicos de la estructura de un cromosoma, mientras que también se desarrollan herramientas analíticas para conocer la relación entre la estructura y la expresión génica. Tal y como se demuestra en la presente memoria, los cromosomas pueden adoptar una amplia gama de configuraciones, y estas configuraciones están relacionadas con la expresión génica (figura 1B). Para indagar los mecanismos moleculares que subyacen en los patrones observados, se puede utilizar una plataforma de cribado por RNAi para buscar proteínas que alteran aspectos espaciales de la expresión génica, lo que establece un nuevo nivel de sofisticación en el uso de imágenes en el cribado a gran escala.

Los datos generados por los métodos in vitro de la presente invención pueden además conectarse con el análisis cuantitativo. Por ejemplo, se pueden utilizar programas informáticos de análisis de imágenes para facilitar la extracción exacta tano del valor de la posición como del valor de la expresión a partir de los datos del microscopio. Una vez procesados, un nivel de análisis es simplemente analizar la configuración espacial de los genes que se expresan activamente en un cromosoma. Los modelos existentes se centran principalmente en modelos poliméricos de la estructura de los cromosomas, que consisten en un paseo al azar, bucle al azar y descripciones de glóbulos

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(Lieberman-Aiden et al., 2009, Science 326: 289-293; Cook et al., 2009, J Cell Biol 186: 825-834). Mientras que los datos generados por la presente invención informarán con certeza de tales modelos, la capacidad para generar y correlacionar los datos posicionales con los datos de expresión génica puede añadir una nueva dimensión importante a tales modelos, que por lo general no incorporan información sobre el estado transcripcional. Así pues, la presente invención da a conocer una plataforma y un método in vitro para probar hipótesis sobre las desviaciones de modelos nulos en los que la expresión no se correlaciona con la estructura, a saber, si determinados genes se expresan solo cuando el cromosoma adopta determinadas conformaciones.

Aplicaciones a células vivas y a enfermedades

La presente invención se puede utilizar también en las células vivas. A lo largo del desarrollo y la aplicación de las nuevas técnicas de detección de ácidos nucleicos in vivo, se pueden detectar grandes cantidades de locus cromosómicos en las células humanas vivas y someterlas al análisis a cámara rápida al microscopio. Así pues, la presente invención da a conocer tanto la detección de una descripción dinámica detallada de la estructura de un cromosoma como la expresión de muchos genes en las células vivas, lo que marca un gran avance en el campo. La presente invención también puede tener un amplio impacto en otros campos, de igual forma. Por ejemplo, la visualización directa de la estructura nuclear y la expresión génica puede incluir aplicaciones en sistemas de desarrollo, tales como C. elegans. También se describen métodos para tomar imágenes en vivo de las células. Por ejemplo, en las células vivas se puede introducir una sonda para la toma de imágenes en vivo, y las señales de la sonda se pueden detectar a continuación con los métodos descritos en la presente memoria. En una realización, la sonda para la toma de imágenes en vivo contiene aproximadamente de 1 a 100 oligonucleótidos marcados. En otra realización, la sonda contiene aproximadamente de 4 a 50 oligonucleótidos marcados. A continuación, las señales se pueden verificar por métodos de FISH en el ARN tal y como está descrito en la presente memoria. Los ejemplos no limitantes de la aplicación de los métodos de toma de imágenes en vivo incluyen la detección de ARN endógeno en una única célula viva o la determinación de la estructura cromosómica. Tal y como se contempla en la presente memoria, las aplicaciones de la presente invención a las enfermedades humanas incluyen la capacidad de identificar la formación de translocaciones cromosómicas estereotípicas en el cáncer. Dada la aparición generalizada de fusiones de genes en el cáncer y la capacidad de dirigir los métodos in vitro de la presente invención, se puede tener un conocimiento mucho más profundo de los mecanismos por los que se producen las translocaciones. Dado que la presente invención no introduce perturbaciones, también quiere decir que estos métodos in vitro también se pueden aplicar a los cortes de tejidos, lo que es posible que dé lugar a mejores herramientas de diagnóstico molecular gracias a la evaluación detallada de las translocaciones en los tumores. Más en general, se pueden elucidar las maneras en las que las translocaciones afectan a la expresión génica, y establecer la relación de estructura/función como un biomarcador para la enfermedad.

Por ejemplo, la presente invención se puede aplicar a muestras de tejido congeladas y a las incluidas en parafina, lo que representa un paso crucial hacia la viabilidad clínica. Al estudiar la dinámica de la propia translocación junto con las diferencias inducidas en la expresión génica a nivel de una única molécula, se puede determinar la génesis de las translocaciones específicas y cómo influyen en la expresión de los transcritos de fusión relevantes. La presente invención también se podría utilizar como diagnóstico clínico y nuevos ensayos para cribar compuestos, o junto a todos ellos. Así pues, la presente invención da a conocer un mejor conocimiento de cómo afecta la estructura del núcleo a la expresión génica mediante la visualización directa de los procesos nucleares en las células fijadas y vivas.

Método de FISH en el ARN

La presente invención incluye el uso de un método de FISH en el ARN específico y muy sensible para marcar los intrones de los genes, tal y como se muestra en la figura 1A. Se puede encontrar otra descripción y explicación de las metodologías de FISH en el ARN en la publicación de solicitud de patente en tramitación con la presente número WO/2010/030818.

Los intrones se degradan típicamente poco después de haber sido transcritos, antes de que tengan la oportunidad de alejarse del propio sitio de transcripción. Cuando se iluminan selectivamente con el método in vitro de FISH en el ARN de la presente invención, se puede observar un punto en el microscopio que ofrece dos tipos de información. Primero, el brillo del punto, o su presencia o su ausencia, está relacionado con la tasa instantánea de transcripción, y la localización del punto da la posición del gen, con exactitud a longitudes por debajo del límite de difracción del microscopio. Este método in vitro implica además el diseño de sondas para marcar simultáneamente docenas e incluso cientos de intrones espaciados a lo largo de un solo cromosoma, con lo que se crea un «cuadro puntillista» y tridimensional del cromosoma, en el que cada uno de los puntos corresponde a un único gen.

Por ejemplo, aproximadamente de 1 a 1000 sondas diferentes, cada una marcada con un fluoróforo igual o diferente, se hibridan simultáneamente a una secuencia diana de una molécula nucleotídica, tal como una molécula de ARN. En determinadas realizaciones, el número de sondas puede oscilar de 4 a 100, de 10 a 80, de 15 a 70 o de 20 a 60. Se crea un punto fluorescente que se puede detectar a partir de la fluorescencia combinada de numerosas sondas. Las sondas pueden carecer de solapamiento, lo que significa que la región de la secuencia diana con la cual se hibrida cada sonda es única (o al menos no están solapadas). Las sondas en un conjunto de 2 o más para una secuencia diana seleccionada se pueden diseñar para que se hibriden adyacentemente la una a la otra, o para que

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se hibriden de forma no adyacente, con tramos de la secuencia diana, desde un nucleótido a cien nucleótidos o más, que no son complementarios a ninguna de las sondas.

De acuerdo con esto, la presente invención da a conocer un método in vitro para explorar una secuencia diana de moléculas del ácido nucleico, tales como, por ejemplo, ARN en una célula permeabilizada y fijada, o una célula viva, en donde dicha secuencia diana incluye al menos 2 regiones sin solapamiento de fijación a las sondas de 15 a 100 nucleótidos. El método in vitro puede incluir las etapas de inmersión de la célula en un exceso de al menos 30 sondas de hibridación de ácido nucleico, cada una únicamente marcada con una marcación fluorescente y cada una con una secuencia de ácido nucleico que es complementaria a una región de fijación a una sonda diferente de la secuencia diana, se lava la célula para retirar las sondas sin fijar, y se detecta la fluorescencia de las sondas.

Las sondas útiles en esta invención podrían ser de ADN, de ARN o mezclas de ADN y ARN. Podrían incluir nucleótidos no naturales y podrían incluir enlaces internucleotídicos que no son naturales. Los nucleótidos no naturales que incrementan la afinidad de fijación de las sondas incluyen 2-O-metil-ribonucleótidos, por ejemplo. La longitud de las sondas útiles en esta invención puede ser aproximadamente de 15 a 40 nucleótidos para las sondas de ADN o ARN típicas de afinidad de fijación media. La longitud preferida de las sondas de ADN y de las sondas de ARN está en el intervalo de aproximadamente 15 a 20 nucleótidos, más preferiblemente de 17 a 25 nucleótidos e incluso más preferiblemente de 17 a 22 nucleótidos. En determinadas realizaciones, las sondas tienen aproximadamente 20 nucleótidos de largo. Si se incluyen los medios para incrementar la afinidad de fijación de una sonda, la sonda puede ser más corta, de tan solo siete nucleótidos, como apreciarán los expertos en la técnica. Se puede unir un fluoróforo a una sonda en cualquier posición, que incluye, sin limitación, la unión de un fluoróforo a un extremo de una sonda, preferiblemente al extremo en 3'. Las sondas se podrían incluir en una solución de hibridación que contiene las numerosas sondas en exceso, habitualmente en el intervalo de 0,2 a 1 nanogramos por microlitro. Se añade suficiente solución para cubrir y mojar la célula de tal manera que la célula quede sumergida en la solución que contiene la sonda. En otra realización, los fluoróforos se pueden incorporar en las sondas durante la síntesis automática del ADN.

En una única célula se pueden explorada de manera simultánea muchas secuencias diana de ARN, o bien más de una secuencia diana de una molécula de ARN, o una o varias secuencias de moléculas de ARN diferentes. Aún más, una secuencia diana de una molécula de ARN se puede explorar con más de un conjunto de sondas, en donde cada conjunto está marcado con un fluoróforo diferente, y los fluoróforos son diferenciables. Por ejemplo, al explorar con sondas una secuencia génica, al menos 2 sondas marcadas con verde se pueden utilizar para explorar una porción de la secuencia génica a modo de secuencia diana, y al menos 2 sondas marcadas con rojo se pueden utilizar para explorar una porción diferente de la secuencia génica a modo de secuencia diana. La utilización de más de un color para cada una de las diferentes sondas permite utilizar esquemas de códigos de colores en los métodos in vitro con sondas muy multiplexadas, de acuerdo con la presente invención.

Los métodos in vitro de la presente invención también podrían incluir la determinación de si están presentes uno o varios puntos que representan una secuencia diana. Los métodos in vitro de acuerdo con la presente invención también incluyen el recuento de puntos de un color dado que corresponde a una especie de ARN dada. Cuando se desea detectar más de una especie de ARN, se pueden utilizar diferentes conjuntos de sondas marcadas con diferentes fluoróforos en la misma mezcla de hibridación. Se construye un perfil de expresión génica para cada especie de ARN mediante el recuento de los puntos de diferentes colores.

Los puntos se pueden detectar con la utilización de métodos al microscopio. No es necesario utilizar un microscopio confocal, ya que es suficiente un microscopio de fluorescencia de campo amplio. Para diferenciar entre los puntos que reflejan positivamente una secuencia diana y los puntos oscuros que podrían reflejar la fluorescencia de fondo o una fijación inespecífica, los métodos in vitro de acuerdo con esta invención incluyen la detección. En una realización, la detección comprende la filtración de las imágenes con un filtro lapaciano de gausiano lineal y tridimensional, y aplicar un umbral de detección. Si se representa el número de puntos en tres dimensiones para todos los umbrales que oscilan de cero a la intensidad máxima de píxeles de la imagen filtrada, hay una meseta amplia, indicativa de una región en la que el número de puntos detectados es insensible al umbral. Así pues, el método comprende además la representación del número de puntos, la determinación de las fronteras de una región meseta, y la selección del umbral preferiblemente dentro de dicha región. Se describen también conjuntos de sondas para la hibridación in situ que permiten la detección de cada una de las moléculas de los ARN en las células. Las sondas hacen que cada molécula emita fluorescencia con tanta intensidad que se puede observar como un punto fluorescente delgado en la microcopia de fluorescencia. Se puede utilizar un programa informático para identificar y contar todas las moléculas de ARN en la célula a partir de la imagen al microscopio. Las hibridaciones in situ realizadas con los conjuntos de sondas descritas más arriba permiten el análisis estructural cromosómico preciso y simple, el análisis de la expresión génica, la detección de patógenos y estados patogénicos, tales como el cáncer. Se describe también un medio legible por ordenador, que incluye instrucciones para obtener una pila tridimensional de imágenes fluorescentes bidimensionales, filtrar la pila tridimensional con un filtro tridimensional, contar un número total de puntos tridimensionales en la pila tridimensional filtrada para cada uno de los muchos umbrales de intensidad, obtener un umbral de intensidad óptimo representativo de una región meseta en un gráfico del número total de puntos tridimensionales frente al umbral de intensidad en el que se contó el número total, y utilizar el número total de puntos tridimensionales obtenidos con el umbral óptimo como representativo de las numerosas partículas fluorescentes detectadas en la pila tridimensional. Se describe también un programa informático para implementar el

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algoritmo de detección de umbral, tal y como está descrito más arriba. En una realización, la determinación del umbral se consigue con el filtro laplaciano de gausiano lineal y tridimensional. Se describe también un kit, que comprende en líneas generales un conjunto de sondas, un manual de instrucciones para realizar cualquiera de los métodos contemplados en la presente memoria y, opcionalmente, el medio legible por ordenador tal y como está descrito en la presente memoria.

Código de colores cromosómico

En otro aspecto de la presente invención, la FISH multicolores se puede utilizar para diferenciar la expresión de cada uno de los genes en el conjunto mediante el uso de un esquema de código de colores, tal y como está descrito en la figura 1A. Esto da a conocer la capacidad de discriminar tres colores fluorescentes al microscopio, lo que además da a conocer la capacidad de diferenciar hasta 5 colores de ARN al mismo tiempo. En otras realizaciones, la paleta de colores se puede expandir mediante el uso de combinaciones de 5 colores básicos para producir hasta 31 colores reales. Se debe apreciar que la presente invención no está limitada a ningún número concreto de colores y, por lo tanto, los métodos in vitro de la presente invención pueden utilizar cualquier tipo y número de colores diferenciables que esté disponible, bien como colores diferentes o bien mediante la combinación de colores. Aún más, el uso de FISH multicolores permite incrementar el número de genes que se desea identificar inequívocamente mediante un esquema de código de colores para marcar los cromosomas. Por ejemplo, al marcar cada punto con una secuencia no repetitiva de colores (p. ej., RRGRRBBG...) y utilizar la proximidad espacial de los puntos a modo de guía, el código permite «conectar los puntos» dentro del núcleo e identificar inequívocamente tanto la localización como el nivel de expresión de cada uno de los genes. En otras realizaciones, el código se puede construir de tal manera que tolere los «agujeros» en el código debido a la expresión variable de los genes diana. Este método in vitro puede dar a conocer patrones de expresión para cientos de genes, lo que constituye una forma de «micromatriz in situ». En otras realizaciones, se pueden colorear grupos de genes organizados por la localización o bien por la función, según el problema biológico que se estudie.

Uso el cribado por RNAi para determinar las bases moleculares de la estructura nuclear

Los métodos in vitro de la presente invención dan a conocer un ensayo compacto para medir la estructura cromosómica y la expresión génica. Para obtener una perspectiva de conjunto de los mecanismos moleculares subyacentes, cada gen se puede alterar sistemáticamente y se pueden medir sus efectos mediante la construcción de una plataforma de RNAi para analizar los datos de FISH de alta resolución. Tal plataforma permite crear un cuadro global de las proteínas específicas responsables de los patrones estructurales observados en los datos de FISH que son el resultado de los métodos in vitro de la presente invención.

El éxito final de un cribado por RNAi basado en imágenes depende de que se tenga un ensayo reproducible y sencillo, y de que se tengan los medios para analizar rápidamente el raudal de datos que la plataforma genera. El propio ensayo puede ser una versión del ensayo por FISH descrito en la presente memoria, aunque simplificado de tal manera que aumente al máximo la información, al mismo tiempo que se aumenta al máximo la robustez del ensayo y se disminuye al mínimo la complejidad del análisis. Por ejemplo, en una realización, un ensayo inicial podría incluir unas pocas regiones diferentes de un cromosoma marcado con diferentes colores, lo que proporciona datos que son relativamente simples de analizar, además de informativos. La propia adquisición de datos puede incluir una plataforma de microscopia automatizada capaz de cumplir los requisitos de los métodos de alta resolución, tales como la FISH. Con este fin, se puede demostrar en un formato de placa de 384 pocillos la capacidad que tiene el método de la FISH en el aRn para detectar diferencias espaciales sutiles de la expresión génica por FISH. En otra realización, se puede incluir una plataforma computacional que es capaz de almacenar y analizar las grandes cantidades de datos que genera un cribado con RNAi.

Aunque la presente invención hace referencia de forma general a ensayos de la estructura de un cromosoma, también se puede incluir una plataforma de alto rendimiento para cribado acoplada a la microscopia de una única molécula. Las aplicaciones de esto podrían incluir el estudio de ARN no codificantes, que se cree que modifican la cromatina y, así pues, afectan a la estructura cromosómica. En una realización, la presente invención incluye un ensayo para medir la expresión de los ARN no codificantes (ncRNA, por su nombre en inglés) al mismo tiempo que la estructura cromosómica, y a continuación el cribado de las proteínas implicadas en la respuesta.

Ejemplos experimentales

La invención se describe ahora con referencia a los ejemplos que vienen a continuación. Estos ejemplos se dan a conocer solo con propósitos ilustrativos y la invención no debe de ninguna manera considerarse limitada por estos ejemplos, sino que más bien se debe considerar que abarca cualquiera y todas las variaciones que se harán evidentes como resultado de las enseñanzas dadas a conocer en la presente memoria.

Los métodos siguientes se utilizaron para llevar a cabo los ejemplos experimentales:

Cultivo celular, fijación e hibridación in situ fluorescente

Los fibroblastos de prepucio humano primario (ATCC CRL 2097) o las células HeLa (donación del laboratorio de Phillip Sharp) se hicieron crecer en el medio de Eagle modificado de Dulbecco con glutamax (DMEM, Life

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Technologies) complementando con penicilina/estreptomicina y suero bovino fetal al 10%. Se enriqueció el cultivo con células en la fase G0/G1 mediante el procedimiento de bloqueo doble con timidina (timidina a 2 pg/ml en el medio) y se liberaron durante una cantidad de tiempo adecuada antes de la fijación. Para fijar las células, se siguió el protocolo de Raj et al. (Nat. Meth. 2008, 5, 877-879). Brevemente, se fijaron las células con formaldehído al 4%/formol al 10% en la solución salina tamponada con fosfato a 1* (PBS), luego se le dieron dos enjuagues en PBS a 1*, tras lo cual las células se permeabilizaron con EtOH al 70% y se conservaron a 4 °C al menos durante una noche.

Para realizar la hibridación in situ fluorescente (FISH), se siguió el procedimiento de Raj et al. (Nat. Meth. 2008, 5, 877-879) con algunas modificaciones menores. Se realizó el prelavado con un tampón de lavado que contenía formamida al 10% y citrato de sodio-solución salina a 2* (SSC), después se realizó la hibridación con la adición de la cantidad y el tipo de sonda (descrita después) adecuada en un tampón que contiene formamida al 10%, SSC a 2* y sulfato de dextrano al 10% (p/v). Se hibridaron las muestras durante una noche en una cámara humidificada mantenida a 37 °C, luego se lavó dos veces durante 30 minutos con el tampón de lavado a 37 °C (y se añade DAPI a una concentración de 50 ng/ml en el segundo lavado), y a continuación se tomaron imágenes en SSC a 2*, tal y como está descrito más adelante.

En el caso de los experimentos con actinomicina D, se incubaron las células HeLa en 2 pg/ml de actinomicina D (Sigma) durante 0, 30, 60 y 120 minutos, tras lo cual se fijaron las células y se realizó la FISH tal y como está descrito en la figura 7. La actinomicina D se mezcló exhaustivamente en el medio antes de añadirla para evitar la heterogeneidad espacial en la actividad del fármaco.

Para los experimentos con ARNasa, las células se fijaron y se permeabilizaron tal y como está descrito en líneas generales más arriba, tras lo cual se aspiró el EtOH al 70%, se lavó una vez con PBS a 1 *, seguido de la adición de PBS a 1* con 10 pg/ml de ARNasa A (Sigma). Las células fijadas se incubaron a 37 °C durante 30 minutos, se lavaron con PBS a 1* y a continuación se realizó la FISH como está descrito en líneas generales más arriba. Como control, se realizó exactamente el mismo procedimiento con las células en el pocillo vecino, pero no se le añadió la ARNasa A al PBS a 1 * para la incubación.

Toma de imágenes y análisis de imagen

Se tomaron imágenes de todas las muestras en un microscopio invertido de fluorescencia Ti-E de Nikon con un objetivo Plan-Apo de 100* y una cámara CCD refrigerada (Pixis 1024B de Princeton Instruments). Se adquirieron secuencialmente pilas tridimensionales de imágenes fluorescentes en 6 canales fluorescentes diferentes con conjuntos de filtros para DAPI, Atto 488, Cy3, Alexa 594, Atto 647N y Atto 700. El tiempo de exposición osciló entre 2 y 3 s para la mayoría de los fluoróforos, excepto para el DAPI (que se expuso ~ 100 ms) y para el Atto 700 (que se expuso ~ 5 s, debido a que la iluminación era algo más débil en el aparato). El espaciado entre los planos consecutivos de las pilas fue de 0,3 pm.

Una vez que se adquirieron, las imágenes, se introdujeron en un flujo lineal de análisis de imagen hecho con un programa informático personalizado de reconocimiento semiautomático de puntos que está escrito en MATLAB con las siguientes series de etapas:

1) Los puntos candidato se identificaron primero en una imagen tridimensional al filtrar la imagen con un filtro laplaciano de gausiano, y se tomaron como candidatos los 300 primeros puntos. En algunos casos, se eligieron las células para el análisis basándose en su fase del ciclo celular. En esos casos, se eligieron las células que tenían pocos o ningún ARNm de ciclina A2. Este método ha sido validado por otros experimentos (figura 8). 2) A continuación, cada candidato se ajustó a un perfil de intensidad gausiano, con lo que se obtuvieron estimaciones precisas del centro, de la anchura y de la intensidad del punto. 3) Basándose en los histogramas de intensidades y anchuras, se seleccionaron a mano un subconjunto de puntos con cualidades (anchura uniforme, intensidad más alta) que eran más elevadas que las del fondo. Esto sigue el mismo espíritu que el procedimiento descrito en Raj et al. (Nat. Meth. 2008, 5, 877-879), en el que se eligió un umbral para separar los puntos de ARN legítimos de los puntos de ruido de fondo. En este caso, los puntos que podrían haber sido de ruido de fondo se incluyeron porque el esquema de multicolores para la asignación de puntos proporcionó otros medios con los que descartar los puntos de ruido de fondo. 4) Una vez que se seleccionaron los puntos, se ejecutó el programa informático que hallaba los marcadores fiables (en este caso, las sondas en los 5 colores del ARN que se hibridad selectivamente con el ARNm de SuZ12). De esta manera, se pudieron medir por separado cada uno de los desplazamientos entre los diferentes canales de fluorescencia en cada célula. A continuación, estos desplazamientos se aplicaron para alinear los puntos identificados por medios informáticos entre los diferentes canales de fluorescencia. 5) Tras el alineamiento, se ejecutó el programa informático que buscaba los puntos colocalizados que corresponden al esquema de seudocoloreado concreto elegido para los intrones deseados. Se estimó que el programa informático tiene una exactitud que ronda el 75% a la hora de asignar puntos colocalizados a genes concretos en esta etapa. 6) Se realizó un proceso de corrección manual en el que se corrigieron los errores que el programa informático hacía a la hora de identificar los puntos. Los problemas habituales incluían la incapacidad de detectar señales tenues (pero claramente presentes) en uno de los canales de fluorescencia, y la resolución de dos puntos fluorescentes cercanos en el espacio que el filtro laplaciano de gausiano y las etapas de identificación de candidatos habían marcado como un punto único. 7) Una vez que los intrones marcados de los locus de los genes se habían anotado correctamente, se

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examinaron las células a mano para separar cada uno de los cromosomas. Se descartaron las células en las que los cromosomas estaban superpuestos, lo que hacía difícil asignar puntos concretos a cromosomas concretos.

Cariotipado de las células HeLa

El análisis de bandas G (cariotipado) se realizó en propagaciones en metafase de las células HeLa siguiendo los procedimientos estándares. Esto indicaba que las células contenían dos copias intactas del cromosoma 19 y una tercera copia completa del cromosoma 19, que se dividió en dos fragmentos y se fusionó con otros cromosomas. Un fragmento incluía la primera mitad del brazo p del cromosoma 19 y se fusionó con una gran porción del cromosoma 6. El segundo fragmento era la porción restante del cromosoma 19 (la mitad del brazo p hasta el centrómero y todo el brazo q), que estaba fusionado al brazo q del cromosoma 13. Para demostrar de manera concluyente que el cromosoma 19 estaba dividido de esta manera concreta, se realizó un análisis por FISH en el ADN sobre las mismas propagaciones en metafase con las que se realizó el análisis de bandas G. Se utilizaron sondas que se hibridaban selectivamente en el interior de las regiones 19p13 y 19q13 del cromosoma 19, cada una marcada con un fluoróforo diferente (Abbot Molecular). Los resultados confirmaron los resultados del análisis de bandas G. Este análisis se realizó en 10 células, cada una de las cuales mostró las mismas anomalías genéticas, lo que indicaba que las células no variaban mucho en esta característica concreta de unas células y otras.

Análisis Click-iT EdU de la progresión del ciclo celular

Para mostrar que el ARNm de la ciclina A2 era un marcador exacto de la posición del ciclo celular, se utilizó el kit Click-iT EdU Alexa Fluor 594 Imaging (Invitrogen), que incorporaba un producto químico dirigible a un ADN recién replicado. En este caso, las células se incubaron con el reactivo Click-iT EdU a 10 pM durante 5 minutos antes de fijar las células. Se realizó el protocolo de la FISH con estas células usando una sonda del ARNm de la ciclina A2 marcada con Cy3, y tras la hibridación y las etapas de lavado, se siguieron las instrucciones dadas a conocer con el kit para la marcación con fluorescencia de la EdU incorporada.

Cultivo de las células S2 de Drosophila

Se obtuvieron las células S2 de Drosophila de la ATCC y se hicieron crecer en el medio completo de Schneider complementado con suero bovino fetal inactivado con calor al 10%, L-glutamina a 2 mM y penicilina/estreptomicina. Las células se subcultivaron diluyéndolas 10 veces en medio recién preparado una vez cada 3 o 4 días, una vez que el cultivo había alcanzado la confluencia.

En los experimentos en los que se indujo la expresión de MtnA, se añadió al medio de cultivo sulfato de cobre a una concentración final de 1 mM, y las células se incubaron durante 5 horas antes de la toma de imágenes en vivo.

Diseño de las sondas

Las sondas oligonucleotídicas de 20 bases se diseñaron contra los intrones utilizando el programa informático de diseño personalizado para FISH (
http://www.biosearchtech.com/stellarisdesigner/). Cuando era posible, se intentaron diseñar 16 oligonucleótidos que se hibridaban selectivamente sobre el primer intrón del gen. Los oligonucleótidos se encargaron a Biosearch Technologies (Novato, CA), que sintetizaron los oligonucleótidos con grupos amina unidos al extremo 3'. A estos extremos 3' se les acoplaron diferentes fluoróforos orgánicos (que incluyen Atto 488 (Atto- Tec), Cy3 (GE), Alexa 594 (Invitrogen), Atto 647N (Atto-Tec), y Atto 700 (Atto-Tec)) tal y como está indicado en el texto y en la tabla 1. Las sondas se purificaron por HPLC tal y como está descrito en Raj et al. (Nat. Meth. 2008, 5, 877-879).

Sondas utilizadas para la toma de imágenes en vivo

Todas las sondas utilizadas en el estudio eran oligonucleótidos monocatenarios de 20 bases sintetizados con esqueletos de ácido nucleico modificados con 2'O-metilos. Todos los oligonucleótidos tienen el colorante tetrametilrodamina (TAMRA) unido covalentemente al extremo 3'.

Las secuencias específicas utilizadas para los oligonucleótidos que se hibridan selectivamente con el ARN de roX2 eran (5' a 3') y se recogen en la tabla 1. También está recogida en la tabla 1 la secuencia (5' a 3') de los oligonucleótidos utilizados para hibridarse selectivamente con el gen MtnA.

Sondas utilizadas para la FISH

Se realizó la FISH con sondas contra el mismo ARN diana que las sondas para la toma de imágenes en vivo, pero en donde los oligonucleótidos para la FISH se hibridaron selectivamente con diferentes secuencias dentro del ARN diana para evitar la competición entre las sondas. Todos los oligonucleótidos utilizados para la FISH eran oligonucleótidos de ADN monocatenario con una molécula fluorescente de Cy5 unida covalentemente al extremo 3' (se eligió el Cy5 porque es diferente al TAMRA desde el punto de vista espectral, que se utilizaba en las sondas para la toma de imágenes en vivo). Las secuencias para los oligonucleótidos utilizados para hibridarse selectivamente con el ARN de roX2 para el análisis de colocalización por FISH son (5' a 3') y se recogen en la tabla 1.

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Las secuencias para los oligonucleótidos utilizados para hibridarse selectivamente con el ARNm de MtnA para el análisis de colocalización por FISH son (5' a 3') y se dan a conocer en la tabla 1.

Introducción de los oligonucleótidos para la toma de imágenes en vivo

Los oligonucleótidos para la toma de imágenes en vivo que son específicos de la diana de interés se introdujeron en las células S2 vivas de Drosophila con el sistema de transfección Neon (Invitrogen/Life Technologies). El conjunto de oligonucleótidos para la toma de imágenes en vivo se añadió directamente al tampón que contenía las células a una concentración de 0,8 pM por oligonucleótido, y luego se realizó la microporación siguiendo esencialmente las instrucciones de los fabricantes, con 4 pulsos de 5 ms de amplitud y un voltaje de 2000 V. Las células se microporaron y a continuación se colocaron en cubreobjetos con cámaras revestidos con concanavalina A para promover la adhesión celular. La toma de imágenes comenzó al cabo de una hora.

La hibridación in situ fluorescente (FISH) después de la toma de imágenes en vivo

En estos experimentos, se introdujeron las sondas para la toma de imágenes en vivo tal y como está descrito más arriba. Al cabo de 6 horas, las células se fijaron siguiendo el protocolo de Raj et al. (Nat. Meth. 2008, 5, 877-879); brevemente, las células se fijaron en formaldehído al 4% en la solución salina tamponada con fosfato (PBS) a 1*, se lavaron dos veces en PBS a 1* y a continuación se permeabilizaron en EtOH al 70%. Después de la fijación, se llevó a cabo la hibridación, en la que se añadieron aproximadamente 0,2 ng/pl (concentración oligonucleotídica total) de la sonda para FISH a la solución de hibridación, se hibridó durante 1 hora y a continuación se lavó dos veces con un tampón de lavado que contenía citrato de sodio-solución salina (SSC) a 2* y formamida al 10%, y se le añadió DAPI al segundo lavado y después se lavó. Se añadió SSC a 2* a las muestras, de las cuales se tomaron imágenes tal y como está descrito más adelante.

Toma de imágenes en vivo del ARN

Se realizó la toma de imágenes de todas las muestras en un microscopio invertido de fluorescencia Leica DMI6000B con un objetivo Plan-Apo de 100* y una cámara CCD refrigerada (Pixis 1024B de Princeton Instruments). Se utilizó un conjunto de filtros optimizado para el fluoróforo TAMRA. Se utilizaron tiempos de exposición de 2 s y el número de exposiciones se limitó a 10 para evitar la fototoxicidad. En algunos casos, se adquirieron una serie de cortes ópticos que corresponden a diferentes planos focales (una pila z) para tomar un juego completo de imágenes de todas las partes de la célula; con un espaciado de 0,3 pm entre los cortes ópticos.

En los experimentos donde se tomaron imágenes simultáneamente de la sonda para la toma de imágenes en vivo y de la señal de FISH que está sobre el mismo ARN, se adquirieron pilas z secuenciales con filtros que pueden distinguir el TAMRA (sonda para la toma de imágenes en vivo) del Cy5 (sonda para la FISH), con lo que se permite la colocalización de las señales.

Tabla 1.

Sonda

Secuencia de la sonda Tinte orgánico Número de secuencia

DHPS_int_1

ctagtaccgcgttggttcta ATTO647N SEQ ID NO: 1

DHPS_int_2

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DHPS_int_3

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DHPS_int_4

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DHPS_int_5

gcccattccagaaagcttta ATTO700 SEQ ID NO: 5

DHPS_int_6

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atctcctttcagatccggtc ATTO700 SEQ ID NO: 8

DHPS_int_9

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taaatcccagactcaggact ATTO647N SEQ ID NO: 10

Sonda

Secuencia de la sonda Tinte orgánico Número de secuencia

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DHPS_int_12

ataactgcattgcccattga Alexa594 SEQ ID NO: 12

DHPS_int_13

tgactcttatgagggagctc ATTO647N SEQ ID NO: 13

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agtgaatttggcccaagaag ATTO700 SEQ ID NO: 14

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cagagatagtctgggaggag Alexa594 SEQ ID NO: 15

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gctaagtgttgcctctactg ATTO647N SEQ ID NO: 16

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catcgagatgcacagctttg Alexa594 SEQ ID NO: 19

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DNMT1_int_5

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DNMT1_int_8

agccagttctcattagcaag Cy3 SEQ ID NO: 24

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acacactaaagaacacaccc Alexa594 SEQ ID NO: 25

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gatccttgtgcacggaagtt ATTO700 SEQ ID NO: 26

DNMT1_int_11

aatgaactgatggcgttcat Cy3 SEQ ID NO: 27

DNMT1_int_12

cacacctcacttgaacaagt Alexa594 SEQ ID NO: 28

DNMT1_int_13

gtgagggttcctctgactca ATTO700 SEQ ID NO: 29

DNMT1_int_14

tttcacaaatccagctggaa Cy3 SEQ ID NO: 30

DNMT1_int_15

cccaaagacccaaatcagaa Alexa594 SEQ ID NO: 31

DNMT1_int_16

ggggttgaaccaaatatcca ATTO700 SEQ ID NO: 32

EEF2_int_1

attactacgcctgccacatc Cy3 SEQ ID NO: 33

EEF2_int_2

cggcagaaaatcgatctcaa ATTO647N SEQ ID NO: 34

EEF2_int_3

ctttgctcgttctgccattc Cy3 SEQ ID NO: 35

EEF2_int_4

ctttgtacatctgggagtca ATTO647N SEQ ID NO: 36

Sonda

Secuencia de la sonda Tinte orgánico Número de secuencia

EEF2_int_5

acacctcgtgtctcaataag Cy3 SEQ ID NO: 37

EEF2_int_6

cgagcaagaagcttcatcat ATTO647N SEQ ID NO: 38

EEF2_int_7

acgtaagggatgaatcctct Cy3 SEQ ID NO: 39

EEF2_int_8

actaaagtctcatttggggc ATTO647N SEQ ID NO: 40

EEF2_int_9

tgagtgtcaacagatttcct Cy3 SEQ ID NO: 41

EEF2_int_10

ggaaccaccgttaataggtg ATTO647N SEQ ID NO: 42

EEF2_int_11

gaatcttgccagcctaacac Cy3 SEQ ID NO: 43

EEF2_int_12

gttcagtccaaacgaaccag ATTO647N SEQ ID NO: 44

EEF2_int_13

ctcgtgatttccaggaacac Cy3 SEQ ID NO: 45

EEF2_int_14

gaaagagacgttgccaagtc ATTO647N SEQ ID NO: 46

EEF2_int_15

ggactgaacctcactcattc Cy3 SEQ ID NO: 47

EEF2_int_16

agatattgtaggagtggggg ATTO647N SEQ ID NO: 48

EGLN2_int_1

aactgcctaaaccttctgtg ATTO700 SEQ ID NO: 49

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gtccccacaagtaagcatac ATTO647N SEQ ID NO: 50

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atcaggtgcacacattaagg ATTO700 SEQ ID NO: 51

EGLN2_int_4

aaagtcaagaaccactgtgg ATTO647N SEQ ID NO: 52

EGLN2_int_5

gaatgtcagcagctctcatg ATTO700 SEQ ID NO: 53

EGLN2_int_6

gacagacagcaacagagaac ATTO647N SEQ ID NO: 54

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gatggactagaaacatgggc ATTO700 SEQ ID NO: 55

EGLN2_int_8

ccacccatgaagacaatgat ATTO647N SEQ ID NO: 56

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cagaagcagaacccaagatg ATTO700 SEQ ID NO: 57

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gtattccgtggatcagcaaa ATTO700 SEQ ID NO: 59

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gtccccaaccacatagaaag ATTO647N SEQ ID NO: 60

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cccatctaaaagcgggaaag ATTO647N SEQ ID NO: 62

Sonda

Secuencia de la sonda Tinte orgánico Número de secuencia

EGLN2_int_15

gagtacaggagagagtccag ATTO700 SEQ ID NO: 63

EGLN2_int_16

cagaacgactaagaagcacg ATTO647N SEQ ID NO: 64

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gattctctcgcttctaggcc ATTO700 SEQ ID NO: 65

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cgaagagactgagtggtacc ATTO488 SEQ ID NO: 66

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aaggaaaccttaaggcaatt ATTO700 SEQ ID NO: 67

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ctagtcttgcacaccaagag ATTO700 SEQ ID NO: 79

EIF3K_int_16

ctcctgtcccaacttccttg ATTO488 SEQ ID NO: 80

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FBL_int_8

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Sonda

Secuencia de la sonda Tinte orgánico Número de secuencia

FBL_int_9

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tctatctagccatccatcca ATTO647N SEQ ID NO: 111

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MARK4_int_1

gaccttgaagaagccagaaa ATTO488 SEQ ID NO: 113

MARK4_int_2

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Sonda

Secuencia de la sonda Tinte orgánico Número de secuencia

MARK4_int_3

caagggaaaagggcttgaaa ATTO647N SEQ ID NO: 115

MARK4_int_4

gagaaagcttccagcagatt ATTO488 SEQ ID NO: 116

MARK4_int_5

aggtcaaggggtctagaaat Cy3 SEQ ID NO: 117

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agatgaataaaggctgagcc ATTO647N SEQ ID NO: 118

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MARK4_int_15

attgtagtgaccaaggaaca ATTO647N SEQ ID NO: 127

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ctgaatcgagtaagccttgg ATTO488 SEQ ID NO: 128

PPP2R1A_int_1

caaccggggagataagagac Cy3 SEQ ID NO: 129

PPP2R1A_int_2

cctacttggagcaagtcatg Alexa594 SEQ ID NO: 130

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PPP2R1A_int_4

aaaatgagaggcggaggaag Alexa594 SEQ ID NO: 132

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gctcctaaacttggctagtc Alexa594 SEQ ID NO: 134

PPP2R1A_int_7

tatcctggtcaatgggagga Cy3 SEQ ID NO: 135

PPP2R1A_int_8

gcttagcaaatccctcaacc Alexa594 SEQ ID NO: 136

PPP2R1A_int_9

catcccataaccaggaatgt Cy3 SEQ ID NO: 137

PPP2R1A_int_10

cctctttaatcaccactccc Alexa594 SEQ ID NO: 138

PPP2R1A_int_11

aacagacctaaagggaggat Cy3 SEQ ID NO: 139

PPP2R1A_int_12

gtttggcaggttacccagtg Alexa594 SEQ ID NO: 140

Sonda

Secuencia de la sonda Tinte orgánico Número de secuencia

PPP2R1A_int_13

tataccaggaacctaggagg Cy3 SEQ ID NO: 141

PPP2R1A_int_14

tccccagcatcatatctcat Alexa594 SEQ ID NO: 142

PPP2R1A_int_15

tatagcaactggtgtctcca Cy3 SEQ ID NO: 143

PPP2R1A_int_16

cctgtttcacatctggatcc Alexa594 SEQ ID NO: 144

PTBP1_int_1

gaatgcgaaacatctccagc Cy3 SEQ ID NO: 145

PTBP1_int_2

aaacttctcaggaaaacgga ATTO700 SEQ ID NO: 146

PTBP1_int_3

ctcttctgacaccacagact Cy3 SEQ ID NO: 147

PTBP1_int_4

gggggaaggtggatagaaag ATTO700 SEQ ID NO: 148

PTBP1_int_5

gaacacagcctcagttactg Cy3 SEQ ID NO: 149

PTBP1_int_6

ctgaaactggcaaactcaca ATTO700 SEQ ID NO: 150

PTBP1_int_7

gtgctttccagtaagttgga Cy3 SEQ ID NO: 151

PTBP1_int_8

cacgttccaagacaaagaca ATTO700 SEQ ID NO: 152

PTBP1_int_9

ccacttgactgcaacttgaa Cy3 SEQ ID NO: 153

PTBP1_int_10

cgctagagaaagctcagaag ATTO700 SEQ ID NO: 154

PTBP1_int_11

cggagaagcaaagtgagaag Cy3 SEQ ID NO: 155

PTBP1_int_12

aactccagattccagaccaa ATTO700 SEQ ID NO: 156

PTBP1_int_13

tgacagcaagaaccgaagag Cy3 SEQ ID NO: 157

PTBP1_int_14

taggctggattctatccagg ATTO700 SEQ ID NO: 158

PTBP1_int_15

tcaaccagtaaatgcccatc Cy3 SEQ ID NO: 159

PTBP1_int_16

ccctttcctcacatgctgag ATTO700 SEQ ID NO: 160

RPL18A_int_1

gttgggtgcaacaagagaag ATTO488 SEQ ID NO: 161

RPL18A_int_2

ctatgctgcgcgacttattc ATTO647N SEQ ID NO: 162

RPL18A_int_3

tttcatctgcttctcacagc ATTO488 SEQ ID NO: 163

RPL18A_int_4

tatgtaccacagcgttaagc ATTO647N SEQ ID NO: 164

RPL18A_int_5

ccatagagccgtttgattct ATTO488 SEQ ID NO: 165

RPL18A_int_6

agtccaggttctcctatctc ATTO647N SEQ ID NO: 166

Sonda

Secuencia de la sonda Tinte orgánico Número de secuencia

RPL18A_int_7

agctggagatctggacataa ATTO488 SEQ ID NO: 167

RPL18A_int_8

cctttgacagcaaggaaacc ATTO647N SEQ ID NO: 168

RPL18A_int_9

gttcaggaagggaacaatgg ATTO488 SEQ ID NO: 169

RPL18A_int_10

ttttactgtgaacctgaccc ATTO647N SEQ ID NO: 170

RPL18A_int_11

aaaccacctctgaaactgac ATTO488 SEQ ID NO: 171

RPL18A_int_12

aatctttggtcaagtccagg ATTO647N SEQ ID NO: 172

RPL18A_int_13

ggtttacagatgcagaggtg ATTO488 SEQ ID NO: 173

RPL18A_int_14

aactgcaatccaaacgtttg ATTO647N SEQ ID NO: 174

RPL18A_int_15

agaactaggacaagacctca ATTO488 SEQ ID NO: 175

RPL18A_int_16

catcttctttcaccctgagg ATTO647N SEQ ID NO: 176

RPS19_int_1

tctggatcgcactaacagag Cy3 SEQ ID NO: 177

RPS19_int_2

catcctaaaccgtggtaccc ATTO488 SEQ ID NO: 178

RPS19_int_3

ggagaaagtcaagcatgtga Cy3 SEQ ID NO: 179

RPS19_int_4

tttgaacctcagtccccaaa ATTO488 SEQ ID NO: 180

RPS19_int_5

gtacaaagagaggctggaac Cy3 SEQ ID NO: 181

RPS19_int_6

cctcaacacaactatgctgt ATTO488 SEQ ID NO: 182

RPS19_int_7

ctaccccatatcccaaatgc Cy3 SEQ ID NO: 183

RPS19_int_8

cacgattcagtcatctccac ATTO488 SEQ ID NO: 184

RPS19_int_9

aagaccaaaacagtgggaaa Cy3 SEQ ID NO: 185

RPS19_int_10

gaagtatggtttgtgccagg ATTO488 SEQ ID NO: 186

RPS19_int_11

gaaagagctcagaggagaca Cy3 SEQ ID NO: 187

RPS19_int_12

caagtggtgacacaaccaag ATTO488 SEQ ID NO: 188

RPS19_int_13

tcgaatgtcacatcacacaa Cy3 SEQ ID NO: 189

RPS19_int_14

aaaaacttggagtaccaagt ATTO488 SEQ ID NO: 190

RPS19_int_15

ttcatctgtctctggtttcc Cy3 SEQ ID NO: 191

RPS19_int_16

aaaccacctgtaagcaaaat ATTO488 SEQ ID NO: 192

Sonda

Secuencia de la sonda Tinte orgánico Número de secuencia

RPS9_int_1

gcttactcatggaaactcgg ATTO488 SEQ ID NO: 193

RPS9_int_2

tcatagtcagtatctgcccc Alexa594 SEQ ID NO: 194

RPS9_int_3

atccgatctcgcgagaataa ATTO488 SEQ ID NO: 195

RPS9_int_4

gagagaagtgtgagcgtaag Alexa594 SEQ ID NO: 196

RPS9_int_5

atagagtacatgggcacctt ATTO488 SEQ ID NO: 197

RPS9_int_6

gtaccaaatttaggggacgg Alexa594 SEQ ID NO: 198

RPS9_int_7

tggaatcacaaaaccttcct ATTO488 SEQ ID NO: 199

RPS9_int_8

cgtactggcacaacaactag Alexa594 SEQ ID NO: 200

RPS9_int_9

gggagaatgaacctcacaag ATTO488 SEQ ID NO: 201

RPS9_int_10

gacacaactctcatcactgg Alexa594 SEQ ID NO: 202

RPS9_int_11

aaggctggttccatttatcc ATTO488 SEQ ID NO: 203

RPS9_int_12

tttcctacttcacaagtgcc Alexa594 SEQ ID NO: 204

RPS9_int_13

acctaagaaacagggcaaag ATTO488 SEQ ID NO: 205

RPS9_int_14

aggcctatctttagctctgg Alexa594 SEQ ID NO: 206

RPS9_int_15

gcccagaaattccacttcat ATTO488 SEQ ID NO: 207

RPS9_int_16

aaccctgttatcaccatcac Alexa594 SEQ ID NO: 208

SLClA5_int_1

gaggactcactgagcgaaag ATTO700 SEQ ID NO: 209

SLC1A5_int_2

tgcatttttccaggaactaa Cy3 SEQ ID NO: 210

SLClA5_int_3

tgagcccgtattctcattga ATTO488 SEQ ID NO: 211

SLC1A5_int_4

aattaaaactcacaggaggc ATTO700 SEQ ID NO: 212

SLC1A5_int_5

atgccaagctaacaatgctc Cy3 SEQ ID NO: 213

SLC1A4_int_6

gtgtccatcgttaccagggc ATTO488 SEQ ID NO: 214

SLC1A5_int_7

taggcaaagaggtagagccc ATTO700 SEQ ID NO: 215

SLC1A5_int_8

aaggactgcagagtgtcaat Cy3 SEQ ID NO: 216

SLC1A5_int_9

acaaagtagagacctatcca ATTO488 SEQ ID NO: 217

SLC1A5_int_10

cacctggggtgggaaaagag ATTO700 SEQ ID NO: 218

Sonda

Secuencia de la sonda Tinte orgánico Número de secuencia

SLClA5_int_11

gagagggcagcatggaatgg Cy3 SEQ ID NO: 219

SLC1A5_int_12

cagtttgagcaggttgaggg ATTO488 SEQ ID NO: 220

SLC1A5_int_13

aaaggacactcagtctacct ATTO700 SEQ ID NO: 221

SLC1A5_int_14

ctgtgggcaaggaacagatc Cy3 SEQ ID NO: 222

SLC1A5_int_15

caaacagaatgccccgcacc ATTO488 SEQ ID NO: 223

SLC1A5_int_16

gtgaatagagggtgccccat ATTO700 SEQ ID NO: 224

SUPT5H_int_1

tctcttgagacaatctggga ATTO647N SEQ ID NO: 225

SUPT5H_int_2

cctttgcttgacttcgactt Cy3 SEQ ID NO: 226

SUPT5H_int_3

tgttatctcactggacctga Alexa594 SEQ ID NO: 227

SUPT5H_int_4

ctttttttagggggtggtgg ATTO647N SEQ ID NO: 228

SUPT5H_int_5

ctctgatccaaccaaagtgg Cy3 SEQ ID NO: 229

SUPT5H_int_6

ggaacacagtagtagatgca Alexa594 SEQ ID NO: 230

SUPT5H_int_7

accagacacctgagaagtaa ATTO647N SEQ ID NO: 231

SUPT5H_int_8

ctggtttgtgattgctacct Cy3 SEQ ID NO: 232

SUPT5H_int_9

gtgcatcaaacaagggatct Alexa594 SEQ ID NO: 233

SUPT5H_int_10

ggcaactaacatatcctggg ATTO647N SEQ ID NO: 234

SUPT5H_int_11

acacagccacatgaaatctt Cy3 SEQ ID NO: 235

SUPT5H_int_12

gcactctccatctaccaaac Alexa594 SEQ ID NO: 236

SUPT5H_int_13

taagtgactgggacaagtca ATTO647N SEQ ID NO: 237

SUPT5H_int_14

ggcaatcaaatgtccacaga Cy3 SEQ ID NO: 238

SUPT5H_int_15

cactctccaaaggtcacaat Alexa594 SEQ ID NO: 239

SUPT5H_int_16

atccagtgctacagcttaga ATTO647N SEQ ID NO: 240

TOMM40_int_1

atcacctcctagtgctgtta ATTO647N SEQ ID NO: 241

TOMM40_int_2

ccatcattctaagccccaag Alexa594 SEQ ID NO: 242

TOMM40_int_3

ctgctatgacattccatccc ATTO647N SEQ ID NO: 243

TOMM40_int_4

gatcacaagagaagtctggc Alexa594 SEQ ID NO: 244

Sonda

Secuencia de la sonda Tinte orgánico Número de secuencia

TOMM40_int_5

gaacaccagaacagaactcc ATTO647N SEQ ID NO: 245

TOMM40_int_6

cacagaattgtcccaaggat Alexa594 SEQ ID NO: 246

TOMM40_int_7

aagctgagcaactttaggtc ATTO647N SEQ ID NO: 247

TOMM40_int_8

ttgcttgctcaaatctcact Alexa594 SEQ ID NO: 248

TOMM40_int_9

tacagcctagttagacaggg ATTO647N SEQ ID NO: 249

TOMM40_int_10

gattccacctgtaaagaggc Alexa594 SEQ ID NO: 250

TOMM40_int_11

cacagcagaacatctcacaa ATTO647N SEQ ID NO: 251

TOMM40_int_12

gagaagagaaacgctgtcac Alexa594 SEQ ID NO: 252

TOMM40_int_13

tctggcactatatctccgag ATTO647N SEQ ID NO: 253

TOMM40_int_14

taggtccccaaactgagtag Alexa594 SEQ ID NO: 254

TOMM40_int_15

agagactcagagaaaggagg ATTO647N SEQ ID NO: 255

TOMM40_int_16

tgtgacgatactggacagat Alexa594 SEQ ID NO: 256

UBA2_int_1

ccaaagaacagtctcctccc ATTO647N SEQ ID NO: 257

UBA2_int_2

ttgaagggaggataagaggc ATTO488 SEQ ID NO: 258

UBA2_int_3

ctcctaacagccgggaattt Alexa594 SEQ ID NO: 259

UBA2_int_4

ttaaagtcacaacatccgcg ATTO647N SEQ ID NO: 260

UBA2_int_5

tcgttacttcggagttacga ATTO488 SEQ ID NO: 261

UBA2_int_6

tcgctatcattgccatcctc Alexa594 SEQ ID NO: 262

UBA2_int_7

ctgtgagagcaatgacagtc ATTO647N SEQ ID NO: 263

UBA2_int_8

atgaaacaagcgagtgtacc ATTO488 SEQ ID NO: 264

UBA2_int_9

caaaaggcacagtcctaacg Alexa594 SEQ ID NO: 265

UBA2_int_10

aaatagcactggcttgtcaa ATTO647N SEQ ID NO: 266

UBA2_int_11

tttaaactcacaccgaaggg ATTO488 SEQ ID NO: 267

UBA2_int_12

tgtttccactagcccttaag Alexa594 SEQ ID NO: 268

UBA2_int_13

aacctgagaactgtgaaagg ATTO647N SEQ ID NO: 269

UBA2_int_14

cctcccttaattcaagcctt ATTO488 SEQ ID NO: 270

Sonda

Secuencia de la sonda Tinte orgánico Número de secuencia

UBA2_int_15

ttcgaatcgccataccaaaa Alexa594 SEQ ID NO: 271

UBA2_int_16

tacattagtggagaaagcgt ATTO647N SEQ ID NO: 272

UBA52_int_1

ctaaagtcagcacaacccac ATTO700 SEQ ID NO: 273

UBA52_int_2

gagaagcaagggcaaaacag Alexa594 SEQ ID NO: 274

UBA52_int_3

caaacgttcttcagatcaca ATTO700 SEQ ID NO: 275

UBA52_int_4

ggccaactgaggtagaagat Alexa594 SEQ ID NO: 276

UBA52_int_5

cactacccccagtttctcaa ATTO700 SEQ ID NO: 277

UBA52_int_6

tattactggcagtgtcctct Alexa594 SEQ ID NO: 278

UBA52_int_7

gaggctcagttagaggctct ATTO700 SEQ ID NO: 279

UBA52_int_8

caatgctcctttcctaggac Alexa594 SEQ ID NO: 280

UBA52_int_9

acactgaattcttgtcgctc ATTO700 SEQ ID NO: 281

UBA52_int_10

aaggtcagacactgaagtct Alexa594 SEQ ID NO: 282

UBA52_int_11

ccgacctctaagtggttcag ATTO700 SEQ ID NO: 283

UBA52_int_12

gcatccatctgggtttctaa Alexa594 SEQ ID NO: 284

UBA52_int_13

ggagtctgagactgacacat ATTO700 SEQ ID NO: 285

UBA52_int_14

cgtgtggaagatacactgtc Alexa594 SEQ ID NO: 286

UBA52_int_15

gcctatagtctgctgctttc ATTO700 SEQ ID NO: 287

UBA52_int_16

caagcatcggagcacacata Alexa594 SEQ ID NO: 288

ZNF444_int_1

gagtcacactggttttcagg ATTO700 SEQ ID NO: 289

ZNF444_int_2

cttctctgataagccgtgac Cy3 SEQ ID NO: 290

ZNF444_int_3

gagaggacagctggtaactg ATTO647N SEQ ID NO: 291

ZNF444_int_4

ttttgaacacattggggtcc ATTO700 SEQ ID NO: 292

ZNF444_int_5

gtgccactactgaaaggatg Cy3 SEQ ID NO: 293

ZNF444_int_6

gactgctctgactcttcacc ATTO647N SEQ ID NO: 294

ZNF444_int_7

ggtacgcacttatgaggaac ATTO700 SEQ ID NO: 295

ZNF444_int_8

tctctgctgctacatctcag Cy3 SEQ ID NO: 296

Sonda

Secuencia de la sonda Tinte orgánico Número de secuencia

ZNF444_int_9

catgagaagggagacggatg ATTO647N SEQ ID NO: 297

ZNF444_int_10

atcccagacaataagagggg ATTO700 SEQ ID NO: 298

ZNF444_int_11

cgaggatagagaagccagag Cy3 SEQ ID NO: 299

ZNF444_int_12

cccacttttgggaacaatga ATTO647N SEQ ID NO: 300

ZNF444_int_13

gctgcgtttgtgatttgtta ATTO700 SEQ ID NO: 301

ZNF444_int_14

ggatgaaagcagaggtcaag Cy3 SEQ ID NO: 302

ZNF444_int_15

ggatgaaagcagaggtcaag ATTO647N SEQ ID NO: 303

ZNF444_int_16

taagtgggtcaaggtcagag ATTO700 SEQ ID NO: 304

ZNF91_int_1

gattgtggagctgactgaag ATTO488 SEQ ID NO: 305

ZNF91_int_2

catcttatcgctgaagggga Cy3 SEQ ID NO: 306

ZNF91_int_3

ctgcacaatctgggagagac Alexa594 SEQ ID NO: 307

ZNF91_int_4

gagttaggctggaggaacag ATTO488 SEQ ID NO: 308

ZNF91_int_5

tggtaagatagctgcgtcta Cy3 SEQ ID NO: 309

ZNF91_int_6

actgaagacacatcacccta Alexa594 SEQ ID NO: 310

ZNF91_int_7

tccaagaaaaaactgaaggg ATTO488 SEQ ID NO: 311

ZNF91_int_8

agagaatatgacccagaagc Cy3 SEQ ID NO: 312

ZNF91_int_9

tcaatacctcaggttgtcct Alexa594 SEQ ID NO: 313

ZNF91_int_10

gtccacacttgagaagctaa ATTO488 SEQ ID NO: 314

ZNF91_int_11

cactatttttctgcccccta Cy3 SEQ ID NO: 315

ZNF91_int_12

gcaagttcttacgccatcta Alexa594 SEQ ID NO: 316

ZNF91_int_13

gtgcctcaggcacattatac ATTO488 SEQ ID NO: 317

ZNF91_int_14

aggagactctgaactatgcc Cy3 SEQ ID NO: 318

ZNF91_int_15

ttaagtgctcaataaccccc Alexa594 SEQ ID NO: 319

ZNF91_int_16

tcaagtcaggccattcaatt ATTO488 SEQ ID NO: 320

SUZ12_mRNA_1

ctccattttcggcttcttca ATTO647N SEQ ID NO: 321

SUZ12_mRNA_2

gaggaaaagctcgtggtcag ATTO488 SEQ ID NO: 322

Sonda

Secuencia de la sonda Tinte orgánico Número de secuencia

SUZ12_mRNA_3

gatctgtgttggctteteaa ATTO700 SEQ ID NO: 323

SUZ12_mRNA_4

gagattccgagttcgaagaa Cy3 SEQ ID NO: 324

SUZ12_mRNA_5

tgtgcaaaaatattggtgct Alexa594 SEQ ID NO: 325

SUZ12_mRNA_6

tctggagtttcgatgagaca ATTO647N SEQ ID NO: 326

SUZ12_mRNA_7

tgagattcttgctctccttt ATTO488 SEQ ID NO: 327

SUZ12_mRNA_8

ctgcaaatgagctgacaagc ATTO700 SEQ ID NO: 328

SUZ12_mRNA_9

tggaagaaaccagtaaacgt Cy3 SEQ ID NO: 329

SUZ12_mRNA_10

aagagtgaactgcaacgtag Alexa594 SEQ ID NO: 330

SUZ12_mRNA_11

gcaataggagccgtagattt ATTO647N SEQ ID NO: 331

SUZ12_mRNA_12

atttctagtggcaagaggtt ATTO488 SEQ ID NO: 332

SUZ12_mRNA_13

taactgaaccaggcttgttt ATTO700 SEQ ID NO: 333

SUZ12_mRNA_14

acagcaatagtttgagtagg Cy3 SEQ ID NO: 334

SUZ12_mRNA_15

tgttgccttgtattgttgtt Alexa594 SEQ ID NO: 335

SUZ12_mRNA_16

caggtcatctcttgcttcag ATTO647N SEQ ID NO: 336

SUZ12_mRNA_17

tcagagtacaccaagggcaa ATTO488 SEQ ID NO: 337

SUZ12_mRNA_18

aaactataaagtttgcggca ATTO700 SEQ ID NO: 338

SUZ12_mRNA_19

tggcagagtttaagatgctt Cy3 SEQ ID NO: 339

SUZ12_mRNA_20

cctagcaccttttggatgat Alexa594 SEQ ID NO: 340

SUZ12_mRNA_21

ggagccatcataacactcat ATTO647N SEQ ID NO: 341

SUZ12_mRNA_22

tatcctgaggatttcctgca ATTO488 SEQ ID NO: 342

SUZ12_mRNA_23

tgcgactaaaagcaaatcca ATTO700 SEQ ID NO: 343

SUZ12_mRNA_24

ggtgttctcttaactggtcc Cy3 SEQ ID NO: 344

SUZ12_mRNA_25

gcctgcacacaagaatatgt Alexa594 SEQ ID NO: 345

SUZ12_mRNA_26

catgcttg cttttgttcgtt ATTO647N SEQ ID NO: 346

SUZ12_mRNA_27

ctttgctgttctacttcccc ATTO488 SEQ ID NO: 347

SUZ12_mRNA_28

aaatacagacgattgtggcc ATTO700 SEQ ID NO: 348

Sonda

Secuencia de la sonda Tinte orgánico Número de secuencia

SUZ12_mRNA_29

agaggtaagcaggtatcact Cy3 SEQ ID NO: 349

SUZ12_mRNA_30

gacatggagattccagagtt Alexa594 SEQ ID NO: 350

SUZ12_mRNA_31

cagcaataaacccatgcttc ATTO647N SEQ ID NO: 351

SUZ12_mRNA_32

caggcatgattcatttgatt ATTO488 SEQ ID NO: 352

SUZ12_mRNA_33

tgaagcatgaagtttcgaca ATTO700 SEQ ID NO: 353

SUZ12_mRNA_34

aaagtcatgcatgctgacta Cy3 SEQ ID NO: 354

SUZ12_mRNA_35

catttcacggagcttggtaa Alexa594 SEQ ID NO: 355

SUZ12_mRNA_36

tatttcttcgtttgcagggg ATTO647N SEQ ID NO: 356

SUZ12_mRNA_37

ccatttgctgtcccattttg ATTO488 SEQ ID NO: 357

SUZ12 mRNA 38

ctgttttgaaacccctgaga ATTO700 SEQ ID NO: 358

SUZ12_mRNA_39

acatggggttagagcttttc Cy3 SEQ ID NO: 359

SUZ12_mRNA_40

agaggatgaattccctaaaa Alexa594 SEQ ID NO: 360

SUZ12_mRNA_41

tgaagtagaaccctgataca ATTO647N SEQ ID NO: 361

SUZ12_mRNA_42

cctccccaagaaaatgtctc ATTO488 SEQ ID NO: 362

SUZ12_mRNA_43

aggatcaaagtttgactgca ATTO700 SEQ ID NO: 363

SUZ12_mRNA_44

gggtgagcaatgcactaaaa Cy3 SEQ ID NO: 364

SUZ12_mRNA_45

acagcttaattttccgtgtg Alexa594 SEQ ID NO: 365

SUZ12_mRNA_46

caaatgcgttctttccttgg ATTO647N SEQ ID NO: 366

SUZ12_mRNA_47

ttctccccttataagtgaca ATTO488 SEQ ID NO: 367

SUZ12_mRNA_48

agtcagcttatetctattgg ATTO700 SEQ ID NO: 368

SUZ12_mRNA_49

acacatataacacagggcaa Cy3 SEQ ID NO: 369

SUZ12_mRNA_50

caactgcaaatatgtgcgtg Alexa594 SEQ ID NO: 370

SUZ12_mRNA_51

tgcttgttaatgtgccagta ATTO647N SEQ ID NO: 371

SUZ12_mRNA_52

cggagttggaataaaaacct ATTO488 SEQ ID NO: 372

SUZ12_mRNA_53

gatgttactcaaccacagtg ATTO700 SEQ ID NO: 373

SUZ12_mRNA_54

acacatcttaaagaccagtc Cy3 SEQ ID NO: 374

Sonda

Secuencia de la sonda Tinte orgánico Número de secuencia

SUZ12_mRNA_55

tcgttaaatagcctcacagt Alexa594 SEQ ID NO: 375

SUZ12_mRNA_56

tgacaaatcacatccacact ATTO647N SEQ ID NO: 376

SUZ12_mRNA_57

aatgaaagctgcagtttccc ATTO488 SEQ ID NO: 377

SUZ12_mRNA_58

gcttaccaatcaaggaatct ATTO700 SEQ ID NO: 378

SUZ12_mRNA_59

ccagaggcaaaaatcagagt Cy3 SEQ ID NO: 379

SUZ12_mRNA_60

cgagataaacgctcgagatc Alexa594 SEQ ID NO: 380

SUZ12_mRNA_61

tatgtgcacagctttagcaa ATTO647N SEQ ID NO: 381

SUZ12_mRNA_62

ttctacacctacatctcccc ATTO488 SEQ ID NO: 382

SUZ12_mRNA_63

agcattaagagcataactgc ATTO700 SEQ ID NO: 383

SUZ12_mRNA_64

gcaaacaatgctagccttct Cy3 SEQ ID NO: 384

SUZ12_mRNA_65

ggtgggaatcaccaactttt Alexa594 SEQ ID NO: 385

CCNA2_exons_1

gtctgctgcaatgctagcag Cy3 SEQ ID NO: 386

CCNA2_exons_2

gccttttecgggttgatatt Cy3 SEQ ID NO: 387

CCNA2_exons_3

ggttcccggacttcagtacc Cy3 SEQ ID NO: 388

CCNA2_exons_4

aggaagatccttaaggggtg Cy3 SEQ ID NO: 389

CCNA2_exons_5

ttgctttccaaggaggaacg Cy3 SEQ ID NO: 390

CCNA2_exons_6

gtgaacgcaggctgtttact Cy3 SEQ ID NO: 391

CCNA2_exons_7

ttctgcttcatccacatgaa Cy3 SEQ ID NO: 392

CCNA2_exons_8

ctggcttcttctgagcttct Cy3 SEQ ID NO: 393

CCNA2_exons_9

tcacgctctattttttgaga Cy3 SEQ ID NO: 394

CCNA2_exons_10

tgaattaaaagccagggcat Cy3 SEQ ID NO: 395

CCNA2_exons_11

aagagggaccaatggttttc Cy3 SEQ ID NO: 396

CCNA2_exons_12

tttccctaaggtatgtgtga Cy3 SEQ ID NO: 397

CCNA2_exons_13

tcatgtaacccactttaggt Cy3 SEQ ID NO: 398

CCNA2_exons_14

gttagtgatgtctggctgtt Cy3 SEQ ID NO: 399

CCNA2_exons_15

ccacgaggatagctctcata Cy3 SEQ ID NO: 400

Sonda

Secuencia de la sonda Tinte orgánico Número de secuencia

CCNA2_exons_16

atgtagttcacagccaaatg Cy3 SEQ ID NO: 401

CCNA2_exons_17

acatggaagacaggaaccta Cy3 SEQ ID NO: 402

CCNA2_exons_18

ctaacagcatagcagcagtg Cy3 SEQ ID NO: 403

CCNA2_exons_19

tgtacacaaactctgctact Cy3 SEQ ID NO: 404

CCNA2_exons_20

ttggtgtaggtatcatctgt Cy3 SEQ ID NO: 405

CCNA2_exons_21

gctccattctcagaacttgt Cy3 SEQ ID NO: 406

CCNA2_exons_22

gtcaaaagtaaggactttca Cy3 SEQ ID NO: 407

CCNA2_exons_23

gatttactgttggagcagct Cy3 SEQ ID NO: 408

CCNA2_exons_24

tgatgcagaaagtattgggt Cy3 SEQ ID NO: 409

CCNA2_exons_25

ttcaactttgcagtttgcag Cy3 SEQ ID NO: 410

CCNA2_exons_26

ttgaggtatgggtcagcatc Cy3 SEQ ID NO: 411

CCNA2_exons_27

agcaataactgatggcaaat Cy3 SEQ ID NO: 412

CCNA2_exons_28

gtgctaaatgaaaggcagct Cy3 SEQ ID NO: 413

CCNA2_exons_29

ctttgtcccgtgactgtgta Cy3 SEQ ID NO: 414

CCNA2_exons_30

ccagtctttcgtattaatga Cy3 SEQ ID NO: 415

CCNA2_exons_31

gcttaagactttccagggta Cy3 SEQ ID NO: 416

CCNA2_exons_32

gtgctttgaggtaggtctgg Cy3 SEQ ID NO: 417

CCNA2_exons_33

tattgactgttgtgcatgct Cy3 SEQ ID NO: 418

CCNA2_exons_34

gaggagagaaacaccatgat Cy3 SEQ ID NO: 419

CCNA2_exons_35

gatttagtgtctctggtggg Cy3 SEQ ID NO: 420

roX2 _1

uauguaacaccaauuuaccc TAMRA SEQ ID NO: 421

roX2 _2

ugugauuuccaaauagucgu TAMRA SEQ ID NO: 422

roX2 _3

guuuuguagcuugacaagcg TAMRA SEQ ID NO: 423

roX2 _4

uguauauuguauaucauuca TAMRA SEQ ID NO: 424

roX2 _5

gcguuccaagacacauuuuu TAMRA SEQ ID NO: 425

roX2 _6

cguuacccauauaugcauau TAMRA SEQ ID NO: 426

Sonda

Secuencia de la sonda Tinte orgánico Número de secuencia

roX2 _7

ugacugguuaaggcgcguaa TAMRA SEQ ID NO: 427

MtnA_1

cugcugaccacaacugaugc TAMRA SEQ ID NO: 428

MtnA_2

cacugagaugauucacuuga TAMRA SEQ ID NO: 429

MtnA_3

gggcuauuuaggccuuuagu TAMRA SEQ ID NO: 430

MtnA_4

uauuuccucgaacuuguuca TAMRA SEQ ID NO: 431

MtnA_5

gcaaggcaucuugauugagu TAMRA SEQ ID NO: 432

MtnA_6

ccgcacuugcagucagaucc TAMRA SEQ ID NO: 433

MtnA_7

guguagagagacaagaugca TAMRA SEQ ID NO: 434

MtnA_8

aauuggacauuuauugcagg TAMRA SEQ ID NO: 435

roX2_FISH_1

ttcgaaacgatctctaaagc Cy5 SEQ ID NO: 436

roX2_FISH_2

tttcgaacgattatcaatgt Cy5 SEQ ID NO: 437

roX2_FISH_3

cttgattttgcttcggagaa Cy5 SEQ ID NO: 438

roX2_FISH_4

tatgcggaaatcgttactct Cy5 SEQ ID NO: 439

roX2_FISH_5

attcaacttaaacattttcg Cy5 SEQ ID NO: 440

roX2_FISH_6

tcatctcactgtccgtaaga Cy5 SEQ ID NO: 441

roX2_FISH_7

tcaaccatgaaaacaattcg Cy5 SEQ ID NO: 442

roX2_FISH_8

gcattgcgacttgtacaatg Cy5 SEQ ID NO: 443

roX2_FISH_9

acacgtcttttaagacttca Cy5 SEQ ID NO: 444

roX2_FISH_10

tttgcttaatttgcaacatt Cy5 SEQ ID NO: 445

roX2_FISH_11

acatttcactagttatatga Cy5 SEQ ID NO: 446

MtnA_FISH_1

atttg catccgcttccgcat Cy5 SEQ ID NO: 447

MtnA_FISH_2

agttgcaggatcccttggtg Cy5 SEQ ID NO: 448

MtnA_FISH_3

gcaggcggatttcttgtcgc Cy5 SEQ ID NO: 449

MtnA_FISH_4

ggaaagctcactcggagcag Cy5 SEQ ID NO: 450

MtnA_FISH_5

gcctctactccagatctttt Cy5 SEQ ID NO: 451

Sin más descripción, se cree que el experto en la técnica puede, con el uso de la descripción anterior y de los ejemplos ilustrativos que vienen a continuación, fabricar y utilizar la presente invención y poner en práctica los

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métodos in vitro reivindicados. Por lo tanto, los siguientes ejemplos de trabajo señalan específicamente a las realizaciones preferidas de la presente invención, y no se consideran como limitantes de ninguna manera el resto de la descripción.

Ejemplo 1: Determinación simultánea de la estructura cromosómica y de la expresión génica

Tal y como se representa en la figura 1B, se hibridaron selectivamente 18 genes a lo largo del cromosoma 19, lo que iluminaba el cromosoma con robustez y con poco ruido de fondo. Ya que el método in vitro de la presente invención se basa en la FISH en el ARN, es fácil combinar con los ARNm que marcan la FISH en el ARN para medir simultáneamente la expresión de genes concretos, tal y como se representa en la figura 1C. Los propios intrones también producen información crítica de la expresión génica, ya que los intrones de la mayoría de los genes producen puntos en menos del 50% de las células. Es decir, la determinación de la estructura cromosómica global a través de los métodos in vitro de la presente invención puede incluir adicionalmente la marcación de un gran número de genes, lo que confiere redundancia al método y puede además incluir un cribado por RT-PCR para ayudar en la identificación bioinformática de dianas intrónicas abundantes.

Tal y como se describe en la figura 1B, genes marcados de manera distinta en tres regiones diferentes del cromosoma 19 revelan una configuración intracromosómica ordenada muy marcada. Al comparar el patrón de los puntos en diferentes células, los cromosomas pueden adquirir una amplia gama de formas. Resulta sorprendente que algunos datos recogidos sugieran que dentro de determinadas células, las dos copias del cromosoma a veces adoptan un patrón de puntos muy parecido, tal y como está representado en la figura 1B. Esto indica que la expresión y la forma están correlacionadas entre las dos copias de los cromosomas dentro de cada una de las células.

En una segunda serie de experimentos, el sitio de la transcripción de 20 genes únicos a lo largo del cromosoma 19 se detectó con sondas codificadas con colores, tal y como está descrito en la figura 3. Aquí se muestra una tasa de identificación de puntos falsos por debajo del 5%. Estos datos de puntos para los 20 genes se utilizaron para reconstruir las conformaciones cromosómicas de los genes que se transcriben activamente (figura 3).

Ejemplo 2: Medición de la estructura cromosómica y de la expresión génica in vivo

Muchos conocimientos de la biología de sistemas han surgido del uso de la microscopia a cámara rápida para comprender la dinámica de los procesos celulares. Por este motivo, los métodos in vitro de la presente invención también se pueden aplicar a las células vivas para dar a conocer una perspectiva dinámica de la estructura cromosómica y de la expresión génica. Hasta la fecha, no hay manera de examinar la estructura cromosómica o la expresión génica sin introducir perturbaciones (a saber, sin manipulación genética) a través de la microscopia de células vivas sueltas.

Los experimentos se pueden realizar para afrontar los desafíos de la hibridación selectiva de ácidos nucleicos in vivo. Por ejemplo, las consideraciones incluyen la cinética de la hibridación, el diseño de las secuencias, la química de los oligonucleótidos y los métodos de introducción, entre otros muchos. Se puede hibridar selectivamente el ARN de un único intrón de un gen que se expresa mucho mediante el diseño de una serie de 16 a 48 oligonucleótidos, con la idea de que la fijación de un gran número de oligonucleótidos a una única localización en la célula puede dar lugar a un punto detectable. Estos oligonucleótidos se pueden sintetizar con una serie de síntesis químicas de esqueletos modificados (tales como con 2'O-etilo), que son necesarias para hacer que los oligonucleótidos sean insensibles a las diferentes nucleasas celulares. En función de los resultados, se puede alterar el diseño de los oligonucleótidos, quizás mediante el empleo de una «baliza molecular» u otros diseños de sondas que son capaces de disminuir la señal de fondo mediante el uso de extintores, en concreto en el núcleo. Los métodos de introducción de sondas pueden incluir la microinyección, la microporación y los reactivos de transfección con lípidos, por ejemplo. Dados los métodos capaces de detectar un único ARN y el hecho de que la mayoría de puntos intrónicos contienen entre 5 y 10 moléculas de ARN intrónico con las que hibridarse selectivamente, cada uno de los puntos intrónicos se puede detectar in vivo con FISH como control para la validación.

Después de detectar un único intrón, se pueden utilizar los métodos in vitro de la presente invención para marcar a la vez varios intrones, con el objetivo de marcar un cromosoma entero in vivo al mismo tiempo que también se dan a conocer algunas mediciones toscas de la expresión génica. Los puntos pueden estar entonces codificados con colores para reproducir un cromosoma como un código de barras en una célula viva.

Los métodos descritos en la presente memoria dan a conocer un modo de realizar la toma de imágenes de ARN en vivo. Esta toma de imágenes se puede realizar sobre los ARN no codificantes largos (roX2) en las células de Drosophila melanogaster. Este ARN concreto reviste el cromosoma X, lo que da lugar a una distribución espacial muy peculiar en la célula. Esta distribución espacial se explotó para comprobar sin ambigüedad si el método descrito puede detectar ARN endógenos en una única célula viva y puede mostrar la estructura del cromosoma X. Por ejemplo, se halló que una sonda para la toma de imágenes en vivo (que consiste en ocho oligonucleótidos marcados) detectaba el ARN de roX2 y las señales se verificaron mediante la FISH en el ARN (figura 5). En otro ejemplo, se realizó la toma de imágenes de ARN en vivo con un gen endógeno en las células de Drosophila melanogaster. Se actuó selectiva y específicamente sobre el gen MtnA, que se enciende en presencia de cobre. Las

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sondas oligonucleotídicas se introdujeron en las células vivas y, a continuación, las sondas se detectaron después de la fijación. La especificidad de la señal se verificó por hibridación selectiva de la misma diana después de la fijación con la FISH en el ARN con sondas marcadas de manera diferente, lo que dio lugar a la colocalización de las señales (figura 6).

Ejemplo 3: Determinación de la localización y de la frecuencia transcripcional de los fragmentos cromosómicos

La localización de diferentes fragmentos cromosómicos en las células HeLa se determinó en una única célula con los métodos descritos en la presente memoria. Tal y como se muestra en la figura 4, estos fragmentos cromosómicos incluyen dos copias intactas del cromosoma 19 así como otra copia del cromosoma 19 que se había dividido por la mitad, donde una mitad estaba fusionada a una porción del cromosoma 13 y la otra mitad estaba fusionada a una porción del cromosoma 6.

A continuación, se comparó la frecuencia transcripcional de las copias intactas del cromosoma 19 con la de los fragmentos translocados. Mediante la segregación especial de los intrones basada en la proximidad nuclear, se aislaron cada uno de los cromosomas y de los fragmentos de los cromosomas, y se midió la actividad transcripcional instantánea de cada cromosoma. Se midió la actividad transcripcional en unidades de fracción de los cromosomas que muestran un punto intrónico para el gen concreto de los 20 genes a lo largo del cromosoma 19. Se halló que los genes de la porción del cromosoma 19 que estaba fusionada al cromosoma 6 se transcribían aproximadamente con la misma frecuencia que los del cromosoma 19 intacto, mientras que los genes de la porción del cromosoma 19 que estaba fusionada con el cromosoma 13 se expresaban por lo general a una tasa considerablemente más alta que los de la copia intacta. Así pues, la presente invención da a conocer un método in vitro para medir la transcripción en cada cromosoma.

Ejemplo 4: Translocaciones en el cáncer

Muchas formas de cáncer muestran translocaciones cromosómicas estereotípicas (Mitelman et al., 2007, Nat Rev Cáncer 7: 233-245), quizás la más famosa sea la translocación Filadelfia, que da lugar a la formación de una proteína de fusión oncogénica (BRC-ABL), que a su vez conduce a la leucemia mieloide crónica. El desarrollo de las tecnologías de secuenciación de ARN ha demostrado la prevalencia de las fusiones específicas en una serie de cánceres. Hasta el momento, sigue sin saberse cómo se producen exactamente estas translocaciones tan específicas. Las translocaciones específicas podrían surgir debido a la colocalización de determinadas localizaciones cromosómicas durante la transcripción de genes específicos.

El método in vitro descrito en la presente memoria da a conocer un nuevo modo de medir estas translocaciones. Al medir la estructura de los cromosomas a través de la presente invención, se puede detectar la propia translocación de manera directa. Además, el método in vitro se combina con facilidad con la FISH en el ARN, con lo que se facilita la detección del transcrito de fusión mediante la marcación de las dos mitades de la fusión con sondas de distinto color. Esto permitiría medir el nivel de expresión del transcrito de la fusión oncogénica, así como las translocaciones cromosómicas dentro de una única célula.

Por ejemplo, se pueden estudiar las translocaciones que dan lugar a la fusión de las proteínas JAZF1 y JJAZ1, que está implicada en la formación del cáncer de endometrio. Es interesante que los transcritos de la fusión aparecen incluso en las células que no son cancerosas y que no contienen la translocación, lo que sugiere que la transcripción normal de estos genes a veces puede producirse en una proximidad física que a continuación conduce a acontecimientos de transayuste. Se puede actuar selectivamente sobre los dos cromosomas implicados (7 y 17) a la vez que sobre las dos mitades del transcrito de la fusión a través de la FISH en el ARN de una única molécula en las células de tipo silvestre y en las células que albergan la translocación (figura 2 y figura 1C). El análisis de colocalización con los dos cromosomas permite determinar las localizaciones relativas de los locus genéticos relevantes y cómo están relacionados con la forma global de los cromosomas. Mientras tanto, se puede buscar simultáneamente la colocalización de las dos mitades del transcrito de la fusión. La colocalización de las dos sondas implica la presencia del transcrito de la fusión, mientras que la señal independiente de cada una de las sondas representa transcritos sin fusionar. En la actualidad, se sabe si las células de tipo silvestre contienen alguna cantidad del transcrito de la fusión en cada célula o si tan solo una pequeña subpoblación de células produce el transcrito de la fusión en gran abundancia. En cualquier caso, análisis de la presente invención de una única molécula en una única célula permite responder esta cuestión de forma directa y relacionar cualquier hallazgo con la estructura de los cromosomas implicados.

Aunque esta invención ha sido descrita con referencia a realizaciones específicas, es evidente que los expertos en la técnica podrían idear otras realizaciones y variaciones de esta invención sin alejarse del alcance de la invención. Las reivindicaciones adjuntas se han diseñado para interpretar que incluyen todas las realizaciones y variaciones equivalentes.

Claims (11)

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   REIVINDICACIONES

   1. Un método in vitro para la determinación de la conformación estructural de un cromosoma en una célula, que comprende la hibridación de numerosas secuencias diana de ARN en la célula con miembros de al menos un conjunto de sondas oligonucleotídicas marcadas con fluorescencia, en donde las numerosas secuencias diana de ARN se transcriben desde porciones de al menos un cromosoma, y en donde el patrón de las sondas marcadas con fluorescencia que se hibridan con las secuencias diana de ARN es indicativo de la conformación estructural del cromosoma; en donde el ARN diana es ARNm; y en donde la secuencia de ARNm hibridada selectivamente es al menos una porción de un intrón de la secuencia de ARNm.
2. 2. El método in vitro de acuerdo con la reivindicación 1, en donde cada conjunto de los conjuntos de sondas oligonucleotídicas marcadas con fluorescencia está marcado con un fluoróforo diferente, lo que da lugar a un color diferente y diferenciable cuando se mide la fluorescencia.
3. 3. El método in vitro de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la célula es una célula viva; en donde, optativamente, las secuencias diana de ARN son ARN endógeno.
4. 4. El método in vitro de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende la utilización de numerosos conjuntos de sondas oligonucleotídicas marcadas con fluorescencia, en donde cada conjunto de sondas utiliza un color diferenciable.
5. 5. El método in vitro de acuerdo con las reivindicaciones 1 o 4, en donde la localización de las sondas hibridadas es indicativa a la vez de la localización cromosómica de la expresión génica para el ARNm transcrito;

   en donde, opcionalmente, el número, la intensidad, o las dos cosas, de las sondas fluorescentes es indicativo del nivel de expresión génica en la localización cromosómica.
6. 6. El método in vitro de acuerdo con las reivindicaciones 1 o 4, que comprende adicionalmente el recuento de los puntos fluorescentes que corresponden a moléculas únicas de ARN diana para obtener un perfil de expresión génica que se corresponde con la conformación cromosómica asociada que se determina a la vez.
7. 7. El método in vitro de acuerdo con las reivindicaciones 1 o 4, en donde las sondas no están solapadas.
8. 8. El método in vitro de acuerdo con las reivindicaciones 1 o 4, en donde la hibridación de las sondas se produce en el núcleo de la célula.
9. 9. El método in vitro de acuerdo con la reivindicación 4, en donde la célula es una célula viva;

   en donde, optativamente, las secuencias diana de ARNm se transcriben desde un gen endógeno.
10. 10. El método in vitro de acuerdo con las reivindicaciones 1 o 4, en donde la célula es una célula de mamífero, una célula de invertebrado, una célula de levadura o una bacteria.
11. 11. El método in vitro de acuerdo con las reivindicaciones 3 o 4, en donde la célula es una célula humana; o en donde la célula es una célula cancerosa.