KR20160003814A - 순차적 하이브리드화 바코딩에 의한 분자의 멀티플렉스 표지화 - Google Patents

순차적 하이브리드화 바코딩에 의한 분자의 멀티플렉스 표지화 Download PDF

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Abstract

본 발명은 무엇보다도 세포, 조직, 기관 또는 유기체에서 핵산을 검출하고/하거나 정량하기 위한 기술을 제공한다. 일부 구체예에서, 순차적 바코딩을 통해, 본 발명은 많은 수의 표적, 예를 들어, 전사물 및/또는 DNA 유전자좌의 고-처리량 프로파일링을 위한 방법을 제공한다.

Description

순차적 하이브리드화 바코딩에 의한 분자의 멀티플렉스 표지화{MULTIPLEX LABELING OF MOLECULES BY SEQUENTIAL HYBRIDIZATION BARCODING}
관련 출원의 전후-참조
본 출원은 2013년 4월 30일에 출원된 미국 가출원 일련 번호 61/817,651호, 및 2014년 3월 28일에 출원된 61/971,974호에 대한 우선권을 청구하며, 상기 출원 각각의 전체내용은 참조로서 본원에 포함된다.
미연방 후원의 연구 또는 개발에 관한 진술
미국 정부는 미국국립보건원에 의해 수여되는 보조금 번호 R01HD075605에 따라 본 발명에 대한 특정 권리를 갖는다.
발명의 배경
세포의 전사 프로파일링은 많은 목적에 필수적이다. 단일 세포에서 다수의 mRNA를 분리할 수 있는 현미경검사 영상화는 전사물 풍부 및 국소화에 관한 가치 있는 정보를 제공할 수 있으며, 이는 세포 확인의 분자적 기초의 이해 및 질병에 대한 치료 개발에 중요하다. 따라서, 예를 들어, 현미경검사 영상화에 의해 세포에서 전사물을 프로파일링하기 위한 신규하고 개선된 방법이 필요하다.
발명의 개요
본 발명은 세포, 특히 단일 세포 내의 전사물 또는 DNA 유전자좌를 프로파일링하기 위한 현존하는 기술과 관련된 난점 또는 단점에 대한 특정 통찰을 제공한다. 또한, 본 발명은 단일 세포의 프로파일링을 포함하는 효과적인 상기 프로파일링을 달성하기 위해 새로운 기술을 제공한다. 제공된 기술은, 예를 들어, 분리된 세포, 조직 내의 세포, 기관 내의 세포, 및/또는 유기체 내의 세포의 프로파일링을 포함하여 광범위하게 유용하다.
예를 들어, 본 발명은 단일 세포 RNA-seq 또는 qPCR과 같은 현존하는 기술이 단일 세포가 분리되고, 매우 고비용일 수 있고, 노동 집약적일 수 있고, 인공물의 경향이 있을 수 있는 다중 단계 과정인 다중-웰 포맷에 적용되는 것을 필요로 한다는 통찰을 제공한다. 또한, 본 발명은 mRNA를 DNA 주형으로 먼저 전환시키기 위해 효소 반응을 이용하는 현존하는 제자리 서열분석 기술이 매우 비효율적(예를 들어, mRNA로부터 DNA로의 전환 과정에서 비효율적)일 수 있어, 종종 작은 분획의 RNA가 전환되고 검출되는 것을 인지하다. 본 발명은 RT에 대해 1% 및 PLA에 대해 10%로 추정되는 상기 낮은 효율의 하나의 주요 다운사이드(downside)가 유전자 발현 측정에서 유의한 노이즈 및 편향을 도입시킬 수 있다는 점의 특정한 통찰을 제공한다. 본 발명은 단일 분자 형광 제자리 보합법(smFISH)을 이용하는 현존하는 스펙트럼 mRNA 바코딩 기술이 규모 확대를 위해 별개의 형광단을 필요로 하고, 생성될 수 있는 바코드의 수에 있어서 제한될 수 있음을 추가로 인지한다. smFISH는 또한 하이브리드화 동안 프로브를 바코딩 서브셋으로 분할시키는 것을 필요로 한다. smFISH는 종종 표적에 대해 2개 이상의 색을 이용하므로, 이는 이미지에서 고밀도의 대상을 발생시킬 수 있으며, 이는 데이터 분석의 복잡성을 증가시킬 수 있다.
무엇보다도, 본 발명은, 예를 들어, 전사물 및/또는 DNA 유전자좌를 프로파일링하기 위한 새로운 기술을 제공하며, 이는 본 발명 이전의 방법과 관련된 문제 중 하나 이상 또는 전부를 극복한다. 일부 구체예에서, 본 발명은 다양한 표적의 멀티플렉싱을 가능케 하는 순차적 바코딩 계획을 통해 세포에서 다수의 표적, 예를 들어, 전사물 또는 DNA 유전자좌를 검출하기 위한 방법을 제공한다.
일부 구체예에서, 본 발명은,
(a) 복수의 핵산을 포함하는 세포와, 각각이 핵산을 표적으로 하고 검출가능한 모이어티로 표지되는 제 1의 복수의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드를 접촉시키는 것을 포함하는 제 1 접촉 단계를 수행하는 단계로서, 조성물이 적어도,
(i) 제 1 핵산을 표적으로 하고, 제 1의 검출가능한 모이어티로 표지되는 제 1 올리고뉴클레오티드; 및
(ii) 제 2 핵산을 표적으로 하고, 제 2의 검출가능한 모이어티로 표지되는 제 2 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 단계;
(b) 제 1의 복수의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드와 이들의 표적의 상호작용이 검출되도록 제 1 접촉 단계 후에 세포를 영상화시키는 단계;
(c) 세포와 제 2의 복수의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드를 접촉시키는 것을 포함하는 제 2 접촉 단계를 수행하는 단계로서, 상기 제 2의 복수의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드가 제 1의 복수의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드에 의해 표적화되는 중첩 핵산을 표적으로 하는 올리고뉴클레오티드를 포함하고, 상기 제 2의 복수의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드가 적어도,
(i) 임의로 제 1 올리고뉴클레오티드와 서열에 있어서 동일하고, 제 1 핵산을 표적으로 하는 제 3 올리고뉴클레오티드; 및
(ii) 임의로 제 2 올리고뉴클레오티드와 서열에 있어서 동일하고, 제 2 핵산을 표적으로 하는 제 4 올리고뉴클레오티드를 포함하고,
상기 제 2의 복수의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드에 존재하는 올리고뉴클레오티드 중 적어도 하나가 상기 제 1의 복수의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드에서의 동일한 핵산을 표적으로 하는 상응하는 올리고뉴클레오티드와 상이한 검출가능한 모이어티로 표지되는 점에 있어서, 상기 제 2의 복수의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드가 상기 제 1의 복수의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드와 상이하고, 이에 따라 상기 제 2의 복수의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드에서,
(iii) 제 3 올리고뉴클레오티드는 제 1의 검출가능한 모이어티, 제 2의 검출가능한 모이어티 또는 제 3의 검출가능한 모이어티로 표지되고;
(iv) 제 4 올리고뉴클레오티드는 제 1의 검출가능한 모이어티, 제 2의 검출가능한 모이어티, 제 3의 검출가능한 모이어티, 또는 제 4의 검출가능한 모이어티로 표지되고,
상기 제 3 올리고뉴클레오티드가 제 1 올리고뉴클레오티드와 상이한 검출가능한 모이어티로 표지되거나, 상기 제 4 올리고뉴클레오티드가 제 2 올리고뉴클레오티드와 상이한 검출가능한 모이어티로 표지되거나, 둘 모두인, 단계;
(d) 제 2의 복수의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드와 이들의 표적의 상호작용이 검출되도록 제 2 접촉 단계 후에 세포를 영상화시키는 단계; 및
(e) 임의로 상기 접촉 및 영상화 단계를 반복하는 단계로서, 각각의 회에서 제 1 및 제 2의 복수의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드에 의해 표적화되는 중첩 핵산을 표적으로 하는 올리고뉴클레오티드를 포함하는 새로운 복수의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드가 이용되며, 동일한 핵산을 표적으로 하는 올리고뉴클레오티드의 검출가능한 모이어티 표지화에서의 적어도 하나의 차이로 인해, 각각의 이용된 복수의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드가 각각의 다른 이용된 복수의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드와 상이한 단계를 포함하는, 방법을 제공한다.
일부 구체예에서, 본 발명(예를 들어, 도 1에 표현된 바와 같음)은,
(a) 복수의 전사물 및 DNA 유전자좌를 포함하는 세포와, 각각이 전사물 또는 DNA 유전자좌를 표적으로 하고 검출가능한 모이어티로 표지되는 제 1의 복수의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드를 접촉시키는 것을 포함하는 제 1 접촉 단계를 수행하는 단계로서, 조성물이 적어도,
(i) 제 1 전사물 또는 DNA 유전자좌를 표적으로 하고, 제 1의 검출가능한 모이어티로 표지되는 제 1 올리고뉴클레오티드; 및
(ii) 제 2 전사물 또는 DNA 유전자좌를 표적으로 하고, 제 2의 검출가능한 모이어티로 표지되는 제 2 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 단계;
(b) 제 1의 복수의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드에 의한 이들의 표적의 인지가 검출되도록 제 1 접촉 단계 후에 세포를 영상화시키는 단계;
(c) 세포와 제 2의 복수의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드를 접촉시키는 것을 포함하는 제 2 접촉 단계를 수행하는 단계로서, 상기 제 2의 복수의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드가 제 1의 복수의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드에 의해 표적화되는 중첩 전사물 및/또는 DNA 유전자좌를 표적으로 하는 올리고뉴클레오티드를 포함하고, 상기 제 2의 복수의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드가 적어도,
(i) 임의로 제 1 올리고뉴클레오티드와 서열에 있어서 동일하고, 제 1 전사물 또는 DNA 유전자좌를 표적으로 하는 제 3 올리고뉴클레오티드; 및
(ii) 임의로 제 2 올리고뉴클레오티드와 서열에 있어서 동일하고, 제 2 전사물 또는 DNA 유전자좌를 표적으로 하는 제 4 올리고뉴클레오티드를 포함하고,
상기 제 2의 복수의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드에 존재하는 올리고뉴클레오티드 중 적어도 하나가 상기 제 1의 복수의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드에서의 동일한 전사물 또는 DNA 유전자좌를 표적으로 하는 상응하는 올리고뉴클레오티드와 상이한 검출가능한 모이어티로 표지되는 점에 있어서, 상기 제 2의 복수의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드가 상기 제 1의 복수의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드와 상이하고, 이에 따라 상기 제 2의 복수의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드에서,
(iii) 제 3 올리고뉴클레오티드는 제 1의 검출가능한 모이어티, 제 2의 검출가능한 모이어티 또는 제 3의 검출가능한 모이어티로 표지되고;
(iv) 제 4 올리고뉴클레오티드는 제 1의 검출가능한 모이어티, 제 2의 검출가능한 모이어티, 제 3의 검출가능한 모이어티, 또는 제 4의 검출가능한 모이어티로 표지되고,
상기 제 3 올리고뉴클레오티드가 제 1 올리고뉴클레오티드와 상이한 검출가능한 모이어티로 표지되거나, 상기 제 4 올리고뉴클레오티드가 제 2 올리고뉴클레오티드와 상이한 검출가능한 모이어티로 표지되거나, 둘 모두인, 단계;
(d) 제 2의 복수의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드에 의한 이들의 표적의 인지가 검출되도록 제 2 접촉 단계 후에 세포를 영상화시키는 단계; 및
(e) 임의로 상기 접촉 및 영상화 단계를 반복하는 단계로서, 각각의 회에서 제 1 및 제 2의 복수의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드에 의해 표적화되는 중첩 전사물 또는 DNA 유전자좌를 표적으로 하는 올리고뉴클레오티드를 포함하는 새로운 복수의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드가 이용되며, 동일한 전사물 또는 DNA 유전자좌를 표적으로 하는 올리고뉴클레오티드의 검출가능한 모이어티 표지화에서의 적어도 하나의 차이로 인해, 각각의 이용된 복수의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드가 각각의 다른 이용된 복수의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드와 상이한 단계를 포함하는, 방법을 제공한다.
일부 구체예에서, 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드에 의해 표적화되는 핵산은 전사물 및/또는 DNA 유전자좌이거나 이들을 포함한다. 일부 구체예에서, 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드에 의해 표적화되는 핵산은 전사물이거나 이를 포함한다. 일부 구체예에서, 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드에 의해 표적화되는 핵산은 전사물이다. 일부 구체예에서, 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드에 의해 표적화되는 핵산은 DNA 유전자좌이거나 이를 포함한다. 일부 구체예에서, 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드에 의해 표적화되는 핵산은 DNA 유전자좌이다. 일부 구체예에서, 접촉 단계에서 사용된 각각의 복수의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드는 동일한 전사물 및/또는 DNA 유전자좌를 표적으로 한다.
일부 구체예에서, 접촉 단계에서 이용되는 복수의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드는 한 세트의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드로 언급된다. 일부 구체예에서, 한 세트의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드의 표적은 한 세트의 표적으로 언급된다. 일부 구체예에서, 한 세트의 표적은 전사물이거나 이를 포함한다. 일부 구체예에서, 한 세트의 표적은 전사물이다. 일부 구체예에서, 한 세트의 각각의 표적은 전사물이거나 이를 포함한다. 일부 구체예에서, 한 세트의 각각의 표적은 전사물이다. 일부 구체예에서, 한 세트의 표적은 DNA 유전자좌이거나 이를 포함한다. 일부 구체예에서, 한 세트의 표적은 DNA 유전자좌이다. 일부 구체예에서, 한 세트의 각각의 표적은 DNA 유전자좌이거나 이를 포함한다. 일부 구체예에서, 한 세트의 각각의 표적은 DNA 유전자좌이다.
일부 구체예에서, 제공된 방법은 영상화 단계 후에 복수의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드를 제거하는 단계를 임의로 포함한다. 일부 구체예에서, 제공된 방법은 각각의 영상화 단계 후에 복수의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드를 제거하는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, 제거 단계는 복수의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드와 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드를 분해하는 효소를 접촉시키는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 제거 단계는 복수의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드와 DNase를 접촉시키는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 제거 단계는 복수의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드와 RNase를 접촉시키는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 제거 단계는 광표백을 포함한다.
일부 구체예에서, 각각의 세트는 동일한 전사물 및/또는 DNA 유전자좌를 표적으로 하는 2개 이상의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구체예에서, 동일한 전사물 및/또는 DNA 유전자좌를 표적으로 하는 한 세트의 2개 이상의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드는 동일한 검출가능한 신호를 발생시킨다. 일부 구체예에서, 동일한 전사물 및/또는 DNA 유전자좌를 표적으로 하는 한 세트의 모든 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드는 동일한 검출가능한 신호를 발생시킨다. 일부 구체예에서, 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드가 형광단으로 표지되는 경우, 검출가능한 신호는 특정 색이다. 일부 구체예에서, 동일한 전사물 및/또는 DNA 유전자좌를 표적으로 하는 한 세트의 모든 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드는 동일한 검출가능한 색을 제공하는 형광단으로 표지된다.
일부 구체예에서, 동일한 전사물 및/또는 DNA 유전자좌를 표적으로 하는 한 세트의 2개 이상의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드는 동일한 검출가능한 표지를 갖는다. 일부 구체예에서, 동일한 전사물 및/또는 DNA 유전자좌를 표적으로 하는 한 세트의 모든 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드는 동일한 검출가능한 표지를 갖는다. 일부 구체예에서, 동일한 전사물 및/또는 DNA 유전자좌를 표적으로 하는 모든 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드는 동일한 형광단을 갖는다.
일부 구체예에서, 본 발명은 제공된 방법을 수행하는데 유용한 조성물을 제공한다.
일부 구체예에서, 본 발명은 복수의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드 각각이 핵산을 표적으로 하고, 검출가능한 모이어티로 표지되는, 상기 올리고뉴클레오티드를 포함하는 조성물을 제공하며, 상기 조성물은 적어도,
(i) 제 1 핵산을 표적으로 하고, 제 1의 검출가능한 모이어티로 표지된 제 1 올리고뉴클레오티드; 및
(ii) 제 2 핵산을 표적으로 하고, 제 2의 검출가능한 모이어티로 표지된 제 2 올리고뉴클레오티드를 포함한다.
일부 구체예에서, 본 발명은 복수의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드 각각이 핵산을 표적으로 하고, 검출가능한 모이어티로 표지되는, 상기 올리고뉴클레오티드를 포함하는 키트를 제공하며, 상기 키트는 적어도,
(i) 제 1 핵산을 표적으로 하고, 제 1의 검출가능한 모이어티로 표지된 제 1 올리고뉴클레오티드;
(ii) 제 2 핵산을 표적으로 하고, 제 2의 검출가능한 모이어티로 표지된 제 2 올리고뉴클레오티드;
(iii) 임의로 제 1 올리고뉴클레오티드와 서열에 있어서 동일하고, 제 1 핵산을 표적으로 하고, 제 1, 제 2 또는 제 3의 검출가능한 모이어티로 표지된 제 3 올리고뉴클레오티드; 및
(iv) 임의로 제 2 올리고뉴클레오티드와 서열에 있어서 동일하고, 핵산을 표적으로 하고, 제 1, 제 2, 제 3 또는 제 4의 검출가능한 모이어티로 표지된 제 4 올리고뉴클레오티드를 포함하고,
상기 제 3 올리고뉴클레오티드는 제 1 올리고뉴클레오티드와 상이한 검출가능한 모이어티로 표지되거나, 상기 제 4 올리고뉴클레오티드는 제 2 올리고뉴클레오티드와 상이한 검출가능한 모이어티로 표지되거나, 둘 모두이다.
일부 구체예에서, 검출가능한 모이어티는 형광단이거나 이를 포함한다.
일부 구체예에서, 복수의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드는 2개 이상의 핵산("표적")을 표적으로 한다. 일부 구체예에서, 표적은 전사물이거나 이를 포함한다. 일부 구체예에서, 표적은 전사물이다. 일부 구체예에서, 표적은 RNA이다. 일부 구체예에서, 표적은 mRNA이다. 일부 구체예에서, 표적은 tRNA이다. 일부 구체예에서, 표적은 rRNA이다. 일부 구체예에서, 표적은 비-코딩 RNA이다. 일부 구체예에서, 표적은 DNA 유전자좌이거나 이를 포함한다. 일부 구체예에서, 전사물은 DNA 유전자좌이다. 일부 구체예에서, 표적은 전사물의 유전자좌이다. 일부 구체예에서, DNA 서열의 다양한 전사물, 예를 들어, 유전자의 스플라이싱 변이체는 다양한 표적을 구성하며, 하나 이상의 변이체는 독립적으로 표적화되고 검출되거나 정량될 수 있다. 일부 구체예에서, 본 발명은 개별적 스플라이싱 변이체를 검출하기 위한 방법, 조성물 또는 키트를 제공한다. 일부 구체예에서, 본 발명은 단일 뉴클레오티드 다형태(SNP)를 검출하기 위한 방법, 조성물, 또는 키트를 제공한다.
일부 구체예에서, 제공된 방법은 표적, 예를 들어, 전사물 또는 DNA 유전자좌를 정량한다.
일부 구체예에서, 동일한 표적을 표적으로 하는 올리고뉴클레오티드는 동일한 세트의 서열을 가지며, 즉, 다양한 단계에서 적용되는 경우, 올리고뉴클레오티드 사이의 차이는 서열이 아니라 모이어티 내에 있다.
정의
동물: 본원에서 사용되는 용어 "동물"은 동물계의 임의의 일원을 나타낸다. 일부 구체예에서, "동물"은 임의의 발달 단계의 인간을 나타낸다. 일부 구체예에서, "동물"은 임의의 발달 단계의 비-인간 동물을 나타낸다. 특정 구체예에서, 비-인간 동물은 포유동물(예를 들어, 설치류, 마우스, 래트, 토끼, 원숭이, 개, 고양이, 양, 소, 영장류, 및/또는 돼지)이다. 일부 구체예에서, 동물은 포유동물, 조류, 파충류, 양서류, 어류, 및/또는 벌레를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 일부 구체예에서, 동물은 트랜스제닉 동물, 유전학적으로 조작된 동물, 및/또는 클론일 수 있다.
대략: 수와 관련하여 본원에서 사용되는 용어 "대략" 또는 "약"은 일반적으로 달리 언급되거나 문맥으로부터 달리 명백하지 않는 한 수의 어떤 방향에서든(초과 또는 미만) 5%, 10%, 15%, 또는 20%의 범위 내에 속하는 수를 포함하는 것으로 받아들여진다(상기 수가 가능한 값의 0% 미만이거나 100% 초과인 경우 제외). 일부 구체예에서, 투여량과 관련하여 용어 "약"의 사용은 ± 5 mg/kg/일을 의미한다.
상동성: "상동성" 또는 "동일성" 또는 "유사성"은 2개의 핵산 분자 사이의 서열 유사성을 나타낸다. 상동성 및 동일성은 각각 비교 목적을 위해 정렬될 수 있는 각각의 서열 내의 위치를 비교함으로써 결정될 수 있다. 비교되는 서열 내의 동등한 위치가 동일 염기에 의해 점유되는 경우, 분자는 상기 위치에서 동일하고; 동등한 부위가 동일하거나 유사한 핵산 잔기(예를 들어, 입체구조적 및/또는 전자적 특성에 있어서 유사함)에 의해 점유되는 경우, 분자는 상기 위치에서 상동성(유사한)인 것으로 언급될 수 있다. 상동성/유사성 또는 동일성의 백분율의 표현은 비교되는 서열에 의해 공유되는 위치에서 동일하거나 유사한 핵산의 수의 함수를 나타낸다. "관련되지 않거나", "비상동성"인 서열은 본원에 기재된 서열과 40% 미만의 동일성, 35% 미만의 동일성, 30% 미만의 동일성, 또는 25% 미만의 동일성을 공유한다. 2개의 서열의 비교에서, 잔기(아미노산 또는 핵산)의 부재 또는 잔여 잔기의 존재는 또한 동일성 및 상동성/유사성을 감소시킨다.
일부 구체예에서, 용어 "상동성"은 유사한 기능 또는 모티프를 갖는 유전자를 확인하기 위해 이용되는 서열 유사성의 수학적 기반의 비교를 기재한다. 본원에 기재된 핵산 서열은 공개적 데이터베이스에 대한 검색을 수행하기 위해, 예를 들어, 다른 패밀리 일원, 관련된 서열 또는 동족체를 확인하기 위해 "질의 서열"로 이용될 수 있다. 일부 구체예에서, 상기 검색은 문헌[Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10]의 NBLAST 및 XBLAST 프로그램(version 2.0)을 이용하여 수행될 수 있다. 일부 구체예에서, BLAST 뉴클레오티드 검색은 본 발명의 핵산 분자에 상동성인 뉴클레오티드 서열을 수득하기 위해 NBLAST 프로그램, 스코어=100, 워드 길이=12로 수행될 수 있다. 일부 구체예에서, 비교 목적을 위해 갭이 있는 정렬을 수득하기 위해, 문헌[Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402]에 기재된 바와 같이 Gapped BLAST가 이용될 수 있다. BLAST 및 Gapped BLAST 프로그램을 이용하는 경우, 각각의 프로그램(예를 들어, XBLAST 및 BLAST)의 디폴트 파라미터가 이용될 수 있다(www.ncbi.nlm.nih.gov 참조).
동일성: 본원에서 사용되는 바와 같은 "동일성"은 서열이 서열 매칭을 최대화시키도록, 즉, 갭 및 삽입을 고려하여 정렬되는 경우 2개 이상의 서열 내의 상응하는 위치에서의 동일한 뉴클레오티드 잔기의 백분율을 의미한다. 동일성은 문헌[Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; 및 Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991; 및 Carillo, H., and Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48: 1073 (1988)]에 기재된 것을 포함하나 이에 제한되지는 않는 공지된 방법에 의해 용이하게 계산될 수 있다. 동일성을 결정하기 위한 방법은 시험되는 서열 사이의 가장 큰 매치를 제공하도록 설계된다. 또한, 동일성을 결정하는 방법은 공적으로 이용가능한 컴퓨터 프로그램에서 요약된다. 2개의 서열 사이의 동일성을 결정하기 위한 컴퓨터 프로그램 방법은 GCG 프로그램 패키지(Devereux, J., et al, Nucleic Acids Research 12(1): 387 (1984)), BLASTP, BLASTN, 및 FASTA(Altschul, S. F. et al, J. Molec. Biol. 215: 403-410 (1990) 및 Altschul et al. Nuc. Acids Res. 25: 3389-3402 (1997))를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. BLAST X 프로그램은 NCBI 및 다른 정보원(BLAST Manual, Altschul, S., et al, NCBI NLM NIH Bethesda, Md. 20894; Altschul, S., et al, J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990))으로부터 공적으로 이용가능하다. 동일성을 결정하기 위해 널리 공지된 스미스 워터맨 알고리즘(Smith Waterman algorithm)이 또한 이용될 수 있다.
시험관내: 본원에서 사용되는 용어 "시험관내"는 유기체(예를 들어, 동물, 식물, 및/또는 미생물) 내가 아닌 인공 환경 내, 예를 들어, 시험관 또는 반응 용기 내, 세포 배양물 내 등에서 발생하는 사건을 나타낸다.
생체내: 본원에서 사용되는 용어 "생체내"는 유기체(예를 들어, 동물, 식물, 및/또는 미생물) 내에서 발생하는 사건을 나타낸다.
올리고뉴클레오티드: 용어 "올리고뉴클레오티드"는 핵염기, 변형된 핵염기, 당, 변형된 당, 포스페이트 브릿지, 또는 변형된 브릿지의 임의의 조합을 함유하는 뉴클레오티드 단량체의 중합체 또는 소중합체를 나타낸다.
본 발명의 올리고뉴클레오티드는 다양한 길이의 올리고뉴클레오티드일 수 있다. 특정 구체예에서, 올리고뉴클레오티드는 약 2 내지 약 200개의 뉴클레오티드 길이 범위일 수 있다. 다양한 관련 구체예에서, 단일-가닥, 이중-가닥, 및 삼중-가닥의 올리고뉴클레오티드는 약 4 내지 약 10개의 뉴클레오티드, 약 10 내지 약 50개의 뉴클레오티드, 약 20 내지 약 50개의 뉴클레오티드, 약 15 내지 약 30개의 뉴클레오티드, 약 20 내지 약 30개의 뉴클레오티드 길이의 범위일 수 있다. 일부 구체예에서, 올리고뉴클레오티드는 약 9 내지 약 39개의 뉴클레오티드 길이이다. 일부 구체예에서, 올리고뉴클레오티드는 적어도 4개의 뉴클레오티드 길이이다. 일부 구체예에서, 올리고뉴클레오티드는 적어도 5개의 뉴클레오티드 길이이다. 일부 구체예에서, 올리고뉴클레오티드는 적어도 6개의 뉴클레오티드 길이이다. 일부 구체예에서, 올리고뉴클레오티드는 적어도 7개의 뉴클레오티드 길이이다. 일부 구체예에서, 올리고뉴클레오티드는 적어도 8개의 뉴클레오티드 길이이다. 일부 구체예에서, 올리고뉴클레오티드는 적어도 9개의 뉴클레오티드 길이이다. 일부 구체예에서, 올리고뉴클레오티드는 적어도 10개의 뉴클레오티드 길이이다. 일부 구체예에서, 올리고뉴클레오티드는 적어도 11개의 뉴클레오티드 길이이다. 일부 구체예에서, 올리고뉴클레오티드는 적어도 12개의 뉴클레오티드 길이이다. 일부 구체예에서, 올리고뉴클레오티드는 적어도 15개의 뉴클레오티드 길이이다. 일부 구체예에서, 올리고뉴클레오티드는 적어도 20개의 뉴클레오티드 길이이다. 일부 구체예에서, 올리고뉴클레오티드는 적어도 25개의 뉴클레오티드 길이이다. 일부 구체예에서, 올리고뉴클레오티드는 적어도 30개의 뉴클레오티드 길이이다. 일부 구체예에서, 올리고뉴클레오티드는 적어도 18개의 뉴클레오티드 길이의 상보적 가닥의 듀플렉스이다. 일부 구체예에서, 올리고뉴클레오티드는 적어도 21개의 뉴클레오티드 길이의 상보적 가닥의 듀플렉스이다.
미리 결정된: 미리 결정된은, 예를 들어, 무작위적으로 발생하거나 달성되는 것에 반하여 고의적으로 선택되는 것을 의미한다. 특정한 개별적 올리고뉴클레오티드를 함유할 수 있는 조성물은, 이들이 특정 올리고뉴클레오티드를 의도적으로 발생시키기 위해 조절될 수 없는 과정을 통해 발생된 것이므로, "미리 결정된" 조성물이 아니다. 일부 구체예에서, 미리 결정된 조성물은 의도적으로 재현될 수 있는(예를 들어, 조절된 과정의 반복을 통함) 것이다.
샘플: 본원에서 사용되는 용어 "샘플"은 본원에 기재된 바와 같은 관심 공급원으로부터 수득되거나 유래된 생물학적 샘플을 나타낸다. 일부 구체예에서, 관심 공급원은 유기체, 예를 들어, 동물 또는 인간을 포함한다. 일부 구체예에서, 생물학적 샘플은 생물학적 조직 또는 유체를 포함한다. 일부 구체예에서, 생물학적 샘플은 골수; 혈액; 혈액 세포; 복수; 조직 또는 미세 바늘 생검 샘플; 세포-함유 체액; 부동성 핵산; 객담; 타액; 소변; 뇌척수액, 복막액; 흉수; 대변; 림프; 부인과 유체; 피부 면봉; 질내 면봉; 구강 면봉; 비내 면봉; 세척액 또는 세척, 예를 들어, 도관 세척 또는 기관지폐포 세척; 흡인물; 찰과표본; 골수 검체; 조직 생검 검체; 외과 검체; 대변, 다른 체액, 분비물, 및/또는 배설물; 및/또는 이들로부터의 세포 등이거나 이들을 포함한다. 일부 구체예에서, 생물학적 샘플은 개체로부터 수득된 세포이거나 이를 포함한다. 일부 구체예에서, 샘플은 임의의 적절한 수단에 의해 관심 공급원으로부터 직접 수득된 "일차 샘플"이다. 예를 들어, 일부 구체예에서, 일차 생물학적 샘플은 생검(예를 들어, 미세 바늘 흡인 또는 조직 생검), 수술, 체액 수거물(예를 들어, 혈액, 림프, 대변 등) 등으로 구성된 군으로부터 선택된 방법에 의해 수득된다. 일부 구체예에서, 문맥으로부터 명백한 바와 같이, 용어 "샘플"은 일차 샘플을 가공(예를 들어, 하나 이상의 성분의 제거 및/또는 하나 이상의 작용제의 첨가에 의함)함으로써 수득되는 제조물을 나타낸다. 예를 들어, 반-투과 막을 이용한 여과. 이러한 "가공된 샘플"은, 예를 들어, 샘플로부터 추출되거나, 일차 샘플을 mRNA의 증폭 또는 역전사, 특정 성분의 분리 및/또는 정제 등과 같은 기술에 적용시킴으로써 수득되는 핵산 또는 단백질을 포함할 수 있다.
대상체: 본원에서 사용되는 용어 "대상체" 또는 "시험 대상체"는, 예를 들어, 실험, 진단, 예방 및/또는 치료 목적을 위해 제공된 화합물 또는 조성물이 본 발명에 따라 투여되는 임의의 유기체를 나타낸다. 통상적인 대상체는 동물(예를 들어, 포유동물, 예를 들어, 마우스, 래트, 토끼, 비-인간 영장류, 및 인간; 곤충; 벌레 등) 및 식물을 포함한다. 일부 구체예에서, 대상체는 질병, 장애 및/또는 질환에 걸릴 수 있고/있거나 이들에 걸리기 쉬울 수 있다.
실질적으로: 본원에서 사용되는 용어 "실질적으로"는 전체 또는 거의 전체 정도 또는 어느 정도의 관심 특징 또는 특성을 나타내는 정성적 상태를 나타낸다. 생물학적 분야의 당업자는 생물학적 및 화학적 현상이 완료에 이르고/이르거나 진행되어 완료되거나 확실한 결과를 달성하거나 피한다 하더라도 이들이 드물게 발생하는 것을 이해할 것이다. 따라서, 용어 "실질적으로"는 많은 생물학적 및/또는 화학적 현상에서 고유한 완료의 잠재적 결핍을 포착하기 위해 본원에서 사용된다.
~에 걸린: 질병, 장애, 및/또는 질환에 "걸린" 개체는 질병, 장애, 및/또는 질환의 하나 이상의 증상으로 진단되고/되거나 이들을 나타낸다.
~에 민감한: 질병, 장애, 및/또는 질환에 "민감한" 개체는 일반 대중의 일원보다 질병, 장애, 및/또는 질환이 발생할 위험이 더 높은 사람이다. 일부 구체예에서, 질병, 장애 및/또는 질환에 민감한 개체는 질병, 장애, 및/또는 질환으로 진단되지 않을 수 있다. 일부 구체예에서, 질병, 장애, 및/또는 질환에 민감한 개체는 질병, 장애, 및/또는 질환의 증상을 나타낼 수 있다. 일부 구체예에서, 질병, 장애, 및/또는 질환에 민감한 개체는 질병, 장애, 및/또는 질환의 증상을 나타내지 않을 수 있다. 일부 구체예에서, 질병, 장애, 및/또는 질환에 민감한 개체는 질병, 장애, 및/또는 질환이 발생할 것이다. 일부 구체예에서, 질병, 장애, 및/또는 질환에 민감한 개체는 질병, 장애, 및/또는 질환이 발생하지 않을 것이다.
치료하다: 본원에서 사용되는 용어 "치료하다", "치료" 또는 "치료하는"은 질병, 장애, 및/또는 질환의 발생을 부분적 또는 완전히 완화시키고/시키거나, 개선시키고/시키거나, 경감시키고/시키거나, 억제하고/하거나, 예방하고/하거나, 지연시키고/시키거나, 질병, 장애, 및/또는 질환의 중증도를 감소시키고/시키거나, 질병, 장애, 및/또는 질환의 하나 이상의 증상 또는 특징의 발생을 감소시키기 위해 이용되는 임의의 방법을 나타낸다. 치료는 질병, 장애, 및/또는 질환의 징후를 나타내지 않는 대상체에 제공될 수 있다. 일부 구체예에서, 치료는, 예를 들어, 질병, 장애, 및/또는 질환과 관련된 병리가 발생할 위험을 감소시키기 위한 목적을 위해 질병, 장애, 및/또는 질환의 초기 징후만 나타내는 대상체에 제공될 수 있다.
야생형: 본원에서 사용되는 용어 "야생형"은 "정상"(돌연변이된, 질병에 걸린, 변경된 등과 대조됨) 상태 또는 상황에서 자연적으로 발견되는 바와 같은 구조 및/또는 활성을 갖는 존재물을 나타내는 당 분야에 이해된 의미를 갖는다. 당업자는 야생형 유전자 및 폴리펩티드가 종종 다수의 상이한 형태(예를 들어, 대립유전자)로 존재하는 것을 인지할 것이다.
도면의 간단한 설명
도 1. 본 발명의 개시에 의해 제공된 방법이 도 1에 표시된다.
도 2. 제공된 방법의 예시적인 순차적 바코딩. (a) 순차적 바코딩의 개략도. 하이브리드화의 각각의 라운드에서, 다수의 프로브(예를 들어, 24개)가 각각의 전사물에 대해 하이브리드화되고, 영상화된 후, DNase I 처리에 의해 스트리핑되었다. 다양한 라운드의 하이브리드화에서 동일한 프로브 서열이 사용될 수 있으나, 프로브는 다양한 형광단에 커플링되었다. (b) 다수의 효모 세포에 대한 3 라운드의 하이브리드화로부터의 복합 4-색 FISH 데이터. 12개의 유전자가 2 라운드의 하이브리드화에 의해 인코딩되었고, 세번째 하이브리드화는 하이브리드화 1과 동일한 프로브를 이용하였다. 박스 영역은 각각의 이미지의 우측 하부 코너에서 확대되었다. 매칭된 스폿이 제시되었고, 바코드가 추출되었다. 이론으로 제한하고자 하는 것은 아니지만 공동-국소화가 없는 스폿은 세포에서의 프로브의 비특이적 결합뿐만 아니라 미스-하이브리드화(mis-hybridization)로 인한 것일 수 있다. 단일 세포에서 상응하는 전사물의 풍부함을 제공하기 위해 각각의 바코드의 수가 정량되었다, (c) 예시적 바코드. mRNA 1: 황색-청색-황색; mRNA 2: 녹색-자색-녹색; mRNA 3: 자색-청색-자색; 및 mRNA 4: 청색-자색-청색.
도 3. 순차적 하이브리드화 및 바코딩의 개략도. (a) 순차적 하이브리드화 및 바코딩의 개략도. (b) 세포의 FISH 이미지의 개략도. 하이브리드화의 각각의 라운드에서, 동일한 스폿이 검출되었으나, 전사물과 관련된 염료는 변하였다. mRNA의 정체는 하이브리드화되는 염료의 시간적 순서로 인코딩되었다.
도 4. DNase I은 mRNA에 결합된 smFISH 프로브를 효과적으로 제거한다. DNase I은 mRNA에 결합된 smFISH 프로브를 효과적으로 제거한다. 스폿은 항-표백 완충액 중 4시간의 DNase I 처리 전 및 후에 영상화되었다. 처리 후의 강도 비의 평균, 정중 및 STD는 11.5%, 8.3% 및 11%였다. DNase I 처리 후 및 전의 스폿 강도의 비가 각각의 스폿에 대해 작도되었다, n = 1084 스폿.
도 5. 광표백은 DNase I 처리 후의 잔여 강도를 제거한다. 광표백은 DNase I 처리 후의 잔여 강도를 제거한다. 스폿은 4시간의 DNase I 처리 후의 10초의 여기에 의해 표백되었다. 표백 후의 강도 비의 평균, 정중 및 STD는 0.03%, 0.01% 및 0.049%였다. DNase I 처리 후 및 전의 스폿 강도의 비가 각각의 스폿에 대해 작도되었다, n = 1286 스폿.
도 6. mRNA는 다수의 라운드의 재-하이브리드화에 걸쳐 안정적이다. mRNA는 다수의 라운드의 재-하이브리드화에 걸쳐 안정적이었다. smFISH 스폿의 강도 분포가 6회의 하이브리드화에 걸쳐 작도되었다. 2회의 하이브리드화가 3회 반복되어 6회의 전체 하이브리드화가 이루어졌다. 스폿은 이들의 다음의 동일한 하이브리드화에서의 스폿과의 공동-국소화에 의해 확인되었다. 각각의 박스플롯(boxplot)에 대해,계수된 스폿의 수는 191 내지 1337이었다.
도 7. 세포 당 후속 라운드의 하이브리드화에서 재발생하는 하이브리드화의 처음 2회의 라운드로부터 확인된 바코드의 분획. 세포 당 후속 라운드의 하이브리드화에서 재발생하는 하이브리드화의 처음 2회의 라운드로부터 확인된 바코드의 분획. 바코드는 모든 3회의 하이브리드화를 통한 공동-국소화에 의해 확인되었다. 바코드의 77.9 ± 5.6%가 재발생하였다, n = 37 세포.
도 8. 하이브리드화 1 및 3에서 FISH 포인트 사이의 포인트별 치환(point-wise displacement). 하이브리드화 1 및 3에서 FISH 포인트 사이의 포인트별 치환. 하이브리드화 1 및 3에서 Cy5 이미지에서의 FISH 도트가 추출되었고, 2D 가우시안(2D Gaussians)으로 적합화되었다. 포인트별 치환이 3D 히스토그램에 제시되었다. 표준 편차는 105.8nm였고, 이는 mRNA가 2 라운드의 하이브리드화 사이에서 100nm로 국소화될 수 있음을 나타낸다, n = 1199 스폿.
도 9. 동일한 프로브 세트의 반복 하이브리드화(하이브리드화 1 및 3) 사이에 확인된 바코드. 동일한 프로브 세트의 반복 하이브리드화(하이브리드화 1 및 3) 사이에 확인된 바코드. 바코드는 하이브리드화 사이의 공동-국소화에 의해 확인되었다. 각각의 컬럼은 개별적 세포에 해당한다. 각각의 열은 하이브리드화 1 및 3 사이에 확인된 특정 바코드에 해당한다. 굵은 글씨의 열의 명칭은 하이브리드화 1 및 3 사이에 공동-국소화되어야 하는 반복된 색 바코드에 해당한다. 굵은 글씨가 아닌 열의 명칭은 거짓 양성 바코드에 해당한다. 예를 들어, (알렉사(Alexa) 532, 알렉사 532)에 대해 많은 수의 바코드가 검출되었고, 이는 알렉사 532 채널에서의 스폿의 공동-국소화를 나타낸다, n = 37 세포. Al532 = 알렉사 532. Al594 = 알렉사 594. Al647 = 알렉사 647.
도 10. 바코드 추출로부터의 단일 세포 mRNA 수준. 바코드 추출로부터의 단일 세포 mRNA 수준. 바코드는 하이브리드화 1 및 2 사이의 공동-국소화에 의해 확인되었다. 각각의 컬럼은 개별적 세포에 해당한다, n = 37 세포. Al532 = 알렉사 532. Al594 = 알렉사 594. Al647 = 알렉사 647. 상부로부터 하부 방향: YLR194c, CMK2, GYP7, PMC1, NPT1, SOK2, UIP3, RCN2, DOA1, HSP30, PUN1 및 YPS1.
도 11. 마우스 배아 줄기 세포(mESC)에서의 나노그 알렉사(Nanog Alexa) 647 프로브의 DNase I 스트리핑. 마우스 배아 줄기 세포(mESC)에서의 나노그 알렉사 647 프로브의 DNase I 스트리핑. 나노그를 표적으로 하는 48개의 프로브가 mESC에서 하이브리드화되었다. 프로브는 3 유닛/μL의 농도에서의 30분의 DNase I 인큐베이션에 의해 벗겨내어졌다.
도 12. 마우스 배아 줄기 세포(mESC)에서의 나노그 mRNA의 재-하이브리드화. 마우스 배아 줄기 세포(mESC)에서의 나노그 mRNA의 재-하이브리드화. 프로브는 3 유닛/μL의 농도에서의 30분의 DNase I 인큐베이션에 의해 벗겨내어졌다. 나노그 알렉사 647 프로브는 12시간 동안 재-하이브리드화되었고, 영상화되었다. 이미지는 1.5 μm 마다 획득된 11개의 이미지의 z 스택으로부터 생성된 2D 최대 투상이었다.
도 13. 피질에서의 β-액틴(적색)의 HCR 검출 및 100μm 관상 절편에서의 역행 추적자(플루오로골드(fluorogold), 녹색)를 이용한 시각화. 전체 관상 절편이 10x 및 60x(확대된 삽입물) 둘 모두에서 영상화되었다. 60X 이미지에서, 개별적 적색 도트는 단일한 β-액틴 mRNA 분자에 해당한다. β-액틴 발현은 역행 추적자(녹색)로 태깅된 신경세포의 원위 부분모집단을 동시에 검출하면서 형광 초점을 계수함으로써 정량될 수 있다.
도 14. HCR로 표지된 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드는 20μm 뇌 절편에서 RNA의 단일 분자를 검출하는데 있어서 형광단으로 직접 표지된 smFISH 프로브만큼 특이적이었다. HCR 프로브(좌측) 및 smFISH 프로브(우측)는 β-액틴을 동시에 표적화하였고, 공동-국소화시켰다. HCR의 개선된 S/N을 인지하라.
도 15. 20μm 뇌 절편에서 충분히 재하이브리드화된 HCR로 표지된 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드. 2회의 하이브리드화 사이에서 DNase 처리를 이용하여 hyb1 및 hyb2에서 HCR 스폿이 공동 국소화되었다. 이는 seqFISH 프로토콜을 이용하여 HCR이 완전히 통합될 수 있음을 나타내었다.
도 16. 니슬(Nissl)을 이용한 CLARITY: Thy-1-eYFP 마우스 뇌의 1mm-두께의 관상 절편(Bregma AP, 2.3-1.3mm)이 NeuroTrace 형광 니슬 염색(1:100 희석, 48시간, RT)으로 명료화되고 염색되었다. 좌측, 운동 피질의 3d 관상 렌더링. 우측, 층 V 운동 피질의 100 μm-두께 절편. 화살표는 피라미드 신경세포의 선단 수상돌기를 나타낸다(적색-형광 니슬, 녹색-eYFP).
도 17. 예시적 광시트 현미경의 개략적 표시.
도 18. SPIM은 100μm CLARITY 뇌 절편에서 단일 mRNA를 검출한다. 절편은 100μm 전체에 걸쳐 스캐닝되었다. 이후, 이미지는 기록되고, 3D 재구성에 스티칭(stitching)되었다. 이미지 내의 회절 한계 도트는 HCR에 의해 검출된 β-액틴 mRNA에 해당하였다. 축척 막대는 15 μm이다.
도 19. 앨런 참조 아틀라스(Allen Reference Atlas)의 연속 관상 수준에 대한 피질 체성 감각운동 서브네트워크의 연결도 맵. 이는 체성 감각운동 영역의 4개의 주요 구성요소인 SSp, SSs, MOp 및 MOs 각각이 4개의 기능적 도메인으로 나뉘는 것을 나타낸다. 이들 기능적으로 관련된 도메인은 나머지 모두와 광범위하게 상호연결되고, 다음과 같이 4개의 주요 피질 체성 감각운동 서브네트워크를 형성한다: 오로파시오파린질(orofaciopharyngeal)(orf, 청색), 상지(ul, 녹색), 하지 및 몸통(ll/tr, 적색), 및 수염(bfd.cm & w, 황색). 수는 브레그마에 비한 절편의 위치를 나타낸다(mm). 제공된 방법은 다양한 서브네트워크 내의 상기 별개의 도메인 각각 내의 투상 신경세포의 연결도 및 분자 정체를 특성규명할 수 있다.
도 20. 역행 표지된 신경세포 및 유전자 바코딩 정보를 자동적으로 검출하고 맵핑하기 위한 예시적 정보과학 작업흐름. A. CTb 표지화(분홍색) 및 니슬 염색(청색)을 이용한 미가공 이미지. 박스 내의 영역은 CTb 표지된 신경세포의 확대도를 제시한다. B. 다중채널 미가공 이미지가 분할을 위해 그레이스케일(grayscale)로 전환된다. C. 개별적 추적자 채널 이미지가 표지된 세포로부터 조직 백그라운드를 별개로 분리시키는 분할 경로를 통해 이동된다. 백색 도트는 표지된 체세포의 재구성이다. D. 재통합된 다중 도면 티프(tiff)는 기록을 위해 ARA 내의 관상 절편과 연관된다. E. 제공된 개발된 기록 소프트웨어를 이용하여, 다중 도면 티프(tiff)는 조직의 실루엣 및 세포구조 윤곽 둘 모두를 이의 상응하는 ARA 수준에 정렬시키기 위해 워핑(warping)된다. F. 분할 과정을 통해 추출된 세포는 공간적으로 표준화되고, ARA 내의 층-특이적 또는 아핵-특이적 ROI와 연관될 수 있다. G. 분할되고 기록된 표지화 재구성은 이들의 수반하는 seqFISH 데이터에 따라 iConnectome FISH 뷰어에서 공적으로 이용가능해진다. 분석 탭은 주입 부위, 추적자 타입, 층-특이적 세포 수로 추가로 명확화될 수 있는 ROI에 의해 표지된 세포의 수, 및 세포에 의한 유전자 발현에 관한 정보를 제공한다.
도 21. 엑소뉴클레아제 III(ExoIII)를 이용한 하이브리드화 연속 반응(HCR) 재-하이브리드화. (a) 브릿징 가닥 및 HCR 중합체의 exoIII 분해의 개략적 표시. ExoIII는 3'에서 5' 방향으로부터 dNMP로 브릿징 가닥 및 HCR 중합체를 분해하여 표적, 예를 들어, mRNA에 결합된 중간체 프로브 가닥을 남긴다. 이후, 새로운 브릿징 가닥이 다양한 헤어핀 세트와 다양한 형광 염료의 중합을 개시시키는 다양한 개시자 서열을 갖는 표적 결합된 프로브에 하이브리드화될 수 있다. (b) 베타-액틴(Actb) 전사물에 대한 프로브를 이용한 T3T 마우스 섬유모세포 세포주에서의 (a)에 제시된 개략도의 사용을 예시하는 미가공 데이터.
도 22. 람다 엑소뉴클레아제(λ-exo)를 이용한 하이브리드화 연속 반응(HCR) 재-하이브리드화. (a) 브릿징 가닥의 λ-exo 분해의 개략적 표시. λ-exo는 5'에서 3' 방향으로 5' 인산화된 브릿징 가닥을 선택적으로 분해하여 표적, 예를 들어, mRNA에 결합된 중간체 프로브 가닥으로부터 HCR 중합체를 방출시킨다. 방출된 중합체는 세척 완충액으로 세척된다. 이후, 새로운 브릿징 가닥이 다양한 헤어핀 세트와 다양한 형광 염료의 중합을 개시시키는 다양한 개시자 서열을 갖는 표적 결합된 프로브에 하이브리드화될 수 있다. (b) 베타-액틴(Actb) 전사물에 대한 프로브를 이용한 T3T 마우스 섬유모세포 세포주에서의 (a)에 제시된 개략도의 사용을 예시하는 미가공 데이터.
도 23. 우라실-특이적 절제 시약(USER)을 이용한 하이브리드화 연속 반응(HCR) 재-하이브리드화. (a) 브릿징 가닥의 USER 분해의 개략적 표시. USER는 브릿징 가닥 내의 데옥시유리딘 뉴클레오티드를 선택적으로 분해하여 브릿징 가닥이 단편화되도록 한다. 이후, 단편은 중간체 프로브 가닥으로부터 분리되어, 표적, 예를 들어, mRNA에 결합된 프로브로부터 HCR 중합체를 방출시킨다. 방출된 중합체는 세척 완충액으로 세척된다. 이후, 새로운 브릿징 가닥이 다양한 헤어핀 세트와 다양한 형광 염료의 중합을 개시시키는 다양한 개시자 서열을 갖는 표적 결합된 프로브에 하이브리드화될 수 있다. (b) 베타-액틴(Actb) 전사물에 대한 프로브를 이용한 T3T 마우스 섬유모세포 세포주에서의 (a)에 제시된 개략도의 사용을 예시하는 미가공 데이터.
도 24. 상보적 올리고뉴클레오티드(cTOE)를 이용한 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드의 예시적 제거.
도 25. 예시적 올리고뉴클레오티드 제조. 본래의 올리고뉴클레오티드(본 도면에 예시된 바와 같음, 프로브) 라이브러리는 여러 프로브 서브라이브러리를 함유한다. 각각의 서브라이브러리는 PCR을 이용하여 서브라이브러리를 증폭시키기 위해 이용될 수 있는 특정 세트의 프라이머를 갖는다. 요망되는 서브라이브러리가 증폭된 후, 생성물은 니킹 효소와 인큐베이션된다. 효소는 이의 인지 부위에서 프로브 가닥 상의 포스포디에스테르 결합을 분해한다. 생성된 생성물을 변성시키고, 이를 변성 겔 상에서 유동시키는 것은 요망되는 프로브 서열이 방출되도록 한다. 이후, 프로브 밴드는 겔에서 절단될 수 있고, 추출될 수 있다. 추출된 생성물은 하이브리드화에 이용될 수 있다.
도 26. 예시적 올리고뉴클레오티드 제조. 생성물은 겔 상의 세번째 밴드였다. 라이브러리는 이와 관련된 많은 다양한 프라이머를 가지며, 하나의 프라이머 세트는 프로브의 각각의 서브셋에 대한 것이다. 예시된 프라이머는 45-55%의 GC 함량 및 약 55℃의 Tm을 갖는 무작위 20개의 뉴클레오티드 서열이었다. 니킹 엔도뉴클레아제 부위는 GTCTCNN이었고, 상응하는 니킹 엔도뉴클레아제는 Nt. BsmAI이다. 생성물 프로브는 45-55%의 GC 함량을 갖는 관심 mRNA에 상보적인 20mer DNA 서열이었다.
특정 구체예의 상세한 설명
무엇보다도, 본 발명은 세포에서 핵산(예를 들어, 전사물 및/또는 DNA 유전자좌)를 프로파일링하기 위한 새로운 방법, 조성물 및/또는 키트를 제공한다.
일부 구체예에서, 본 발명은 세포에서 핵산(예를 들어, 전사물 및/또는 DNA 유전자좌)를 프로파일링하기 위한 방법을 제공한다. 일부 구체예에서, 제공된 방법은 단일 세포에서 다수의 표적을 프로파일링한다. 제공된 방법은 무엇보다도 순차적 바코딩을 통해 제한된 수의 검출가능한 표지를 이용하여 많은 수의 표적(전사물, DNA 유전자좌 또는 이의 조합)을 프로파일링할 수 있다.
도 1은 본 발명에 따른 방법을 도시한다. 도시된 바와 같이, 본 발명은 표지된 프로브와의 다수의 라운드의 하이브리드화(접촉 단계)가 세포에 존재하는 핵산(예를 들어, mRNA)을 프로파일링하는 방법을 제공한다. 특히, 도 1에 도시된 바와 같이, 세포 내의 핵산 표적과 하이브리드화되는 프로브의 세트가 제공되며, 여기서 프로브(즉, 다양한 표적과 하이브리드화되는 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드)는 단일 세트 내에서 표지되고, 또한 적어도 하나의 프로브는 상이한 세트에서 상이하게 표지된다.
일부 구체예에서, 본 발명(예를 들어, 도 1에 표현된 바와 같음)은,
(a) 복수의 전사물 및 DNA 유전자좌를 포함하는 세포와, 각각이 전사물 또는 DNA 유전자좌를 표적으로 하고 검출가능한 모이어티로 표지되는 제 1의 복수의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드를 접촉시키는 것을 포함하는 제 1 접촉 단계를 수행하는 단계로서, 조성물이 적어도,
(i) 제 1 전사물 또는 DNA 유전자좌를 표적으로 하고, 제 1의 검출가능한 모이어티로 표지되는 제 1 올리고뉴클레오티드; 및
(ii) 제 2 전사물 또는 DNA 유전자좌를 표적으로 하고, 제 2의 검출가능한 모이어티로 표지되는 제 2 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 단계;
(b) 제 1의 복수의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드와 이들의 표적의 하이브리드화가 검출되도록 제 1 접촉 단계 후에 세포를 영상화시키는 단계;
(c) 세포와 제 2의 복수의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드를 접촉시키는 것을 포함하는 제 2 접촉 단계를 수행하는 단계로서, 상기 제 2의 복수의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드가 제 1의 복수의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드에 의해 표적화되는 중첩 전사물 및/또는 DNA 유전자좌를 표적으로 하는 올리고뉴클레오티드를 포함하고, 상기 제 2의 복수의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드가 적어도,
(i) 임의로 제 1 올리고뉴클레오티드와 서열에 있어서 동일하고, 제 1 전사물 또는 DNA 유전자좌를 표적으로 하는 제 3 올리고뉴클레오티드; 및
(ii) 임의로 제 2 올리고뉴클레오티드와 서열에 있어서 동일하고, 제 2 전사물 또는 DNA 유전자좌를 표적으로 하는 제 4 올리고뉴클레오티드를 포함하고,
상기 제 2의 복수의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드에 존재하는 올리고뉴클레오티드 중 적어도 하나가 상기 제 1의 복수의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드에서의 동일한 전사물 또는 DNA 유전자좌를 표적으로 하는 상응하는 올리고뉴클레오티드와 상이한 검출가능한 모이어티로 표지되는 점에 있어서, 상기 제 2의 복수의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드가 상기 제 1의 복수의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드와 상이하고, 이에 따라 상기 제 2의 복수의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드에서,
(iii) 제 3 올리고뉴클레오티드는 제 1의 검출가능한 모이어티, 제 2의 검출가능한 모이어티 또는 제 3의 검출가능한 모이어티로 표지되고;
(iv) 제 4 올리고뉴클레오티드는 제 1의 검출가능한 모이어티, 제 2의 검출가능한 모이어티, 제 3의 검출가능한 모이어티, 또는 제 4의 검출가능한 모이어티로 표지되고,
상기 제 3 올리고뉴클레오티드가 제 1 올리고뉴클레오티드와 상이한 검출가능한 모이어티로 표지되거나, 상기 제 4 올리고뉴클레오티드가 제 2 올리고뉴클레오티드와 상이한 검출가능한 모이어티로 표지되거나, 둘 모두인, 단계;
(d) 제 2의 복수의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드와 이들의 표적의 하이브리드화가 검출되도록 제 2 접촉 단계 후에 세포를 영상화시키는 단계; 및
(e) 임의로 상기 접촉 및 영상화 단계를 반복하는 단계로서, 각각의 회에서 제 1 및 제 2의 복수의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드에 의해 표적화되는 중첩 전사물 또는 DNA 유전자좌를 표적으로 하는 올리고뉴클레오티드를 포함하는 새로운 복수의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드가 이용되며, 동일한 전사물 또는 DNA 유전자좌를 표적으로 하는 올리고뉴클레오티드의 검출가능한 모이어티 표지화에서의 적어도 하나의 차이로 인해, 각각의 이용된 복수의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드가 각각의 다른 이용된 복수의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드와 상이한 단계를 포함하는, 방법을 제공한다.
본원에서 사용되는 바와 같은 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드는 검출가능한 모이어티로 표지된다. 일부 구체예에서, 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드는 1개의 검출가능한 모이어티를 포함한다. 일부 구체예에서, 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드는 2개 이상의 검출가능한 모이어티를 포함한다. 일부 구체예에서, 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드는 1개의 검출가능한 모이어티를 갖는다. 일부 구체예에서, 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드는 2개 이상의 검출가능한 모이어티를 갖는다.
일부 구체예에서, 검출가능한 모이어티는 형광단이거나 이를 포함한다. 형광단으로 표지된 예시적인 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드는 형광 제자리 보합법(FISH)을 위한 프로브를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 당업자에 의해 널리 공지되고 실시되는 FISH는 무엇보다도 특정 DNA 서열 또는 RNA 표적의 존재 또는 부재를 검출하고 국소화시키기 위해 이용된다. 표지된 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드를 설계하고 제조하기 위한 방법은 비제한적으로 미국 특허 출원 공개 US 20120142014호에 기재된 것을 포함하여 당 분야에 널리 공지되어 있다. 그러나, 형광단 이용가능성과 같은 제한으로 인해, FISH는 단지 제공된 실험에서 제한된 수의 표적을 프로파일링하는데 사용될 수 있다. 다양한 멀티플렉스 표적에 대한 순차적 바코딩을 통해, 본 발명의 제공된 방법은 F N 개 이하의 많은 수의 표적을 프로파일링할 수 있으며, 여기서 F는 검출가능한 모이어티(FISH의 경우, 형광단)의 타입의 수이고, N은 접촉 단계(FISH의 경우, 하이브리드화)의 수이다. 예를 들어, F가 4이고, N이 8인 경우, 거의 전체의 전사체(48 = 65,536)가 프로파일링될 수 있다. 일부 구체예에서, F는 적어도 2이다. 일부 구체예에서, F는 3이다. 일부 구체예에서, F는 4이다. 일부 구체예에서, F는 5이다. 일부 구체예에서, F는 6이다. 일부 구체예에서, F는 7이다. 일부 구체예에서, F는 8이다. 일부 구체예에서, F는 9이다. 일부 구체예에서, F는 10이다. 일부 구체예에서, F는 11이다. 일부 구체예에서, F는 12이다. 일부 구체예에서, F는 13이다. 일부 구체예에서, F는 14이다. 일부 구체예에서, F는 15이다. 일부 구체예에서, F는 15 초과이다. 일부 구체예에서, N은 2이다. 일부 구체예에서, N은 2 초과이다. 일부 구체예에서, N은 3이다. 일부 구체예에서, N은 3 초과이다. 일부 구체예에서, N은 4이다. 일부 구체예에서, N은 4 초과이다. 일부 구체예에서, N은 5이다. 일부 구체예에서, N은 5 초과이다. 일부 구체예에서, N은 6이다. 일부 구체예에서, N은 6 초과이다. 일부 구체예에서, N은 7이다. 일부 구체예에서, N은 7 초과이다. 일부 구체예에서, N은 8이다. 일부 구체예에서, N은 8 초과이다. 일부 구체예에서, N은 9이다. 일부 구체예에서, N은 9 초과이다. 일부 구체예에서, N은 10이다. 일부 구체예에서, N은 10 초과이다. 일부 구체예에서, 복수의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드는 적어도 100개의 표적을 표적으로 한다.
접촉 단계에서, 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드는 이의 표적으로의 결합 전, 결합과 동시에 또는 결합 후에 표지될 수 있다. 일부 구체예에서, 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드, 예를 들어, 형광단-표지된 올리고뉴클레오티드는 이의 표적에 대한 결합 전에 표지된다. 일부 구체예에서, 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드는 이의 표적에 대한 결합과 동시에 표지된다. 일부 구체예에서, 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드는 이의 표적에 대한 결합 후에 표지된다. 일부 구체예에서, 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드는 하이브리드화 연속 반응(HCR)을 이용한 오르쏘고날 증폭을 통해 하이브리드화 후에 표지된다(Choi, HM., Nat Biotechnol. 2010 Nov;28(11): 1208-12). 일부 구체예에서, 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드는 모이어티, 예를 들어, 핵산 서열을 포함하며, 영상화 단계에서 신호를 제공할 수 있는 하나 이상의 모이어티는 올리고뉴클레오티드에 직접 또는 간접적으로 연결될 수 있다.
일부 구체예에서, 동일 유형의 표지가 상이한 표적에 대한 상이한 프로브에 부착될 수 있다. 일부 구체예에서, 동일 표적에 대한 프로브는 접촉 단계에서 사용된 복수의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드(한 세트의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드)에서 동일한 표지를 갖는다. 접촉 및 영상화의 라운드 후에 각각의 표적은 그 자신의 독특한 표지의 조합(순차적 바코딩)을 가져, 표적에 대한 정보, 예를 들어, 정량적 및/또는 공간적 정보가 수득될 수 있다. 예를 들어, 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드를 표지시키기 위해 형광단이 이용되는 경우, N 단계 후, 표적은 F 1 F 2 ...F N 의 순차적 바코드를 가지며, 여기서 F n 은 n번째 영상화에서 표적에 대해 사용된 형광단의 색이다. 한 표적은 이들의 바코드에서의 차이에 의해 또 다른 표적과 구별될 수 있다(예를 들어, 적색적색적색청색에 비해 적색적색청색적색).
일부 구체예에서, 본 발명의 표지는 플루오레세인, 로다민, 알렉사 플루오르(Alexa Fluor), 디라이트 플루오르(DyLight fluor), ATTO 염료, 또는 이들의 임의의 유사체 또는 유도체를 포함하나, 이에 제한되지는 않는 하나 이상의 형광 염료이거나 이들을 포함한다.
일부 구체예에서, 본 발명의 표지는 플루오레세인 및 플루오레세인의 화학적 유도체; 에오신(Eosin); 카르복시플루오레세인; 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC); 플루오레세인 아미다이트(FAM); 에리트로신; 로즈 벤갈; 박테리아 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa)로부터 분비된 플루오레세인; 메틸렌 블루; 레이저 염료; 로다민 염료(예를 들어, 로다민, 로다민 6G, 로다민 B, 로다민 123, 오라민(Auramine) O, 설포로다민 101, 설포로다민 B, 및 텍사스 레드(Texas Red))를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
일부 구체에에서, 본 발명의 표지는 ATTO 염료; 아크리딘 염료(예를 들어, 아크리딘 오렌지, 아크리딘 옐로우); 알렉사 플루오르; 7-아미노 악티노마이신 D; 8-아닐리노나프탈렌-1-설포네이트; 오라민-로다민 염색; 벤잔트론(Benzanthrone); 5,12-비스(페닐에티닐)나프타센; 9,10-비스(페닐에티닐)안트라센; 블랙라이트(Blacklight) 페인트; 브레인보우(Brainbow); 칼세인(Calcein); 카르복시플루오레세인; 카르복시플루오레세인 디아세테이트 숙신이미딜 에스테르; 카르복시플루오레세인 숙신이미딜 에스테르; 1-클로로-9,10-비스(페닐에티닐)안트라센; 2-클로로-9,10-비스(페닐에티닐)안트라센; 2-클로로-9,10-디페닐안트라센; 쿠마린; 시아닌 염료(예를 들어, 시아닌, 예를 들어, Cy3 및 Cy5, DiOC6, SYBR Green I); DAPI, 다크 켄쳐(Dark quencher), 디라이트 플루오르, 플루오-4(Fluo-4), 플루오프로브스(FluoProbes); 플루오론(Fluorone) 염료(예를 들어, 칼세인, 카르복시플루오레세인, 카르복시플루오레세인 디아세테이트 숙신이미딜 에스테르, 카르복시플루오레세인 숙신이미딜 에스테르, 에오신, 에오신 B, 에오신 Y, 에리트로신, 플루오레세인, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 플루오레세인 아미다이트, 인디안 옐로우(Indian yellow), 메르브로민(Merbromin)); 플루오로-제이드(Fluoro-Jade) 염색; 퓨라-2(Fura-2); 퓨라-2-아세톡시메틸 에스테르; 녹색 형광 단백질, 회흐스트 염색(Hoechst stain), 인디안 옐로우, 인도-1(Indo-1), 루시퍼 옐로우(Lucifer yellow), 루시페린(Luciferin), 메로시아닌(Merocyanine), 광학 증백제(Optical brightener), 옥사진(Oxazin) 염료(예를 들어, 크레실 바이올렛(Cresyl violet), 나일 블루(Nile blue), 나일 레드(Nile red)); 페릴렌(Perylene); 페난트리딘(Phenanthridine) 염료(에티디움 브로마이드 및 프로피듐 아이오다이드); 플록신(Phloxine), 피코빌린(Phycobilin), 피코에리트린, 피코에리트로빌린(Phycoerythrobilin), 피라닌(Pyranine), 로다민, 로다민 123, 로다민 6G, 리보그린(RiboGreen), RoGFP, 루브렌(Rubrene), SYBR 그린 I(SYBR Green I), (E)-스틸벤, (Z)-스틸벤, 설포로다민 101, 설포로다민 B, 시냅토-플루오린(Synapto-pHluorin), 테트라페닐 부타디엔, 테트라소듐 트리스(바토페난트롤린 디설포네이트)루테늄(II), 텍사스 레드(Texas Red), TSQ, 움벨리페론(Umbelliferone), 또는 황색 형광 단백질을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
일부 구체예에서, 본 발명의 표지는 형광 염료의 알렉사 플루오르 패밀리(Molecular Probes, Oregon)를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 알렉사 플루오르 염료는 형광현미경검사 및 세포생물학에서 세포 및 조직 표지로서 널리 사용된다. 알렉사 플루오르 시리즈의 여기 및 방출 스펙트럼은 가시 스펙트럼을 포함하고, 적외선까지 미친다. 상기 패밀리의 개별적 일원은 이들의 최대 여기(nm 단위)에 따라 대략적으로 넘버링된다. 특정 알렉사 플루오르 염료는 쿠마린, 로다민, 잔텐(예를 들어, 플루오레세인), 및 시아닌 염료의 설폰화반응을 통해 합성된다. 일부 구체예에서, 설폰화는 알렉사 플루오르 염료를 음성적으로 하전되고 친수성으로 만든다. 일부 구체예에서, 알렉사 플루오르 염료는 동등한 여기 및 방출의 일반적인 염료(예를 들어, 플루오레세인, 로다민), 및 다소 더 새로운 시아닌 시리즈보다 더 안정적이고, 더 밝고, pH-민감성이 덜하다. 예시적인 알렉사 플루오르 염료는 알렉사-350, 알렉사-405, 알렉사-430, 알렉사-488, 알렉사-500, 알렉사-514, 알렉사-532, 알렉사-546, 알렉사-555, 알렉사-568, 알렉사-594, 알렉사-610, 알렉사-633, 알렉사-647, 알렉사-660, 알렉사-680, 알렉사-700, 또는 알렉사-750을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
일부 구체예에서, 본 발명의 표지는 형광 염료의 디라이트 플루오르 패밀리(Dyomics and Thermo Fisher Scientific) 중 하나 이상을 포함한다. 예시적 디라이트 플루오르 패밀리 염료는 디라이트-350, 디라이트-405, 디라이트-488, 디라이트-549, 디라이트-594, 디라이트-633, 디라이트-649, 디라이트-680, 디라이트-750, 또는 디라이트-800을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
일부 구체예에서, 검출가능한 모이어티는 나노물질이거나 이를 포함한다. 일부 구체예에서, 검출가능한 모이어티는 나노입자이거나 이를 포함한다. 일부 구체예에서, 검출가능한 모이어티는 양자점이거나 이를 포함한다. 일부 구체예에서, 검출가능한 모이어티는 양자점이다. 일부 구체예에서, 검출가능한 모이어티는 양자점을 포함한다. 일부 구체예에서, 검출가능한 모이어티는 금 나노입자이거나 이를 포함한다. 일부 구체예에서, 검출가능한 모이어티는 금 나노입자이다. 일부 구체예에서, 검출가능한 모이어티는 금 나노입자를 포함한다.
당업자는, 일부 구체예에서, 특정 주기에서 특정 프로브에 대한 표지의 선택이, 예를 들어, 생성되는 신호의 크기, 유형, 프로브에 부착되거나 통합되는 방식, 세포 내의 이들의 위치를 포함하는 세포 구성물의 특성, 세포의 특성, 분석되는 상호작용의 유형 등을 포함하는 다양한 요인을 기초로 하여 결정될 수 있음을 이해한다.
예를 들어, 일부 구체예에서, 프로브는 N-하이드록시숙신이미딜 에스테르(NHS-에스테르) 반응기를 갖도록 합성된 Cy3 또는 Cy5로 표지된다. NHS-에스테르는 지방족 아민기와 용이하게 반응하므로, 뉴클레오티드는 아미노알킬기를 갖도록 변형될 수 있다. 이는 합성 반응 동안 아미노알킬-변형된 뉴클레오티드의 통합을 통해 수행될 수 있다. 일부 구체예에서, 표지는 켄칭 효과를 피하기 위해 60개 염기마다 사용된다.
검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드는 표적, 예를 들어, 전사물 또는 DNA 유전자좌와 하이브리드화될 수 있다. 일부 구체예에서, 표적은 전사물이거나 이를 포함한다. 일부 구체예에서, 표적은 전사물이다. 일부 구체예에서, 전사물은 RNA이다. 일부 구체예에서, 전사물은 mRNA이다. 일부 구체예에서, 전사물은 tRNA이다. 일부 구체예에서, 전사물은 rRNA이다. 일부 구체예에서, 전사물은 snRNA이다. 일부 구체예에서, RNA는 비-코딩 RNA이다. 긴 비-코딩 RNA(lncRNA), 마이크로RNA(miRNA), 짧은 간섭 RNA(siRNA), 피위-상호작용 RNA(piwi-interacting RNA)(piRNA), 작은 핵소체 RNA(snoRNA) 및 다른 짧은 RNA를 포함하나, 이에 제한되지는 않는 예시적 비-코딩 RNA 유형이 당 분야에 널리 공지되어 있다. 일부 구체예에서, RNA는 lncRNA이다. 일부 구체예에서, RNA는 miRNA이다. 일부 구체예에서, RNA는 piRNA이다. 일부 구체예에서, RNA는 snoRNA이다.
일부 구체예에서, 표적은 DNA 유전자좌이거나 이를 포함한다. 일부 구체예에서, 표적이 DNA 유전자좌인 경우, 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드는 임의로 하나 이상의 RNA 뉴클레오티드 또는 RNA 세그먼트를 포함한다. RNA 서열을 포함하는 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드는, 예를 들어, DNA 표적을 분해시킴이 없이 영상화 후에 RNA-특이적 효소 분해를 통해 선택적으로 제거될 수 있다. RNA를 특이적으로 분해하나, DNA를 특이적으로 분해하지 않는 예시적 효소는 다양한 RNase, 예를 들어, RNase A 및 RNase H를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
일부 구체예에서, 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드는 이의 표적, 예를 들어, 전사물 또는 DNA 유전자좌에 직접 하이브리드화된다. 일부 구체예에서, 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드는 표적에 결합되거나, 하이브리드화되거나, 달리 특이적으로 연결되는 하나 이상의 중간체, 예를 들어, 올리고뉴클레오티드로의 결합 또는 하이브리드화를 통해 이의 표적과 특이적으로 상호작용(인지)한다. 일부 구체예에서, 중간체 올리고뉴클레오티드는 오버행을 갖는 이의 표적에 대해 하이브리드화되어, 상보적 서열을 갖는 제 2 올리고뉴클레오티드("브릿지 올리고뉴클레오티드" 또는 "브릿지 프로브")가 여기에 결합할 수 있다. 일부 구체예에서, 중간체는 핵산을 표적으로 하고, 검출가능한 모이어티로 임의로 표지화되고, 표적과의 하이브리드화 후에 오버행 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 중간체는 표적에 하이브리드화되는 서열, 오버행 서열, 및 임의로 검출가능한 모이어티를 포함한다. 일부 구체예에서, 중간체는 표적에 하이브리드화되는 서열 및 오버행 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 중간체는 검출가능한 모이어티를 갖지 않는다. 일부 구체예에서, 제 2 올리고뉴클레오티드는 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드이다. 일부 구체예에서, 제 2의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드는 염료로 표지된다. 일부 구체예에서, 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드는 HCR 중합체로 표지된다. 일부 구체예에서, 표적에 결합된 중간체 올리고뉴클레오티드는 다수의 접촉, 제거 및/또는 영상화 단계를 통해 보존되고; 접촉 및 영상화 단계에서 브릿지 프로브를 통해 중간체 올리고뉴클레오티드에 연결되는 검출가능한 표지의 조합을 통해 순차적 바코드가 제공된다. 예를 들어, 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드가 브릿지 프로브로 사용되는 경우, 바코드는 이의 오버행 서열을 통해 중간체 올리고뉴클레오티드와 하이브리드화되는 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드에 의해 제공된다. 영상화 단계 후, 브릿지 올리고뉴클레오티드는 본원에 기재된 바와 같이 임의로 제거된다. 일부 구체예에서, 하나의 중간체 올리고뉴클레오티드가 표적에 대해 이용된다. 일부 구체예에서, 2개 이상의 중간체 올리고뉴클레오티드가 표적에 대해 이용된다. 일부 구체예에서, 3개 이상의 중간체 올리고뉴클레오티드가 표적에 대해 이용된다. 일부 구체예에서, 4개 이상의 중간체 올리고뉴클레오티드가 표적에 대해 이용된다. 일부 구체예에서, 5개 이상의 중간체 올리고뉴클레오티드가 표적에 대해 이용된다. 일부 구체예에서, 6개 이상의 중간체 올리고뉴클레오티드가 표적에 대해 이용된다. 일부 구체예에서, 7개 이상의 중간체 올리고뉴클레오티드가 표적에 대해 이용된다. 일부 구체예에서, 8개 이상의 중간체 올리고뉴클레오티드가 표적에 대해 이용된다. 일부 구체예에서, 9개 이상의 중간체 올리고뉴클레오티드가 표적에 대해 이용된다. 일부 구체예에서, 10개 이상의 중간체 올리고뉴클레오티드가 표적에 대해 이용된다. 일부 구체예에서, 11개 이상의 중간체 올리고뉴클레오티드가 표적에 대해 이용된다. 일부 구체예에서, 12개 이상의 중간체 올리고뉴클레오티드가 표적에 대해 이용된다. 일부 구체예에서, 13개 이상의 중간체 올리고뉴클레오티드가 표적에 대해 이용된다. 일부 구체예에서, 13개 이상의 중간체 올리고뉴클레오티드가 표적에 대해 이용된다. 일부 구체예에서, 15개 이상의 중간체 올리고뉴클레오티드가 표적에 대해 이용된다. 일부 구체예에서, 16개 이상의 중간체 올리고뉴클레오티드가 표적에 대해 이용된다. 일부 구체예에서, 17개 이상의 중간체 올리고뉴클레오티드가 표적에 대해 이용된다. 일부 구체예에서, 18개 이상의 중간체 올리고뉴클레오티드가 표적에 대해 이용된다. 일부 구체예에서, 19개 이상의 중간체 올리고뉴클레오티드가 표적에 대해 이용된다. 일부 구체예에서, 20개 이상의 중간체 올리고뉴클레오티드가 표적에 대해 이용된다. 일부 구체예에서, 21개 이상의 중간체 올리고뉴클레오티드가 표적에 대해 이용된다. 일부 구체예에서, 22개 이상의 중간체 올리고뉴클레오티드가 표적에 대해 이용된다. 일부 구체예에서, 23개 이상의 중간체 올리고뉴클레오티드가 표적에 대해 이용된다. 일부 구체예에서, 24개 이상의 중간체 올리고뉴클레오티드가 표적에 대해 이용된다. 일부 구체예에서, 25개 이상의 중간체 올리고뉴클레오티드가 표적에 대해 이용된다. 일부 구체예에서, 30개 이상의 중간체 올리고뉴클레오티드가 표적에 대해 이용된다. 일부 구체예에서, 40개 이상의 중간체 올리고뉴클레오티드가 표적에 대해 이용된다. 일부 구체예에서, 50개 이상의 중간체 올리고뉴클레오티드가 표적에 대해 이용된다.
일부 구체예에서, 각각의 중간체 올리고뉴클레오티드는 상이한 서열의 표적과 하이브리드화된다. 일부 구체예에서, 표적의 각각의 중간체 올리고뉴클레오티드는 동일한 오버행 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 표적에 대한 각각의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드는 표적의 모든 중간체 올리고뉴클레오티드에 의해 공유된 동일한 오버행 서열에 상보적인 동일한 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 중간체 올리고뉴클레오티드는 표적에 상보적인 서열, 및 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드에 상보적인 서열을 포함한다.
일부 구체예에서, 제공된 방법은,
(f) 복수의 핵산을 포함하는 세포와 복수의 중간체 올리고뉴클레오티드를 접촉시키는 것을 포함하는 접촉 단계를 수행하는 단계로서, 상기 복수의 중간체 올리고뉴클레오티드 각각이 (i) 핵산을 표적으로 하고, 검출가능한 모이어티로 임의로 표지되고; (ii) 표적과의 하이브리드화 후에 오버행 서열을 포함하는, 단계; 및
(g) 임의로, 중간체 올리고뉴클레오티드와 이들의 표적 사이의 상호작용이 검출되도록 세포를 영상화시키는 단계를 추가로 포함한다.
일부 구체예에서, 단계 (f) 및 임의로 단계 (g)는 단계 (a) 전에 수행된다. 일부 구체에에서, 단계 (f)는 단계 (a)와 수행된다. 일부 구체예에서, 제거 단계는 중간체 올리고뉴클레오티드를 보존시킨다.
일부 구체예에서, 제공된 기술은 스플라이싱 변이, RNA 편집, 올리고뉴클레오티드 변형, 또는 이들의 조합의 결과로서 형성된 다양한 전사물을 프로파일링하기 위해 이용된다. 일부 구체예에서, 표적은 RNA 스플라이싱 변이체이다. 일부 구체예에서, 제공된 기술은 유전자의 하나 이상의 스플라이싱 변이체, 예를 들어, 유전자의 하나 이상의 스플라이싱 변이체의 위치 및 양을 프로파일링한다. 일부 구체예에서, 제공된 방법 또는 조성물은 다양한 스플라이싱 변이체를 프로파일링한다. 일부 구체예에서, 하나 이상의 변이체를 함유하는 엑손은 순차적 하이브리드화 및 바코딩에 의해 표적화되고 바코딩된다. 일부 구체예에서, 스플라이싱 변이체는 스플라이싱으로부터 발생된 하나 이상의 구별가능한 서열을 함유하며, 상기 서열이 표적화된다. 일부 구체예에서, 엑손 및/또는 구별가능한 서열을 표적화시킴으로써, 제공된 기술은 하나 이상의 특이적 스플라이싱 변이체, 또는 mRNA의 전체 스플라이싱 레퍼토리를 프로파일링할 수 있다. 당 분야에 널리 공지된 바와 같이, mRNA 스플라이싱은 다수의 생물학적 과정 및 질병, 예를 들어, 자폐증 및 다운증후군과 같은 신경계 질병에 중요하다. 세포-대-세포 부착 및 시냅스형성을 담당하는 분자가 스플라이싱되고, 이들의 결함은 뇌에서 이상연결을 발생시키고 질병을 야기시키는 것으로 공지되어 있다.
일부 구체예에서, 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드는 서열 편집, 화학적 변형 및/또는 이들의 조합에 의해 야기되는 서열 변형을 표적으로 한다. 일부 구체예에서, 변형된 핵산 표적은, 임의로 전환 과정 후, 변형되지 않은 표적에 비해 하나 이상의 다양한 상보적 서열과 하이브리드화되며, 변형된 핵산과 선택적으로 하이브리드화되는 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 이용하여 프로파일링된다. 일부 구체예에서, 표적은 RNA 편집을 통한 RNA이다(Brennicke, A., A. Marchfelder, et al. (1999). "RNA editing". FEMS Microbiol Rev 23 (3): 297-316). 일부 구체예에서, 제공된 기술은 RNA 편집에 의해 형성된 다양한 RNA 변이체를 프로파일링한다. 일부 구체예에서, 제공된 기술은 변형된 올리고뉴클레오티드를 프로파일링한다. 일부 구체예에서, 제공된 기술은 메틸화된 RNA를 프로파일링한다(Song CX, Yi C, He C. Mapping recently identified nucleotide variants in the genome and transcriptome. Nat Biotechnol. 2012 Nov;30(11):1107-16). 일부 구체예에서, 제공된 기술은 메틸화된 DNA를 프로파일링한다. 일부 구체예에서, 표적은 단일-뉴클레오티드 다형태(SNP)이다.
일부 구체예에서, 표적을 프로파일링함으로써, 제공된 기술은 무엇보다도, 단일 세포, 조직, 기관 또는 유기체 내의 표적의 정량적 및/또는 위치결정 정보를 제공한다. 일부 구체예에서, 전사물의 프로파일링은 세포, 조직, 기관 또는 유기체 내에서의 유전자 발현의 공간-시간적 패턴을 정성적 및/또는 정량적으로 규정하기 위해 이용될 수 있다.
일부 구체예에서, 한 세트의 각각의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드는 상이한 표적, 예를 들어, 전사물 또는 DNA 유전자좌를 갖는다. 일부 구체예에서, 한 세트의 2개 이상의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드는 동일한 표적을 갖는다. 일부 구체예에서, 2개 이상의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드는 동일한 전사물을 표적으로 한다. 일부 구체예에서, 2개 이상의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드는 동일한 DNA 유전자좌를 표적으로 한다. 일부 구체예에서, 약 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 또는 100개의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드는 동일한 표적을 표적으로 한다. 일부 구체예에서, 2개 이상의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드는 동일한 표적을 표적으로 한다. 일부 구체예에서, 5개 이상의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드는 동일한 표적을 표적으로 한다. 일부 구체예에서, 10개 이상의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드는 동일한 표적을 표적으로 한다. 일부 구체예에서, 15개 이상의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드는 동일한 표적을 표적으로 한다. 일부 구체예에서, 20개 이상의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드는 동일한 표적을 표적으로 한다. 일부 구체예에서, 25개 이상의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드는 동일한 표적을 표적으로 한다. 일부 구체예에서, 30개 이상의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드는 동일한 표적을 표적으로 한다. 일부 구체예에서, 35개 이상의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드는 동일한 표적을 표적으로 한다. 일부 구체예에서, 40개 이상의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드는 동일한 표적을 표적으로 한다. 일부 구체예에서, 45개 이상의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드는 동일한 표적을 표적으로 한다. 일부 구체예에서, 50개 이상의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드는 동일한 표적을 표적으로 한다. 일부 구체예에서, 60개 이상의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드는 동일한 표적을 표적으로 한다. 일부 구체예에서, 70개 이상의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드는 동일한 표적을 표적으로 한다. 일부 구체예에서, 80개 이상의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드는 동일한 표적을 표적으로 한다. 일부 구체예에서, 90개 이상의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드는 동일한 표적을 표적으로 한다. 일부 구체예에서, 100개 이상의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드는 동일한 표적을 표적으로 한다. 일부 구체예에서, 약 1-10개의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드는 동일한 표적을 표적으로 한다. 일부 구체예에서, 약 5-15개의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드는 동일한 표적을 표적으로 한다. 일부 구체예에서, 약 10-20개의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드는 동일한 표적을 표적으로 한다. 일부 구체예에서, 약 15-25개의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드는 동일한 표적을 표적으로 한다. 일부 구체예에서, 약 20-30개의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드는 동일한 표적을 표적으로 한다. 일부 구체예에서, 약 25-35개의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드는 동일한 표적을 표적으로 한다. 일부 구체예에서, 약 30-40개의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드는 동일한 표적을 표적으로 한다. 일부 구체예에서, 약 35-45개의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드는 동일한 표적을 표적으로 한다. 일부 구체예에서, 약 40-50개의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드는 동일한 표적을 표적으로 한다. 일부 구체예에서, 약 45-55개의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드는 동일한 표적을 표적으로 한다. 일부 구체예에서, 약 50-70개의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드는 동일한 표적을 표적으로 한다. 일부 구체예에서, 약 60-80개의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드는 동일한 표적을 표적으로 한다. 일부 구체예에서, 약 70-90개의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드는 동일한 표적을 표적으로 한다. 일부 구체예에서, 약 80-100개의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드는 동일한 표적을 표적으로 한다.
일부 구체예에서, 무엇보다도, 동일한 표적에 대해 다수의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드를 이용하는 것은 신호 강도를 증가시킨다. 일부 구체예에서, 동일한 표적을 표적으로 하는 한 세트의 각각의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드는 표적의 다양한 부분과 상호작용한다.
일부 구체예에서, 한 세트의 표적에 대한 모든 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드는 동일한 검출가능한 모이어티를 갖는다. 일부 구체예에서, 모든 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드는 동일한 방식으로 표지된다. 일부 구체예에서, 표적에 대한 모든 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드는 동일한 형광단을 갖는다.
일부 구체예에서, 표적에 대한 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드는 표적의 표적화된 영역 내에 위치된다. 표적화된 영역은 다양한 길이를 가질 수 있다. 일부 구체예에서, 표적화된 영역은 약 20 bp 길이이다. 일부 구체예에서, 표적화된 영역은 약 30 bp 길이이다. 일부 구체예에서, 표적화된 영역은 약 40 bp 길이이다. 일부 구체예에서, 표적화된 영역은 약 50 bp 길이이다. 일부 구체예에서, 표적화된 영역은 약 60 bp 길이이다. 일부 구체예에서, 표적화된 영역은 약 80 bp 길이이다. 일부 구체예에서, 표적화된 영역은 약 100 bp 길이이다. 일부 구체예에서, 표적화된 영역은 약 150 bp 길이이다. 일부 구체예에서, 표적화된 영역은 약 200 bp 길이이다. 일부 구체예에서, 표적화된 영역은 약 250 bp 길이이다. 일부 구체예에서, 표적화된 영역은 약 300 bp 길이이다. 일부 구체예에서, 표적화된 영역은 약 350 bp 길이이다. 일부 구체예에서, 표적화된 영역은 약 400 bp 길이이다. 일부 구체예에서, 표적화된 영역은 약 450 bp 길이이다. 일부 구체예에서, 표적화된 영역은 약 500 bp 길이이다. 일부 구체예에서, 표적화된 영역은 약 600 bp 길이이다. 일부 구체예에서, 표적화된 영역은 약 700 bp 길이이다. 일부 구체예에서, 표적화된 영역은 약 800 bp 길이이다. 일부 구체예에서, 표적화된 영역은 약 900 bp 길이이다. 일부 구체예에서, 표적화된 영역은 약 1,000 bp 길이이다. 일부 구체예에서, 표적에 대한 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드는 표적 상에서 서로 근접하여 위치된다.
당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 영상화 단계에 대해 다양한 기술이 이용될 수 있다. 예시적 방법은 에피-형광 현미경검사, 동일초점 현미경검사, 다양한 유형의 초-해상도 현미경검사(PALM/STORM, SSIM/GSD/STED), 및 광시트 현미경검사(SPIM 등)를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
예시적 초 해상도 기술은 I5M 및 4Pi-현미경검사, 유도 방출 감쇠 현미경검사(STEDM), 기저 상태 감쇠 현미경검사(GSDM), 공간 구조화 조명 현미경검사(SSIM), 광-활성화 국소화 현미경검사(PALM), 역 포화성 광학 선형 형광 전이(Reversible Saturable Optically Linear Fluorescent Transition)(RESOLFT), 전반사 형광 현미경(TIRFM), 형광-PALM(FPALM), 확률 재구성 광학 현미경검사(STORM), 1-나노미터 정확도를 갖는 형광 영상화(Fluorescence Imaging with One-Nanometer Accuracy)(FIONA), 및 이들의 조합을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 예를 들어, 문헌[Chi, 2009 "Super-resolution microscopy: breaking the limits, Nature Methods 6(1): 15-18; Blow 2008, "New ways to see a smaller world," Nature 456:825-828; Hell, et al, 2007, "Far-Field Optical Nanoscopy," Science 316: 1153; R. Heintzmann and G. Ficz, 2006, "Breaking the resolution limit in light microscopy," Briefings in Functional Genomics and Proteomics 5(4):289-301; Garini et al., 2005, "From micro to nano: recent advances in high-resolution microscopy," Current Opinion in Biotechnology 16:3-12; 및 Bewersdorf et al, 2006, "Comparison of I5M and 4Pi-microscopy," 222(2): 105-117; 및 Wells, 2004, "Man the Nanoscopes," JCB 164(3):337-340.] 참조.
일부 구체예에서, 전자현미경(EM)이 사용된다.
일부 구체예에서, 영상화 단계는 표적을 검출한다. 일부 구체예에서, 영상화 단계는 표적을 국소화시킨다. 일부 구체예에서, 영상화 단계는 표적의 3-차원 공간 정보를 제공한다. 일부 구체예에서, 영상화 단계는 표적을 정량한다. 다수의 접촉 및 영상화 단계를 이용함으로써, 제공된 방법은 놀랍게도 높은 처리량으로 많은 수의 표적에 대한 공간적 및/또는 정량적 정보를 제공할 수 있다. 예를 들어, F개의 검출 가능하게 상이한 유형의 표지를 이용하는 경우, F N 개 이하의 표적의 공간적 및/또는 정량적 정보가 N회의 접촉 및 영상화 단계 후에 수득될 수 있다.
일부 구체예에서, 제공된 방법은 접촉 및/또는 영상화 단계 전 또는 후에 추가 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, 제공된 방법은 각각의 영상화 단계 후에 복수의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드를 제거하는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, 제거 단계는 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드를 분해시키는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 제거 단계는 표적을 유의하게 분해시키지 않아, 표적은 요망시 다음 접촉 및/또는 영상화 단계(들)에 사용될 수 있다. 일부 구체예에서, 제거 단계는 복수의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드와 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드를 분해시키는 효소를 접촉시키는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 제거 단계는 복수의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드와 DNase 또는 RNase를 접촉시키는 것을 포함한다. 예를 들어, 일부 구체예에서, 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드는 DNA 서열을 포함하며, 이의 분해를 위해 DNase가 사용되며, 일부 다른 구체예에서, 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드는 RNA 서열을 포함하고, 이의 분해를 위해 RNase가 사용된다. 일부 구체예에서, 제거 단계는 검출가능한 모이어티를 분해시키는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 제거 단계는 광표백을 포함한다.
일부 구체예에서, 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드의 한 세트의 표적은 또한 또 다른 세트의 표적이다. 일부 구체예에서, 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드의 한 세트의 표적은 또 다른 세트의 표적과 중첩된다. 일부 구체예에서, 중첩은 10% 초과이다. 일부 구체예에서, 중첩은 20% 초과이다. 일부 구체예에서, 중첩은 30% 초과이다. 일부 구체예에서, 중첩은 40% 초과이다. 일부 구체예에서, 중첩은 50% 초과이다. 일부 구체예에서, 중첩은 60% 초과이다. 일부 구체예에서, 중첩은 70% 초과이다. 일부 구체예에서, 중첩은 80% 초과이다. 일부 구체예에서, 중첩은 90% 초과이다. 일부 구체예에서, 중첩은 91% 초과이다. 일부 구체예에서, 중첩은 92% 초과이다. 일부 구체예에서, 중첩은 93% 초과이다. 일부 구체예에서, 중첩은 94% 초과이다. 일부 구체예에서, 중첩은 90% 초과이다. 일부 구체예에서, 중첩은 95% 초과이다. 일부 구체예에서, 중첩은 96% 초과이다. 일부 구체예에서, 중첩은 97% 초과이다. 일부 구체예에서, 중첩은 98% 초과이다. 일부 구체예에서, 중첩은 99% 초과이다. 일부 구체예에서, 중첩은 99.5% 초과이다. 일부 구체예에서, 중첩은 99.6% 초과이다. 일부 구체예에서, 중첩은 99.7% 초과이다. 일부 구체예에서, 중첩은 99.8% 초과이다. 일부 구체예에서, 중첩은 99.9% 초과이다. 일부 구체예에서, 중첩은 100%이다. 일부 구체예에서, 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드의 한 세트의 표적은 또 다른 세트의 표적과 동일하다. 일부 구체예에서, 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드의 각각의 세트는 동일한 표적을 표적으로 한다.
일부 구체예에서, 제 1 전사물 또는 DNA 유전자좌(제 1 표적)를 표적으로 하는 제 2 접촉 단계에서의 제 3의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드는 임의로 제 1 전사물 또는 DNA 유전자좌를 표적으로 하는 제 1의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드와 동일한 서열을 갖는다. 일부 구체예에서, 서열은 동일하다. 일부 구체예에서, 서열은 상이하다. 유사하게, 일부 구체예에서, 제 2 전사물 또는 DNA 유전자좌(제 1 표적)를 표적으로 하는 제 2 접촉 단계에서의 제 4의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드는 임의로 제 1 전사물 또는 DNA 유전자좌를 표적으로 하는 제 2의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드와 동일한 서열을 갖는다. 일부 구체예에서, 서열은 동일하다. 일부 구체예에서, 서열은 상이하다.
일부 구체예에서, 제 2의 복수의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드는 제 2의 복수의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드에 존재하는 올리고뉴클레오티드 중 적어도 하나가 제 1의 복수의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드 내의 동일한 전사물 또는 DNA 유전자좌를 표적으로 하는 상응하는 올리고뉴클레오티드와 상이한 검출가능한 모이어티로 표지된다는 점에서 제 1의 복수의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드와 상이하다. 일부 구체예에서, 각각의 복수의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드는 복수의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드에 존재하는 올리고뉴클레오티드 중 적어도 하나가 또 다른 복수의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드 내의 동일한 전사물 또는 DNA 유전자좌를 표적으로 하는 상응하는 올리고뉴클레오티드와 상이한 검출가능한 모이어티로 표지된다는 점에서 또 다른 복수의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드와 상이하다.
일부 구체예에서, 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드는 [S]-[L]의 구조를 가지며, 여기서 [S]는 올리고뉴클레오티드 서열이고, [L]은 검출가능한 모이어티 또는 검출가능한 모이어티의 조합이다. 일부 구체예에서, [L]은 검출가능한 표지, 예를 들어, 형광단의 다수의 단위를 포함하며, 이들 각각은 독립적으로 올리고뉴클레오티드 서열, 예를 들어, [S]의 하나 이상의 뉴클레오티드 모이어티와 회합된다. 일부 구체예에서, 동일한 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드에 부착된 각각의 검출가능한 표지는 동일한 검출가능한 신호를 제공한다. 일부 구체예에서, 동일한 올리고뉴클레오티드 서열에 부착된 모든 검출가능한 표지는 동일하다.
일부 구체예에서, 동일한 표적을 표적으로 하는 올리고뉴클레오티드는 2개 이상의 세트의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드 사이에서 동일 세트의 서열을 가지며, 즉, 존재시 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드 사이에서 차이는 서열이 아니라 검출가능한 모이어티 내에 존재한다. 예를 들어, 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드의 한 세트에서, 제 1 표적을 표적으로 하는 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드는 모두 동일한 검출가능한 모이어티, 또는 검출 모이어티 [L]1의 조합을 갖는다:
[S]1-[L]1, [S]2-[L]1,..., [S]n-[L]1, 여기서 n은 표적에 대한 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드의 수, 예를 들어, 3-50의 정수이다;
또 다른 세트의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드에서, 동일한 표적을 표적으로 하는 올리고뉴클레오티드가 상이하게 표지되는 경우, 동일한 표적을 표적으로 하는 올리고뉴클레오티드는 동일한 세트의 올리고뉴클레오티드 서열([S]1, [S]2,..., [S]n)을 가지나, 상이한 [L]2를 갖는다:
[S]1-[L]2, [S]2-[L]2,..., [S]n-[L]2, 여기서 [L]1은 [L]2와 검출 가능하게 상이하다.
본 발명의 특정 구체예를 예시하기 위해, 2-단계, 2-표지, 4-표적(F N = 22 = 4) 과정(여기서, 각각의 세트에서 동일 표적을 표적으로 하는 모든 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드는 독립적으로 동일한 검출가능한 모이어티를 갖음)이 하기에 제공된다:
단계 1. 표적과 제 1의 복수(P1)의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드의 접촉:
표적 T1: [S]P1-T1-1[L]1, [S]P1-T1-2[L]1, [S]P1-T1- 3[L]1,..., [S]P1 -T1- P1T1[L]1, 여기서 P1T1은 제 1의 복수의 T1을 표적으로 하는 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드의 수이고, [L]1은 제 1의 검출가능한 표지이다;
표적 T2: [S]P1-T2-1[L]1, [S]P1-T2-2[L]1, [S]P1-T2- 3[L]1,..., [S]P1 -T2- P1T2[L]1, 여기서 P1T2는 제 1의 복수의 T2를 표적으로 하는 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드의 수이다;
표적 T3: [S]P1-T3-1[L]2, [S]P1-T3-2[L]2, [S]P1-T3- 3[L]2,..., [S]P1 -T3- P1T3[L]2, 여기서 P1T3는 제 1의 복수의 T3를 표적으로 하는 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드의 수이고, [L]2는 [L]1과 검출 가능하게 상이한 표지이다;
표적 T4: [S]P1-T4-1[L]2, [S]P1-T4-2[L]2, [S]P1-T4- 3[L]2,..., [S]P1 -T4- P1T4[L]2, 여기서 P1T4는 제 1의 복수의 T4를 표적으로 하는 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드의 수이다.
단계 2: 영상화;
단계 3: 표적으로부터 P1 제거;
단계 4: 표적과 제 2의 복수(P2)의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드의 접촉:
표적 T1: [S]P2-T1-1[L]1, [S]P2-T1-2[L]1, [S]P2-T1- 3[L]1,..., [S]P2 -T1- P2T1[L]1, 여기서 P2T1은 제 2의 복수의 T1을 표적으로 하는 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드의 수이고;
표적 T2: [S]P2-T2-1[L]2, [S]P2-T2-2[L]2, [S]P2-T2- 3[L]2,..., [S]P2 -T2- P2T2[L]2, 여기서 P2T2는 제 2의 복수의 T2를 표적으로 하는 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드의 수이고;
표적 T3: [S]P2-T3-1[L]1, [S]P2-T3-2[L]1, [S]P2-T3- 3[L]1,..., [S]P2 -T3- P2T3[L]1, 여기서 P2T3는 제 2의 복수의 T3를 표적으로 하는 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드의 수이고;
표적 T4: [S]P2-T4-1[L]2, [S]P2-T4-2[L]2, [S]P2-T4- 3[L]2,..., [S]P2 -T4- P2T4[L]2, 여기서 P2T4는 제 2의 복수의 T4를 표적으로 하는 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드의 수이다.
단계 5: 영상화.
2회의 영상화 단계 후, 각각의 표적은 그 자체의 독특한 순차적 바코드를 갖는다:
T1: [L]1[L]1;
T2: [L]1[L]2;
T3: [L]2[L]1; 및
T4: [L]2[L]2.
일부 구체예에서, 추가 바코드, T1--, T2--, --T1, --T2가 또한 이용될 수 있으며, 여기서 --는 상기 단계에 대해 신호가 없는 것을 나타낸다.
상기 예시된 과정에서, P1T1, P1T2, P1T3, P1T4, P2T1, P2T2, P2T3 및 P2T4 각각은 독립적으로 자연수(0을 초과하는 정수)이다. 일부 구체예에서, P1T1은 P2T1이다. 일부 구체예에서, P1T2는 P2T2이다. 일부 구체예에서, P1T3는 P2T3이다. 일부 구체예에서, P1T4는 P2T4이다. 일부 구체예에서, 하나의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드가 표적에 대해 사용된다. 일부 구체예에서, 2개 이상의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드가 표적에 대해 사용된다.
일부 구체예에서, 동일한 표적을 표적으로 하는 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드는 각각의 복수의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드에서 동일한 세트의 서열을 갖는다. 예를 들어, 상기 예에서 표적 T1에 대해, [S]P1-T1-1 내지 [S]P1-T1- P1T1 각각은 독립적으로 [S]P2-T1-1 내지 [S]P2-T1- P2T1 중 하나와 동일한 서열을 갖고, [S]P2-T1-1 내지 [S]P2-T1- P2T1 각각은 독립적으로 [S]P1-T1-1 내지 [S]P1-T1- P1T1 중 하나와 동일한 서열을 갖는다. 일부 구체예에서, 동일한 표적을 표적으로 하는 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드는 각각 복수의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드에서 상이한 세트의 서열을 갖는다.
일부 구체예에서, 제공된 방법은 임의로 영상화 단계 후에 복수의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드를 제거하는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, 제공된 방법은 영상화 단계 후에 제거 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, 제공된 방법은 각각의 영상화 단계 후, 그러나 마지막 영상화 단계에서는 아닌 제거 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, 제공된 방법은 각각의 영상화 단계 후에 제거 단계를 포함한다.
제공된 방법에서의 제거 단계는 다양한 목적 중 하나 이상을 제공할 수 있다. 일부 구체예에서, 제거 단계는 표적으로부터의 복수의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드를 제거하며, 표적은 또 다른 복수의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드와 상호작용하기 위해 이용가능하다. 일부 구체예에서, 제거 단계는 복수의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드를 제거하며, 한 복수의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드의 검출가능한 모이어티는 표적에 결합된 또 다른 복수의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드의 검출을 방해하지 않는다. 일부 구체예에서, 제거 단계는 적어도 80%의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드를 제거한다. 일부 구체예에서, 제거 단계는 적어도 85%의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드를 제거한다. 일부 구체예에서, 제거 단계는 적어도 90%의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드를 제거한다. 일부 구체예에서, 제거 단계는 적어도 91%의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드를 제거한다. 일부 구체예에서, 제거 단계는 적어도 92%의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드를 제거한다. 일부 구체예에서, 제거 단계는 적어도 93%의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드를 제거한다. 일부 구체예에서, 제거 단계는 적어도 94%의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드를 제거한다. 일부 구체예에서, 제거 단계는 적어도 95%의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드를 제거한다. 일부 구체예에서, 제거 단계는 적어도 96%의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드를 제거한다. 일부 구체예에서, 제거 단계는 적어도 97%의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드를 제거한다. 일부 구체예에서, 제거 단계는 적어도 98%의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드를 제거한다. 일부 구체예에서, 제거 단계는 적어도 99%의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드를 제거한다. 일부 구체예에서, 제거 단계는 적어도 99.1%의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드를 제거한다. 일부 구체예에서, 제거 단계는 적어도 99.2%의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드를 제거한다. 일부 구체예에서, 제거 단계는 적어도 99.3%의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드를 제거한다. 일부 구체예에서, 제거 단계는 적어도 99.4%의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드를 제거한다. 일부 구체예에서, 제거 단계는 적어도 99.5%의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드를 제거한다. 일부 구체예에서, 제거 단계는 적어도 80%의 검출가능한 신호를 제거한다. 일부 구체예에서, 제거 단계는 적어도 85%의 검출가능한 신호를 제거한다. 일부 구체예에서, 제거 단계는 적어도 90%의 검출가능한 신호를 제거한다. 일부 구체예에서, 제거 단계는 적어도 91%의 검출가능한 신호를 제거한다. 일부 구체예에서, 제거 단계는 적어도 92%의 검출가능한 신호를 제거한다. 일부 구체예에서, 제거 단계는 적어도 93%의 검출가능한 신호를 제거한다. 일부 구체예에서, 제거 단계는 적어도 94%의 검출가능한 신호를 제거한다. 일부 구체예에서, 제거 단계는 적어도 95%의 검출가능한 신호를 제거한다. 일부 구체예에서, 제거 단계는 적어도 96%의 검출가능한 신호를 제거한다. 일부 구체예에서, 제거 단계는 적어도 97%의 검출가능한 신호를 제거한다. 일부 구체예에서, 제거 단계는 적어도 98%의 검출가능한 신호를 제거한다. 일부 구체예에서, 제거 단계는 적어도 99%의 검출가능한 신호를 제거한다. 일부 구체예에서, 제거 단계는 적어도 99.5%의 검출가능한 신호를 제거한다. 일부 구체예에서, 제거 단계는 100%의 검출가능한 신호를 제거한다. 일부 구체예에서, 제거 단계 후, 신호는 영상화 단계에 의해 검출될 수 없다.
제거 단계는 임의로 추가 사용, 예를 들어, 추가 접촉 및/또는 영상화 단계에 의한 추가 검출 또는 정량화를 위해 표적(예를 들어, 전사물 또는 DNA 유전자좌)을 보존시킨다. 일부 구체예에서, 제거 단계는 적어도 80%의 표적을 보존시킨다. 보존된 표적의 백분율은, 예를 들어, 임의로 동일한 접촉 및 영상화 프로토콜을 이용하여 제거 단계 전 및 후에 수거된 데이터를 비교함으로써 측정될 수 있다. 일부 구체예에서, 제거 단계는 적어도 85%의 표적을 보존시킨다. 일부 구체예에서, 제거 단계는 적어도 90%의 표적을 보존시킨다. 일부 구체예에서, 제거 단계는 적어도 91%의 표적을 보존시킨다. 일부 구체예에서, 제거 단계는 적어도 92%의 표적을 보존시킨다. 일부 구체예에서, 제거 단계는 적어도 93%의 표적을 보존시킨다. 일부 구체예에서, 제거 단계는 적어도 94%의 표적을 보존시킨다. 일부 구체예에서, 제거 단계는 적어도 95%의 표적을 보존시킨다. 일부 구체예에서, 제거 단계는 적어도 96%의 표적을 보존시킨다. 일부 구체예에서, 제거 단계는 적어도 97%의 표적을 보존시킨다. 일부 구체예에서, 제거 단계는 적어도 98%의 표적을 보존시킨다. 일부 구체예에서, 제거 단계는 적어도 99%의 표적을 보존시킨다.
검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드를 제거하기 위한 방법은 당 분야에 널리 공지되어 있다. 일부 구체예에서, 제거 단계는 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드를 분해시키는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드는 효소적 분해에 의해 제거된다. 일부 구체예에서, 제거 단계는 복수의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드와 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드를 분해하는 효소를 접촉시키는 것을 포함한다.
적합한 효소는 당 분야에서 널리 사용된다. 예를 들어, 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드 및/또는 표적의 유형(들)에 따라, DNase 또는 RNase가 이용될 수 있다. 일부 구체예에서, RNA 표적을 검출/정량하기 위한 DNA 서열을 포함하는 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드는 DNase, 예를 들어, DNase I에 의해 분해된다. 일부 구체예에서, DNA 표적을 검출/정량하기 위한 RNA 서열을 포함하는 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드는 RNase에 의해 분해된다. 일부 구체예에서, 검출 가능하게 표지된 RNA 올리고뉴클레오티드는 DNA 유전자좌를 표적화하기 위해 이용된다.
일부 구체예에서, 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드는 표적에 결합되거나, 하이브리드화되거나, 달리 연결된 하나 이상의 중간체, 예를 들어, 올리고뉴클레오티드에 대한 결합 또는 하이브리드화를 통해 이의 표적과 상호작용한다. 일부 구체예에서, 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드는 표적에 하이브리드화된 중간체 올리고뉴클레오티드와의 하이브리드화를 통해 표적과 상호작용하며, 상기 중간체 올리고뉴클레오티드는 표적에 상보적인 서열, 및 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드 서열에 상보적인 서열(오버행)을 포함한다. 일부 구체예에서, 제거 단계는 임의로 중간체 올리고뉴클레오티드를 온전하게 유지시키면서 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드를 제거한다. 일부 구체예에서, 제거 단계는 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드를 제거하고, 중간체 올리고뉴클레오티드는 온전하게 유지시킨다. 일부 구체예에서, 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드는 화학적 또는 효소적 시각에서 중간체와 상이하여, 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드는 선택적으로 제거될 수 있다.
일부 구체예에서, DNA 유전자좌에 대해 하이브리드화시키기 위해 RNA 서열을 포함하고, 상보적 서열(예를 들어, RNA 브릿지 프로브)을 갖는 브릿지 올리고뉴클레오티드가 결합할 수 있는 오버행(예를 들어, 20 nt)을 갖는 중간체 DNA 올리고뉴클레오티드가 사용된다. RNA 브릿지 프로브는 염료 또는 HCR 중합체(이는 또한 DNA일 수 있음)로 직접 표지될 수 있다. 영상화 후, DNA 유전자좌에서 하이브리드화된 DNA 프로브를 온전하게 남겨두면서 RNA 브릿지 프로브를 분해시키기 위해 RNase가 이용될 수 있다. 이러한 방법은 다수의 장점을 제공한다. 예를 들어, 이후의 접촉 단계는 오버행을 갖는 DNA 올리고뉴클레오티드에 대해 하이브리드화되는 RNA 브릿지 프로브만 포함하며, 이중 가닥 DNA가 용해되어, DNA 올리고뉴클레오티드와 하이브리드화되는 것을 피하는데, 이는 어려운 과정일 수 있다. 추가로, 오버행은 동일한 유전자를 표적으로 하는 모든 DNA 올리고뉴클레오티드(예를 들어, 20-40)에 대해 동일하게 제조될 수 있어, 하이브리드화 라운드 당 유전자 당 단지 하나의 유형의 RNA 브릿지 프로브가 필요하다. 다양한 하이브리드화(접촉 단계)에서 색을 교환시키기 위해, RNA 브릿지 프로브를 다양한 표지 또는 다양한 HCR 중합체로 변경시킬 수 있다. 예를 들어, 브릿지 또는 HCR 헤어핀 상에 EcoRI과 같은 특정 효소 제한 부위를 갖는, 특이적으로 제거될 수 있는 DNA 브릿지 프로브가 또한 이용될 수 있다. 세포와 적절한 뉴클레아제를 인큐베이션시키는 것은 DNA 유전자좌 및/또는 이들 상에 하이브리드화되는 프로브에 영향을 미치지 않고 모든 검출가능한 모이어티를 분해시킬 수 있다.
일부 구체예에서, 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드는 5' 인산화를 포함하며, 람다 엑소뉴클레아제에 의해 분해될 수 있는 반면, 중간체 올리고뉴클레오티드는 5'-인산화되지 않고, 람다 엑소뉴클레아제에 의해 분해될 수 없다.
일부 구체예에서, 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드는 우라실을 포함한다. 일부 구체예에서, 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드는 우라실을 함유하고, USER™ 효소(New England BioLabs, Ipswich, Massachusetts, MA, US)에 의해 분해될 수 있는 반면, 중간체 올리고뉴클레오티드는 우라실을 함유하지 않고, USER™ 효소에 의해 분해될 수 없다.
일부 구체예에서, 중간체 올리고뉴클레오티드의 오버행에 대해 하이브리드화되는 올리고뉴클레오티드는 오버행에 대해 하이브리드화되는 경우 리세스드 3'-말단을 갖는다. 중간체 올리고뉴클레오티드에 대해 하이브리드화되는 경우 리세스드 3'-말단을 갖는 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드는 엑소뉴클레아제 III에 의해 선택적으로 분해될 수 있다. 리세스드 3'-말단을 갖지 않거나, 3'-말단이 RNA-DNA 듀플렉스로 존재하는 중간체 올리고뉴클레오티드는 이들에 대한 엑소뉴클레아제 III의 훨씬 약한 활성으로 인해 온전하게 유지될 수 있다.
일부 구체예에서, 효소가 포함되는 경우, 제거 단계는 최적의 결과를 발생시키는 온도에서 수행된다. 일부 구체예에서, 제거 단계는 약 37℃에서 수행된다. 일부 구체예에서, 제거 단계는 실온에서 수행된다. 일부 구체예에서, 람다 엑소뉴클레아제를 이용한 분해는 약 37℃에서 수행된다. 일부 구체예에서, USER™ 효소를 이용한 분해는 약 37℃에서 수행된다. 일부 구체예에서, USER™ 효소를 이용한 분해는 실온에서 수행된다. 일부 구체예에서, 엑소뉴클레아제 III를 이용한 분해는 약 37℃에서 수행된다. 일부 구체예에서, 엑소뉴클레아제 III를 이용한 분해는 실온에서 수행된다.
일부 구체예에서, 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드 결합에 대한 중간체 올리고뉴클레오티드 및 오버행 서열의 사용은 다양한 장점을 제공한다. 일부 구체예에서, 오버행 서열과 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드 사이의 하이브리드화의 동역학은 중간체 올리고뉴클레오티드와 표적 사이의 동역학보다 신속하다. 일부 구체예에서, 표적에 대한 모든 중간체 올리고뉴클레오티드는 동일한 오버행 서열을 포함하고, 표적에 대한 모든 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드는 동일한 오버행 서열로의 결합을 위해 동일한 상보적 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 한 세트의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드와 한 세트의 중간체 올리고뉴클레오티드 사이의 하이브리드화는 한 세트의 중간체 올리고뉴클레오티드와 한 세트의 표적 사이의 하이브리드화보다 약 20-40배 이하로 신속하다. 일부 구체예에서, 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드와 중간체 올리고뉴클레오티드 사이의 하이브리드화는, 일부 경우에서, 중간체 올리고뉴클레오티드와 표적 사이의 하이브리드화에 대한 약 12시간 이하에 비해 30분 내에 수행될 수 있다.
일부 구체예에서, 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드를 제거하기 위해 제거 단계에서 가닥 치환이 이용된다. 일부 구체예에서, 제거 단계에서 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드를 분리시키기 위해 열이 이용된다.
일부 구체예에서, 제거 단계는 광표백을 포함한다. 일부 구체예에서, 광표백은 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드의 염료, 예를 들어, 형광단을 파괴한다.
일부 구체예에서, 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드의 제 1 및 제 2 세트는 각각의 표적의 상이한 서열을 표적으로 하고, 제 1 영상화 단계 후의 제거 단계는 선택적이다. 예를 들어, 한 전략은 상이한 DNA 프로브(검출 가능하게 표지된 DNA 올리고뉴클레오티드)로 동일한 RNA를 표적화시키는 것으로, 제 1의 복수의 프로브는 RNA 상의 한 세트의 서열을 표적화할 수 있고, 제 2의 복수의 프로브는 동일 RNA 상의 상이한 세트의 서열을 표적화할 수 있다. 제 1 하이브리드화(접촉) 시, 제 1의 복수의 프로브가 사용된다. 이후, 이들은 영상화될 수 있고, 임의로 광표백될 수 있거나, DNase 또는 올리고 또는 염료를 파괴하는 다른 방법에 의해 분해될 수 있다. 제 2 세트의 프로브는 제 1 세트의 프로브로부터의 간섭 없이 하이브리드화될 수 있고, 영상화될 수 있다.
일부 구체예에서, 제공된 방법은 임의로 HCR, 광시트 현미경검사, CLARITY, 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 구체예에서, 제공된 방법은 조직, 기관 또는 유기체 내의 표적의 직접적인 프로파일링을 가능케 한다. 일부 구체예에서, 기관은 뇌이다. 일부 구체예에서, 제공된 방법은 온전한 뇌 또는 조직 내의 전사물의 직접적인 영상화를 가능케 한다. 일부 구체예에서, 제공된 방법은 HCR을 추가로 포함한다. 일부 구체예에서, 제공된 방법은 광시트 현미경검사를 추가로 포함한다. 일부 구체예에서, 제공된 방법은 CLARITY를 추가로 포함한다.
제공된 방법은 본 발명 이전의 방법에 비해 많은 장점을 제공한다. 예를 들어, 일부 구체예에서, 제공된 방법은 적당한 비용으로 고-처리량을 제공한다. 일부 구체예에서, 제공된 방법은 표적의 전환 또는 증폭 없이 표적의 직접적인 프로빙을 제공한다. 일부 구체예에서, 제공된 방법은 많은 양의 검출가능한 표지의 필요조건 없이 신속한 규모 확장을 가능케 한다. 일부 구체예에서, 제공된 방법은 다수의 표지를 동일한 표적에 적용시킬 수 있고, 따라서 신호 강도를 증가시킬 수 있다. 일부 구체예에서, 제공된 방법은 상기 장점의 조합을 제공한다.
일부 구체예에서, 본 발명은, 예를 들어, 제공된 방법에서 사용하기 위한 복수의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 조성물을 제공한다. 예시적 조성물은 본원의 예시적 방법의 구체예에 기재된 것을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
일부 구체예에서, 본 발명은 복수의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드 각각이 핵산을 표적으로 하고, 검출가능한 모이어티로 표지되는, 상기 올리고뉴클레오티드를 포함하는 조성물을 제공하며, 상기 조성물은 적어도,
(i) 제 1 핵산을 표적으로 하고, 제 1의 검출가능한 모이어티로 표지된 제 1 올리고뉴클레오티드; 및
(ii) 제 2 핵산을 표적으로 하고, 제 2의 검출가능한 모이어티로 표지된 제 2 올리고뉴클레오티드를 포함한다.
일부 구체예에서, 본 발명은 복수의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드 각각이 전사물 또는 DNA 유전자좌를 표적으로 하고, 검출가능한 모이어티로 표지되는, 상기 올리고뉴클레오티드를 포함하는 조성물을 제공하며, 상기 조성물은 적어도,
(i) 제 1 전사물 또는 DNA 유전자좌를 표적으로 하고, 제 1의 검출가능한 모이어티로 표지된 제 1 올리고뉴클레오티드; 및
(ii) 제 2 전사물 또는 DNA 유전자좌를 표적으로 하고, 제 2의 검출가능한 모이어티로 표지된 제 2 올리고뉴클레오티드를 포함한다.
일부 구체예에서, 본 발명은 복수의 검출가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드 각각이 전사물 또는 DNA 유전자좌를 표적으로 하고, 검출가능한 모이어티로 표지된, 상기 올리고뉴클레오티드를 포함하는 키트를 제공하며, 상기 키트는 적어도,
(i) 제 1 전사물 또는 DNA 유전자좌를 표적으로 하고, 제 1의 검출가능한 모이어티로 표지된 제 1 올리고뉴클레오티드;
(ii) 제 2 전사물 또는 DNA 유전자좌를 표적으로 하고, 제 2의 검출가능한 모이어티로 표지된 제 2 올리고뉴클레오티드;
(iii) 임의로 제 1 올리고뉴클레오티드와 서열에 있어서 동일하고, 제 1 전사물 또는 DNA 유전자좌를 표적으로 하고, 제 1, 제 2 또는 제 3의 검출가능한 모이어티로 표지된 제 3 올리고뉴클레오티드; 및
(iv) 임의로 제 2 올리고뉴클레오티드와 서열에 있어서 동일하고, 제 2 전사물 또는 DNA 유전자좌를 표적으로 하고, 제 1, 제 2, 제 3 또는 제 4의 검출가능한 모이어티로 표지된 제 4 올리고뉴클레오티드를 포함하고,
상기 제 3 올리고뉴클레오티드는 제 1 올리고뉴클레오티드와 상이한 검출가능한 모이어티로 표지되거나, 상기 제 4 올리고뉴클레오티드는 제 2 올리고뉴클레오티드와 상이한 검출가능한 모이어티로 표지되거나, 둘 모두이다.
일부 구체예에서, 조성물 내의 동일 표적(전사물 또는 DNA 유전자좌)을 표적으로 하는 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드는 동일한 검출가능한 신호, 또는 영상화 단계에서 구별될 수 없는 검출가능한 신호를 제공하는 모이어티로 표지된다. 일부 구체예에서, 조성물 내의 동일 표적을 표적으로 하는 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드는 동일한 검출가능한 모이어티로 표지된다.
일부 구체예에서, 검출가능한 모이어티는 형광단이거나 이를 포함한다. 일부 구체예에서, 검출가능한 모이어티는 형광단이다. 예시적인 형광단은 당 분야에서 널리 공지되어 있고, 사용되며, 예를 들어, 플루오레세인, 로다민, 알렉사 플루오르, 디라이트 플루오르, ATTO 염료, 또는 이들의 임의의 유사체 또는 유도체가 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
일부 구체예에서, 제 1 및 제 2의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드는 상이한 표적을 표적으로 한다. 일부 구체예에서, 제 1 및 제 2의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드는 동일한 표적을 표적으로 한다. 일부 구체예에서, 조성물 또는 키트 내의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드는 2개 이상의 표적, 예를 들어, 전사물 및/또는 DNA 유전자좌를 표적으로 한다. 일부 구체예에서, 조성물 또는 키트 내의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드는 2개 이상의 전사물을 표적으로 한다. 일부 구체예에서, 조성물 또는 키트 내의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드는 2개 이상의 DNA 유전자좌를 표적으로 한다. 일부 구체예에서, 조성물 또는 키트 내의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드는 적어도 4개의 표적을 표적으로 한다. 일부 구체예에서, 조성물 또는 키트 내의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드는 적어도 9개의 표적을 표적으로 한다. 일부 구체예에서, 조성물 또는 키트 내의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드는 적어도 16개의 표적을 표적으로 한다. 일부 구체예에서, 조성물 또는 키트 내의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드는 적어도 25개의 표적을 표적으로 한다. 일부 구체예에서, 조성물 또는 키트 내의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드는 적어도 36개의 표적을 표적으로 한다. 일부 구체예에서, 조성물 또는 키트 내의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드는 적어도 50개의 표적을 표적으로 한다. 일부 구체예에서, 조성물 또는 키트 내의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드는 적어도 100개의 표적을 표적으로 한다. 일부 구체예에서, 조성물 또는 키트 내의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드는 적어도 200개의 표적을 표적으로 한다. 일부 구체예에서, 조성물 또는 키트 내의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드는 적어도 500개의 표적을 표적으로 한다. 일부 구체예에서, 조성물 또는 키트 내의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드는 적어도 1,000개의 표적을 표적으로 한다. 일부 구체예에서, 조성물 또는 키트 내의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드는 적어도 5,000개의 표적을 표적으로 한다. 일부 구체예에서, 조성물 또는 키트 내의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드는 적어도 10,000개의 표적을 표적으로 한다. 일부 구체예에서, 조성물 또는 키트 내의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드는 적어도 50,000개의 표적을 표적으로 한다. 일부 구체예에서, 조성물 또는 키트 내의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드는 적어도 100,000개의 표적을 표적으로 한다. 일부 구체예에서, 조성물 또는 키트 내의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드는 적어도 1,000,000개의 표적을 표적으로 한다.
일부 구체예에서, 제 1 및 제 2 올리고뉴클레오티드는 상이한 올리고뉴클레오티드 서열을 갖는다. 일부 구체예에서, 제 1 및 제 2의 검출가능한 모이어티는 상이하다. 일부 구체예에서, 제 1 및 제 2의 검출가능한 모이어티는 동일하다.
일부 구체예에서, 제 1 및 제 2 올리고뉴클레오티드는 5% 미만의 서열 동일성을 공유한다. 일부 구체예에서, 제 1 및 제 2 올리고뉴클레오티드는 10% 미만의 서열 동일성을 공유한다. 일부 구체예에서, 제 1 및 제 2 올리고뉴클레오티드는 20% 미만의 서열 동일성을 공유한다. 일부 구체예에서, 제 1 및 제 2 올리고뉴클레오티드는 30% 미만의 서열 동일성을 공유한다. 일부 구체예에서, 제 1 및 제 2 올리고뉴클레오티드는 40% 미만의 서열 동일성을 공유한다. 일부 구체예에서, 제 1 및 제 2 올리고뉴클레오티드는 50% 미만의 서열 동일성을 공유한다. 일부 구체예에서, 제 1 및 제 2 올리고뉴클레오티드는 60% 미만의 서열 동일성을 공유한다. 일부 구체예에서, 제 1 및 제 2 올리고뉴클레오티드는 65% 미만의 서열 동일성을 공유한다. 일부 구체예에서, 제 1 및 제 2 올리고뉴클레오티드는 68% 미만의 서열 동일성을 공유한다. 일부 구체예에서, 제 1 및 제 2 올리고뉴클레오티드는 70% 미만의 서열 동일성을 공유한다. 일부 구체예에서, 제 1 및 제 2 올리고뉴클레오티드는 80% 미만의 서열 동일성을 공유한다. 일부 구체예에서, 제 1 및 제 2 올리고뉴클레오티드는 90% 미만의 서열 동일성을 공유한다.
일부 구체예에서, 각각의 올리고뉴클레오티드는 임의의 다른 올리고뉴클레오티드와 5% 미만의 서열 동일성을 공유한다. 일부 구체예에서, 각각의 올리고뉴클레오티드는 임의의 다른 올리고뉴클레오티드와 10% 미만의 서열 동일성을 공유한다. 일부 구체예에서, 각각의 올리고뉴클레오티드는 임의의 다른 올리고뉴클레오티드와 20% 미만의 서열 동일성을 공유한다. 일부 구체예에서, 각각의 올리고뉴클레오티드는 임의의 다른 올리고뉴클레오티드와 30% 미만의 서열 동일성을 공유한다. 일부 구체예에서, 각각의 올리고뉴클레오티드는 임의의 다른 올리고뉴클레오티드와 40% 미만의 서열 동일성을 공유한다. 일부 구체예에서, 각각의 올리고뉴클레오티드는 임의의 다른 올리고뉴클레오티드와 50% 미만의 서열 동일성을 공유한다. 일부 구체예에서, 각각의 올리고뉴클레오티드는 임의의 다른 올리고뉴클레오티드와 55% 미만의 서열 동일성을 공유한다. 일부 구체예에서, 각각의 올리고뉴클레오티드는 임의의 다른 올리고뉴클레오티드와 60% 미만의 서열 동일성을 공유한다. 일부 구체예에서, 각각의 올리고뉴클레오티드는 임의의 다른 올리고뉴클레오티드와 65% 미만의 서열 동일성을 공유한다. 일부 구체예에서, 각각의 올리고뉴클레오티드는 임의의 다른 올리고뉴클레오티드와 68% 미만의 서열 동일성을 공유한다. 일부 구체예에서, 각각의 올리고뉴클레오티드는 임의의 다른 올리고뉴클레오티드와 70% 미만의 서열 동일성을 공유한다. 일부 구체예에서, 각각의 올리고뉴클레오티드는 임의의 다른 올리고뉴클레오티드와 80% 미만의 서열 동일성을 공유한다. 일부 구체예에서, 각각의 올리고뉴클레오티드는 임의의 다른 올리고뉴클레오티드와 90% 미만의 서열 동일성을 공유한다.
일부 구체예에서, 조성물 또는 키트는 동일한 표적을 표적으로 하는 2개 이상의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구체예에서, 5, 10, 20, 30, 40, 50 또는 그 초과의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드는 동일한 표적을 표적으로 한다.
검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드는 다양한 적합한 길이의 올리고뉴클레오티드일 수 있다. 일부 구체예에서, 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드는 15개의 염기쌍 길이이다. 일부 구체예에서, 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드는 16개의 염기쌍 길이이다. 일부 구체예에서, 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드는 17개의 염기쌍 길이이다. 일부 구체예에서, 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드는 18개의 염기쌍 길이이다. 일부 구체예에서, 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드는 19개의 염기쌍 길이이다. 일부 구체예에서, 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드는 20개의 염기쌍 길이이다. 일부 구체예에서, 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드는 21개의 염기쌍 길이이다. 일부 구체예에서, 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드는 22개의 염기쌍 길이이다. 일부 구체예에서, 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드는 23개의 염기쌍 길이이다. 일부 구체예에서, 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드는 24개의 염기쌍 길이이다. 일부 구체예에서, 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드는 25개의 염기쌍 길이이다. 일부 구체예에서, 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드는 26개의 염기쌍 길이이다. 일부 구체예에서, 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드는 27개의 염기쌍 길이이다. 일부 구체예에서, 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드는 28개의 염기쌍 길이이다. 일부 구체예에서, 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드는 29개의 염기쌍 길이이다. 일부 구체예에서, 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드는 30개의 염기쌍 길이이다. 일부 구체예에서, 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드는 적어도 15개의 염기쌍 길이이다. 일부 구체예에서, 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드는 적어도 16개의 염기쌍 길이이다. 일부 구체예에서, 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드는 적어도 17개의 염기쌍 길이이다. 일부 구체예에서, 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드는 적어도 18개의 염기쌍 길이이다. 일부 구체예에서, 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드는 적어도 19개의 염기쌍 길이이다. 일부 구체예에서, 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드는 적어도 20개의 염기쌍 길이이다. 일부 구체예에서, 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드는 적어도 21개의 염기쌍 길이이다. 일부 구체예에서, 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드는 적어도 22개의 염기쌍 길이이다. 일부 구체예에서, 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드는 적어도 23개의 염기쌍 길이이다. 일부 구체예에서, 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드는 적어도 24개의 염기쌍 길이이다. 일부 구체예에서, 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드는 적어도 25개의 염기쌍 길이이다. 일부 구체예에서, 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드는 적어도 26개의 염기쌍 길이이다. 일부 구체예에서, 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드는 적어도 27개의 염기쌍 길이이다. 일부 구체예에서, 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드는 적어도 28개의 염기쌍 길이이다. 일부 구체예에서, 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드는 적어도 29개의 염기쌍 길이이다. 일부 구체예에서, 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드는 적어도 30개의 염기쌍 길이이다. 일부 구체예에서, 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드는 적어도 35개의 염기쌍 길이이다. 일부 구체예에서, 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드는 적어도 40개의 염기쌍 길이이다. 일부 구체예에서, 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드는 적어도 50개의 염기쌍 길이이다. 일부 구체예에서, 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드는 약 15-25개의 염기쌍 길이이다. 일부 구체예에서, 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드는 약 20-30개의 염기쌍 길이이다. 일부 구체예에서, 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드는 약 25-35개의 염기쌍 길이이다. 일부 구체예에서, 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드는 약 30-40개의 염기쌍 길이이다. 일부 구체예에서, 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드는 약 35-45개의 염기쌍 길이이다. 일부 구체예에서, 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드는 약 40-50개의 염기쌍 길이이다. 일부 구체예에서, 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드는 약 15-30개의 염기쌍 길이이다. 일부 구체예에서, 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드는 약 20-30개의 염기쌍 길이이다. 일부 구체예에서, 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드는 약 15-35개의 염기쌍 길이이다. 일부 구체예에서, 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드는 약 20-35개의 염기쌍 길이이다.
일부 구체예에서, 복수의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드는 2개의 검출가능한 모이어티를 함유한다. 일부 구체예에서, 복수의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드는 3개의 검출가능한 모이어티를 함유한다. 일부 구체예에서, 복수의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드는 4개의 검출가능한 모이어티를 함유한다. 일부 구체예에서, 복수의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드는 5개의 검출가능한 모이어티를 함유한다. 일부 구체예에서, 복수의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드는 6개의 검출가능한 모이어티를 함유한다. 일부 구체예에서, 복수의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드는 7개의 검출가능한 모이어티를 함유한다. 일부 구체예에서, 복수의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드는 8개의 검출가능한 모이어티를 함유한다. 일부 구체예에서, 복수의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드는 9개의 검출가능한 모이어티를 함유한다. 일부 구체예에서, 복수의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드는 10개의 검출가능한 모이어티를 함유한다.
일부 구체예에서, 복수의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드는 적어도 2개의 검출가능한 모이어티를 포함한다. 일부 구체예에서, 복수의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드는 적어도 3개의 검출가능한 모이어티를 포함한다. 일부 구체예에서, 복수의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드는 적어도 4개의 검출가능한 모이어티를 포함한다. 일부 구체예에서, 복수의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드는 적어도 5개의 검출가능한 모이어티를 포함한다. 일부 구체예에서, 복수의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드는 적어도 6개의 검출가능한 모이어티를 포함한다. 일부 구체예에서, 복수의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드는 적어도 7개의 검출가능한 모이어티를 포함한다. 일부 구체예에서, 복수의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드는 적어도 8개의 검출가능한 모이어티를 포함한다. 일부 구체예에서, 복수의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드는 적어도 9개의 검출가능한 모이어티를 포함한다. 일부 구체예에서, 복수의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드는 적어도 10개의 검출가능한 모이어티를 포함한다.
일부 구체예에서, 조성물은,
(iii) 임의로, 제 1 올리고뉴클레오티드와 서열에 있어서 동일하고, 제 1 전사물 또는 DNA 유전자좌를 표적으로 하는 제 3 올리고뉴클레오티드; 및
(iv) 임의로, 제 2 올리고뉴클레오티드와 서열에 있어서 동일하고, 제 2 전사물 또는 DNA 유전자좌를 표적으로 하는 제 4 올리고뉴클레오티드를 추가로 포함하며,
상기 제 3 올리고뉴클레오티드는 제 1 올리고뉴클레오티드와 상이한 검출가능한 모이어티로 표지되거나, 상기 제 4 올리고뉴클레오티드는 제 2 올리고뉴클레오티드와 상이한 검출가능한 모이어티로 표지되거나, 둘 모두이다.
일부 구체예에서, 제 3 올리고뉴클레오티드는 제 1 올리고뉴클레오티드와 서열에 있어서 동일하다. 일부 구체예에서, 제 3 올리고뉴클레오티드는 제 1 올리고뉴클레오티드와 중첩되는 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 제 3 올리고뉴클레오티드는 제 1 올리고뉴클레오티드와 50% 미만의 서열 동일성을 갖는다. 일부 구체예에서, 제 3 올리고뉴클레오티드는 제 1 올리고뉴클레오티드와 40% 미만의 서열 동일성을 갖는다. 일부 구체예에서, 제 3 올리고뉴클레오티드는 제 1 올리고뉴클레오티드와 30% 미만의 서열 동일성을 갖는다. 일부 구체예에서, 제 3 올리고뉴클레오티드는 제 1 올리고뉴클레오티드와 20% 미만의 서열 동일성을 갖는다. 일부 구체예에서, 제 3 올리고뉴클레오티드는 제 1 올리고뉴클레오티드와 10% 미만의 서열 동일성을 갖는다. 일부 구체예에서, 제 3 올리고뉴클레오티드는 제 1 올리고뉴클레오티드와 5% 미만의 서열 동일성을 갖는다.
일부 구체예에서, 제 4 올리고뉴클레오티드는 제 2 올리고뉴클레오티드와 서열에 있어서 동일하다. 일부 구체예에서, 제 4 올리고뉴클레오티드는 제 2 올리고뉴클레오티드와 중첩되는 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 제 4 올리고뉴클레오티드는 제 2 올리고뉴클레오티드와 50% 미만의 서열 동일성을 갖는다. 일부 구체예에서, 제 4 올리고뉴클레오티드는 제 2 올리고뉴클레오티드와 40% 미만의 서열 동일성을 갖는다. 일부 구체예에서, 제 4 올리고뉴클레오티드는 제 2 올리고뉴클레오티드와 30% 미만의 서열 동일성을 갖는다. 일부 구체예에서, 제 4 올리고뉴클레오티드는 제 2 올리고뉴클레오티드와 20% 미만의 서열 동일성을 갖는다. 일부 구체예에서, 제 4 올리고뉴클레오티드는 제 2 올리고뉴클레오티드와 10% 미만의 서열 동일성을 갖는다. 일부 구체예에서, 제 4 올리고뉴클레오티드는 제 2 올리고뉴클레오티드와 5% 미만의 서열 동일성을 갖는다.
일부 구체예에서, 제 3 올리고뉴클레오티드는 제 1 올리고뉴클레오티드와 상이한 검출가능한 모이어티로 표지된다. 일부 구체예에서, 제 4 올리고뉴클레오티드는 제 2 올리고뉴클레오티드와 상이한 검출가능한 모이어티로 표지된다.
일부 구체예에서, 조성물, 키트 또는 방법에서 복수의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드의 양이 미리 결정된다. 일부 구체예에서, 조성물, 키트 또는 방법에서 5%의 복수의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드의 양이 미리 결정된다. 일부 구체예에서, 조성물, 키트 또는 방법에서 10%의 복수의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드의 양이 미리 결정된다. 일부 구체예에서, 조성물, 키트 또는 방법에서 20%의 복수의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드의 양이 미리 결정된다. 일부 구체예에서, 조성물, 키트 또는 방법에서 30%의 복수의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드의 양이 미리 결정된다. 일부 구체예에서, 조성물, 키트 또는 방법에서 40%의 복수의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드의 양이 미리 결정된다. 일부 구체예에서, 조성물, 키트 또는 방법에서 50%의 복수의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드의 양이 미리 결정된다. 일부 구체예에서, 조성물, 키트 또는 방법에서 60%의 복수의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드의 양이 미리 결정된다. 일부 구체예에서, 조성물, 키트 또는 방법에서 70%의 복수의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드의 양이 미리 결정된다. 일부 구체예에서, 조성물, 키트 또는 방법에서 80%의 복수의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드의 양이 미리 결정된다. 일부 구체예에서, 조성물, 키트 또는 방법에서 90%의 복수의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드의 양이 미리 결정된다.
일부 구체예에서, 조성물, 키트 또는 방법에서 적어도 5개의 복수의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드의 양이 미리 결정된다. 일부 구체예에서, 조성물, 키트 또는 방법에서 적어도 10개의 복수의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드의 양이 미리 결정된다. 일부 구체예에서, 조성물, 키트 또는 방법에서 적어도 20개의 복수의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드의 양이 미리 결정된다. 일부 구체예에서, 조성물, 키트 또는 방법에서 적어도 30개의 복수의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드의 양이 미리 결정된다. 일부 구체예에서, 조성물, 키트 또는 방법에서 적어도 40개의 복수의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드의 양이 미리 결정된다. 일부 구체예에서, 조성물, 키트 또는 방법에서 적어도 50개의 복수의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드의 양이 미리 결정된다. 일부 구체예에서, 조성물, 키트 또는 방법에서 적어도 60개의 복수의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드의 양이 미리 결정된다. 일부 구체예에서, 조성물, 키트 또는 방법에서 적어도 70개의 복수의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드의 양이 미리 결정된다. 일부 구체예에서, 조성물, 키트 또는 방법에서 적어도 80개의 복수의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드의 양이 미리 결정된다. 일부 구체예에서, 조성물, 키트 또는 방법에서 적어도 90개의 복수의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드의 양이 미리 결정된다. 일부 구체예에서, 조성물, 키트 또는 방법에서 적어도 각각의 복수의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드의 양이 미리 결정된다.
일부 구체예에서, 2개 이상의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드가 한 표적에 대해 제공된다. 일부 구체예에서, 표적에 대한 모든 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드의 전체량이 미리 결정된다. 일부 구체예에서, 표적에 대한 모든 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드의 전체량이 미리 결정되고, 표적에 대한 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드 각각의 양이 독립적이고 임의로 미리 결정된다. 일부 구체예에서, 복수의 표적 각각에 대한 모든 검출 가능하게 표지된 올리고뉴크레오티드의 전체량이 독립적으로 미리 결정된다. 일부 구체예에서, 복수의 표적은 적어도 2개의 표적을 갖는다. 일부 구체예에서, 복수의 표적은 적어도 5개의 표적을 갖는다. 일부 구체예에서, 복수의 표적은 적어도 10개의 표적을 갖는다. 일부 구체예에서, 복수의 표적은 적어도 50개의 표적을 갖는다. 일부 구체예에서, 복수의 표적은 적어도 100개의 표적을 갖는다. 일부 구체예에서, 복수의 표적은 적어도 500개의 표적을 갖는다. 일부 구체예에서, 복수의 표적은 적어도 1,000개의 표적을 갖는다.
일부 구체예에서, 조성물, 키트 또는 방법에서 복수의 표적이 미리 결정된다. 일부 구체예에서, 조성물, 키트 또는 방법에서 적어도 10개의 복수의 표적이 미리 결정된다. 일부 구체예에서, 조성물, 키트 또는 방법에서 적어도 50개의 복수의 표적이 미리 결정된다. 일부 구체예에서, 조성물, 키트 또는 방법에서 적어도 100개의 복수의 표적이 미리 결정된다. 일부 구체예에서, 조성물, 키트 또는 방법에서 적어도 1,000개의 복수의 표적이 미리 결정된다. 일부 구체예에서, 조성물, 키트 또는 방법에서 F N 개 이하의 복수의 표적이 미리 결정되고, 여기서 F는 복수의 검출가능한 모이어티의 수이고, N은 영상화 단계의 수이다.
검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드를 합성하기 위한 방법은 당 분야에서 널리 공지되어 있고 실시되며, 예를 들어, 문헌[Lubeck, E. & Cai, L. Nat. Methods 9, 743-48 (2012)]을 참조하라. 올리고뉴클레오티드는 또한 다양한 시판 업체로부터 상업적으로 이용가능하다. 일부 구체예에서, 본 발명은 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드를 제조하기 위한 방법을 제공한다. 일부 구체예에서, 본 발명은 중간체 올리고뉴클레오티드를 제조하기 위한 방법을 제공한다. 일부 구체예에서, 본 발명은 브릿지 올리고뉴클레오티드를 제조하기 위한 방법을 제공한다.
일부 구체예에서, 본 발명은,
1) 제 1 서열을 포함하는 제 1 핵산을 제공하는 단계로서, 상기 제 1 서열이 양 말단에서 니킹 엔도뉴클레아제 부위와 측면을 접한, 단계;
2) 제 1 서열 및 측면을 접한 니킹 엔도뉴클레아제 부위를 포함하는 제 2 핵산을 제공하기 위해 제 1 핵산 또는 제 1 핵산의 일부를 증폭시키는 단계; 및
3) 제 2 핵산과 측면을 접한 니킹 엔도뉴클레아제 부위에 상응하는 하나 이상의 니킹 엔도뉴클레아제를 접촉시키는 단계를 포함하는, 제 1 서열을 갖는 표적 핵산을 제조하기 위한 방법을 제공한다.
일부 구체예에서, 제 1 서열을 갖는 표적 핵산은 단일-가닥이다. 일부 구체예에서, 증폭 단계는 중합효소 연쇄 반응(PCR)을 포함한다. 일부 구체예에서, 제공된 방법은 변성 단계를 추가로 포함하며, 여기서 이중-가닥의 제 2 핵산이 변성되고, 2개의 가닥이 단일-가닥이 된다. 일부 구체예에서, 제공된 방법은 제 1 서열을 갖는 핵산을 분리시키는 것을 추가로 포함한다. 일부 구체예에서, 제 2 핵산은 니킹 엔도뉴클레아제와의 접촉 전에 임의로 변형된다. 일부 구체예에서, 제공된 방법은 제 1 서열을 갖는 핵산을 표지시키는 것을 추가로 포함한다.
일부 구체예에서, 2개의 측면을 접한 엔도뉴클레아제 부위는 동일하다. 일부 구체예에서, 동일한 니킹 엔도뉴클레아제 부위에 상응하는 1개의 니킹 엔도뉴클레아제가 이용된다. 일부 구체예에서, 2개의 측면을 접한 엔도뉴클레아제 부위는 상이하다. 일부 구체예에서, 각각이 독립적으로 니킹 엔도뉴클레아제 부위에 상응하는 2개의 니킹 엔도뉴클레아제가 이용된다.
일부 구체예에서, 제공된 기술의 올리고뉴클레오티드는 올리고뉴클레오티드 풀(pool)로부터 발생된다. 일부 구체예에서, 상기 풀은 상업적으로 이용가능하다. 일부 구체예에서 최초 DNA 올리고뉴클레오티드 풀은 서브셋으로 조직된 12,000개 또는 그 초과까지의 상이한 단일 가닥 서열로 구성된다. 각각의 서열은 니킹 엔도뉴클레아제 부위 및 정방향 및 역방향 프라이머 서열이 요망되는 서열(예를 들어, 프로브 서열)의 측면에 접하도록 설계된다. 요망되는 서열을 갖는 서브셋에 해당하는 정방향 및 역방향 프라이머 서열이 명시된다. 중합효소 연쇄 반응(PCR)을 이용하여 서브셋을 증폭시키기 위해 프라이머 쌍이 이용될 수 있다. PCR 반응의 생성물은 니킹 엔도뉴클레아제에 의해 분리되고 분해된다. 니킹 효소와의 인큐베이션 시간은 사용되는 효소의 양 및 회수되는 DNA의 양을 기초로 하여 다양하다. 일부 구체예에서, 약 10 유닛의 효소는 약 1시간 동안 약 1 μg의 DNA를 분해한다. 이후, 샘플은 정제되고, 완충액, 예를 들어, 2x 로딩 완충액(96% 포름아미드/20mM EDTA) 및 물에서 재구성되어, 최종 로딩 완충액(48% 포름아미드/10mM EDTA)이 제조되고, DNA를 완전히 변성시키기 위해, 예를 들어, 95℃로의 가열에 의해 변성된다. 변성된 DNA는 정제되고, 요망되는 생성물이 분리된다. 일부 구체예에서, 정제 및/또는 분리는 전기영동을 포함한다. 예시적 과정이 도 25에 예시된다.
일부 구체예에서, 본 발명은,
1) 제 1 서열 또는 이의 상보적 서열을 포함하는 제 1 핵산을 제공하는 단계로서, 상기 제 1 서열 또는 이의 상보적 서열이 적어도 하나의 제한 부위와 측면을 접한, 단계;
2) 제 1 서열 및 적어도 하나의 측면을 접한 제한 부위를 포함하는 제 2 핵산을 제공하기 위해 제 1 핵산 또는 제 1 핵산의 일부를 증폭시키는 단계;
3) 리세스드 말단을 포함하는 제 3 핵산을 제공하기 위해 제 2 핵산과 적어도 하나의 측면을 접한 제한 부위에 상응하는 제한 효소를 접촉시키는 단계; 및
4) 제 1 서열을 포함하는 가닥을 유지시키면서 존재시 상보적 서열을 포함하는 가닥을 선택적으로 분해시키기 위해 제 3 핵산과 뉴클레아제를 접촉시키는 단계를 포함하는, 제 1 서열을 갖는 표적 핵산을 제조하기 위한 방법을 제공한다.
일부 구체예에서, 제 1 서열 또는 이의 상보적 서열은 독립적으로 각각의 말단에서 제한 부위와 측면을 접한다.
일부 구체예에서, 본 발명은,
1) 제 1 서열 또는 이의 상보적 서열을 포함하는 제 1 핵산을 제공하는 단계로서, 상기 제 1 서열 또는 이의 상보적 서열이 양 말단에서 제한 부위와 측면을 접한, 단계;
2) 제 1 서열 및 측면을 접한 제한 부위를 포함하는 제 2 핵산을 제공하기 위해 제 1 핵산 또는 제 1 핵산의 일부를 증폭시키는 단계;
3) 리세스드 말단을 포함하는 제 3 핵산을 제공하기 위해 제 2 핵산과 측면을 접한 제한 부위에 상응하는 제한 효소를 접촉시키는 단계; 및
4) 제 1 서열을 포함하는 가닥을 유지시키면서 존재시 상보적 서열을 포함하는 가닥을 선택적으로 분해시키기 위해 제 3 핵산과 뉴클레아제를 접촉시키는 단계를 포함하는, 제 1 서열을 갖는 표적 핵산을 제조하기 위한 방법을 제공한다.
일부 구체예에서, 제 1 서열을 갖는 표적 핵산은 단일-가닥이다. 일부 구체예에서, 증폭 단계는 PCR을 포함한다. 일부 구체예에서, 제공된 방법은 제 1 서열을 갖는 핵산을 분리시키는 것을 추가로 포함한다. 일부 구체예에서, 제 2 핵산은 제한 효소와의 접촉 전에 임의로 변형된다. 일부 구체예에서, 제 3 핵산은 뉴클레아제와의 접촉 전에 임의로 변형된다. 일부 구체예에서, 뉴클레아제는 3'-리세스드 말단을 갖는 가닥을 우선적으로 분해하고, 5' 리세스드 말단을 갖는 가닥은 보존시킬 수 있는 엑소뉴클레아제 III이다. 일부 구체예에서, 제한 효소는 5'-리세스드 말단을 발생시킨다. 일부 구체예에서, 제한 효소는 3'-리세스드 말단을 발생시킨다. 일부 구체예에서, 상보적 서열은 제한 분해 후에 3' 리세스드 말단을 갖는다. 일부 구체예에서, 상보적 서열을 포함하는 가닥은 제한 분해 후에 3' 리세스드 말단을 갖고, 제 1 서열을 포함하는 가닥은 제한 분해 후에 5' 리세스드 말단을 갖는다. 일부 구체예에서, 제공된 방법은 제 1 서열을 갖는 핵산을 표지시키는 것을 추가로 포함한다.
일부 구체예에서, 단일 가닥 올리고뉴클레오티드, 예를 들어, seqFISH를 위한 프로브 또는 중간체 올리고뉴클레오티드는 뉴클레아제 분해, 예를 들어, exoIII 뉴클레아제 분해를 이용하여 생성될 수 있다. 증폭(예를 들어, PCR) 생성물 상의 2개의 닉 부위 대신, 프로브 및/또는 어댑터 서열과 측면을 접한 2개의 제한 부위가 이용될 수 있다. 일부 구체예에서, 1개의 제한 부위는 3' 리세스드 말단을 남기는 한편, 나머지 제한 부위는 5' 리세스드 말단을 남긴다. 예를 들어, EcoRI 및 BamHI은 5' 리세스드 말단을 남기는 한편, BmtI 및 PacI은 3' 리세스드 말단을 남긴다. 상기 제한 효소는 당 분야에서 널리 공지되어 있고, 사용된다. 엑소뉴클레아제 III는 3' 리세스드 말단을 우선적으로 분해하고, 5' 리세스드 말단을 갖는 가닥을 보존시킨다. 이는 PCR 및 제한 뉴클레아제를 이용하여 올리고뉴클레오티드 풀로부터 단일 가닥 프로브를 생성시키는 또 다른 메커니즘을 제공한다.
일부 구체예에서, 제공된 표적 핵산은 DNA이다. 일부 구체예에서, 표적 핵산은 동일 서열 제 1 서열을 갖는다. 일부 구체예에서, 표적 핵산은 표적, 예를 들어, 전사물 또는 DNA 유전자좌에 하이브리드화되는 제 1 서열, 및 제 2 올리고뉴클레오티드, 예를 들어, 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드에 하이브리드화되는 제 2 서열을 포함하는 중간체 올리고뉴클레오티드이다. 일부 구체예에서, 표적 핵산은 표적에 하이브리드화되는 제 1 서열, 및 HCR에 의해 표지된 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드와 하이브리드화되는 제 2 서열을 포함하는 중간체 올리고뉴클레오티드이다. 일부 구체예에서, 표적 핵산은 브릿지 프로브이다.
일부 구체예에서, 제공된 방법은 질병의 진단을 위해 사용되며, 상기 질병은 전사물 또는 DNA 유전자좌의 비정상적 수와 관련된다. 일부 구체예에서, 제공된 방법은 치료를 위한 대상체를 선택하기 위해 사용된다. 일부 구체예에서, 제공된 방법은 치료 요법을 모니터링하기 위해 사용된다. 일부 구체예에서, 제공된 방법의 세포는 대상체로부터의 세포이다. 일부 구체예에서, 제공된 방법의 세포는 포유동물 세포이다. 일부 구체예에서, 제공된 방법의 세포는 인간 세포이다. 일부 구체예에서, 제공된 방법의 세포는 대상체로부터의 세포이다. 일부 구체예에서, 제공된 방법의 세포는 동물로부터의 세포이다. 일부 구체예에서, 제공된 방법의 세포는 인간 대상체로부터의 세포이다. 일부 구체예에서, 제공된 방법의 세포는 인간 대상체로부터 분리된 세포이다. 일부 구체예에서, 제공된 방법의 세포는 질병에 걸린 조직, 또는 질병에 민감한 조직으로부터의 세포이다. 동시에 다수의 표적을 검출하고 정량할 수 있는 경우, 제공된 방법은 진단, 치료 모니터링 및 환자 분류화에 유의한 장점을 제공한다.
일부 구체예에서, 제공된 기술은 임의로 단백질, 신경 활성, 및/또는 구조 배열을 프로파일링하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 제공된 방법은 동일 샘플 내의 단백질을 프로파일링하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 제공된 방법은 동일 샘플 내의 신경 활성을 프로파일링하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 제공된 방법은 구조 배열을 프로파일링하는 것을 포함한다.
본원에 예시된 바와 같이, 제공된 기술은 매우 다양한 샘플에 대해 수행된다. 예를 들어, HCR-seqFISH는 뇌 절편에서 수행되고, SPIMs는 CLARITY 뇌 절편에서 단일 mRNA를 확실히 검출할 수 있다. 일부 구체예에서, 제공된 기술은 신경변성 질병의 마우스 모델, 또는 인간 뇌에서 표적을 프로파일링하는데 유용하다. 본 발명 이전의 다른 기술은 동일한 데이터 양 및 품질을 전달할 수 없다.
예시
전술한 내용은 본 발명의 특정한 비제한적인 구체예의 설명이었다. 따라서, 본원에 기재된 본 발명의 구체예가 단지 본 발명의 원리의 적용의 예시인 것이 이해되어야 한다. 예시된 구체예의 세부사항에 대한 본원의 참조는 청구항의 범위를 제한하고자 하는 것이 아니다.
순차적 하이브리드화 및 바코딩에 의한 핵산의 제자리 프로파일링
본원의 비제한적인 실시예에 기재된 바와 같이, 세포 내의 핵산, 예를 들어, mRNA를 순차적 라운드의 접촉, 영상화 및 제거 단계를 통한 제공된 방법에 의해 프로파일링하였다(도 2 (a) 및 3). 전사물이 세포 내에 자리잡음에 따라, 상응하는 형광 스폿은 다수의 라운드의 하이브리드화 동안 그 자리에 남아있으며, 형광단 서열을 판독하기 위해 정렬될 수 있다. 이러한 순차적 바코드는 mRNA를 독특하게 확인하도록 설계된다.
각각의 라운드의 하이브리드화 동안, 각각의 전사물은 한 세트의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드, 이 경우에, 단일 유형의 형광단으로 표지된 FISH 프로브에 의해 표적화되었다. 샘플을 영상화시킨 후, 이를 DNase I으로 처리하여, FISH 프로브를 제거하였다. 이후의 라운드에서, mRNA를 동일 세트의 올리고뉴클레오티드 서열을 갖지만, 상이한 염료로 표지된 FISH 프로브와 하이브리드화시켰다. 이용가능한 바코드의 수는 F N 으로 점점 높아지며, 여기서 F는 형광단의 수이고, N은 하이브리드화 라운드의 수이다. 예를 들어, 4개의 염료를 이용한, 8 라운드의 하이브리드화는 거의 전체의 전사체(48=65,536)를 포함할 수 있다.
증거로서, 4개의 염료 및 2 라운드의 하이브리드화로 단일 효모 세포에서 12개의 유전자가 바코딩되었다(42=16, 4개의 바코드가 남음; 각각의 하이브리드화는 3 주기에 대해 수행되었다). 세포를 유리 표면 상에 고정시켰다. DNA 프로브를 하이브리드화시키고, 영상화시킨 후, DNase I 처리에 의해 제거하였다(88.5±11.0% (SE) 효율, 도 4). 나머지 신호를 광표백시켰다(도 5). 6회의 하이브리드화 후에도, mRNA가 본래 강도의 70.9±21.8%(SE)로 관찰되었다(도 6). 처음 2회의 하이브리드화에서 공동-국소화된 스폿의 77.9±5.6%(SE)가 또한 세번째 하이브리드화와 공동-국소화된 것으로 관찰되었다(도 7 및 8). mRNA 풍부를 세포 내에서의 상응하는 바코드의 발생을 계수함으로써 정량하였다(도 9 및 10, n=37 세포). mRNA가 포유동물 세포에서 효과적으로 스트리핑되고 재하이브리드화될 수 있는 것으로 밝혀졌다(도 11 및 12). 여기에서 입증되는 바와 같이, 제공된 방법은 본 발명 이전에 공지된 방법에 비해 많은 장점을 갖는다. 예를 들어, 제공된 방법은 신속히 규모 확장되고, 2개의 염료를 이용해서도 코딩 능력은 원칙적으로 무제한적이다(2 N ). 각각의 접촉 단계 동안, 표적에 대한 모든 이용가능한 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드, 본 실시예에서 FISH 프로브가 이용될 수 있고, 이는 신호의 밝기를 증가시킬 수 있다. 제공된 방법의 판독은 또한 확실하고, 자연 샘플에 대한 완전한 Z-스택을 가능케 한다. 제공된 방법은 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드, 예를 들어, FISH 프로브의 높은 하이브리드화 효율의 장점을 가질 수 있다(mRNA의 > 95%가 검출된다; Lubeck, E. & Cai, L. Nat. Methods 9, 743-48 (2012)). 출원인은 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드, 예를 들어, FISH 프로브가 또한 단일 세포에서 많은 수의 스플라이스-아이소형, SNP, 뿐만 아니라 염색체 유전자좌를 분리하도록 설계될 수 있음을 인지한다(Levesque, M. J. & Raj, A. Nat Meth 10, 246-248 (2013)). 초-해상도 방법(Lubeck, E. & Cai, L. Nat. Methods 9, 743-48 (2012))과 조합하여, 제공된 방법은 많은 수의 표적, 예를 들어, 전사체가 복잡한 샘플, 예를 들어, 뇌에서 단일 세포 해상도로 직접 영상화되는 것을 가능케 한다.
방법 및 절차
샘플 제조: MDN1-GFP 효모 세포를 50mM CaCL2가 보충된 YPD에서 OD 0.3으로 성장시켰다. 세포를 5분 동안 1% 포름알데하이드 5% 아세트산에 고정시키고, 완충액 B에서 3회 헹구고, 30℃에서 1시간 동안 세포벽 불완전 제거(spheroplast)하였다. 세포를 2주 이하 동안 -20℃에서 70% EtOH 중에 저장하였다.
1M NaOH 및 100% EtOH의 교대 용액과 함께 3회 음파처리한 후, 아세톤 중에서의 최종 라운드의 음파처리에 의해 커버슬립을 제조하였다. (3-아미노프로필) 트리에톡시실란(Sigma 440140)의 2% 용액을 아세톤 중에 제조하고, 여기에 세척된 커버슬립을 2분 동안 즉시 침지시켰다. 아민-변형된 커버슬립을 헹구고, 실온에서 초순수(ultrapure water)에 저장하였다.
고정된 효모 세포를 23℃에서 30분 동안 DNase I(Roche 04716728001)의 0.5U/μL 용액으로 전처리하였다. 처리 후, 2개의 아민-변형된 커버슬립 사이에서 효모의 희석 용액을 물리적으로 압축시킴으로써 코팅된 커버슬립에 효모 세포를 부착시켰다. 이후, 커버슬립을 조심스럽게 벗겨 내고, 즉시 2.5분 동안 1% 포름알데하이드 용액에 침지시켰다. 고정 후, 커버슬립을 건조시키고, 커버슬립에 접착성의 코팅된 플로우 셀을 부착시킴으로써 플로우 셀을 작제하였다(GraceBio Labs SA84-0.5-SecureSeal). 다수의 하이브리드화 전체에 걸친 변이를 측정하기 위해 FluoSphere 365nm 형광 비드를 커버슬립에 추가하였다(Life F8805). 플로우 셀을 파라필름으로 덮어 4℃에서 저장하였다.
검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드의 제조: 프로브를 문헌[Lubeck, E. & Cai, L. Nat. Methods 9, 743-48 (2012)]의 방법에 따라 제조하였다. 각각의 표적에 대해, 24개의 프로브를 이용하였다. 각각의 세트의 유전자에 대한 모든 24개의 프로브를 사용되는 4개의 염료 알렉사 532, 594, Cy5 및 Cy7 중 하나에 커플링시켰다.
하이브리드화: 플로우 셀을 10% 덱스트란 설페이트(Sigma D8906), 10% 포름아미드, 및 2X SSC의 하이브리드화 완충액 중에서 밤새 프로브 당 2nM의 농도로 하이브리드화시켰다. 하이브리드화 후, 샘플을 37℃로 미리 가열된 30% 포름아미드, 0.1% Triton-X 100 완충액 중에서 세척한 후, 10분 동안 실온 샘플에 첨가하였다. 샘플을 2X SSC로 수회 세척하여 확산 프로브를 제거하였다.
영상화: 샘플을 항-표백 완충액(Swoboda, M. ACS Nano 6, 6364-69 (2012))에 침지시켰다: 20mM Tris-HCL, 50mM NaCl, 0.8% 글루코스, 포화된 Trolox(Sigma: 53188-07-1), OD405nm에서 0.05의 피라노스 옥시다제(Sigma P4234), 및 1/1000의 희석액의 카탈라제(Sigma:9001-05-2).
프로브 치환: 영상화 후, 세포를 DNase I 완충액(Roche) 중에서 세척하고, 4시간 동안 0.5U/μL DNase I(Roche) 중에 방치시켰다. DNase를 억제하기 위해, 세포를 30% 포름아미드, 0.1% Trition-X 100, 2X SSC로 2회 세척하였다. DNase 처리 후, 세포를 항-표백 완충액 중에서 1회 이상 영상화시켜, DNase I 프로브 스트리핑 속도를 결정하였다. 남아 있는 프로브 신호를 제거하기 위해, 모든 영상화 채널에서 10초의 여기로 샘플을 표백시키고, 표준 여기 시간으로 1회 이상 영상화시켜, 잔여 신호를 기록하였다.
재- 하이브리드화: 샘플을 이전에 개설된 조건에 따라 현미경 상에서 재-하이브리드화시켰다. 증발을 방지하기 위해 현미경 상에서의 하이브리드화 동안 샘플을 파라필름으로 덮었다.
동일 샘플에 대해 적어도 6 라운드의 하이브리드화를 수행하였다. 각각의 라운드의 하이브리드화를 현미경 상에서 밤새 수행하였고, DNase 처리 및 영상화를 낮 동안 수행하였다. 상기 대응에 적용된 반복 하이브리드화 계획에서, mRNA를 바코딩하기 위해 2 라운드의 하이브리드화를 이용하였다. 이후, 바코드 계획을 반복하였고, hyb1 및 hyb3를 동일 프로브를 이용하여 수행한 한편, hyb2 및 hyb4를 또 다른 세트의 프로브로 수행하였다. hyb1과 hyb3 사이의 공동-국소화는 검출된 전사물에 대한 보정을 제공한 한편, hyb1 및 hyb2는 바코딩 데이터를 발생시켰다.
데이터 분석: ImageJ, Python 및 Matlab을 이용하여 데이터 분석을 수행하였다. 샘플은 실험 동안 변이되었으므로, 미가공 이미지를 각각의 영상화 위치의 DAPI 채널로부터 결정된 교차-상관 기반 기록 방법을 이용하여 정렬시켰다. 이후, 변이-교정을 동일 위치에 해당하는 다른 4색 채널로 증식시켰다. 이후, 이미지를 인접한 FISH 스폿 사이의 중첩을 감소시키기 위해 디콘볼브화(deconvolved)시켰다. 개별적 채널 내의 스폿 중첩은 거의 관찰되지 않았으나, 상이한 채널 내의 스폿은 이미지가 오버레이된 경우 이들의 포인트 확산 함수(point spread function)(PSF)에서 중첩될 수 있다. 미가공 데이터를 반복 루시-리차드슨 알고리즘을 기초로 하여 처리하였다(Lucy, L.B. The Astronomical Journal. 79, 745 (1974) 및 Richardson, W.H. J. Opt. Soc . Am. 62, 55-59 (1972)). 현미경의 PSF를 현미경의 DAPI 채널 내에서 측정된 비드 이미지(~200 nm 직경)의 평균을 구함으로서 측정하였다. 루시-리차드슨 알고리즘과 함께 상기 측정된 포인트 확산 함수를 이용하여, 본 발명자는 ~20회의 반복 초과로 상기 과정을 계산한 후에 FISH 이미지 내의 형광 방출기 분포의 최대-가능도 측정을 수행하였다. 상기 디콘볼루션(deconvolution) 방법의 출력은 분리된 FISH 데이터를 제공하며, 바코드 지정 충실도를 증가시킨다.
이미지 내의 FISH 신호에 해당하는 도트를 극대 함수(local maximum function)를 이용하여 확인하였다. 역치 아래의 도트를 추가 분석을 위해 폐기하였다. 동일 프로브 세트와 하이브리드화된 hyb1과 hyb3 이미지 사이의 공동-국소화를 최적화시킴으로써 역치의 값을 결정하였다. 각각의 PSF에 대한 최대 강도 픽셀을 상기 mRNA 분자의 위치에 대한 프록시로 사용하였다.
hyb1 및 hyb2에서 mRNA에 해당하는 도트로부터 자동적으로 바코드를 추출하였다. 상기 알고리즘은 hyb1에서 확인된 각각의 포인트와 hyb2에서 확인된 모든 포인트 사이의 쌍을 이룬 거리를 계산하였다. hyb1에서 각각의 포인트에 대해, hyb2에서 가장 가까운 이웃을 확인하였다. 상기 거리가 0 또는 1 픽셀이고, hyb2에서 포인트의 가장 가까운 이웃이 또한 hyb1에서의 본래의 포인트인 경우, 바코드 쌍이 입증되었다. 대칭성의 가장 가까운 이웃의 필요는 바코드의 거짓 지정을 감소시켰다. cy7에서 거짓 양성을 감소시키기 위해, hyb1 cy7에서 검출된 포인트는 hyb3 cy7에서 다시 나타나는 것을 필요로 하였다.
이러한 비-제한적인 예에서, 출원인은 낮은 비용 및 신속한 활성으로 인해 DNase I을 이용하여 프로브를 제거하였다. 출원인은 가닥-치환(Duose, D. Y. Nucleic Acids Research, 40, 3289-3298 (2012)) 및 고온 또는 포름아미드 세척을 포함하나, 이에 제한되지는 않는, mRNA로부터 프로브를 제거하고, mRNA를 온전하게 남기는 임의의 방법이 제공된 바코딩 접근법에서 사용될 수 있음을 인지한다. 출원인은 DNase I이 표준 smFISH 프로브로부터의 프로브 재설계를 필요로 하지 않고, 가혹한 세척으로 샘플을 불안정화시키지 않는 것을 인지한다.
일부 구체예에서, dsDNA로부터 DAPI 신호의 수초 내의 신속한 소실이 관찰된 반면, smFISH 프로브는 분해되기에 실질적으로 더 긴 기간(수분의 10s)이 걸렸다. 이론으로 제한하고자 하는 것은 아니지만, DNase I 프로브 제거의 효율은 dsDNA 분해 속도에 비해 낮을 수 있다. 제거 과정이 여전히 짧은 시간 내에 관찰되었다.
특정 실험에서, 형광 신호의 11.5%가 DNase I 처리 후에 mRNA에 대해 유지되었다. 잔여 신호는 표백에 의해 거의 0으로 감소되었다. 출원인은 광표백 전에 신호 및/또는 프로브의 거의 완전한 제거가 달성될 수 있어, 더 많은 mRNA가 이후의 라운드의 하이브리드화에 이용가능한 것을 인지한다. 출원인은 바코딩에 대해 광표백이 필요하지 않으나, 일부 구체예에서, 이러한 광표백이 추가 라운드의 바코딩에서 거짓 양성을 발생시킬 수 있는 잔여 신호를 제거함으로써 상기 과정을 간소화시키는 것을 인지한다. mRNA에 결합된 11.5%의 잔여 프로브 중 일부는 추가 라운드의 하이브리드화를 억제할 수 있다. 출원인은 제시된 데이터가 5회의 하이브리드화에 대한 하이브리드화 효율에서의 적은 하락을 나타냄에 따라 잔여 프로브가 진행 라운드의 하이브리드화를 유의하게 억제하지 않은 것을 인지한다.
뇌 조직에서의 핵산의 프로파일링
온전한 뇌 절편에서의 세포의 전사 프로파일링은 세포 정체의 분자적 기반을 이해하는데 필수적이다. 그러나, 본 발명 전에, 자연 신경세포 네트워크의 해부학적 상황에서 단일 세포 내에서 전사물 풍부 및 국소화를 정량적으로 프로파일링하는 것은 기술적으로 어려웠다. 피질 체성 감각 서브네트워크는, 예를 들어, FISH에 의한 제자리 서열분석(seqFISH)을 이용하여 예시적인 제공된 기술의 실행가능성 및 유용성을 입증하기 위한 예, 및 다양한 기능성 도메인 내의 별개의 신경세포 집단 내의 다수의 유전자, 예를 들어, 일차 체성 감각(primary somatic sensory)(SSp), 일차 체성운동(primary somatomotor)(MOp), 이차 체성운동(secondary somatomotor)(MOs), 및 보조 체성 감각(SSs) 피질 영역 내의 다수의 유전자를 프로파일링하기 위한 연결체학으로 이용된다.
본원에 광범위하게 기재된 바와 같이, 일부 구체예에서, 본 발명은, 예를 들어, 도 1 및 2에 예시된 바와 같이 FISH에 의한 제자리 "서열분석"을 통해 단일 세포에서의 유전자 발현을 프로파일링하는 기술을 제공한다. 개별적 mRNA를 검출하기 위해, 단일 분자 형광 제자리 하이브리드화(smFISH)는 mRNA 서열에 상보적인 20mer 올리고뉴클레오티드 프로브와 함께 사용하였다(Fan, Y., Braut, SA, Lin, Q., Singer, RH, Skoultchi, AI. Determination of transgenic loci by expression FISH. Genomics. 2001 Oct 2; 71(1): 66-9; Raj A, Peskin CS, Tranchina D, Vargas DY, Tyagi S. Stochastic mRNA synthesis in mammalian cells. PLoS Biol. 2006 Oct;4(10):e309). mRNA 상에 24개의 상기 형광단 표지된 프로브를 둠으로써, 세포에서의 단일 전사물이 제자리에서 용이하게 검출가능해진다. 검출될 수 있는 거의 모든 mRNA가 smFISH에 의해 관찰되는 것으로 밝혀졌다(Lubeck, E. L. Cai. Single cell systems biology by super-resolution imaging and combinatorial labeling. Nature Methods 9, 743-48 (2012)). 제공된 방법은 고도로 정량적이고, 단일 세포를 물리적으로 분리시키거나 균질액을 이용하지 않고 조직 샘플 내의 공간 정보를 보존시킨다.
일부 구체예에서, 다양한 mRNA 종을 구별하기 위해, mRNA는 순차적 라운드의 하이브리드화를 이용하여 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드, 예를 들어, FISH 프로브로 바코딩된다. 한 라운드의 하이브리드화 동안, 각각의 전사물은 단일 유형의 형광단으로 표지된 한 세트의 복수, 예를 들어, 24개의 FISH 프로브에 의해 표적화된다. 샘플은 영상화되고, FISH 프로브는 효소 분해에 의해 제거된다. 이후, mRNA는 이후 라운드에서 동일한 FISH 프로브이나, 일부 경우에서, 상이한 염료로 표지된 FISH 프로브와 하이브리드화된다. 전사물이 세포 내에 자리 잡음에 따라, 단일 mRNA에 해당하는 형광 스폿이 다수의 라운드의 하이브리드화 동안 그 자리에 남아 있고, 색 서열을 판독하기 위해 정렬될 수 있다. 따라서, 각각의 mRNA 종이 독특한 바코드로 지정된다. 제공된 세포에서 각각의 전사물의 수는 상응하는 바코드의 수를 계수함으로써 결정될 수 있다. 예시적 과정이 도 1, 2, 또는 3에 예시되어 있다.
제공된 기술은 FISH의 높은 하이브리드화 효율의 장점을 가질 수 있다(mRNA의 >95%가 검출된다). 일부 구체예에서, 전사물을 확인하기 위해 염기쌍 분리가 필요하지 않으나, 이는 요망시 달성될 수 있다. 제공된 방법과 함께 이용가능한 바코드의 수는 F N 으로 점점 높아지며, 여기서 F는 별개의 형광단의 수이고, N은 하이브리드화 라운드의 수이다. 5개의 별개의 염료 및 3 라운드의 하이브리드화를 이용하여, 125개의 독특한 핵산이 프로파일링될 수 있다. 예를 들어, 세포 내의 전사물 모두를 분리시키는 초-해상도 현미경검사를 이용하여 6 라운드의 하이브리드화(56=15,625)에 의해 거의 전체의 전사체가 포함될 수 있다. 일부 구체예에서, 실행하기에 간단하고 확실한 통상적인 현미경검사, 예를 들어, 통상적인 에피-형광 현미경검사가 더 적으나, 여전히 많은 수의 표적을, 예를 들어, 100 유전자 멀티플렉스로 검출하기 위해 이용된다.
프로브는 다수의 주기의 하이브리드화에서 스트리핑되고, 동일 mRNA에 재하이브리드화될 수 있다(도 2). 바코딩에 대해 적어도 7개의 색을 제공하는 알렉사 플루오르 488, 532, 594, 647, 700, 750, 및 790과 같은 많은 상업적으로 이용가능한 형광단이 확실하게 작용한다. 6 라운드의 하이브리드화의 종료에서도, 프로브는 본래 강도의 70.9±21.8%(도 6)로 스트리핑된 mRNA에 재하이브리드화될 수 있다. 증거로서, 바코딩된 12개의 유전자는 4개의 염료 및 2 라운드의 하이브리드화로 단일 효모 세포에서 바코딩되었다(42=16, 도3, c).
12개의 유전자 멀티플렉스 이미지가 각각의 형광 채널 내의 광학 공간의 5%만 점유함에 따라 다수, 예를 들어, 100개의 유전자 멀티플렉스를 수행하기 위해 세포 내에 충분한 광학 공간이 존재한다. 도 3 내의 4개 모두의 형광 채널의 복합 이미지가 조밀한 것으로 보이나, 각각의 형광 채널 내의 스폿은 드문드문 분포되어 있다. 각각의 스폿은 이의 중심 위치를 추출하고, 다른 형광 채널에서의 스폿과의 중첩을 추가로 감소시키기 위해 2차원 가우스 프로파일로 적합화될 수 있다. 동일한 스폿이 다양한 라운드의 하이브리드화 사이에서 100nm로 재조정되는 것으로 밝혀졌다(도 8).
일부 구체예에서, 100개의 유전자 멀티플렉스가 3 라운드의 하이브리드화로 신속히 수행될 수 있다. 일부 구체예에서, 각각의 하이브리드화 주기는 약 4시간의 하이브리드화, 약 1시간의 영상화 및 약 1시간의 DNase 처리 및 세척을 포함하며, 각각의 시간 길이는 임의적 및 독립적으로 다양화될 수 있다. 일부 구체예에서, 3 라운드의 하이브리드화는 약 18시간이 걸린다. 일부 구체예에서, 하이브리드화 시간이 아니라 영상화 시간이 속도 제한 단계인데, 이는 하나의 뇌 절편이 동일한 현미경 상에서 다른 절편이 하이브리드화되는 동안 영상화될 수 있기 때문이다. 일부 구체예에서, 단일 현미경은 8개 이하의 절편을 동시에 멀티플렉싱할 수 있으며, 18시간 이내에 3주기의 하이브리드화 종료시 8개 모두의 절편에 대해 100개의 유전자 데이터를 수득할 수 있다.
일부 구체예에서, 106개의 세포를 함유하는 10mm x 5mm x 10μm의 뇌 절편이 현미경 상에서 35분 이내에 영상화되고 분석될 수 있다. 일부 구체예에서, 현미경 상의 단일시야각(single field of view)(FOV)은 20x 에어 대물렌즈(air objective) 및 13mm x 13mm 카메라 칩을 이용하여 0.5mm x 0.5mm x 2μm이다. 일부 구체예에서, 각각의 FOV가 노출되고 100 msec에서 판독된다. 일부 구체예에서, xyz 및 다양한 색 채널로 샘플을 스캐닝하는 것은 스냅 사진 사이에 200msec의 시간 지연을 도입시킨다. 일부 구체예에서, 전체 뇌 절편은 2000초 또는 35분 내에 영상화될 수 있다. 100개의 유전자 배수에 필요한 3 라운드의 하이브리드화를 이용하여, 전체 영상화 시간은 105분이다. 일부 구체예에서, 전체 마우스 뇌는 하나의 현미경 상에서 30일 이내에 영상화될 수 있다. 다수의 현미경이 사용되는 경우, 기간은 추가로 단축될 수 있다. 일부 구체예에서, 제공된 방법은 $25,000 미만의 비용으로 500개의 절편의 전체 마우스 뇌를 영상화시킬 수 있다.
본 발명 이전에 공지된 다른 방법과 비교하여, 제공된 기술은 다양한 장점을 제공한다. 무엇보다도, 제공된 기술은 정량적이고, 공간 정보를 보존시키고, 전체 조직, 기관 및/또는 유기체로 저비용으로 규모 확장된다.
본 발명 이전의 단일 세포 RNA- seq와의 비교. 단일 세포가 분리되고, 96 웰 포맷으로 적용되는 것을 필요로 하는 단일 세포 RNA-seq 또는 qPCR과는 달리, seqFISH와 같은 제공된 방법은 적은 추가 비용으로 자동화된 현미경검사법을 이용하여 자연 해부학적 상황에서 많은 수의 세포를 스캐닝할 수 있다. 미세유체공학 장치를 이용하여 동일 수준의 처리량을 달성하는 것은 경제적으로 불가능하고, 노동 집약적이다. 일부 구체예에서, 제공된 기술의 대부분의 비용은 프로브 합성의 최초 비용이며, 이는 프로브가 합성된 후, 이들이 많은, 예를 들어, 1000 내지 10,000개 또는 심지어 그 초과의 반응에서 이용될 수 있다는 사실에 의해 차감된다.
제공된 방법, 예를 들어, seqFISH는 단일 분자 FISH를 기초로 하며, 이는 절대 정량으로 낮은 카피수의 전사물을 측정할 수 있다. 이러한 방법으로 수득된 데이터는 매우 정량적이고, 고품질의 통계 분석을 가능케 한다. 비교해서, 현재의 단일 세포 qPCR 및 RNA-seq 실험은 역전사(RT) 및 PCR 증폭 오류로부터의 편향과 함께 정량 능력이 제한적이다.
본 발명 이전의 다른 제자리 서열분석 방법과의 비교. smFISH 접근법의 한 주요 장점은 표적화되는 거의 모든 mRNA가 관찰될 수 있다는 점이다. mRNA에 대한 각각의 FISH 프로브 결합의 효율은 50-60%인 것으로 결정되었다(Lubeck, E. & Cai, L. Nat. Methods 9, 743-48 (2012); Levesque, M. J. & Raj, A. Nat Meth 10, 246-248 (2013)). mRNA 당 다수, 예를 들어, 24-48개의 프로브를 표적화하는 것은 적어도 10개의 프로브가 거의 모든 mRNA에 대해 하이브리드화되어, 비특이적 백그라운드에 비해 우수한 신호를 제공하는 것을 보장한다. FISH 프로브로 mRNA를 직접 프로빙시키는 것은 매우 특이적이며, 모든 전사물이 검출되는 것을 보장한다.
대조적으로, 많은 다른 제자리 서열분석 방법은 mRNA를 직접 표적화하는 대신 서열분석 반응에 의해 DNA 주형을 검출하기 전에 mRNA를 DNA 주형으로 먼저 전환시키는 효소 반응을 이용한다. 그러나, mRNA의 DNA로의 전환 과정은 매우 비효율적이고, 단지 적은 분획의 RNA가 전환되고 검출된다. 역전사(RT)에 대해 1% 및 패드락 라이게이션(padlock ligation)(PLA)에 대해 10%로 추정되는 낮은 효율의 한 예시적인 주요 다운사이드는 유전자 발현 측정에서 유의한 노이즈 및 편향을 도입할 수 있다는 점이다.
(10-20 μm3)의 통상적인 세포 크기가 제공되는 경우, 세포 내에 약 25,000개의 회절 한계 스폿이 존재한다. 일부 구체예에서, 이는 단일 세포에서의 전사물 검출을 위한 이용가능한 물적 재산이다. seqFISH에서, 선택된 세트의 유전자, 예를 들어, 전사 인자(TFs) 및 세포 부착 분자(CAMs)가 영상화될 수 있고, 높은 정확도로 정량될 수 있다. 유전자 당 100개의 전사물의 평균 카피수를 갖는 표적 유전자가 선택되는 경우, 매우 정량적인 100-200개의 유전자 프로파일링 실험이 수행될 수 있다. 대조적으로, 많은 다른 제자리 서열분석 방법을 이용하는 경우, 상기 물적 재산 대부분이 리보솜 RNA 뿐만 아니라 하우스-키핑 유전자를 서열분석하는데 이용되며; 관심 유전자, 예를 들어, 신경 세포 밀도에 특이적인 관심 유전자가 심하게 낮은 수준으로 표시되거나, 불량하게 검출된다.
일부 구체예에서, 제공된 방법은 20x 에어 대물렌즈로 더 큰 FOV 영상화를 가능케 하나, 동시에 smFISH의 높은 검출 효율을 보존시키면서 FISH 신호를 증폭시키기 위해 하이브리드화 연쇄 반응(HCR)(Choi, et al., Programmable in situ amplification for multiplexed imaging of mRNA expression Nature Biotechnol, 28, 1208-1212, (2010))을 이용한다.
본 발명 이전의 멀티플렉싱 RNA의 초-해상도 바코딩 방법과의 비교. 일부 구체예에서, 제공된 방법은 본 발명 이전의 smFISH에 의한 mRNA의 스펙트럼 바코딩에 비해 많은 장점을 가지며(Femino et al, Visualization of single RNA transcripts in situ. Science. 1998 Apr 24;280(5363):585-90; Kosman et al., Multiplex detection of RNA expression in Drosophila embryos. Science. 2004 Aug 6;305(5685):846; Levsky et al, Single-cell gene expression profiling. Science. 2002 Aug 2; 297(5582):836-40; Lubeck et al, Single cell systems biology by super-resolution imaging and combinatorial labeling. Nature Methods 9, 743-48 (2012); 및 Levesque et al., Nat Meth 10, 246-248 (2013)), 여기서 특정 mRNA에 대한 프로브는 다양한 염료로 표지되는 서브셋으로 분할된다. 무엇보다도, 제공된 기술은 규모 확대를 위해 많은 별개의 형광단을 필요로 하지 않으며, 심지어 2개의 염료를 이용하여, 코딩 능력이 무한하고, 반복된 바코드가 이용될 수 있다(예를 들어, 적색-적색-적색). 비교시, 본 발명 이전의 RNA의 스펙트럼 바코딩은 생성될 수 있는 바코드의 수(~30)에 있어서 제한적이다. 제공된 방법에서, 각각의 라운드의 하이브리드화 동안, 전사물에 대한 FISH 프로브와 같은 모든 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드가 프로브를 서브셋으로 분할하는 것 대신 한번에 이용될 수 있다. 무엇보다도, 제공된 기술은 각각의 mRNA에 대한 신호가 더 강력함에 따라 바코드 판독의 개선된 확실성을 제공한다. 본 발명 이전의 방법에 비해, 본 발명 이전의 스펙트럼 바코딩 계획에서의 적어도 3개의 색 대신 각각의 라운드의 하이브리드화 동안 각각의 mRNA가 더 적은 색, 일부 구체예에서 단일 색을 가질 수 있음에 따라 이미지 내의 대상의 밀도가 낮다. 요망되는 경우, 더 낮은 이미지 밀도는 데이터 분석을 크게 간소화시킬 수 있고, 초-해상도 현미경검사가 필요하기 전에 더 많은 유전자가 멀티플렉스싱되는 것을 가능케 할 수 있다. 출원인은 특정 스펙트럼 바코딩 방법, 프로브, 및/또는 초-해상도 현미경검사가 이용될 수 있고, 제공된 구체예에서 유용한 구체예일 수 있음을 인지한다. seqFISH와 같은 제공된 기술로 전사체를 프로파일링하기 위해, 일부 구체예에서, 세포 내의 수백만 개의 전사물을 분리시키기 위해 초-해상도 현미경검사가 이용된다.
전사 프로파일링 외에, 제공된 기술은 동일한 mRNA 분자에 대한 다수의 대안적 스플라이싱 선택 및 RNA 편집을 해소할 수 있다. 대안적으로 스플라이싱된 아이소형은 서열분석 방법에 의해 프로빙하기 어려운데, 이는 서열분석 판독이 일반적으로 동일 전사물 내에서의 엑손 선택과 관련시키기에 너무 짧기 때문이다. seqFISH와 같은 제공된 방법은 뇌 절편 내의 개별적 세포 내에서 스플라이스 아이소형의 전체 레퍼토리의 직접적인 시각화를 가능케 한다. 유사하게, 단일 뉴클레오티드 다형태(SNP)를 검출하는 smFISH 방법은 신경세포 또는 다른 세포 유형 내의 편집된 전사물을 영상화시키기 위해 seqFISH로 적합화될 수 있다.
일부 구체예에서, 제공된 기술은 순차적 FISH(seqFISH)에 의해 제자리에서 유전자 프로파일링을 위한 효율적이고 비용 효과적인 경로를 제공하며, 세포 밀도에 상응하는 조합 분자 마커를 확인하기 위해 피질 내의 체성 운동 신경세포를 프로파일링하기 위해 seqFISH 및 연결체학을 통합시킨다.
뇌에서의 정량적 제자리 유전자 발현 맵핑
CLARITY 명료화 뇌 절편을 직접 영상화시키기 위해 광시트 현미경검사가 적용된다. 일부 구체예에서, 마우스 뇌가 기계 당 1개월 내에 맵핑된다. 일부 구체예에서, 마우스 뇌는 4-5개의 기계로 1주 내에 맵핑된다.
증폭: FISH 신호의 증폭은 20x 저 NA 대물렌즈를 이용하여 뇌 절편의 큰 FOV 영상화를 가능케 한다. 일부 구체예에서, 제공된 방법은 신호-대-백그라운드를 증가시키고/시키거나, FISH 방법의 특이성 및 멀티플렉싱 능력을 보존시키기 위해 하이브리드화 연쇄 반응(HCR)(Choi et al., 2010)으로 표지된 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드를 이용한다. 이러한 접근법을 이용하여, mRNA 표적에 상보적인 핵산 프로브는 준안정 형광단 표지된 핵산 헤어핀이 구속된 형광 증폭 중합체로 자가 어셈블리되는 연쇄 반응을 촉발시킨다. 스펙트럼적으로 별개의 형광단을 갖는 오르쏘고날 HCR 증폭기를 이용하여, 모든 채널에 대해 제자리 증폭이 동시에 수행될 수 있다.
일부 구체예에서, HCR로 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드(HCR 프로브)는 표적 mRNA에 상보적인 20-nt 도메인 + 40-nt HCR 개시자를 함유한다. 프로브의 하이브리드화는 10% 포름아미드의 엄격성 하에서 수행된 후, 허용 조건에서 증폭 단계가 수행된다. 헤어핀의 농도와 같은 조건은 최적 결과를 달성하기 위해 최적화될 수 있으며, 출원인은 특정 경우에서 더 높은 농도의 헤어핀이 반응 속도를 증가시키는 것을 인지한다. 모든 HCR 프로브는 회절-한계 스폿으로 증폭될 수 있다. 일부 구체예에서, FISH 신호는 회절-한계 스폿 크기 내에서 약 10-20배까지 증폭된다. 예를 들어, 각각의 프로브 내에 다수의 HCR 개시자를 통합시키고/시키거나, 각각의 HCR 증폭 헤어핀을 다수의 형광단으로 표지시킴으로써 회절-한계 스폿 크기는 유지시키면서 스폿 밝기가 추가로 향상될 수 있다.
뇌 절편에서 직접 mRNA로부터 HCR 증폭된 신호가 관찰되었다. 동일한 mRNA에 표적화시키는 경우, HCR 프로브는 90% 비율로 smFISH 도트와 공동 국소화되었으나, 10-20배 더 밝다(도 14). 이는 HCR 프로브가 뇌의 자가형광을 초과하여 용이하게 검출되는 것을 가능케 한다(도 13). 높은 공동국소화 비율은 smFISH 및 대부분의 전사물이 검출됨에 따라 HCR이 특이적인 것을 입증한다.
HCR 프로브는 용이하게 스트리핑되고 재하이브리드화되며, 본원에 기재된 seqFISH 프로토콜을 이용하여 완전히 통합될 수 있다. 도 15는 2개의 상이한 라운드의 하이브리드화에서 뇌 절편에서 HCR에 의해 표적화된 동일한 유전자를 나타내었다. 2개의 하이브리드화 사이의 우수한 공동국소화는 HCR-seqFISH가 뇌에서 mRNA를 바코딩시키기 위해 확실히 작용하는 것을 나타낸다.
HCR 프로토콜은 smFISH 하이브리드화와 동일한 시간 척도로 작용하며, 검정의 주기 수를 증가시키지 않는다. HCR에서의 최초 하이브리드화 단계는 시간에 있어서 smFISH와 유사한 한편, 두번째 증폭 단계는 30분 내지 1시간 내에 발생한다. 전사물에 RNA 프로브를 하이브리드화시키고, 임의로 신호를 증폭시키기 위해 헤어핀의 대안적 유형을 이용하는 대안적 방법이 주기 수를 추가로 감소시킬 수 있다. 일부 구체예에서, HCR은 아민 표지된 올리고 프로브를 구입할 필요성을 제거한다. 무엇보다도, HCR은 시약의 비용을 약 절반, 예를 들어, 뇌 당 $10,000로 잠재적으로 감소시킬 수 있다.
자동화. 예를 들어, 100개의 유전자를 맵핑하고/하거나, 인간 노동 및/또는 오차를 감소시키기 위해 효과적으로 규모 확대시키기 위해 하드웨어 및 소프트웨어 둘 모두의 자동화가 적용될 수 있다. 일부 구체예에서, 조직 및/또는 기관 영상화, 예를 들어, 뇌 절편의 영상화를 위한 경로를 발생시키고/시키거나 작업흐름을 최적화시키기 위해 기술의 주요 부분이 통합된다. 무엇보다도, 자동화된 유체공학, 이미지 획득 및/또는 통합된 분석이 신속한 하이브리드화 주기 시간 및 영상화 시간과 독립적으로 및 임의로 조합될 수 있다.
하드웨어. 일부 구체예에서, 자동화된 시스템은 사용자로부터의 최소의 개재를 필요로 하며, 사용자가 실험을 설정한 후 이미지 획득을 자동적으로 수행할 수 있다. 일부 구체예에서, 각각의 서열분석기는 순차적 하이브리드화를 수행하기 위해 영상화 및 자동화 유체공학 시스템을 수행하기 위한 자동화된 에피-형광 현미경으로 구성되거나 이를 포함한다. 일부 구체예에서, 하부 커버슬립 상에 고정된 세포 및 조직을 갖는 1cm x 1cm 웰에 시약을 밀어 넣기 위해 압축 공기가 이용된다. 이론으로 제한하고자 하는 것은 아니지만, 출원인은 일부 구체예에서, 하이브리드화 완충액의 높은 점도로 인해, 압축 공기 유도 시스템이 사장 용적을 제거하고, 또한 규정된 부피의 시약을 전달하기 위해 정밀하게 조절될 수 있음을 인지한다. 일부 구체예에서, 챔버를 퍼징시키기 위해 독립된 진공 라인이 이용된다. 일부 구체예에서, 제공된 프로토콜의 작업 흐름은 본 발명의 출원시에 현존하는 DNA 서열분석기와 유사하며, 이는 당 분야에 널리 공지되어 있다.
일부 구체예에서, 하이브리드화의 각각의 주기 동안, 기계는 샘플과 프로브를 자동적으로 하이브리드화시키고/시키거나, 완충액으로 세척하여 과량의 프로브를 제거하고/하거나, 영상화를 위해 뇌 절편을 스캔한다. 일부 구체예에서, DNase가 제거 단계에서 이용되는 경우, 영상화 후, DNase는 프로브에 접근하여 이를 제거한다. 광범위한 세척 후, 또 다른 라운드의 하이브리드화가 이후에 진행될 수 있다. 하이브리드화 시간 동안, 이미 하이브리드화되고 세척된 또 다른 뇌 절편을 영상화시키기 위해 현미경은 스테이지 상의 상이한 위치로 이동한다. 이러한 방식으로, 카메라는 대부분의 시간 동안 이미지를 획득하고, 그 동안 스테이지 상의 다른 샘플이 하이브리드화된다.
소프트웨어. 일부 구체예에서, 예를 들어, 제어 과정 및 데이터의 분석을 자동화시키기 위해 소프트웨어가 이용된다. 일부 구체예에서, 현미경 뿐만 아니라 유체공학 구성요소를 제어하기 위해 미국 국립보건원에 의해 후원되는 무료 소프트웨어인 Micromanager에서 코드가 기재된다. 일부 구체예에서, 밸브, 스테이지, 광원, 카메라 및/또는 현미경은 Micromanager를 통해 제어된다.
일부 구체예에서, 조밀한 이미지에 대해 압축 센싱(compressed sensing)이 이용되며(Zhu et al, Faster STORM using compressed sensing. Nat. Methods. 2012, 9(7):721-3), 조밀한 클러스터에서 스폿을 분리시키기 위해 디콘볼루션 방법이 이용된다. 일부 구체예에서, 이미지 분석에서의 개선은 제공된 방법, 예를 들어, seqFISH의 멀티플렉스 능력을 증가(예를 들어, 100개의 유전자 멀티플렉스 초과에서 약 4-5배까지 증가)시킨다. 일부 구체예에서, 효율은 Illumina GAII 서열분석기로부터 HiSeq 기계로의 개선과 유사한 방식으로 개선되며, 여기서 서열분석 칩 상의 조밀하게 패킹된 클러스터를 분석하기 위해 이미지 처리 방법을 이용하는 것은 처리량을 증가시켰다. 일부 구체예에서, 데이터 획득 및 분석은 사용자-친화적 패키지로 통합된다.
일부 구체예에서, 제공된 기술은 데이터 분석을 위한 소프트웨어 패키지를 제공한다. 일부 구체예에서, 제공된 기술은 Python 및 Matlab의 데이터 분석을 위한 소프트웨어 패키지를 제공한다. 제공된 기술의 이미지는 다양한 크기일 수 있고, 요망되는 경우 임의로 최적화시킬 수 있다. 일부 구체예에서, 각각의 FOV는 14 비트 심도로 6 메가픽셀이며, 이는 이미지 당 1.5MB의 데이터에 해당한다. 일부 구체예에서, 약 100GB의 데이터가 작동 당 생성된다. 일부 구체예에서, 제공된 기술은 데이터 처리 및/또는 데이터 정체 완화를 위한 방법을 제공한다. 일부 구체예에서, 데이터 정체는 각각의 이미지로부터의 스폿을 분할하고, 이들을 2차원 가우스 분포로 적합화시키고, 적합도의 중심 위치를 기록함으로써 완화된다. 일부 구체예에서, 제공된 기술은 미가공 이미지를 폐기하고, 처리된 데이터를 감축시킴으로써 컴퓨터 공간의 낭비를 막는다.
CLARITY 명료화된 뇌 절편을 이용한 광시트 현미경검사. 일부 구체예에서, 제공된 기술은 조직, 기관 및/또는 유기체를 영상화시키기 위한 방법을 제공한다. 일부 구체예에서, 제공된 기술은 두꺼운 조직 또는 기관을 측정하기 위한 방법을 제공한다. 일부 구체예에서, 두꺼운 조직 또는 기관은 약 100 μm 또는 100 μm 초과의 두께를 갖는다. 일부 구체예에서, 제공된 기술은 단일 세포 내를 넘어서는 긴 범위 투상(long range projection) 및 형태를 보존시킨다. 일부 구체예에서, 광시트 현미경검사는 두꺼운 조직 또는 기관을 측정하기 위해 이용된다. 일부 구체예에서, 조직, 기관, 및/또는 유기체는 CLARITY에 의해 명료화된다(Chung et al., Structural and molecular interrogation of intact biological systems, Nature, 2013, doi: 10.1038/nature12107).
일부 구체예에서, 긴 범위 투상 및 형태를 더 잘 보존시키는 더 두꺼운 뇌 절편(>100μm)을 영상화시키기 위해, 가변 평면 레이저 형광 현미경(SPIM)을 별칭으로 하는 광시트 현미경검사가 CLARITY 명료화된 뇌 조직에 대해 적용된다. 일부 구체예에서, CLARITY 방법은 뇌가 신경세포 성분 및 이들의 분자 정체의 시각화 및 확인을 위해 투명화되도록 한다. 일부 구체예에서, CLARITY는 뇌 조직의 형태를 보존시키기 위해 다공성 하이드로겔에 의해 대체되는 광 분산 지질을 제거함으로써 뇌 조직을 광학적으로 투명하고 거대분자-투과성으로 전환시켜, 연구는 뇌를 얇게 절편화시키지 않고 수행될 수 있으며, 이는 관심 신경세포의 시각화 뿐만 아니라 긴 범위 시냅스 연결을 가능케 한다. 이론으로 제한하고자 하는 것은 아니지만, 출원인은 본 발명 전에 배양물 또는 얇은 절편에서 이전에 수행된 FISH에 비해, 제공된 기술이 더 두꺼운 조직을 이용할 수 있고, 개별적 신경세포 또는 3D 신경세포 네트워크 전사체의 더욱 정확한 재구성을 가능케 할 수 있음을 인지한다. 도 16은 FISH 염색과 상용성인 광학적으로 명료한 두꺼운 절편을 제조하기 위한 성공적인 확인된 Clarity-기반 프로토콜을 예시한다: (1) 2mL 에펜도르프 튜브(Eppendorf tube) 내의 100 마이크론의 관상 뇌 절편을 밤새 4도에서 1.5mL의 4% 아크릴아미드, 2% 포름알데하이드, 0.25% 열-개시제(thermo-initiator), 1x PBS에서 인큐베이션하고; (2) 질소를 10초 동안 하이드로겔 용액을 통해 버블링시키고; (3) 탈기된 샘플을 42도에서 2시간 동안 인큐베이션하여 중합시키고; (4) 샘플을 PBS 중에서 3회 세척하고, 4시간 동안 37도에서 10% SDS, 1XPBS 중에서 인큐베이션하여 명료화시키고; (5) 샘플을 PBS 중에서 3회 세척하고, seqFISH에 대해 사용 준비시켰다.
일부 구체예에서, 제공된 기술은 초점을 벗어난 백그라운드를 최소화시키거나 예방하기 위한 방법을 제공한다. 일부 구체예에서, 제공된 기술은 초점을 벗어난 백그라운드를 최소화시키거나 예방하는 영상화 기술을 이용한다. 일부 구체예에서, SPIM은 더 높은 초점을 벗어난 백그라운드를 갖는 더 두꺼운 절편에 대해 사용된다. 일부 구체예에서, 동일초첨 현미경은 이러한 백그라운드를 무시할 수 있으나, 이는 천천히 스캔하며, 하부층을 영상화하는 동안 상부층을 광표백시킨다. 일부 구체예에서, SPIM에서, 영상화되는 층만이 여기 광에 의해 조명된다. 일부 구체예에서, 제공된 기술에 유용한 SPIM 설정에서, 서로 직각으로 위치된 2개의 대물렌즈가 약 55°로 샘플 위에 걸려진다. 일부 구체예에서, 광시트는 약 10 μm 높이 및 약 200 μm의 유효폭 또는 FOV으로 광선의 한 축을 집중시키기 위해 원주 렌즈를 이용하여 생성된다.
일부 구체예에서, 본 발명은 제공된 방법에 대한 현미경 설정을 제공한다. 일부 구체예에서, 본 발명은 광시트 현미경을 제공하며, 샘플은 측면으로부터 조명된다. 일부 구체예에서, 광시트는 샘플 스테이지와 평행하다. 일부 구체예에서, 광시트는 검출 대상과 직각으로 존재한다. 광시트 현미경의 예시적 설정은 도 17에 예시된다. 2개의 반사경 및 원주 렌즈를 적합화시킴으로써, 광시트의 평면이 생성되고, 측면으로부터 샘플을 조명하며, 검출 대물렌즈(중간)에 직각으로 존재한다. 하부 반사경이 원주 렌즈에 연결되고, 대물렌즈의 동일 기부 상에 직접 마운팅된다. 이러한 형태와 함께, 대물렌즈는 조명 시트와 동기적으로 이동되고, 이는 샘플을 z-축을 따라 스캐닝하는 것을 가능케 한다(우측, 상부). 우측(하부) 도면은 또한 샘플이 하이브리드화 챔버 내부에 마운팅되고, 하부에서 에어 대물렌즈에 의해 영상화되는 것을 나타낸다.
도 18에 예시된 바와 같이, SPIM 이미지는 CLARITY 명료화되고, β-액틴에 대한 HCR 프로브로 하이브리드화된 100μm 뇌 절편으로 획득되었다. 0.5μm 간격을 갖는 200개의 광학 절편을 수득하여 재구성을 발생시켰다. 명료한 HCR 신호가 20x 침수형 대물렌즈로 관찰되었다. β-액틴 mRNA가 고도로 발현되며, 이것이 세포체 내의 많은 수의 도트를 설명한다. 그러나, 축삭에서 명료한 회절 한계 스폿이 또한 관찰되었다.
일부 구체예에서, CLARITY 명료화된 뇌 및 SPIM 현미경검사에 대해 HCR-seqFISH 프로토콜이 적합화될 수 있다. 100μm 절편이 4-5시간 내에 효과적으로 하이브리드화되었으며, 이는 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드 프로브가 100 μm 두께이나, 명료화된 절편에서 용이하게 확산할 수 있음을 나타낸다. 또한, DNase 효소는 용이하게 확산되었을 뿐만 아니라 절편으로부터 HCR 신호를 스트리핑하였다(도 15). 일부 구체예에서, 제공된 기술은 당업자가 1mm 두께의 관상 절편으로 통상적으로 확산시키는 항체보다 작고, 전체 조직 또는 기관에 대한 표적의 프로파일링, 예를 들어, CLARITY 명료화된 전체 뇌에 대한 seqFISH의 수행을 제공하는 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드, 예를 들어, FISH 및 HCR 프로브를 제공한다.
일부 구체예에서, 제공된 기술은 현미경검사의 기하학을 제공한다. 일부 구체예에서, 제공된 기술은 두꺼운 뇌 절편(>100μm) 및 잠재적으로 전체의 CLARITY 명료화된 뇌가 긴 작동 거리 대물렌즈를 갖는 에피형광 현미경 상에 마운팅될 수 있도록 하는 SPIM의 대안적 기하학을 제공한다. 일부 구체예에서, 영상화 축에 직각으로 광시트가 생성되고, 200-300μm에 걸쳐 10 μm 폭으로 현미경 상의 한 각도로 마운팅된 샘플을 절편화한다. 일부 구체예에서, 제공된 기하학은 발생된 흐름 챔버 및 자동화 설계의 직접적인 실시를 가능케 한다. 일부 구체예에서, 뇌 절편 내의 기준 마커가 연속적인 절편을 기록하기 위해 이용된다. 일부 구체예에서, 나노스코픽 로드(nanoscopic rod)가 절편화 전에 뇌로 주입되고, 이는 다양한 절편 사이에 우수한 기록을 가능케 한다.
속도. 일부 구체예에서, 영상화 속도는 최종 처리량을 제한한다. 일부 구체예에서, 제공된 HCR 증폭은 영상화를 위한 더 많은 충분한 수의 광자를 제공하며, 샘플을 영상화시키기 위해 덜 비싼 카메라가 이용될 수 있다. 일부 구체예에서, 수집 대물렌즈로부터의 빛은 영상화 편평 다이크로익(dichroic) 및 필터를 이용하여 다수, 예를 들어, 6개의 별개의 경로(예를 들어, 5개의 형광 및 1개의 DAPI)로 분할될 수 있다. 이는 제자리 "서열분석기"의 처리량을 극적으로 증가시켜, 전체 뇌가 단일 현미경 상에서 1주 내에 완료될 수 있다.
표적 유전자 선택. 일부 구체예에서, 본 발명은 한 세트의 표적, 예를 들어, 한 세트의 전사물 및/또는 DNA 유전자좌(예를 들어, 예시된 바와 같이 한 세트의 100개의 표적)를 선택하고 영상화시키기 위한 기술을 제공한다. 일부 구체예에서, 표적 유전자는 앨런 뇌 아틀라스(Allen brain atlas)(ABA)로부터의 제자리 데이터베이스로부터 선택된다. 관심 유전자를 선택하기 위해 다수의 기준, 예를 들어, 피질 영역 내의 세포 정체를 나타낼 수 있는 것이 이용될 수 있다. 중첩 기준으로부터의 최적 세트의 유전자의 계산 선택이 널리 공지되어 있다(2. Alon, N; Moshkovitz, Dana; Safra, Shmuel (2006), "Algorithmic construction of sets for k-restrictions", ACM Trans. Algorithms (ACM) 2 (2): 153-177, ISSN 1549-6325; 8. Cormen, TH.; Leiserson, Charles E.; Rivest, Ronald L.; Stein, Clifford (2001), Introduction to Algorithms, Cambridge, Mass.: MIT Press and McGraw-Hill, pp. 1033-1038, ISBN 0-262-03293-7; 12. Feige, U (1998), "A threshold of ln n for approximating set cover", Journal of the ACM (ACM) 45 (4): 634-652,, ISSN 0004-5411). 일부 구체예에서, 1. 하위 세포 유형을 규정하는 것으로 공지되어 있고; 2. ABA 내에서 "솔트 앤드 페퍼(salt and pepper)" 발현 패턴을 나타내고; 3. 전사 인자, 이온 채널, GPCR, 및 뉴로트로핀과 같은 유전자의 패밀리에 속하고; 4. 피질 샘플로부터의 RNA-seq 실험으로부터 선별되는 유전자를 선택하기 위해 세트-커버-휴리스틱스(set-cover-heuristics)(Pe'er, 2002)가 이용된다. 예를 들어, SLC1A3는 아교 세포를 표시하는 한편, SLC6A1은 억제성 신경세포를 표시하고, SLC17A7은 흥분성 신경세포를 표시한다. 일부 구체예에서, 이종성 발현 패턴을 갖는 유전자, 예를 들어, PVALB, SST 및 CALB2가 억제성 신경세포의 서브셋을 표시한다. 100개의 유전자의 예시적 세트가 하기에 제시된다:
유전자명 발현 프로파일
SLC6A1 모든 억제성 (I)
SLC17A7 모든 흥분성 (E)
SLC1A3 아교
PVALB 서브셋 I
SST 서브셋 I
CALB2 서브셋 I
LER5 동종피질
TNNC1 동종피질
MYL4 동종피질
SATB2 동종피질
CCL27a 동종피질
BOC 일차 운동 L1
DACT2 일차 운동 L1
LHX1 일차 운동 L1
PVRL3 일차 운동 L1
SLC44a3 일차 운동 L2/L3
KLK5 일차 운동 L2/L3
TNNC1 일차 운동 L2/L3
WNT6 일차 운동 L2/L3
ZMAT4 일차 운동 L5
STARD8 일차 운동 L5
TCF21 일차 운동 L5
MYL4 일차 운동 L5
KRT80 일차 운동 L6a
OLFR19 일차 운동 L6a
TBCld30 일차 운동 L6a
OLF16 일차 운동 L6b
EAR6 일차 운동 L6b
CHIT1 일차 운동 L6b
SLN 이차 운동 L1
ADAMTS8 이차 운동 L1
EPYC 이차 운동 L1
KCNV1 이차 운동 L1
유전자명 발현 프로파일
pcdh7 이차 운동 L2/L3
GLT8d2 이차 운동 L2/L3
HKDC1 이차 운동 L2/L3
SRPX 이차 운동 L3
ZFP458 이차 운동 L3
SLC30a8 이차 운동 L3
GK5 이차 운동 L5
TEX28 이차 운동 L5
MS4a10 이차 운동 L5
KRT16 이차 운동 L6a
KRT42 이차 운동 L6a
DOC2a 이차 운동 L6a
KRT33b 이차 운동 L6b
YBX 이차 운동 L6b
PNPLA5 이차 운동 L6b
TMEM215 일차 체성감각 L1
SDC1 일차 체성감각 L1
PREX1 일차 체성감각 L1
DIEXF 일차 체성감각 L1
DHRS7c 일차 체성감각 L2/L3
DDIT41 일차 체성감각 L2/L3
TDG 일차 체성감각 L2/L3
EPSTI1 일차 체성감각 L2/L3
RORb 일차 체성감각 L4
GSC2 일차 체성감각 L4
KRT10 일차 체성감각 L4
GCA 일차 체성감각 L4
DCBLD2 일차 체성감각 L5
ABCD2 일차 체성감각 L5
GTDC1 일차 체성감각 L5
IL17RA 일차 체성감각 L6a
TBR1 일차 체성감각 L6a
PPID 일차 체성감각 L6a
IGHM 일차 체성감각 L6b
MMGT1 일차 체성감각 L6b
CPLX3 일차 체성감각 L6b
ART2b 이차 체성감각 L1
GNB4 이차 체성감각 L1
B3GAT2 이차 체성감각 L1
유전자명 발현 프로파일
PDC 이차 체성감각 L2/L3
ADIG 이차 체성감각 L2/L3
FPR1 이차 체성감각 L2/L3
INHBC 이차 체성감각 L4
RUFY4 이차 체성감각 L4
HGFAC 이차 체성감각 L4
EFCAB4b 이차 체성감각 L5
SSTR2 이차 체성감각 L5
ZFP395 이차 체성감각 L5
CCDC36 이차 체성감각 L6a
ST14 이차 체성감각 L6a
MYL12b 이차 체성감각 L6b
RSP02 이차 체성감각 L6b
NDNF L1 (I)
RASGRF2 L2/3 (I)
CUX2 L2/3/4
RORB L4
SCNN1A L4
ETV1 L5
FEZF2 L5
BCL6 L5
TRIB2 L5a
FOXP2 L6
TLE4 L6/L6b
CTGF L6b
CYLD L2/3
CMTM3 L2/3
ANKRD6 L2/3
seqFISH와 단백질 검출, 소기관 마커 및 활성 측정의 통합. 일부 구체예에서, 제공된 기술, 예를 들어, seqFISH는 단일 세포 분리를 이용하여 제자리에서 동일 샘플 내의 RNA 뿐만 아니라 단백질, 신경세포 활성, 및 구조적 배열의 멀티플렉스 분석을 가능케 한다. 특정 표적에 대한 항체는 한 추가 라운드의 하이브리드화에서 샘플에 하이브리드화될 수 있다. 일부 구체예에서, 제공된 방법은 임의로 한 단계의 면역염색을 포함한다. 일부 구체예에서, 순차적 라운드의 하이브리드화에서 많은 단백질 표적을 검출하기 위해 다수의 항체가 이용된다(Schubert W et al. Analyzing proteome topology and function by automated multidimensional fluorescence microscopy. Nat Biotechnol (2006) 24(10): 1270-1278). 출원인은 세포에서 mRNA에 비한 약 100-1000 또는 그 초과 배수의 더 높은 단백질 풍부함이 존재하는 것을 인지한다. 표적화된 단백질은 세포 소기관, 예를 들어, 미토콘드리아, ER, 운송 소포, 세포골격, 뿐만 아니라 시냅스 연접을 표시할 수 있다. 예를 들어, 축삭 및 수상돌기의 분할을 돕기 위해 세포 경계를 표시하기 위해 MAP2 항체가 이용될 수 있다.
뇌 절편의 라이브 관찰이 제공된 방법(예를 들어, seqFISH)에 의한 전사 프로파일링 전에 에피-형광 및 광시트 현미경 상에서 영상화될 수 있다. 칼슘(Nakai J, Ohkura M, Imoto K (February 2001). "A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein". Nat. Biotechnol. 19 (2): 137-41; Akerboom et al, "Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging." J Neurosci . 2012 Oct 3;32(40): 13819-40; Stosiek et al, "In vivo two-photon calcium imaging of neuronal networks." Proceedings of the National Academy of Sciences 100 (12): 7319) 및 전압 센서(Cohen, et al., "Optical Measurement of Membrane Potential" in Reviews of Physiology." Biochemistry and Pharmacalogy, vol. 83, pp. 35-88, 1978 (June); Mutoh et al, Genetically Engineered Fluorescent Voltage Reporters ACS Chem Neurosci. 2012 August 15; 3(8): 585-592; Peterka et al, Imaging voltage in neurons. Neuron. 2011 Janl3;69(1):9-21)가 뇌 절편에서 영상화될 수 있다. SPIM은 뇌 절편에서 이들 센서의 효과적이고 신속한 영상화를 가능케 한다. 뇌 절편이 현미경 상에 고정되고, 제공된 프로토콜, 예를 들어, seqFISH 프로토콜이 자동화된 유체공학으로 수행될 수 있다. 일부 구체예에서, 라이브 측정에 더하여, 활성 의존성 즉시 초기 유전자(IEG)의 mRNA가 신경세포에 통합된 신경세포 활성의 척도로서 검출된다. 예를 들어, CamKII 및 cFos가 이종성 발현 수준으로 신경세포 내에서 용이하게 검출되었고, 이들은 한 세트의 유전자, 예를 들어, 예시적인 100개의 유전자 멀티플렉에 통합되거나, 풍부함에 따라 추가 주기에서 별개로 FISH화될 수 있다.
다양한 체성 감각운동 신경세포 네트워크 내의 별개의 신경세포의 분자 정체를 확인하기 위한 연결체학 및 seqFISH의 통합.
제공된 기술을 이용한 체성 감각운동 신경세포 네트워크 내의 별개의 신경세포 집단의 분자 정체의 체계적 특성규명. 일부 구체예에서, 동일 기능 서브네트워크 내의 신경세포 집단은 공통 세트의 마커 유전자를 공유할 수 있으나, 또한 세포 수준에서 정체를 규정하는 다른 유전자의 이종성 발현을 가질 수 있다. 일부 구체예에서, 다양한 서브네트워크 내의 세포는 이들의 발현 패턴에 있어서 더욱 상이하다. 각각이 감각운동 기능의 기본 부류를 조절하는 예시적인 피질-피질 체성 서브네트워크는 (1) 먹고 마시는 것에 대한 오로파시오파린질(orofaciopharyngeal), (2) 손뻗음 및 움켜쥠에 대한 상지(upper limbs), (3) 보행에 대한 하지(lower limbs), 및 (4) 율동적 수염 운동에 대한 수염(whisker)이다. 일부 구체예에서, 제공된 기술은 별개의 신경세포 네트워크를 갖는 피질 신경세포의 분자 정체를 특성규명하기 위한 신규하고 엄격한 접근법을 제공하고, 포유동물 뇌의 배선도에 기초가 되는 유전자 회로를 이해하기 위한 매우 귀중한 정보를 제공한다.
신경세포 경로의 수집을 이용하여, 트랙 추적 연구의 미가공 이미지를 나타내기 위해 디지털 피질 연결도 아틀라스가 생성될 수 있다. 대규모 데이터의 분석을 돕기 위해 피질-피질 연결도 맵을 생성시키기 위해 경로가 도표적으로 재구성될 수 있다. 피질내 연결도를 기초로 하여, 각각이 감각운동 기능의 기본 부류를 조절하는 4개의 별개의 피질-피질 체성 서브네트워크가 확립될 수 있다. 이들 서브네트워크 각각은 일차 체성 감각(SSp), 일차 체성운동(MOp), 이차 체성운동(MOs), 및 보조 체성 감각(SSs) 피질 영역 내에 4-5개의 별개의 기능성 도메인을 포함하며, 이들은 이들의 특정 신체 서브필드에 해당하는 다른 체성 감각운동 영역과의 연결도의 강도에 따라 추가로 세분된다. 일부 구체예에서, 오로파시오파린질(orofaciopharyngeal) 서브네트워크는 5개의 주요 결절을 포함한다: (1) SSp 입 및 코 도메인(SSp-m/n); (2) MOp 구강안면 도메인(MOp-orf); (3) MO 입쪽등가쪽 도메인(MOs-rdl); (4) SSp 배럴 필드 앞가쪽 도메인(barrel field anterolateral domain)(SSp-bfd.al); 및 (5) SSs 입쪽 및 미복측(caudoventral) 도메인(SSs-r & cv). 일부 구체예에서, 상지 서브네트워크의 4개의 주요 결절은 (1) SSp 상지(SSp-ul); (2) MOp-ul; (3) 입쪽등쪽 MOs(MOs-rd); 및 (4) 꼬리등쪽 SSs(SSs-cd)를 포함한다. 일부 구체예에서, 하지/몸통 서브네트워크는 SSp 하지/몸통 영역(SSp-ll/tr), MOp-11/tr, 및 입쪽뒤안쪽 MO(MOs-rdm)를 포함한다(도 10 B-D). 일부 구체예에서, 수염 서브네트워크는 꼬리안쪽 SSp-bfd(SSp-bfd.cm), 코털 일차 운동 피질(vM1)에 해당하는 MOp-w 및 꼬리등쪽 SSs(SSs-cd; 도 19)를 포함한다. 예시적 데이터는 마우스 커넥톰 프로젝트(Mouse Connectome Project)(www.mouseconnectome.org)에 의해 기재된다.
이들 체성 감각운동 서브네트워크 각각에서 별개의 신경세포 집단의 분자 정체를 결정하기 위해, 신경세포를 표지시키기 위해 다중-형광 역행 추적자가 사용되고, 단일 세포 분리에서 역행 표지된 집단의 유전자 발현 프로파일을 결정하기 위해 제공된 기술, 예를 들어, seqFISH가 적용될 수 있다. 신경세포 집단을 표지시키기 위해, 다수(예를 들어, 5개)의 역행 추적자가 동일 동물에서 각각의 감각운동 서브네트워크의 주요 결절 중 하나의 5개의 주요 표적으로 주입된다(추적자 정보가 하기에 제공됨). 예를 들어, 한 동물에서, 회로 추적자가 오로파시오파린질 서브네트워크의 주요 피질 결절 중 2개(SSp-bfd.al 및 SSs-r & cv) 및 피질하 결절 중 3개(꼬리조가비핵 배쪽외측 도메인, CP-vl; 배쪽 뒤안쪽 시상 핵, VPM; 및 배쪽 척수 삼차신경핵, SPV)로 주입된다. 이는 오로파시오파린질 서브네트워크의 다른 결절 모두에서 5개의 상이한 신경세포 집단을 동시에 역 표지시킨다. 이러한 예에서, 표지된 신경세포는 SSp-m/n 도메인 및 MOp-oro에 존재한다.
다른 한편으로, 추적자는 각각이 별개의 체성 서브네트워크에 속하는 4개의 상이한 SSp 신체 서브필드 도메인(즉, SSp-m/n, SSp-ul, SSp-ll/tr, 및 SSp-bfd.cm)으로 주입될 수 있다. 이는 다양한 서브네트워크와 관련된 피질 영역에서 별개의 신경세포 집단을 동시에 표지시킨다. 이러한 경우에서, 예를 들어, 역 표지된 신경세포가 각각의 서브네트워크와 관련된 MOp 도메인, 즉, MOp-orf, MOp-ul, MOp-ll/tr, 및 MOp-w에서 관찰된다. 4개의 체성 감각운동 서브네트워크 각각의 모든 주요 결절 및 피질하 표적에 적용된 상기 주입 전략은 서브네트워크 각각의 별개의 신경세포 집단을 표지시킨다.
추적자의 주입 후(예를 들어, 추적자의 주입 1주일 후), 동물이 희생되고, 이들의 뇌가 수거되고, 역 표지된 신경세포의 seqFISH 분석을 위해 20 μm 또는 100 μm 두께로 관상으로 절편화된다. 체성 감각운동 피질 영역(SSp, MOp, MOs, SSs)에서 풍부하게 발현되는 유전자, 예를 들어, 예시된 약 100개의 유전자가, 예를 들어, 앨런 뇌 아틀라스(Allen brain atlas) 프로젝트의 온라인 디지털 유전자 발현 데이터베이스(www.Brian-Map.org)를 이용하여 프로파일링하기 위해 미리 선택될 수 있다(Lein et al, 2007 Genome-wide atlas of gene expression in the adult mouse brain. Nature, 11; 445(7124): 168-76).
주입 전략 및 주입 후 처리. 300마리의 4주령 수컷 C57Bl/6 마우스가 이용된다. 하나의 동물에서, 5개의 형광 역행 추적자가 상기 기재된 바와 같이 동일한 체성 감각운동 서브네트워크 내의 다양한 결절, 또는 상이한 체성 서브네트워크 내의 다양한 결절로 주입된다(도 19). 추적자는 플루오로골드(Fluorogold)(FG, 황색), 488 또는 647와 컨쥬게이션된 콜레라 독소 b(CTb-488 [녹색], CTb-647 [분홍색]), 적색 레트로비드(red retrobead)(RR, 적색), 및 655와 컨쥬게이션된 밀 배아 응집소(WGA-Qdot655, 백색)이다. Qdot655는 CTb 647과 상이한 여기 파장을 가지므로, 이는 다양한 채널로 포착될 수 있고, 독특한 색조로 거짓착색될 수 있다. 추적자는 정위 수술을 통해 주입(이온영동적으로 또는 압력 주입을 이용함)된다. 수술 및 관류에 대한 세부사항은, 예를 들어, 문헌[Hintiryan et al., Comprehensive connectivity of the mouse main olfactory bulb:analysis and online digital atlas. Front Neuroanat. 2012 Aug 7;6:30. eCollection 2012]에 기재되어 있다. 일부 구체예에서, 2개의 쌍을 이룬 마우스에 정확히 동일한 좌표에서 사용되는 동일 트레이서가 주입된다. 동물 중 하나가 표지된 세포 및 주입 부위의 위치를 확인하기 위해 이용되는 한편, 다른 동물은 제공된 방법, 예를 들어, seqFISH 방법에 적용된다. 하나는 추적자 운반 후에 관류되고, 뇌가 50 μm 두께의 절편으로 관상적으로 절편화되고, 4개 시리즈로 수거된다. 4개 시리즈의 절편 중 하나가 형광 니슬 염색 용액(NeuroTrace Blue [NTB])으로 대조염색되고, 유리 슬라이드 상에 마운팅되고, Olympus VS120 가상 현미경검사 시스템을 이용하여 영상화된다. 일부 구체예에서, 니슬 염색은 역 표지된 세포의 정확한 해부학적 위치를 시각화시키기 위한 세포구축 백그라운드를 제공한다. 이들 이미지는 모든 개별적 이미지가 이의 앨런 참조 아틀라스(Allen Reference Atlas)(ARA)의 상응하는 수준으로 충실히 기록되도록 정보학 경로를 통해 처리된다. 제공된 정보학 툴과 함께 이러한 니슬은 각각의 ROI(이러한 경우에서, 체성 감각운동 영역의 다양한 도메인)에서 각각의 추적자 표지된 신경세포 집단의 대략적인 수의 자동적이고 정확한 계수를 가능케 한다. 분포 패턴은 이들의 연결도 맵을 생성시키기 위해 상응하는 아틀라스 수준으로 자동적으로 작도된다.
쌍을 이룬 마우스가 동시에 희생되고, 이들의 뇌가 seqFISH 분석을 위해 20 μm 또는 100 μm 두께로 절편화된다. 이들 절편은 다양한 추적자를 이용하여 역 표지된 신경세포를 나타내기 위해 20x (또는 10x) 대물렌즈 하에서 먼저 영상화된다. 체성 감각운동 영역을 함유하는 모든 관상 수준을 통한 뇌 절편이 100개의 유전자의 예시된 세트에 대한 seqFISH를 수행하기 위해 이용된다. 이러한 방법은 모든 추적자 표지된 신경세포에서 유전자 발현을 나타낸다. 모든 이미지가 각각의 개별적 추적자 표지된 신경세포의 유전자 발현 프로파일에 대해 먼저 분석된다. 각각의 절편은 쌍을 이룬 뇌로부터의 대략 동일한 관상 수준의 절편이 커넥톰 뷰어와 나란히 디스플레이될 수 있도록 이의 쌍을 이룬 뇌의 가장 가까운 매치된 절편으로 다시 기록된다. 이와 같이, 다양한 신경세포 집단의 분자 프로파일이 이의 가장 가까운 매치된 해부학적 백그라운드 내에 디스플레이된다. 일부 구체예에서, 유전자 발현 프로파일은 각각의 역행 표지된 신경세포 집단에서 상관된다.
결과. 일부 구체예에서, 다양한 체성 감각운동 영역 내의 별개의 역행 표지된 신경세포 집단은 다양한 전사체 프로파일을 나타내고; 심지어 다양한 추적자로 표지되는 동일 도메인(예를 들어, SSp-m) 내의 신경세포 집단도 다양한 연결도 프로파일을 갖는 이웃 신경세포와 별개의 유전자 발현 프로파일을 나타낸다. 일부 구체예에서, 동일 서브네트워크(예를 들어, SSp-m, MOp-orf, SSp-bfd.al, 및 SSs-r) 내의 다양한 체성 감각운동 결절 내의 다양한 신경세포 집단은 공통의 네트워크-특이적 유전자를 공유하는 한편, 상이한 신경세포 네트워크(예를 들어, 오로파시오파린질 및 하지/몸통 서브네트워크) 내의 신경세포 집단은 매우 별개의 전사체 프로파일을 나타낸다. 일부 구체예에서, 부위적(예를 들어, SSp 또는 MOp) 또는 층상(다양한 층) 특이적 유전자가 다양한 피질 영역 및 다양한 층 내의 신경세포에 대해 확인된다.
예시된 바와 같이, 제공된 기술은 신경세포하 분리 및 충실한 해부학적 백그라운드를 이용하여 별개의 체성 감각운동 네트워크 내의 연결도-기반 신경세포 집단(세포 유형)의 분자 정체를 특성규명하기 위해 seqFISH 기술과 형광 트랙 추적의 독특한 조합을 제공한다. 예를 들어, 예시적 결과에 대해 도 3 및 9를 참조하라. 일부 구체예에서, 제공된 기술은 동시에 다른 파라미터(즉, 항체 및 소기관 염색 뿐만 아니라 IEG 발현 수준)를 측정하는 것을 포함하고, 이는 전체 신피질 또는 뇌에 적용될 수 있다.
데이터 온라인을 분석하고 제시하기 위한 고 처리량 경로 및 정보학 툴. 일부 구체예에서, 제공된 기술은, 예를 들어, 공적으로 접근가능한 데이터베이스, 예를 들어, www.MouseConnectome.org를 통해 데이터 온라인을 분석하고 제시하기 위한 고 처리량 경로 및 정보학 툴을 제공한다. 일부 구체예에서, 제공된 기술은 연구의 넓은 범위 및 다중-형광 영상화의 이용이 연결체학 집단 중에서 가치있는 도구로 만들고, 마우스 뇌에서 긴-범위 연결도를 연구하기 위해 충분히 적합화된 마우스 커넥톰 프로젝트와의 통합을 제공한다. 예를 들어, 이는 사용자가 자체의 세포구조 백그라운드 상부에 다수의 형광 표지된 경로 및 상응하는 ARA 아틀라스 수준을 시각화시키는 것을 가능케 하는 온라인 시각화 도구를 제공한다. 일부 구체예에서, seqFISH 정보와 이의 상응하는 역행 표지된 체세포를 정확히 관련시키기 위해, 표지된 세포체는 조직 백그라운드 및 동일 절편의 이미지로부터 별개로 분할되나, 다양한 라운드(예를 들어, seqFISH에서 이미지 역행 추적자에 대해 먼저, 그 후 다양한 mRNA에 대해)에서 획득되고, 슬라이드 및/또는 조직 내의 해부학적 기준점 상의 고정된 참조 포인트에 비한 이들의 좌표에 의해 공간적으로 색인화된다. 일부 구체예에서, 데이터와 ARA에서 정의된 정위 좌표를 관련시키기 위해, 본 발명은 기록 정확도를 극적으로 증가시키는 신규한 기록 경로(즉, 각각의 스캔된 현미경검사 사진의 상응하는 수준의 ARA의 형태로의 워핑(warping)), 및 제공된 ROI(예를 들어, SSp-m, MOp-ll)에서 형광 표지된 신경세포를 자동적으로 및 정확히 계수하는 이미지 분할을 제공한다. 일부 구체예에서, 제공된 기술은 뇌 내 및 다수의 뇌 전체에 걸친 다수의 추적자로부터의 표지 및 seqFISH 데이터가 시각화 및 주석의 목적을 위해 단일 해부학적 프레임워크로 대조되는 것을 가능케 한다.
일부 구체예에서, 이미지는 앨런 참조 아틀라스의 상응하는 아틀라스 수준으로 기록된다(Dong, H. W. (2008). The Allen Reference Atlas: A Digital Color Brain Atlas of C57BL/6J Male Mouse, John Wiley & Sons). 기록 과정으로부터 발생하는 변형 행렬이 본래의 분리 이미지에 적용되어 고-해상도 워핑된 이미지가 수득된다. 기록 및 기록 정련 후, NeuroTrace® 형광 니슬 염색이 명시야 이미지로 전환된다. 다음으로, 모든 이미지에 대한 각각의 채널은 툴, 예를 들어, iConnectome에서 표지 시감도 및 품질을 최대화시키기 위해 밝기 및 대비에 대해 조정된다. 변형(즉, 비대칭도, 각) 및 JPEG2000 파일 포맷 전환 후, 이미지는 iConnectome 뷰(www.MouseConnectome.org)에 공개될 수 있다.
FISH 시각화 툴. 일부 구체예에서, 생성된 모든 연결도 데이터는 MCP 정보학 경로를 통해 처리되고, 새로운 iConnectome FISH 뷰어(www.MouseConnectome.org)를 통해 온라인에 제공된다. 2개의 선행(PHAL 및 BDA) 및 2개의 역행(FG 및 CTb) 표지를 나타내는 이용가능한 iConnectome 뷰어와 상이하게, iConnectome FISH는 역행 형광 염료를 이용하여 5개 이하의 상이한 신경세포 집단을 나타낼 수 있다. 상기 언급된 바와 같이, 주입의 각각의 세트가 한 쌍의 마우스에 제공될 수 있다. 하나는 정규적인 MCP 경로에 따라 처리될 수 있고, 자체의 니슬-염색된 세포구조 백그라운드 및 상응하는 ARA 수준 내에서의 다수의 형광 표지된 신경세포 집단을 나타내기 위해 iConnectome FISH 뷰어에 제공될 수 있다. 이들은 전체 뇌에 걸쳐 형광 표지된 신경세포 집단 각각에 대해 정확한 해부학적 정보를 제공할 수 있다. seqFISH 후의 쌍을 이룬 파트너로부터의 뇌 절편이 쌍을 이룬 파트너가 다양한 범위 내에서 기록되고 나란히 제시될 수 있는 가장 가까운 ARA 수준으로 기록된다. 신경세포에서 발현된 유전자의 목록은 측면 패널 상에 나열될 수 있다. 유전자에서의 클리킹(clicking) 시, 상기 유전자를 발현한 형광 표지된 신경세포는 이의 발현 위치를 표시하기 위해 밝아질 수 있다. 이는 연결도 및 해부학적 백그라운드의 전반적 상황에서 신경세포 집단의 분자 정체를 나타내기 위한 실질적 방식을 제공한다.
일부 구체예에서, 사용자가 상기 데이터를 분석하고, 신경세포 연결도와 이들의 분자 정체를 상관시키는 것을 가능케 하는 상응하는 데이터베이스가 개발된다. 이러한 정보학 툴은 유전자 바코딩을 이용하여 각각의 역행 표지된 신경세포 집단과 관련된 정보(예를 들어, 세포수, 해부학적 위치)를 저장하는 데이터베이스의 상부에 만들어진다. 이러한 데이터베이스는 동일한 신경세포 네트워크 또는 별개의 신경세포 네트워크 내의 신경세포에 대한 상응하는 유전자 바코드를 확인하려는 사용자를 도울 수 있다.
전체 뇌 맵핑. 일부 구체예에서, 제공된 기술은 전체 뇌에 대해 역행 표지된 신경세포에서 유전자 발현의 고-처리량 분석을 위한 단일 신경세포 수준에서의 충분한 민감도, 선택성, 자동화, 및/또는 시공간적 해상도를 갖는다.
제거 단계에 대한 추가의 예시적인 방법
일부 구체예에서, 본 발명은 표적으로부터 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드를 제거하기 위한 다양한 방법을 제공한다. 일부 구체예에서, 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드를 제거하기 위해 엑소뉴클레아제 III(ExoIII)가 이용된다. 도 21은 Exo III를 이용한 HCR 재-하이브리드화에 대한 예시적 과정을 예시한다. 도 21에서, Exo III는 중간체 올리고뉴클레오티드를 신규한 브릿징 가닥과의 하이브리드화를 위해 온전하게 유지시키면서 브릿징 가닥 및 HCR 중합체를 분해한다. T3T 마우스 섬유모세포 세포에서 베타-액틴(Actb) 전사물을 표적으로 하는 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드를 이용한 예시적 데이터가 도 21 (b)에 제시되었다. 좌측 이미지는 알렉사 488 염료를 이용한 Actb 전사물의 최초 하이브리드화 및 증폭을 나타내었다. 중간 이미지는 실온에서 exoIII에서 1시간의 인큐베이션 후의 알렉사 488 채널에서의 신호의 완전한 소실을 나타내었다. 우측 이미지는 신규한 브릿징 가닥 및 알렉사 647 염료로 태깅된 상응하는 헤어핀만의 첨가 후에 Actb 전사물의 재-증폭을 나타내었다. 이미지의 대조 비가 상기 방법의 특정 특징을 예시하기 위해 조정되었다.
일부 구체예에서, 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드를 제거하기 위해 람다 엑소뉴클레아제(λ-exo)가 이용된다. 도 22는 λ-exo를 이용한 HCR 재하이브리드화를 위한 예시적 과정을 예시한다. 도 22에서, λ-exo는 5' 인산화된 브릿징 가닥을 분해하고, 표적, 예를 들어, mRNA에 결합된 중간체 올리고뉴클레오티드로부터 HCR 중합체를 방출시키고, 방출된 중합체를 세척한 후에 신규한 브릿징 가닥과의 하이브리드화를 위해 중간체 올리고뉴클레오티드를 온전하게 유지시킨다. T3T 마우스 섬유모세포 세포에서 베타-액틴(Actb) 전사물을 표적으로 하는 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드를 이용한 예시적 데이터가 도 22 (b)에 제시되었다. 좌측 이미지는 알렉사 488 염료를 이용한 Actb 전사물의 최초 하이브리드화 및 증폭을 나타내었다. 중간 이미지는 37℃에서 λ-exo와의 1시간 인큐베이션 후의 알렉사 488 채널에서의 신호의 소실을 나타내었다. 우측 이미지는 세척 완충액을 이용한 세척 및 알렉사 647 염료와 태깅된 상응하는 헤어핀과 함께 신규한 브릿징 가닥만의 첨가 후의 Actb 전사물의 재증폭을 나타내었다. 이미지의 대조 비가 상기 방법의 특정 특징을 예시하기 위해 조정되었다.
일부 구체예에서, 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드를 제거하기 위해 우라실-특이적 절제 시약(USER)이 사용된다. 도 23은 USER를 이용한 HCR 재하이브리드화를 위한 예시적 과정을 예시한다. 도 23에서, USER는 브릿징 가닥 내의 데옥시유리딘 뉴클레오티드를 분해하고, 표적, 예를 들어, mRNA에 결합된 중간체 올리고뉴클레오티드로부터 HCR 중합체를 방출시키고, 단편 및 방출된 중합체를 세척한 후 신규한 브릿징 가닥과의 하이브리드화를 위해 중간체 올리고뉴클레오티드를 온전하게 유지시킨다. T3T 마우스 섬유모세포 세포에서 베타-액틴(Actb) 전사물을 표적으로 하는 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드를 이용한 예시적 데이터가 도 23 (b)에 제시되었다. 좌측 이미지는 알렉사 488 염료를 이용한 Actb 전사물의 최초 하이브리드화 및 증폭을 나타내었다. 중간 이미지는 37℃에서 USER와의 1시간 인큐베이션 후의 알렉사 488 채널에서의 신호의 소실을 나타내었다. 우측 이미지는 세척 완충액을 이용한 세척 및 알렉사 647 염료와 태깅된 상응하는 헤어핀과 함께 신규한 브릿징 가닥만의 첨가 후의 Actb 전사물의 재증폭을 나타내었다. 이미지의 대조 비가 상기 방법의 특정 특징을 예시하기 위해 조정되었다.
일부 구체예에서, 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드는 상보적 올리고뉴클레오티드(cTOE)를 이용한 치환에 의해 제거된다. 일부 구체예에서, 치환은 덱스트란 또는 이의 유도체, 염, 및/또는 유기 용매의 사용을 포함한다. 일부 구체예에서, 치환은 덱스트란 또는 이의 유도체의 사용을 포함한다. 일부 구체예에서, 치환은 덱스트란 설페이트의 사용을 포함한다. 일부 구체예에서, 치환은 염의 사용을 포함한다. 일부 구체예에서, 염은 MgCl2이다. 일부 구체예에서, 치환은 유기 용매의 사용을 포함한다. 일부 구체예에서, 유기 용매는 포름아미드이다. 다양한 요인, 비제한적인 예로, cTOE 농도, 인큐베이션 시간, 완충액 조성 및 유기 용매의 유형 및/또는 농도가 개별적으로 또는 조합하여 최적화될 수 있다. 도 24는 cTOE를 이용한 smFISH 프로브의 치환의 예시적 데이터를 나타내었다. 치환되는 smFISH 프로브(알렉사 647)와 공동국소화된 smFISH 프로브(알렉사 532) 사이의 형광 강도의 평균 비가 제시된다. cTOE의 농도, 하이브리드화 완충액 조성 및 치환 시간이 비교된 다양한 처리가 수행되었다. 모든 치환 프로브 조건은 세포가 10% DS에 배치되고, cTOE가 첨가되지 않은 대조군에 비해 유의하게 더 많은 치환을 발생시켰다. 이론으로 제한하고자 하는 것은 아니지만, 출원인은 무엇보다도 cTOE의 농도를 증가시키고, cTOE 프로브가 하이브리드화되는 시간의 양을 증가시키고, 완충액을 10mM MgCl2 또는 10% 포름아미드로 조정하는 것 모두가 증가된 치환을 발생시킨 것을 인지한다. 10% 덱스트란 설페이트(DS)에서 2시간 동안 2.5 μM의 cTOE는 최소의 잔여 알렉사 647 smFISH 신호를 발생시키나, 알렉사 647 대신 알렉사 594(A594)를 하이브리드화시키고, cTOE를 첨가하지 않음으로써 결정된 기준선 신호에 비해 약간의 증가를 발생시켰다.
올리고뉴클레오티드 제조를 위한 추가 예
한 세트의 서열을 PCR에 의해 증폭시켰다(도 25). 생성물을 분리, 예를 들어, 적어도 10분 동안 -20℃에서 5 부피의 침전 완충액(30:1 EtOH:1M NaOAc)을 이용하여 침전시켰다. 침전 혼합물을 10분 동안 원심분리시켰다. 상층액을 폐기하고, 올리고뉴클레오티드 펠렛을 1시간 내에 약 1 μg의 DNA를 분해하는 약 10 유닛의 효소를 기초로 하여 적절한 유닛의 효소를 갖는 니킹 효소 완충액 중에 재구성시켰다. 인큐베이션 시간이 경과된 후, 샘플을 다시 침전시키고, 2x 로딩 완충액(96% 포름아미드/20mM EDTA) 및 물에 재구성시켜, 최종 로딩 완충액(48% 포름아미드/10mM EDTA)을 제조하였다. DNA를 완전히 변성시키기 위해 샘플을 95℃로 가열하였다. 이후, 변성된 DNA를 변성 아크릴아미드 겔(8M 우레아 10-12% 아크릴아미드)로 로딩하였다. 겔을 1시간 동안 250V에서 영동시키거나, 요망되는 바에 따라 최적화시켰다. 전기영동 후, 겔을 15분 동안 1x sybr 골드를 이용하여 염색시킨 후, 시각화시켰다. 적절한 밴드를 절단하고, 분쇄시키고, 2시간 동안 DI 물에서 인큐베이션시켰다. 인큐베이션 후, 샘플을 다시 침전시킨 후, 진공 컬럼을 이용하여 정제하였다. 컬럼을 30 μL의 RNase 비함유 물로 용리시켜, 도 26에 제시된 바와 같이 최종 생성물을 생성시켰다.
일부 구체예에서, 제공된 방법은 니킹 엔도뉴클레아제 부위 대신 제한 부위를 이용한다. 도 25에서의 증폭 단계와 유사하게, 한 세트의 서열이 PCR에 의해 증폭되며, BamHI 부위는 5'-말단의 측면을 접하고, AatII 부위는 3'-말단의 측면을 접한다. PCR 생성물은 적어도 10분 동안 -20℃에서 5 부피의 침전 완충액(30:1 EtOH:1M NaOAc)으로 침전되고, 분리된 후, BamHI 및 AatII에 의해 분해된다. 생성물은 다시 정제되고, exo III 분해에 적용된다. 분해된 핵산의 제거는 생성물 올리고뉴클레오티드를 제공한다.
동등물
본 발명의 일부 예시적 구체예가 기재되어 있는 경우, 전술한 내용은 단지 예시이고, 이로 제한하는 것이 아니며, 단지 예로서 제공된 것이 당업자에게 명백할 것이다. 다수의 변형 및 다른 예시적 구체예는 당 분야의 통상적인 기술 중 하나의 범위 내에 속하며, 본 발명의 범위 내에 해당하는 것으로 간주된다. 특히, 본원에 제시된 예 중 많은 예가 방법의 실시 또는 시스템 구성요소의 특정 조합을 포함하나, 상기 실시 및 상기 구성요소는 동일 목적을 달성하기 위해 다른 방식과 조합될 수 있음이 이해되어야 한다. 한 구체예와 관련하여서만 논의된 실시, 구성요소 및 특징은 다른 구체예에서의 유사한 역할로부터 배제되는 것으로 의도하는 것이 아니다. 추가로, 하기 청구항에서 언급된 하나 이상의 수단+기능 한정에 대해, 상기 수단은 언급된 기능을 수행하기 위해 본원에 개시된 수단을 제한하고자 하는 것이 아니라, 언급된 기능을 수행하기 위해 현재 공지되거나 이후에 개발되는 임의의 수단을 범위 내에 포함하고자 하는 것이다.
청구항 구성요소를 변형시키기 위해 청구항 내에서 "제 1", "제 2", "제 3" 등과 같은 순서를 나타내는 용어의 사용은 그 자체로 방법의 실시가 수행되는 임의의 우선사항, 선행, 또는 또 다른 청구항 구성요소에 비한 한 청구항 구성요소의 순서 또는 시간적 순서를 의미하는 것이 아니라, 이는 단지 청구항 구성요소를 구별하기 위해 특정 명칭을 갖는 하나의 청구항 구성요소를 동일 명칭(그러나 순서를 나타내는 용어의 사용을 위함)을 갖는 또 다른 구성요소와 구별하기 위한 표지로서 사용된다. 유사하게, a), b) 등, 또는 i), ii) 등의 사용은 그 자체로 청구항 내에서의 임의의 우선사항, 선행, 또는 단계의 순서를 의미하지 않는다. 유사하게, 명세서에서의 이들 용어의 사용은 그 자체로 임의의 요구되는 우선사항, 선행, 또는 순서를 의미하지 않는다.
상기 기재된 명세서는 당업자가 본 발명을 실시하는 것을 가능케 하기에 충분한 것으로 간주된다. 본 발명은 범위에 있어서 제공된 예에 의해 제한되는 것이 아닌데, 이는 상기 예가 본 발명의 한 양태의 단일 예시로서 의도되며, 다른 기능적으로 동등한 구체예가 본 발명의 범위 내에 속하기 때문이다. 본원에 제시되고 기재된 것에 더한 본 발명의 다양한 변형이 전술한 기재로부터 당업자에게 명백할 것이며, 이는 첨부된 청구항의 범위 내에 속한다. 본 발명의 장점 및 목적은 본 발명의 각각의 구체예에 의해 반드시 포함되지는 않는다.

Claims (81)

  1. 복수의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드 각각이 전사물 또는 DNA 유전자좌를 표적으로 하고, 검출가능한 모이어티로 표지되는, 상기 올리고뉴클레오티드를 포함하는 조성물로서, 상기 조성물이 적어도,
    (i) 제 1 전사물 또는 DNA 유전자좌를 표적으로 하고, 제 1의 검출가능한 모이어티로 표지된 제 1 올리고뉴클레오티드; 및
    (ii) 제 2 전사물 또는 DNA 유전자좌를 표적으로 하고, 제 2의 검출가능한 모이어티로 표지된 제 2 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 조성물.
  2. 복수의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드 각각이 전사물 또는 DNA 유전자좌를 표적으로 하고, 검출가능한 모이어티로 표지되는, 상기 올리고뉴클레오티드를 포함하는 키트로서, 상기 키트가 적어도,
    (i) 제 1 전사물 또는 DNA 유전자좌를 표적으로 하고, 제 1의 검출가능한 모이어티로 표지된 제 1 올리고뉴클레오티드;
    (ii) 제 2 전사물 또는 DNA 유전자좌를 표적으로 하고, 제 2의 검출가능한 모이어티로 표지된 제 2 올리고뉴클레오티드;
    (iii) 임의로 제 1 올리고뉴클레오티드와 서열에 있어서 동일하고, 제 1 전사물 또는 DNA 유전자좌를 표적으로 하고, 제 1, 제 2 또는 제 3의 검출가능한 모이어티로 표지된 제 3 올리고뉴클레오티드; 및
    (iv) 임의로 제 2 올리고뉴클레오티드와 서열에 있어서 동일하고, 제 2 전사물 또는 DNA 유전자좌를 표적으로 하고, 제 1, 제 2, 제 3 또는 제 4의 검출가능한 모이어티로 표지된 제 4 올리고뉴클레오티드를 포함하고,
    상기 제 3 올리고뉴클레오티드가 제 1 올리고뉴클레오티드와 상이한 검출가능한 모이어티로 표지되거나, 상기 제 4 올리고뉴클레오티드가 제 2 올리고뉴클레오티드와 상이한 검출가능한 모이어티로 표지되거나, 둘 모두인, 키트.
  3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 각각의 올리고뉴클레오티드가 형광단으로 표지되는 조성물 또는 키트.
  4. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, 제 1 및 제 2 올리고뉴클레오티드가 상이한 전사물 또는 DNA 유전자좌를 표적으로 하는 조성물 또는 키트.
  5. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 제 1 및 제 2 올리고뉴클레오티드가 동일한 전사물 또는 DNA 유전자좌를 표적으로 하는 조성물 또는 키트.
  6. 제 5항에 있어서, 복수의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드가 동일한 전사물 또는 DNA 유전자좌를 표적으로 하는 2개 이상의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 조성물 또는 키트.
  7. 제 5항에 있어서, 제 1 및 제 2 올리고뉴클레오티드가 상이한 올리고뉴클레오티드 서열을 갖는 조성물 또는 키트.
  8. 제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 있어서, 제 1 및 제 2의 검출가능한 모이어티가 상이한 조성물 또는 키트.
  9. 제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항에 있어서, 제 1 및 제 2의 검출가능한 모이어티가 동일한 조성물 또는 키트.
  10. 제 1항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 있어서, 제 1 및 제 2 올리고뉴클레오티드가 68% 미만의 서열 동일성을 공유하는 조성물 또는 키트.
  11. 제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 올리고뉴클레오티드가 임의의 다른 올리고뉴클레오티드와 50% 미만의 서열 동일성을 공유하는 조성물 또는 키트.
  12. 제 1항 내지 제 11항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 올리고뉴클레오티드가 29개 미만의 염기쌍 길이인 조성물 또는 키트.
  13. 제 1항 내지 제 12항 중 어느 한 항에 있어서, 복수의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드가 적어도 10개의 상이한 전사물 및/또는 DNA 유전자좌를 표적으로 하는 조성물 또는 키트.
  14. 제 1항 내지 제 13항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 2개의 검출가능한 모이어티를 포함하는 조성물 또는 키트.
  15. 제 1항 내지 제 14항 중 어느 한 항에 있어서,
    (iii) 임의로 제 1 올리고뉴클레오티드와 서열에 있어서 동일하고, 제 1 전사물 또는 DNA 유전자좌를 표적으로 하는 제 3 올리고뉴클레오티드; 및
    (iv) 임의로 제 2 올리고뉴클레오티드와 서열에 있어서 동일하고, 제 2 전사물 또는 DNA 유전자좌를 표적으로 하는 제 4 올리고뉴클레오티드를 추가로 포함하고,
    상기 제 3 올리고뉴클레오티드가 제 1 올리고뉴클레오티드와 상이한 검출가능한 모이어티로 표지되거나, 상기 제 4 올리고뉴클레오티드가 제 2 올리고뉴클레오티드와 상이한 검출가능한 모이어티로 표지되거나, 둘 모두인, 조성물.
  16. 제 1항 내지 제 15항 중 어느 한 항에 있어서, 제 3 올리고뉴클레오티드가 제 1 올리고뉴클레오티드와 서열에 있어서 동일한 조성물 또는 키트.
  17. 제 1항 내지 제 16항 중 어느 한 항에 있어서, 제 3 올리고뉴클레오티드가 제 1 올리고뉴클레오티드와 상이한 검출가능한 모이어티로 표지되는 조성물 또는 키트.
  18. 제 1항 내지 제 17항 중 어느 한 항에 있어서, 제 4 올리고뉴클레오티드가 제 2 올리고뉴클레오티드와 서열에 있어서 동일한 조성물 또는 키트.
  19. 제 1항 내지 제 18항 중 어느 한 항에 있어서, 제 4 올리고뉴클레오티드가 제 2 올리고뉴클레오티드와 상이한 검출가능한 모이어티로 표지되는 조성물 또는 키트.
  20. (a) 복수의 핵산을 포함하는 세포와, 각각이 핵산을 표적으로 하고 검출가능한 모이어티로 표지되는 제 1의 복수의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드를 접촉시키는 것을 포함하는 제 1 접촉 단계를 수행하는 단계로서, 조성물이 적어도,
    (i) 제 1 핵산을 표적으로 하고, 제 1의 검출가능한 모이어티로 표지되는 제 1 올리고뉴클레오티드; 및
    (ii) 제 2 핵산을 표적으로 하고, 제 2의 검출가능한 모이어티로 표지되는 제 2 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 단계;
    (b) 제 1의 복수의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드와 이들의 표적의 상호작용이 검출되도록 제 1 접촉 단계 후에 세포를 영상화시키는 단계;
    (c) 세포와 제 2의 복수의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드를 접촉시키는 것을 포함하는 제 2 접촉 단계를 수행하는 단계로서, 상기 제 2의 복수의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드가 제 1의 복수의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드에 의해 표적화되는 중첩 핵산을 표적으로 하는 올리고뉴클레오티드를 포함하고, 상기 제 2의 복수의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드가 적어도,
    (i) 임의로 제 1 올리고뉴클레오티드와 서열에 있어서 동일하고, 제 1 핵산을 표적으로 하는 제 3 올리고뉴클레오티드; 및
    (ii) 임의로 제 2 올리고뉴클레오티드와 서열에 있어서 동일하고, 제 2 핵산을 표적으로 하는 제 4 올리고뉴클레오티드를 포함하고,
    상기 제 2의 복수의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드에 존재하는 올리고뉴클레오티드 중 적어도 하나가 상기 제 1의 복수의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드에서의 동일한 핵산을 표적으로 하는 상응하는 올리고뉴클레오티드와 상이한 검출가능한 모이어티로 표지되는 점에 있어서, 상기 제 2의 복수의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드가 상기 제 1의 복수의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드와 상이하고, 이에 따라 상기 제 2의 복수의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드에서,
    (iii) 제 3 올리고뉴클레오티드는 제 1의 검출가능한 모이어티, 제 2의 검출가능한 모이어티 또는 제 3의 검출가능한 모이어티로 표지되고;
    (iv) 제 4 올리고뉴클레오티드는 제 1의 검출가능한 모이어티, 제 2의 검출가능한 모이어티, 제 3의 검출가능한 모이어티, 또는 제 4의 검출가능한 모이어티로 표지되고,
    상기 제 3 올리고뉴클레오티드가 제 1 올리고뉴클레오티드와 상이한 검출가능한 모이어티로 표지되거나, 상기 제 4 올리고뉴클레오티드가 제 2 올리고뉴클레오티드와 상이한 검출가능한 모이어티로 표지되거나, 둘 모두인, 단계;
    (d) 제 2의 복수의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드와 이들의 표적의 상호작용이 검출되도록 제 2 접촉 단계 후에 세포를 영상화시키는 단계; 및
    (e) 임의로 상기 접촉 및 영상화 단계를 반복하는 단계로서, 각각의 회에서 제 1 및 제 2의 복수의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드에 의해 표적화되는 중첩 핵산을 표적으로 하는 올리고뉴클레오티드를 포함하는 새로운 복수의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드가 이용되며, 동일한 핵산을 표적으로 하는 올리고뉴클레오티드의 검출가능한 모이어티 표지화에서의 적어도 하나의 차이로 인해, 각각의 이용된 복수의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드가 각각의 다른 이용된 복수의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드와 상이한 단계를 포함하는, 방법.
  21. (a) 복수의 전사물 및 DNA 유전자좌를 포함하는 세포와, 각각이 전사물 또는 DNA 유전자좌를 표적으로 하고 검출가능한 모이어티로 표지되는 제 1의 복수의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드를 접촉시키는 것을 포함하는 제 1 접촉 단계를 수행하는 단계로서, 조성물이 적어도,
    (i) 제 1 전사물 또는 DNA 유전자좌를 표적으로 하고, 제 1의 검출가능한 모이어티로 표지되는 제 1 올리고뉴클레오티드; 및
    (ii) 제 2 전사물 또는 DNA 유전자좌를 표적으로 하고, 제 2의 검출가능한 모이어티로 표지되는 제 2 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 단계;
    (b) 제 1의 복수의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드와 이들의 표적의 하이브리드화가 검출되도록 제 1 접촉 단계 후에 세포를 영상화시키는 단계;
    (c) 세포와 제 2의 복수의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드를 접촉시키는 것을 포함하는 제 2 접촉 단계를 수행하는 단계로서, 상기 제 2의 복수의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드가 제 1의 복수의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드에 의해 표적화되는 중첩 전사물 및/또는 DNA 유전자좌를 표적으로 하는 올리고뉴클레오티드를 포함하고, 상기 제 2의 복수의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드가 적어도,
    (i) 임의로 제 1 올리고뉴클레오티드와 서열에 있어서 동일하고, 제 1 전사물 또는 DNA 유전자좌를 표적으로 하는 제 3 올리고뉴클레오티드; 및
    (ii) 임의로 제 2 올리고뉴클레오티드와 서열에 있어서 동일하고, 제 2 전사물 또는 DNA 유전자좌를 표적으로 하는 제 4 올리고뉴클레오티드를 포함하고,
    상기 제 2의 복수의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드에 존재하는 올리고뉴클레오티드 중 적어도 하나가 상기 제 1의 복수의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드에서의 동일한 전사물 또는 DNA 유전자좌를 표적으로 하는 상응하는 올리고뉴클레오티드와 상이한 검출가능한 모이어티로 표지되는 점에 있어서, 상기 제 2의 복수의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드가 상기 제 1의 복수의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드와 상이하고, 이에 따라 상기 제 2의 복수의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드에서,
    (iii) 제 3 올리고뉴클레오티드는 제 1의 검출가능한 모이어티, 제 2의 검출가능한 모이어티 또는 제 3의 검출가능한 모이어티로 표지되고;
    (iv) 제 4 올리고뉴클레오티드는 제 1의 검출가능한 모이어티, 제 2의 검출가능한 모이어티, 제 3의 검출가능한 모이어티, 또는 제 4의 검출가능한 모이어티로 표지되고,
    상기 제 3 올리고뉴클레오티드가 제 1 올리고뉴클레오티드와 상이한 검출가능한 모이어티로 표지되거나, 상기 제 4 올리고뉴클레오티드가 제 2 올리고뉴클레오티드와 상이한 검출가능한 모이어티로 표지되거나, 둘 모두인, 단계;
    (d) 제 2의 복수의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드와 이들의 표적의 하이브리드화가 검출되도록 제 2 접촉 단계 후에 세포를 영상화시키는 단계; 및
    (e) 임의로 상기 접촉 및 영상화 단계를 반복하는 단계로서, 각각의 회에서 제 1 및 제 2의 복수의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드에 의해 표적화되는 중첩 전사물 또는 DNA 유전자좌를 표적으로 하는 올리고뉴클레오티드를 포함하는 새로운 복수의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드가 이용되며, 동일한 전사물 또는 DNA 유전자좌를 표적으로 하는 올리고뉴클레오티드의 검출가능한 모이어티 표지화에서의 적어도 하나의 차이로 인해, 각각의 이용된 복수의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드가 각각의 다른 이용된 복수의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드와 상이한 단계를 포함하는, 방법.
  22. 제 20항 또는 제 21항에 있어서, 각각의 복수의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드가 F개의 검출가능한 모이어티를 포함하고, F가 적어도 2인 방법.
  23. 제 20항 내지 제 22항 중 어느 한 항에 있어서, N회의 접촉 단계를 포함하고, N이 적어도 2인 방법.
  24. 제 20항 내지 제 23항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 복수의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드가 (F)N개의 전사물 및/또는 DNA 유전자좌를 표적으로 하는 방법.
  25. 제 20항 내지 제 23항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 복수의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드가 (F)N개 미만의 전사물 및/또는 DNA 유전자좌를 표적으로 하는 방법.
  26. 제 20항 내지 제 25항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 복수의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드가 동일한 전사물 및/또는 DNA 유전자좌를 표적으로 하는 방법.
  27. 제 20항 내지 제 26항 중 어느 한 항에 있어서, 영상화 단계 후에 복수의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드를 제거하는 단계를 임의로 포함하는 방법.
  28. 제 20항 내지 제 27항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 영상화 단계 후에 복수의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드를 제거하는 단계를 포함하는 방법.
  29. 제 28항에 있어서, 제거 단계가 복수의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드와 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드를 분해하는 효소를 접촉시키는 것을 포함하는 방법.
  30. 제 29항에 있어서, 제거 단계가 복수의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드와 DNase를 접촉시키는 것을 포함하는 방법.
  31. 제 29항에 있어서, 제거 단계가 복수의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드와 RNase를 접촉시키는 것을 포함하는 방법.
  32. 제 20항 내지 제 31항 중 어느 한 항에 있어서, 제거 단계가 광표백(photobleaching)을 포함하는 방법.
  33. 제 20항 내지 제 32항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 복수의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드가 동일한 전사물 또는 DNA 유전자좌를 표적으로 하는 2개 이상의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 방법.
  34. 제 33항에 있어서, 동일한 전사물 또는 DNA 유전자좌를 표적으로 하는 모든 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드가 동일한 색을 제공하는 형광단으로 표지되는 방법.
  35. 제 33항에 있어서, 동일한 전사물 또는 DNA 유전자좌를 표적으로 하는 모든 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드가 동일한 형광단으로 표지되는 방법.
  36. 제 20항 내지 제 35항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 복수의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드가 다른 복수의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드와 상이한 방법.
  37. 제 20항 내지 제 36항 중 어느 한 항에 있어서, 제 3 올리고뉴클레오티드가 제 1 올리고뉴클레오티드와 상이한 검출가능한 모이어티로 표지되고, 제 4 올리고뉴클레오티드가 제 2 올리고뉴클레오티드와 동일한 검출가능한 모이어티로 표지되거나; 제 3 올리고뉴클레오티드가 제 1 올리고뉴클레오티드와 동일한 검출가능한 모이어티로 표지되고, 제 4 올리고뉴클레오티드가 제 2 올리고뉴클레오티드와 상이한 검출가능한 모이어티로 표지되는 방법.
  38. 제 20항 내지 제 36항 중 어느 한 항에 있어서, 제 3 올리고뉴클레오티드가 제 1 올리고뉴클레오티드와 상이한 검출가능한 모이어티로 표지되고, 제 4 올리고뉴클레오티드가 제 2 올리고뉴클레오티드와 상이한 검출가능한 모이어티로 표지되는 방법.
  39. 제 20항 내지 제 38항 중 어느 한 항에 있어서, 영상화 단계가 복수의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드와 이들의 표적의 하이브리드화가 정량되도록 접촉 단계 후에 세포를 영상화시키는 것을 포함하는 방법.
  40. 제 20항 내지 제 39항 중 어느 한 항에 있어서, HCR, 광시트 현미경검사(light sheet microscopy), CLARITY, 또는 이들의 조합을 추가로 포함하는 방법.
  41. 제 1항 내지 제 40항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 복수의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드의 표적이 미리 결정되는 조성물, 키트 또는 방법.
  42. 제 1항 내지 제 41항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드의 양이 미리 결정되는 조성물, 키트 또는 방법.
  43. 제 1항 내지 제 42항 중 어느 한 항에 있어서, 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드가 표적에 하이브리드화된 중간체 올리고뉴클레오티드에 하이브리드화되는 조성물, 키트 또는 방법.
  44. 제 43항에 있어서, 중간체 올리고뉴클레오티드가 표적의 서열에 상보적인 서열, 및 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드에 상보적인 오버행 서열을 포함하는 조성물, 키트 또는 방법.
  45. 제 1항 내지 제 44항 중 어느 한 항에 있어서, 표적에 하이브리드화된 2개 이상의 중간체 올리고뉴클레오티드가 존재하는 조성물, 키트 또는 방법.
  46. 제 45항에 있어서, 각각의 중간체 올리고뉴클레오티드가 동일한 오버행 서열을 포함하는 표적에 하이브리드화되는 조성물.
  47. 제 1항 내지 제 46항 중 어느 한 항에 있어서, 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드가 5'-인산화를 포함하는 조성물, 키트 또는 방법.
  48. 제 1항 내지 제 47항 중 어느 한 항에 있어서, 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드가 하나 이상의 우라실을 포함하는 조성물, 키트 또는 방법.
  49. 제 43항 내지 제 46항 중 어느 한 항에 있어서, 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드가 중간체 올리고뉴클레오티드에 대한 하이브리드화 후에 리세스드(recessed) 3'-말단을 갖는 조성물, 키트 또는 방법.
  50. 제 20항 내지 제 49항 중 어느 한 항에 있어서,
    (f) 복수의 핵산을 포함하는 세포와 복수의 중간체 올리고뉴클레오티드를 접촉시키는 것을 포함하는 접촉 단계를 수행하는 단계로서, 상기 복수의 중간체 올리고뉴클레오티드 각각이 (i) 핵산을 표적으로 하고, 검출가능한 모이어티로 임의로 표지되고; (ii) 표적과의 하이브리드화 후에 오버행 서열을 포함하는, 단계; 및
    (g) 임의로, 중간체 올리고뉴클레오티드와 이들의 표적 사이의 상호작용이 검출되도록 세포를 영상화시키는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  51. 제 50항에 있어서, 중간체 올리고뉴클레오티드가 검출가능한 모이어티로 표지되지 않는 방법.
  52. 제 50항에 있어서, 단계 (g)가 없는 방법.
  53. 제 50항에 있어서, 단계 (f) 및 임의로 단계 (g)가 단계 (a) 전에 수행되는 방법.
  54. 제 20항 내지 제 53항 중 어느 한 항에 있어서, 제거 단계가 중간체 올리고뉴클레오티드를 파괴하지 않는 방법.
  55. 제 50항 내지 제 54항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산이 전사물 또는 DNA 유전자좌인 방법.
  56. 제 20항 내지 제 55항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 인간 세포인 방법.
  57. 제 20항 내지 제 56항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 조직 또는 기관 내에 존재하는 방법.
  58. 제 1항 내지 제 57항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드가 HCR에 의해 표지되는 조성물, 키트 또는 방법.
  59. 제 1항 내지 제 58항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드가 전사물 또는 DNA 유전자좌와 하이브리드화되는 중간체 올리고뉴클레오티드와 하이브리드화되는 조성물, 키트 또는 방법.
  60. 제 1항 내지 제 59항 중 어느 한 항에 있어서, 엑소뉴클레아제 III, 람다 엑소뉴클레아제 또는 우라실-특이적 절제 시약의 사용을 포함하는 제거 단계를 포함하는 방법.
  61. 샘플이 광시트 현미경의 측면으로부터 조명되는 광시트 현미경.
  62. 제 61항에 있어서, 샘플이 광시트 현미경의 측면으로부터 조명되고, 광시트가 샘플 스테이지와 평행한 현미경.
  63. 제 61항 또는 제 62항에 있어서, 광시트가 검출 대상과 수직으로 존재하는 현미경.
  64. 제 61항 내지 제 63항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플이 z-축을 따라 스캐닝되는 현미경.
  65. 1) 제 1 서열을 포함하는 제 1 핵산을 제공하는 단계로서, 상기 제 1 서열이 양 말단에서 니킹 엔도뉴클레아제 부위와 측면을 접한, 단계;
    2) 제 1 서열 및 측면을 접한 니킹 엔도뉴클레아제 부위를 포함하는 제 2 핵산을 제공하기 위해 제 1 핵산 또는 제 1 핵산의 일부를 증폭시키는 단계; 및
    3) 제 2 핵산과 측면을 접한 니킹 엔도뉴클레아제 부위에 상응하는 하나 이상의 니킹 엔도뉴클레아제를 접촉시키는 단계를 포함하는, 제 1 서열을 포함하는 표적 핵산을 제조하기 위한 방법.
  66. 제 65항에 있어서, 2개의 측면을 접한 니킹 엔도뉴클레아제 부위가 동일한 방법.
  67. 제 66항에 있어서, 동일한 니킹 엔도뉴클레아제 부위에 상응하는 하나의 니킹 엔도뉴클레아제가 사용되는 방법.
  68. 제 65항에 있어서, 2개의 측면을 접한 니킹 엔도뉴클레아제 부위가 상이한 방법.
  69. 제 68항에 있어서, 각각이 니킹 엔도뉴클레아제 부위와 독립적으로 상응하는 2개의 니킹 엔도뉴클레아제가 사용되는 방법.
  70. 제 65항 내지 제 69항 중 어느 한 항에 있어서, 이중-가닥 핵산이 단일 가닥 핵산으로 전환되는 변성 단계를 포함하는 방법.
  71. 1) 제 1 서열 또는 이의 상보적 서열을 포함하는 제 1 핵산을 제공하는 단계로서, 상기 제 1 서열 또는 이의 상보적 서열이 적어도 하나의 제한 부위와 측면을 접한, 단계;
    2) 제 1 서열 및 적어도 하나의 측면을 접한 제한 부위를 포함하는 제 2 핵산을 제공하기 위해 제 1 핵산 또는 제 1 핵산의 일부를 증폭시키는 단계;
    3) 리세스드 말단을 포함하는 제 3 핵산을 제공하기 위해 제 2 핵산과 적어도 하나의 측면을 접한 제한 부위에 상응하는 제한 효소를 접촉시키는 단계; 및
    4) 제 1 서열을 포함하는 가닥을 유지시키면서, 존재시, 상보적 서열을 포함하는 가닥을 선택적으로 분해시키기 위해 제 3 핵산과 뉴클레아제를 접촉시키는 단계를 포함하는, 제 1 서열을 포함하는 표적 핵산을 제조하기 위한 방법.
  72. 제 71항에 있어서, 제 1 서열 또는 이의 상보적 서열이 독립적으로 양 말단에서 제한 부위와 측면을 접한 방법.
  73. 제 71항 또는 제 72항에 있어서, 제 2 핵산이 적어도 하나의 측면을 접한 제한 부위 각각에 상응하는 제한 효소와 접촉되는 방법.
  74. 제 71항 내지 제 73항 중 어느 한 항에 있어서, 상보적 서열을 포함하는 가닥이 제한 분해 후에 3' 리세스드 말단을 갖는 방법.
  75. 제 71항 내지 제 74항 중 어느 한 항에 있어서, 제 1 서열을 포함하는 가닥이 제한 분해 후에 5' 리세스드 말단을 갖는 방법.
  76. 제 71항 내지 제 75항 중 어느 한 항에 있어서, 뉴클레아제가 엑소뉴클레아제 III인 방법.
  77. 제 65항 내지 제 76항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 핵산이 DNA인 방법.
  78. 제 65항 내지 제 77항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 핵산이 제 1 서열과 동일한 서열을 갖는 방법.
  79. 제 65항 내지 제 78항 중 어느 한 항에 있어서, 제 2 및/또는 제 3 핵산이 후속 접촉 단계 전에 임의로 및 독립적으로 변형되는 방법.
  80. 제 65항 내지 제 79항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 핵산이 표적에 하이브리드화되는 제 1 서열, 및 HCR에 의해 표지된 검출 가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드와 하이브리드화되는 제 2 서열을 포함하는 중간체 올리고뉴클레오티드인 방법.
  81. 제 65항 내지 제 79항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 핵산이 브릿지 프로브인 방법.
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