CN114686571A

CN114686571A - 一种多轮、多色荧光原位杂交鉴定微生物的方法

Info

Publication number: CN114686571A
Application number: CN202011640856.7A
Authority: CN
Inventors: 戴磊; 曹朝辉; 左文龙
Original assignee: Shenzhen Institute of Advanced Technology of CAS
Current assignee: Shenzhen Institute of Advanced Technology of CAS
Priority date: 2020-12-31
Filing date: 2020-12-31
Publication date: 2022-07-01
Anticipated expiration: 2040-12-31
Also published as: CN114686571B

Abstract

本发明提供了一种多轮、多色荧光原位杂交鉴定微生物的方法，该方法包括：采用带有荧光分子标记的多种探针对待测样本进行第一轮次荧光原位杂交；对杂交后的样本进行荧光成像；对已经杂交上的探针分子进行解离；对解离后的样本进行第二轮次或更多轮次的杂交并荧光成像，形成多轮次的荧光成像；其中前一轮次的已经杂交的rRNA分子与探针分子进行解离后再进行下一轮次杂交；根据多轮次荧光成像情况鉴定微生物。本发明的方法，通过多轮、多色的荧光原位杂交，同时结合高容错的编码方案，可以同时对一个样本中所有微生物物种进行空间定位，可用于解析不同样本所包含的复杂微生物群落在微米尺度上的物种组成和空间结构。

Description

一种多轮、多色荧光原位杂交鉴定微生物的方法

技术领域

本发明属于微生物鉴定技术领域，具体而言是关于一种利用多轮、多色荧光原位杂交来鉴定微生物的方法。

背景技术

荧光原位杂交(Fluorescence in situ hybridization，FISH)是一种基于碱基互补配对原则使用荧光标记的核酸探针靶向细胞内特定核酸序列的染色技术。在微生物检测方面，基于所设计探针的特异性，荧光标记的18-25碱基长度的寡核苷酸探针靶向到目标细菌的核糖体RNA，可以实现从种到门不同水平的微生物鉴定。无需进行细胞培养，荧光原位杂交技术不仅能对混合菌群中的特定微生物进行鉴定，还可以提供菌群的形态和空间位置信息。

然而在实际的荧光成像中，由于有机荧光染料间存在激发串扰和发射渗漏，可以同时使用的荧光团数量有限。因此，常规的荧光原位杂交实验只能一次鉴定一种或几种类型的微生物。Gary G.Borisy等人提出了一种组合标记和光谱成像的方法(CLASI-FISH)，对每一种细菌的特异性探针进行两种不同颜色的荧光分子修饰，然后同时使用两种荧光分子标记的探针靶向细菌(Proc.Natl.Acad.Sci.108,4152–4157(2011))。选用8种荧光分子进行荧光分子的两两组合，则可获得28种不同荧光分子的组合，从而实现对28种不同细菌的标记。之后通过线性分离算法对图像中的荧光信号进行分析处理，获取该细菌成像中荧光发射信号最强的两种荧光分子进而判定该细菌种类，从而实现28种细菌的同时成像。

然而，由于荧光染料间存在的激发串扰和发射渗漏，组合标记和光谱成像的方法可以同时使用的荧光分子数目仍然有限(10个左右)，因而对同一个样本的一个选定区域，可以同时成像的微生物物种数量有限(几十种)，可拓展性不高。并且随着选用的荧光分子数目的增加，对显微镜的配置要求也会越来越高，需要更多的激光器(比如6-7个激光)，而常规的显微镜通常是配备4个激光器。此外，随着可同时成像微生物物种数量的增加，针对每种不同微生物设计出高度特异性探针的困难也随之加大。由于探针是靶向到核糖体序列，对于一些亲缘关系相近的微生物物种，其核糖体序列相似度较高，会限制可同时成像的微生物种类数量。进一步地，该方法难以运用到组织中细菌的原位成像。由于组织样本中邻近的细菌经常重叠，因而在进行光谱分离时难以准确判定该细菌的两种荧光分子组合，从而无法鉴定细菌类别。因此，对于组织样本中多细菌(当细菌种数大于十种时)进行空间结构成像分析时，只能分批对不同样本中的不同细菌进行标记，无法实现同一样本多细菌的同时成像。

发明内容

本发明的一个目的在于提供一种鉴定微生物的新方法，以准确提高同一样本同一区域可同时成像的不同种微生物的物种数量。

为达上述目的，本发明提供了一种多轮、多色荧光原位杂交鉴定微生物的方法，该方法包括：

第一轮次杂交：采用带有荧光分子标记的多种探针对待测样本进行第一轮次荧光原位杂交；

成像：对杂交后的样本进行荧光成像；

解离：对已经杂交上的探针分子进行解离；

第二轮次以上的重复杂交及成像：对解离后的样本进行第二轮次或更多轮次的杂交并荧光成像，形成多轮次的荧光成像；其中前一轮次的已经杂交的探针分子进行解离后再进行下一轮次杂交；

根据多轮次荧光成像情况鉴定微生物；

其中，每轮次的杂交过程均采用带有荧光分子标记的多种探针；每一轮次中，所述多种探针特异性靶向两种以上的微生物，多种探针带有的荧光分子标记包括两种以上；多轮次中每种探针所带有的荧光分子标记至少两种。

根据本发明的具体实施方案，本发明的多轮、多色荧光原位杂交鉴定微生物的方法中，每轮次的杂交过程均采用带有荧光分子标记的M种探针；共形成N轮次的荧光成像；各轮次的多种探针带有的荧光分子标记共包括A种。其中，M为大于2的正整数，N为大于2的正整数，A为大于等于2的正整数。

在本发明的一些优选实施方案中，M为选自3～200的正整数，N为选自4～50的正整数，A为选自3～5的正整数。

在本发明的一些优选实施方案中，各轮次的多种探针带有的荧光分子标记包括FAM、Cy3和Cy5。

根据本发明的具体实施方案，本发明的多轮、多色荧光原位杂交鉴定微生物的方法中，杂交过程包括将待测样本与工作液接触静置孵育的过程，其中所述工作液为含有所述带有荧光分子标记的多种探针的杂交液。

在本发明的一些优选实施方案中，杂交液含有NaCl(氯化钠)、Tris-HCl(三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液)、SDS(十二烷基硫酸钠)和甲酰胺。

根据本发明的具体实施方案，本发明的多轮、多色荧光原位杂交鉴定微生物的方法中，每轮次杂交后采用洗脱液洗去非特异性杂交，之后再进行荧光成像；

在本发明的一些优选实施方案中，所述洗脱液中含有NaCl、Tris-HCl和EDTA(乙二胺四乙酸)。

根据本发明的具体实施方案，本发明的多轮、多色荧光原位杂交鉴定微生物的方法中，解离过程包括将杂交后的待测样本与解离液接触静置孵育以将已经杂交到微生物上的探针分子从微生物上解离的过程。

在本发明的一些优选实施方案中，解离液中含有甲酰胺、Tris-HCl和EDTA。

在本发明的一些更优选实施方案中，杂交液中，甲酰胺的体积浓度为20％-50％。杂交液中的NaCl、Tris-HCl、SDS的浓度可适量添加，通常情况下，NaCl浓度为0.8～1.2mol/L，Tris-HCl浓度为0.01～0.03mol/L，SDS浓度为0.005～0.02％。

在本发明的一些更优选实施方案中，洗脱液中，NaCl浓度为0.018 0.215mol/L，具体可根据杂交液中甲酰胺浓度进行调整。优选地，洗脱液中的Tris-HCl的浓度为0.01～0.03mol/L，EDTA浓度为0～0.01mol/L。

在本发明的一些更优选实施方案中，解离液中，甲酰胺的体积浓度为60-100％。优选地，解离液中Tris-HCl浓度为0.01～0.03mol/L，EDTA浓度为0.005～0.01mol/L。

在本发明的一些更优选实施方案中，杂交、洗脱、解离的温度可在室温进行，优选地，杂交温度42-50℃，洗脱温度也可以为42-50℃，解离温度也可以为42-50℃。更优选地，洗脱温度、解离温度不低于杂交温度。

在本发明的一些优选实施方案中，解离后对样本进行显微成像以验证解离效果。

根据本发明的具体实施方案，本发明的多轮、多色荧光原位杂交鉴定微生物的方法中，所述微生物可包括细菌、真菌、古菌中的一种或多种。

根据本发明的具体实施方案，本发明的多轮、多色荧光原位杂交鉴定微生物的方法中，所述探针可以为靶向预定微生物的转录产物或DNA基因座的探针(例如，可以是微生物的rRNA、mRNA或其组合)。

微生物核糖体rRNA之间的序列相似性更高。16S rRNA作为细菌系统分类研究中最常用的分子钟，既含有高度保守的序列区域，又有中度保守和高度变化的序列区域。通过序列比对人们将16S rRNA划分为保守区和可变区，在约1540bp的16S核糖体RNA中，所有可变区范围加起来也只有550bp左右。相近种属之间的微生物在16S上往往只有几个碱基的差异。因而，当对样本中多种微生物进行更细致的同时标记(譬如属或种水平)时，随着同时成像微生物物种数量的增加，针对每种不同微生物设计出高度特异性探针的困难也随之加大。非特异性杂交会出现，从而出现难以鉴定和假阳性的问题。当同时标记的微生物种类大大增加时，非特异性杂交的影响会导致很多微生物的误判。

根据本发明的具体实施方案，本发明的多轮、多色荧光原位杂交鉴定微生物的方法中，每种探针在各轮次中所带有的荧光分子按照轮次顺序形成对应该探针的荧光编码，两种探针在同一轮次中的荧光分子不同定义为1个距离，多种探针的荧光编码两两之间具有至少3个、优选至少4个距离。本发明的方法具有高容错性能，对于非特异性引起的识别率和准确鉴定率低的问题，与一轮杂交相比，多轮编码纠错的方法大大提高了菌株鉴定的准确率。具体而言，在本发明的一些具体实施方案中，确定了在多轮荧光原位杂交实验中每种微生物每轮所应使用的荧光探针的颜色。对于每种微生物，其在N轮荧光杂交使用中所使用的颜色构成了一个长度为N的编码，不同微生物的编码之间的距离(Hamming Distance，汉明距离)可设定为大于等于4。对于使用C种颜色N轮的编码方案，可以先生成所有C种颜色长度为N的编码共C^N个，再依次从中筛选出两两距离均大于等于4的一组编码。使用C种颜色N轮的编码方案不是唯一的。

根据本发明的具体实施方案，本发明的多轮、多色荧光原位杂交鉴定微生物的方法中，进一步优选地，所述探针满足与靶向微生物的ΔG小于-13.0kcal/mol并与非靶向微生物拥有至少三个中间错配碱基。根据本发明的更优选实施方案，所述探针满足与非靶向微生物的ΔG大于-7.3kcal/mol。

根据本发明的具体实施方案，本发明的多轮、多色荧光原位杂交鉴定微生物的方法中，还可包括：在进行多轮杂交前，根据探针的ΔG与荧光强度的分布关系，确定荧光编码方案。具体地，可以计算探针的ΔG并经模拟评估不同编码方案下使用该组探针的菌群鉴定情况，从而选取更合适的编码方案或更合适的探针组合。

在本发明的一些优选实施方案中，每种探针的荧光分子标记在探针的5’或3’末端。

根据本发明的具体实施方案，本发明的多轮、多色荧光原位杂交鉴定微生物的方法中，所述待测样本可以来自人体、动物、植物和/或环境。如前述所提及的，所述微生物可包括细菌、真菌、古菌中的一种或多种。本发明的多轮、多色荧光原位杂交鉴定微生物的方法具体可以应用于检测样本中所包含的微生物群落在微米尺度上的物种组成和/或空间结构。

根据本发明的具体实施方案，本发明的多轮、多色荧光原位杂交鉴定微生物的方法中，根据多轮次荧光成像情况鉴定微生物时，可以采用现有技术中任何可行的方式进行解析，确定图像中对应样品本中特定位置的微生物杂交上的荧光分子。优选地，本发明中可通过图像处理进行对齐、分割，从而得到待测样本中目标微生物对应的空间位置，并从多轮次图像中获得目标微生物杂交的荧光分子标记顺序，将该荧光分子标记顺序与多轮次杂交过程中每种探针在各轮次中所带有的荧光分子的轮次顺序进行比较，鉴定目标微生物种类。在本发明的一些具体实施方案中，由于不同种类的目标微生物之间的编码具有大于等于4的距离，即至少有四轮应该为不一样的荧光分子标记(或对应的颜色)，因此该方法在解码中具有极高的容错性。

根据本发明的具体实施方案，本发明的多轮、多色荧光原位杂交鉴定微生物的方法，其是应用于检测样本中所包含的复杂微生物群落在微米尺度上的物种组成和/或空间结构。

在本发明的一些具体实施方案中，本发明的多轮、多色荧光原位杂交鉴定微生物的方法，是将待测样本固定在粘附玻片上，并随后组装到流体腔室中，该腔室可承纳一定量的液体，并在两端有液体出入口可保证液体进出。之后按照以下操作进行：

(1)杂交：探针工作液中包括探针和杂交液，探针工作液流经腔室并与样本静置孵育完成杂交。

(2)洗脱：洗脱液流经腔室，清洗样本洗去非特异性杂交。

(3)成像：样本在荧光显微镜下成像(包括但不限于激光共聚焦显微镜，转盘共聚焦显微镜，宽场荧光显微镜，超分辨显微镜等可用于荧光原位杂交成像的显微镜)。

(4)解离：对已经特异性杂交上的探针分子进行解离。解离液流经腔室，并与样本静置孵育完成探针解离。

(5)解离验证：保持之前的拍摄参数不变，对样本进行显微成像以验证解离效果。

(6)重杂交：解离后的微生物rRNA分子又恢复为单链，可在之前的同样位置进行探针杂交。不同荧光分子标记的组合探针工作液流经腔室，重复(1)-(5)。该步骤可进行N次重复。

本发明的多轮、多色荧光原位杂交鉴定微生物的方法，可以根据现有的显微镜配置可以选择A种荧光分子进行标记(例如A＝3，利用FAM、Cy3和Cy5三种荧光分子)，通过增加杂交轮数N使得可成像的微生物数目(A的N次方)大大增加。与已报道的使用DNA酶1或者通过氧化还原反应进行荧光分子的清除相比，本发明中使用的解离方法更加快速且经济。利用本发明的多轮成像方法，每一轮杂交只需约20分钟，至少可以进行26轮以上的多轮杂交，而且具有很高的扩展性。此外，通过可纠错的多色编码设计，在探针存在非特异性杂交的情况下，仍然可以保证微生物鉴定的高准确率，因此可以同时成像亲缘关系相近的微生物物种。本发明的技术可以运用到组织样本中的微生物成像，从而真正地实现多微生物的同时成像和空间结构分析。

综上所述，本发明提供的多轮、多色荧光原位杂交鉴定微生物的方法，大大提高了同一样本同一区域可同时成像的不同种微生物的物种数量，可以达到对微生物的高效、快速、准确成像，扩展了目前可同时成像的微生物种数并保证了正确率，从而实现了对多种微生物的空间分布分析。本发明的技术可拓展性更高，适用于解析更复杂的微生物群落。

附图说明

图1为本发明的多轮荧光原位杂交成像的实验流程示意图。

图2显示本发明中基于3色(红、黄、绿)、8轮荧光原位杂交成像的可容错编码方案。每一列对应一种微生物的颜色编码，不同列的颜色编码之间至少有4位差异，共计60种编码。该编码方案不唯一。

图3A和图3B显示本发明一具体实施例中10种细菌在26轮的荧光原位杂交中每一轮的杂交和解离图像以及对应的荧光强度定量分析。

图4A显示本发明一具体实施例中实验测量得到的该12种探针与12种菌杂交的荧光强度矩阵。图4B为由探针-荧光强度矩阵和探针-ΔG矩阵得到的ΔG与荧光强度的分布关系。图4C为拟合得到的三种不同的杂交情况对应的荧光分布。

图5A显示本发明一具体实施例中基于ΔG模拟对12种细菌使用三色不同轮次不同距离的编码方案的F1 score。图5B和图5C显示采用3色8轮HD4的编码方案(蓝色)和一轮杂交(灰色)对每种菌的识别率的模拟结果。

图6A为12种菌采用8轮HD4的编码方案进行多轮杂交后每种菌的鉴定图像。图6B和图6C显示使用该编码方案对每种菌的识别率的实验结果。

图7A为本发明一具体实施例中12种混菌的合成菌群经8轮编码的荧光原位杂交后的解码荧光图像。图7B显示了经8轮杂交后两种编码方案对12种细菌的总识别率。图7C和图7D分别显示了在实验和模拟中得到的两组编码方案在多轮杂交实验中对每种菌的识别情况。

图8A显示本发明一具体实施例中对30种细菌的合成菌群进行两种不同的编码方案(R8-HD4和R12-HD6)的原位杂交后的解码图像。图8B显示两种编码方案识别得到的每种菌的相对丰度。图8C显示两种不同的编码对30种细菌的总鉴定比例。

图9中的图片A为本发明一具体实施例中拟南芥接菌实验示意图。图9中的图片B为定植在拟南芥根部的合成菌群使用通用探针EUB338-Cy5标记和8轮编码杂交后的荧光图像。图9中的图片C显示根据图像分析统计不同位置根的菌群组成及相对丰度。

图10显示本发明一具体实施例中不同解离条件下解离效果的比较。

具体实施方式

下面将结合本发明具体实施方案、实施例及附图，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的具体实施方案、及实施例仅仅是本发明的一部分，而不是全部。且下述实施方案、实施例中所涉及的仪器、试剂、材料等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规仪器、试剂、材料等，可通过正规商业途径获得；所涉及的实验方法、检测方法等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规实验方法、检测方法等。

在本发明的一具体实施方案中，是对待测样品中的细菌进行鉴定。具体鉴定方法包括：

1、特异性探针的设计

通过测序或者从数据库中下载所需成像的所有细菌的16S rRNA(或23rRNA)全长序列。然后，将rRNA序列导入到已经安装的ARB软件中，建立本地的数据库PT-Server。基于ARB软件的“Probe Design”功能，选择本地数据库中的靶向菌(可以是一种，也可以是多种)，根据已经建立的本地数据库，设置一系列筛选参数，获得满足条件的探针。为保证所设计探针的特异性，可使用ARB软件的“Probe Match”功能，查看探针与其它未选中的非靶向菌的错配碱基数目和位置，对所设计出的探针进行进一步筛查。通常，错配碱基数越多越好，同样数目的错配碱基的探针，其位置位于探针中间优于探针两端。选择与非靶向菌拥有至少三个中间错配碱基的探针。之后，根据mathFISH软件进行杂交反应中探针与样本中所有细菌rRNA总的吉布斯自由能变化(ΔG)和杂交效率的计算。一般来说，ΔG越低，探针与rRNA分子形成的杂交就会越稳定，杂交效率越高。根据ΔG与荧光强度的关系，选择满足ΔG小于-13.0kcal/mol的靶向探针会拥有较高的杂交效率。对于已满足该条件的探针，尽可能挑选与其它所有非靶向细菌的ΔG值较高的探针，使其非特异性杂交效率越低越好。根据实验中观测得到的ΔG、杂交效率与荧光强度的关系，探针与非靶向菌的非特异性杂交的ΔG大于-7.3kcal/mol最优。

针对每一种菌的特异性探针依次进行如上设计。如果基于16S rRNA数据库不能得到满足条件的探针，那么可以选择基于23S rRNA数据库设计探针，方法等同于16S rRNA。之后对每种探针分别进行5’或3’末端的荧光分子修饰，选择n种不同的荧光分子，则每种探针序列可拥有n种不同的荧光分子修饰。

2、多轮杂交成像实验流程(参见图1)

经固定处理的多种微生物混合悬液涂布在直径为40mm的粘附玻片上，室温风干，随后组装到Bioptech’s FCS2的流动腔室中。腔室与大多数显微镜兼容，一端连接进液管，一端连接出液管。液体通过蠕动泵被抽进腔室。同时，Bioptech’s FCS2配有温控装置，可以调节腔室温度。

(1)杂交：探针工作液中包括探针和杂交液。促进荧光原位杂交的杂交液，包括适量的NaCl(氯化钠)，pH＝7.6的Tris-HCl(三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液)，SDS(十二烷基硫酸钠)和20％-50％体积浓度的甲酰胺，其余为去离子水。其中，甲酰胺有利于RNA变性，加快反应速率并降低探针与目标的退火温度，避免温度过高破坏细胞结构。此外，甲酰胺还可以提高杂交的严格度，减少非特异性杂交。NaCl中的钠离子可以与核酸中的磷酸基团形成离子键，从而减少了双链核酸分子中的静电斥力，增加溶液中NaCl的浓度，可以提高杂交的稳定性。将针对X种微生物的X种特异性探针(探针的颜色组合依据编码方案)依次稀释到杂交液中制备探针工作液，探针工作液流经腔室并与样本静置孵育完成杂交。

(2)洗脱：洗去非特异性的杂交。洗脱液包括0.018-0.215mol/L的NaCl,适量的pH＝7.6的Tris-HCl，还包括适量的EDTA(乙二胺四乙酸)，其余为去离子水。通过适度降低溶液中NaCl的浓度，使得有错配碱基的探针-rRNA分子的非特异性杂交稳定性降低。洗脱液流经腔室清洗样本。

(3)显微成像：杂交后的微生物在荧光显微镜下成像，得到各个荧光通道和明场的依次扫描图像。

(4)解离：对杂交上的探针分子进行解离。解离液包括60％-100％体积浓度的甲酰胺，0.01～0.03mol/L的Tris-HCl和0.005～0.01mol/L的EDTA，其余为去离子水。EDTA可以鳌合溶液中自由的二价阳离子，从而不利于探针-rRNA分子双链的稳定。通过提高甲酰胺的浓度，降低盐浓度，减少体系中游离的阳离子，使得形成的探针-rRNA分子双键不稳定而解离，得到单链的rRNA分子。配好的解离液流经腔室并与样本静置孵育完成探针解离。在不大幅度提高温度的情况下，使得探针可以与rRNA分子快速分离(2-5min)。

(5)显微成像：保持之前的拍摄参数不变，对样本进行荧光显微成像以验证解离效果。

(6)重杂交：解离后的rRNA分子恢复为单链，再次加入同样序列的探针可继续与之杂交。不同荧光分子组合标记的探针工作液(探针的颜色组合依据编码方案)流经腔室，重复(1)-(5)。对该步骤进行N次重复，可得到微生物荧光原位杂交的N张荧光图像。

本方案中步骤1杂交所使用的针对目标微生物的探针序列可以根据上述探针设计方案获得，每轮杂交所使用的荧光探针的颜色可以根据下述多轮编码方案中对应目标微生物在对应轮次的编码颜色确定。

3、可纠错的编码方案(图2)

本发明所使用的编码的长度根据使用的荧光探针的颜色种类数目和目标微生物的种类数目决定。例如，包含3种颜色，长度为8的编码可以用于解析群落中至少60种不同的微生物。编码可以但不限于由如下方案生成：

(1)生成包含C种颜色长度为N的所有C^N种编码

(2)从n＝1开始，依次去掉所列编码中除第n个编码外其他与第n个编码距离小于4的编码，直到所列编码中所有编码之间的距离均大于等于4。

图像分析、解码(包括颜色识别、纠错)

根据每一轮荧光原位杂交拍摄得到的图像中的明场图像，利用寻找图像互相关最大值的位置进行多轮图像的对齐，并根据对齐的图像利用阈值和分水岭算法相结合的方法进行图像分割从而得到分离的目标微生物在图像中的位置。根据分割好的图像得到对应目标在每一轮不同荧光颜色通道的平均荧光强度，并选择一轮中目标最亮的通道为该目标本轮的颜色。

得到每个目标的颜色序列后，根据颜色序列和编码序列匹配得到目标对应的微生物种类。具体的解码方式如下：

(1)当目标与某一编码序列完全匹配时，可以直接判断目标的微生物类别。

(2)当目标的颜色序列与某一编码相差一位时，由于编码之间的距离大于等于4，因此目标的颜色序列与其他编码至少相差3位以上，因此可以纠正错误的轮次，从而矫正目标到对应的种类。

(3)当目标的颜色序列与某一编码相差两位时，如果该序列与其他编码相差3位或以上，则判断该目标为距离最近(相差两位)的编码对应的种类。

(4)当目标的颜色序列同时多个编码相差两位或以上时，则无法判断该目标的种类。

本发明所使用的编码方案通过纠错和排除错误可以在保证较高识别率的同时减少被错误识别的情况，从而实现高容错的样品微生物群落空间分布解析。

实施例1

对root401,Pseudomonas sp.；root186，Flavobacterium sp.；root1280,Acinetobacter sp.；root901,Flavobacterium sp.；root241,Sphingomonas sp.；root170,Achromobacter sp.；root381D1,Variovorax sp.；root70,Acidovorax sp.；root1240,Agrobacterium sp.；root444D2,Paenibacillus sp.等十种革兰氏阳性和革兰氏阴性菌分别在1/2TSB培养基中培养(28℃，200rpm，正常需氧环境)，在OD600＝0.8时收取菌液(5000xg下离心5min)，随后经PBS清洗并重悬到等体积的4％多聚甲醛中，4℃固定3h。之后，细菌在5000xg下离心5min，并经PBS清洗重悬到等体积的50％乙醇溶液中，置于-20℃保存用于后续杂交实验。取该十种细菌的固定液，等OD混匀。20μl混合菌液涂布到直径为40mm的玻片上，室温风干。玻片组装到Bioptech’s FCS2腔室中，随后架置到共聚焦显微镜载物台上，连接控温器、进出液管和蠕动泵。使用5’末端Cy5修饰的EUB338通用探针(5'-GCTGCC TCC CGT AGG AGT-3'，SEQ ID No.1)对十种菌进行标记，共进行了26轮杂交-洗脱-解离成像。

首先通入PBS缓冲液充满腔室，设置腔室温度为46℃保持不变。之后，上第一轮杂交工作液。杂交工作液组成为：0.9mol/LNaCl，0.02mol/LpH＝7.6的Tris-HCl，0.01％SDS，20％体积浓度的甲酰胺，Cy5修饰的EUB338通用探针(0.5μM)。1mL的杂交液经蠕动泵流入腔室并充满，后静置与细菌样本46℃孵育3min。随后，1mL的洗脱液(0.215mol/LNaCl，0.02mol/LpH＝7.6Tris-HCl，0.005mol/LEDTA)流经腔室清洗样本2min，进行荧光显微成像。最后，1mL的解离液(70％体积浓度的甲酰胺，0.02mol/L pH＝7.6Tris-HCl，0.005mol/LEDTA)流经样本(2min)，48℃下静置孵育3min，然后进行解离成像。第一轮杂交解离成像完成，之后，上第二轮、第三轮直至第26轮杂交液进行杂交，方法同上。

如图3A所示，细菌在每一轮杂交之后解离完全，解离成像显示荧光信号等同于背景值，不影响后续轮次的杂交成像。对每一轮图像的荧光强度进行定量分析(图3B)，同样拍摄参数下，杂交成像中细菌的平均荧光信号略有降低，但仍保持在一定强度范围，远高于背景(解离)信号，杂交轮次可继续拓展。

该成像方法每一轮次仅需20min，杂交轮次的规模可扩展到N轮，从而实现了对n种细菌的快速、同时成像。

实施例2

本实施例选取了十二种细菌，获得其16S、23S及全基因组的数据，并通过ARB和mathFISH软件设计了针对单菌的特异性探针。菌株信息及探针序列见表1。

表1 12菌菌株信息及探针序列

探针由通用生物系统(安徽)合成，并对每种探针分别进行5’末端的FAM、Cy3和Cy5荧光分子修饰，使得每种探针拥有3种不同的荧光分子修饰。细菌分别在1/2TSB培养基中培养(28℃，200rpm，正常需氧环境)、OD₆₀₀＝0.8时收取菌液，随后经PBS清洗、4％多聚甲醛中固定后保存在50％乙醇溶液中(-20℃)用于后续杂交实验。

使用传统的FISH实验手段对表1中设计的12种探针与12种细菌进行分别杂交以验证探针的特异性和杂交效率，得到了探针-菌杂交的荧光图像，并进一步对图像的荧光强度进行定量分析，得到了探针与菌杂交的荧光强度的分布矩阵(图4A)。由于12种菌中包含同一属的不同菌种以及相近属的菌种，因而在探针-菌种的荧光特异性矩阵中，存在探针与非靶向菌的非特异性杂交。有些非特异性杂交较弱，荧光强度远低于特异性杂交；有些非特异性杂交较强，难以与特异性杂交区分。针对靶向微生物群落设计的特异性探针，每一个探针都与所有微生物物种的16S及23S rRNA序列进行ΔG计算，得到针对该物种的ΔG最低值及对应的杂交效率，并最终获得一个探针(靶向菌种)-ΔG的矩阵。根据杂交实验中观测得到的探针-荧光强度的矩阵(图4A)并结合计算得到的探针-ΔG的矩阵，得到了杂交中ΔG与荧光强度的分布关系：探针与靶向菌的特异性杂交，ΔG<-13.0kcal/mol，杂交效率大于99％，荧光强度高；探针与非靶向菌较弱的非特异性杂交，ΔG>-7.3kcal/mol，杂交效率低于5％，荧光强度很低几乎等同于背景荧光；可能出现的探针与非靶向菌较强的非特异性杂交，-13.0<ΔG<-7.3kcal/mol(图4B)。满足ΔG<-13.0kcal/mol的探针与靶向菌杂交时拥有较高的杂交效率，但当其与非靶向菌的ΔG位于-13.0<ΔG<-7.3kcal/mol区间时，其杂交后的荧光强度分布较为随机，难以根据mathFISH软件合理预测其杂交效率，可能出现强的非特异性杂交从而影响微生物的正确鉴定。当探针与非靶向菌的ΔG>-7.3kcal/mol时，其杂交效率和荧光信号远低于特异性杂交，不会对鉴定造成影响。因而在探针设计时，选择靶向探针满足ΔG<-13.0kcal/mol，同时尽可能使其满足与非靶向菌的ΔG>-7.3kcal/mol，会有更好的杂交特异性。

通过对以上三种杂交情况的荧光强度统计，本发明拟合得到了该三种情况下的荧光分布(图4C)。根据拟合得到的荧光分布，在模拟实验中对于每种方案，测试了在每种菌等量为2000个时的菌株鉴定结果。为比较不同方案对菌株的识别情况，引入了F1 score值来对不同方案进行评估。参考F1 Score的计算方法https://simplyml.com/what-are-precision-recall-and-f1/，对本发明的探针编码的F1 score进行计算。根据探针的特异性情况，可以进一步模拟菌群中每种菌的识别率。每种菌的识别精度(Precision)和正确识别率(Recall)定义如下：A菌的识别精度(Precision)为通过解码识别到为A菌的所有菌中真正为A菌的比例。A菌的识别率(Recall)为实际是A菌的所有菌中通过解码正确识别出的比例。F1 Score定义为识别精度和识别率的调和平均。某种编码的F1 Score为所有菌识别情况的F1 Score调和平均。

本发明模拟了5000种不同轮次和不同编码距离(汉明距离HD＝0，2，4，6)的三色编码方案对12株菌的总鉴定情况(图5A)。F1 score越高，则表明该方案对微生物的正确识别率越高。根据模拟结果，本发明选择了拥有较高F1值的8轮HD4的编码进行多轮杂交成像，在不明显增加轮次的情况下提高多轮杂交对微生物的识别率。进一步地，本发明模拟比较了8轮HD4编码方案(蓝色)与使用一轮杂交(灰色圆圈)相比对每株菌的鉴定情况(图5B和图5C)。结果显示，对于某些易被非特异性影响的菌，相比于一轮杂交，多轮杂交可以提高其鉴定的准确率。

实施例3

本实施例选取了一组R8-HD4(8轮、汉明距离为4)的编码方案(表2)对表1中12种细菌进行多轮杂交成像，探针序列不变。首先分别取十二种细菌的固定液点样到40mm的玻片上，室温风干。玻片组装到Bioptech’s FCS2腔室中，随后架置到共聚焦显微镜载物台上，连接控温器、进出液管和蠕动泵。共进行8轮杂交-洗脱-解离成像，每一轮的探针组合如下表2所示。

表2 12菌R8-HD4编码方案(F1＝0.928)

首先通入PBS缓冲液充满腔室，设置腔室温度为46℃保持不变。之后，上第一轮杂交工作液。杂交工作液组成为：0.9mol/L NaCl，0.02mol/L pH＝7.6的Tris-HCl，0.01％SDS，20％体积浓度的甲酰胺以及十二种细菌的探针组合(每种探针的浓度均为0.5μM)。1mL的杂交液经蠕动泵流入腔室并充满，后静置与细菌样本46℃孵育3min。随后，1mL的洗脱液(0.215mol/LNaCl，0.02mol/LpH＝7.6Tris-HCl，0.005mol/LEDTA)流经腔室清洗样本2min，进行荧光显微成像。最后，1mL的解离液(70％体积浓度的甲酰胺，0.02mol/LpH＝7.6Tris-HCl，0.005mol/L EDTA)流经样本(2min)，48℃下静置孵育3min，然后进行解离成像。第一轮杂交解离成像完成，之后，上第二轮、第三轮直至第8轮杂交液进行杂交，方法同上。针对十二个位置的12种不同菌种，在每一轮分别对其进行图像收集。

通过八轮的连续杂交，最终获得针对12种微生物中每种微生物的的8张荧光和明场图像。根据每一轮的明场图像，进行多轮图像的对齐，并利用阈值和分水岭算法相结合的方法进行图像分割从而得到分离的目标微生物在图像中的位置。根据分割好的图像得到对应细菌在每一轮不同荧光通道的平均荧光强度，并选择一轮中最亮的通道作为该细菌在本轮的颜色。得到每个细菌的颜色序列后，根据颜色序列和编码序列匹配得到每个细菌对应的微生物种类。12个位置的12种微生物经解码后的图像如图6A，与图示中微生物注释颜色一致的菌为通过多轮编码鉴定到的该菌，图像中与图示颜色不符的则为该种菌中被误判的菌。如图6B和图6C所示，每种细菌经独立的统计分析，得到该编码方案下每种菌(红色三角)实际的识别精度(Precision)和识别率(Recall)。该实验结果与模拟相符，细菌在经8轮纠错编码成像后被正确鉴定的比例得到了提高。

实施例4

本实施例中，将表1中十二种细菌的固定液等OD混匀，20μl混合菌液涂布到直径为40mm的玻片上，使用两组不同的R8-HD4(8轮、汉明距离为4)的编码方案(表2和表3)进行同样的8轮杂交实验。

表3 12菌R8-HD4编码方案(F1＝0.1)

两套编码方案的F1 score是基于实验测量的不同荧光分子修饰的12个探针与菌的杂交特异性而模拟得到的值，分别为0.928和0.1。细菌在8轮编码的连续杂交后，所得图像经解码分析处理和定量统计，最终得到12种细菌的荧光图像及每种细菌的识别比例。图7A展示了12种混菌在经F1＝0.928编码方案的8轮杂交后，所得图像经解码分析处理得到的12种细菌的荧光图像。图7B显示了经8轮杂交后两种编码方案对12种细菌的总识别率，其中，F1＝0.1的编码方案未被鉴定出的细菌比例高于F1＝0.928的编码方案。由于可容错的编码方案，在经过纠错之后，使用较好的编码方案(F1＝0.928)最终可识别的细菌比例达到90％(图7B)。图7C显示了实验中使用编码方案F1＝0.1得到的每种菌的识别情况(左侧较浅颜色的柱状图)及对应地使用编码方案F1＝0.928得到的每种菌的识别情况(右侧较深颜色的柱状图)。与编码方案F1＝0.1相比，使用优选编码方案F1＝0.928，经8轮杂交成像后，WCS358被鉴定到的比例大大提高，其对菌株WCS358的识别率为F1＝0.1编码方案的38倍。图7D显示了对应的两组编码在模拟实验中得到的每种菌的识别情况。实验与模拟结果比较一致，均表现为使用F1＝0.1编码方案时菌株WCS358的识别率降低。通过优选的编码方案，可以提高对某些特异性较差的菌的识别率，并进而提高细菌总体的鉴定率。

实施例5

本实施例进一步选取了30菌的合成菌群，使用不同的编码方案对其进行多轮杂交成像。三十菌的菌株信息及设计的探针序列如下表4。

表4 30菌菌株信息及探针序列

30种细菌分别培养并固定保存，之后取30种细菌的固定液，等OD混匀。然后分别取20μl混合菌液涂布到直径为40mm的2片玻片上。玻片室温风干并组装到Bioptech’s FCS2腔室中进行多轮杂交。根据之前的编码生成方法，本次选取了三色R8-HD4(8位编码，汉明距离为4)和三色R12-HD6(12位编码，汉明距离为6)的两套编码方案(见表5和表6)，对30菌的合成菌群分别进行多轮杂交成像。

表5 30菌R8-HD4编码方案

表6 30菌R12-HD6编码方案

每一轮次中杂交液工作的组成为：0.9mol/L NaCl，0.02mol/L pH＝7.6的Tris-HCl，0.01％SDS，20％体积浓度的甲酰胺以及30种菌的特异性探针探针(各0.5μM，探针组合方式见表5和表6)。洗脱液和解离液及多轮杂交解离成像流程与上述实验流程一致。最终，30种混菌经两套不同的编码方案进行多轮杂交成像后，分别得到一组8张的荧光和明场图像以及一组12张的荧光和明场图像。所得图像分别经解码分析处理，最终得到分割后的30种细菌的荧光图像(图8A)。两套编码方案都同时识别鉴定到了30种细菌，并且对该30种细菌的识别情况比较一致。如图8B展示了在两套不同编码方案下最终识别到的每种菌的相对丰度，大部分菌使用两种不同编码方案鉴定最终得到的比例都比较一致。两套编码在经纠错之后对30种菌的总鉴定率在80％左右(图8C)。

实施例6

使用该方法进一步对组织样本的多菌进行多轮杂交成像。首先，表面无菌的拟南芥种子在MS固体培养基上生长7天，之后将拟南芥接种到含有12种细菌的MS液体培养基中继续培养(图9中的图片A)。培养基中每种细菌的接种量为OD₆₀₀＝0.01。七天之后，取出拟南芥，经PBS清洗、4％多聚甲醛固定3小时后保存于50％乙醇中(-20℃)。

之后，取固定好的拟南芥的根于直径40mm的粘附玻片上，室温风干并随后组装到Bioptech’s FCS2腔室中进行多轮杂交。本次实验中使用的12种细菌与实施例2中相同，探针和编码方案也相同。在进行8轮编码的多轮杂交成像之前，样本首先与通用探针进行杂交对所以的细菌进行标记定位。杂交液工作的组成为：0.9mol/LNaCl，0.02mol/L pH＝7.6的Tris-HCl，0.01％SDS，20％体积浓度的甲酰胺以及Cy5修饰的EUB338通用探针(0.5μM)。1mL的杂交液经蠕动泵流入腔室并充满，后静置与细菌样本46℃孵育10min。随后，1mL的洗脱液流经腔室清洗样本2min，进行荧光显微成像。最后，1mL的解离液流经样本(2min)，48℃下静置孵育3min，然后进行解离成像。之后按照编码方案进行多轮杂交成像。多轮杂交流程与上述一致，由于该样本为定殖到组织上的菌，因而探针与样本的杂交孵育时间延长至十分钟。

在通用探针杂交后，选取根部几个不同的位置分别进行荧光成像。之后在每一轮次杂交后的荧光成像中，都对上述几个位置分别进行荧光成像。经8轮编码杂交之后，得到拟南芥根部几个不同位置的8张荧光和明场图像，并经图像分割、解码得到每个位置的12种菌的分布。如图9中的图片B所示，上图为根部某一位置使用通用探针染色标记到的所有菌，下图为经8轮编码杂交解码后的12种菌的分布。图9中的图片C为定量统计距离根尖不同位置的12种菌的组成及丰度。通过多轮杂交成像，本实施例鉴定到了定植在拟南芥根部的12种菌，其中某几个菌的丰度较低，个别菌如root186(Flavobacterium,FL1)在某些位置的拍摄中没有鉴定到。

实施例7

取root401、root186、root1280、root901、root241、root170、root381D1、root70、root1240、root444D2等十种细菌的固定液，等OD混匀。通用探针Eub338：GCTGCCTCCCGTAGGAGT(SEQ ID No.1)可以靶向到这十种菌的16S rRNA保守区，同时对十种细菌进行标记。探针由通用生物系统(安徽)合成，并进行5’末端的Cy5荧光分子修饰。20μl混合菌液涂布到直径为40mm的玻片上，室温风干。玻片组装到Bioptech’s FCS2腔室中，随后架置到共聚焦显微镜载物台上，连接控温器、进出液管和蠕动泵。杂交工作液组成为：0.9mol/L NaCl，0.02mol/L pH＝7.6的Tris-HCl，0.01％SDS，20％体积浓度的甲酰胺以及EUB338通用探针(0.5μM)。1mL的杂交液经蠕动泵流入腔室并充满，后静置与细菌样本46℃孵育3min。随后，1mL的洗脱液(0.215mol/L NaCl，0.02mol/L pH＝7.6Tris-HCl，0.005mol/L EDTA)流经腔室清洗样本2min，进行荧光显微成像。最后，1mL的解离液(不同体积浓度的甲酰胺，0.02mol/L pH＝7.6Tris-HCl，0.005mol/L EDTA)流经样本(2min)，并与样本48℃下静置孵育，然后在不同时间进行成像以验证解离效果。

对杂交成像后的十种细菌分别在60％-100％甲酰胺四个不同浓度解离液条件下进行探针解离。如图10所示，四种浓度的甲酰胺解离液最终都可以解离完全。随着甲酰胺浓度的升高，解离越快所需时间越少。60％的甲酰胺解离液需要孵育15min才能解离彻底，而70％甲酰胺只需要5min。对于更高浓度的甲酰胺(90％、100％)，1-2min就可以解离完全。中间浓度70％的甲酰胺解离液，其解离时间较短，所需甲酰胺浓度不会过高从而减少一定的毒性试剂使用和污染。与之前报道使用的DNA酶Ⅰ进行探针解离相比，该解离液更快速且经济。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国科学院深圳先进技术研究院

<120> 一种多轮、多色荧光原位杂交鉴定微生物的方法

<130> GAI20CN3113

<160> 31

<170> PatentIn version 3.5

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Claims

1.一种多轮、多色荧光原位杂交鉴定微生物的方法，该方法包括：

成像：对杂交后的样本进行荧光成像；

解离：对已经杂交上的探针分子进行解离；

根据多轮次荧光成像情况鉴定微生物；

2.根据权利要求1所述的方法，其中，每轮次的杂交过程均采用带有荧光分子标记的M种探针；共形成N轮次的荧光成像；各轮次的多种探针带有的荧光分子标记共包括A种；

其中，M为大于2的正整数，N为大于2的正整数，A为大于等于2的正整数；

优选地，M为选自3～200的正整数，N为选自4～50的正整数，A为选自3～5的正整数；

更优选地，各轮次的多种探针带有的荧光分子标记包括FAM、Cy3和Cy5。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，杂交过程包括将待测样本与工作液接触静置孵育的过程，其中所述工作液为含有所述带有荧光分子标记的多种探针的杂交液；优选地，杂交液中含有NaCl(氯化钠)、Tris-HCl(三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液)、SDS(十二烷基硫酸钠)和甲酰胺；

优选地，每轮次杂交后采用洗脱液洗去非特异性杂交，之后再进行荧光成像；更优选地，所述洗脱液中含有NaCl、Tris-HCl和EDTA(乙二胺四乙酸)。

4.根据权利要求1～3中任一项所述的方法，其中，解离过程包括将杂交后的待测样本与解离液接触静置孵育以将已经杂交到微生物上的探针分子从微生物上解离的过程；

优选地，解离液中含有甲酰胺、Tris-HCl和EDTA；

更优选地，解离后对样本进行显微成像以验证解离效果。

5.根据权利要求4所述的方法，其中：

解离液中，甲酰胺的体积浓度为60-100％；优选地，Tris-HCl浓度为0.01～0.03mol/L，EDTA浓度为0.005～0.01mol/L。

6.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述微生物包括细菌、真菌、古菌中的一种或多种；

优选地，所述探针为靶向预定微生物的转录产物或DNA基因座的探针。

7.根据权利要求1或2或6所述的方法，其中，所述探针满足与靶向微生物的ΔG小于-13.0kcal/mol并与非靶向微生物拥有至少三个中间错配碱基；

优选地，所述探针满足与非靶向微生物的ΔG大于-7.3kcal/mol。

8.根据权利要求1或2所述的方法，其中，每种探针在各轮次中所带有的荧光分子按照轮次顺序形成对应该探针的荧光编码，两种探针在同一轮次中的荧光分子不同定义为1个距离，多种探针的荧光编码两两之间具有至少3个、优选至少4个距离。

9.根据权利要求6～8任一项所述的方法，其还包括：在进行多轮杂交前，根据探针的ΔG与荧光强度的分布关系，确定荧光编码方案。

10.根据权利要求1所述的方法，其中，待测样本来自人体、动物、植物和/或环境；优选地，该方法是应用于检测样本中所包含的微生物群落在微米尺度上的物种组成和/或空间结构。