JP7093836B2 - 超解像蛍光顕微鏡及び蛍光寿命測定のためのデバイス及び方法 - Google Patents
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Description
- S.W. Hell,J. Wichmann “Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission:stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy”,Optics Letters,Vol.19,No.11,June 1,1994
- T.A. Klar et al. “Fluorescence microscopy with diffraction resolution barrier broken by stimulated emission”, PNAS,Vol.97,No.15,July 18,2000
- E. Betzig et al. “Imaging Intracellular Fluorescent Proteins at Nanometer Resolution”,Science,Vol.313,September 15,2006
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- C.-W. Chang et al. “Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy”, Methods in Cell Biology, Vol.81,chapter 24
a)観察対象の試料に含まれる蛍光発光体の確率的活性化を誘発するステップ、及び活性化された発光体からの蛍光発光を引き起こすのに適当な波長を有する励起光ビームで上記試料を照射するステップと、
b)マトリクスイメージセンサを含む結像系によって、上記蛍光発光の画像シーケンスを取得するステップと、を含み、
- 上記励起光ビームがパルス型であり、2つの連続するパルス間の時間間隔が、蛍光発光体の蛍光寿命よりも大きいことと、
- 方法が、上記励起光ビームのパルスに対する上記光子の到達遅延を判定するために、蛍光発光の光子を計数するステップをさらに含み、上記計数するステップが、各光子が上記マトリクスイメージセンサの画素セットに関連付けられることを可能にする空間解像度で実行されることと、
- 1つの上記画像の取得時間中に、多くとも1つの個々の蛍光発光体が、マトリクスイメージセンサの1つの上記画素セットに対応する試料の領域において平均して活性化されるように、蛍光発光体の確率的活性化が実行されることと、
を特徴とする、超解像蛍光顕微鏡方法である。
a)第1の波長の第1の光ビーム及び第2の波長の第2の光ビームによって光変換可能な蛍光発光体を含む試料を照射するステップであって、第1の波長が、第1の状態から第1の状態とは異なる第2の状態への蛍光発光体の変換を誘発することによって上記蛍光発光体を活性化するように選択され、第2の波長が、第1の波長とは異なり、第2の状態の蛍光発光体の蛍光発光を引き起こすのに適当である、ステップと、
b)マトリクスイメージセンサを含む結像系によって、上記蛍光発光の画像シーケンスを取得するステップと、を含み、
- 上記第2の光ビームがパルス型であり、2つの連続するパルス間の時間間隔が、蛍光発光体の蛍光寿命よりも大きいことと、
- 方法が、上記第2の光ビームのパルスに対する上記光子の到達遅延を判定するために、蛍光発光の光子を計数するステップをさらに含み、上記計数するステップが、各光子が上記マトリクスイメージセンサの画素セットに関連付けられることを可能にする空間解像度で実行されることと、
- 1つの上記画像の取得時間中に、多くとも1つの個々の蛍光発光体が、マトリクスイメージセンサの1つの上記画素セットに対応する試料の領域において平均して活性化されるように、第1の光ビームの強度が選択されることと、
を特徴とする。
- 試料が、
- マイクロメートル未満の厚さを有し、
- 励起光ビームの波長に対して透明な、誘電体支持体の面上に堆積され、
- 第1の種類の分子で機能化される支持体に対向する面を有し、平均して、多くとも1つの第2の種類の分子が、マトリクスイメージセンサの1つの上記画素セットに対応する試料の領域において第1の種類の分子に結合されるように、蛍光発光体に結合され、且つ運動性を有する反応によって第1の種類の分子と一過的に結合しやすい、第2の種類の分子を含む溶液に接触して置かれ、
- ステップa)が、誘電体支持体の面からマイクロメートル未満の距離に位置する単独の蛍光発光体からの蛍光発光が活性化されるように、上記励起光ビームを用いた内部全反射による試料の照射を含む。
c)上記蛍光発光の一部を光子計数検出器又は検出器のマトリクスに向けるステップであって、上記検出器又はマトリクスの各検出器が、上記マトリクスイメージセンサの画素セットに関連付けられる、ステップと、
d)光子計数検出器を使用して、上記励起光ビーム(第2の光ビーム)のパルスに対する蛍光光子の到達遅延を測定するステップと、
を含み得る。
e)ステップb)において取得された画像シーケンスを使用して、上記個々の蛍光発光体を位置特定することによって超解像画像を構築するステップと、
f)ステップd)において測定された蛍光光子の到達遅延を使用して蛍光寿命を計算し、ステップe)において位置特定された個々の蛍光発光体に蛍光寿命を関連付けるステップと、
をさらに含んでもよく、
ステップe)及びf)が、電子プロセッサによって実施される。
- 観察対象の試料に含まれる蛍光発光体の確率的活性化のための手段と、
- 励起光ビームと呼ばれる光ビームを、活性化された蛍光発光体からの蛍光発光を引き起こすのに適当な波長で放射するのに適当な、励起光ソースと呼ばれる光源と、
- 励起光ビームを試料の方に向けるように構成される光学系と、
-上記試料の蛍光画像のシーケンスを取得するように構成されるマトリクスイメージセンサを含む、光学検出系と、を備え、
- 上記励起光ソースがパルス型ソースであり、このソースの2つの連続するパルス間の時間間隔が、蛍光発光体の蛍光寿命よりも大きいことと、光学検出系が、上記第2の光ビームのパルスに対する上記光子の到達遅延を判定するために、蛍光発光の光子の計数を実行するようにさらに構成され、上記計数が、各光子が上記マトリクスイメージセンサの画素セットに関連付けられることを可能にする空間解像度で実行されることと、
を特徴とする、超解像蛍光顕微鏡デバイスである。
- 第1の波長で第1の光ビームを放射するのに適当な第1の光源であって、上記第1の波長が、第1の状態から第1の状態とは異なる第2の状態への蛍光発光体の変換を誘発することによって蛍光発光体を活性化するように選択される、第1の光源と、
- 第1の波長とは異なる第2の波長で第2の光ビームを放射するのに適当な第2の光源であって、上記第2の波長が、第1の波長とは異なり、第2の状態の蛍光発光体の蛍光発光を引き起こすのに適当である、第2の光源と、
- 第1の光ビーム及び第2の光ビームを試料の方に向けるように構成される、光学系と、
- 上記試料の蛍光画像のシーケンスを取得するように構成される、光学検出系と、を備え、
- 上記第2の光源がパルス型ソースであり、このソースの2つの連続するパルス間の時間間隔が、蛍光発光体の蛍光寿命よりも大きいことと、光学検出系が、上記第2の光ビームのパルスに対する上記光子の到達遅延を判定するために、蛍光発光の光子の計数を実行するようにさらに構成され、上記計数が、各光子が上記マトリクスイメージセンサの画素セットに関連付けられることを可能にする空間解像度で実行されることと、
を特徴とする。
- 光学検出系が、上記試料の上記蛍光画像のシーケンスを取得するように構成される結像系と、上記試料から蛍光発光の一部を受けるように配置される光子計数検出器又は検出器のマトリクスであって、上記検出器又はマトリクスの各検出器が、上記マトリクスイメージセンサの上記画素セットに関連付けられる、光子計数検出器又は検出器のマトリクスと、上記第2の光ビームのパルスに対する上記検出器又は上記各検出器上に到達する光子の到達遅延を測定するように構成される、上記光子計数検出器又は検出器のマトリクスに関連付けられる電子回路と、を含み得る。
- 光活性化された蛍光分子の検出に有効に対応する信号のみを保持し、雑音を却下するように、マトリクスイメージセンサによって、及び光子計数検出器によって取得される信号を閾値で2値化すること。
- 異常な時間特性を表している信号をフィルタリングすること。例えば、フォトブリーチングは、平均値が既知である時間(例えば、30ms)、蛍光をオフに切り替える。センサCIMによって取得された画像が、あまりに長い間持続している光スポットを示す場合、それが複数の分子に起因し、したがって、破棄されるべきであることを意味する。光子計数検出器に関して、閾値の上及び下で、数ミリ秒の間隔で複数回「明滅する」信号が見られること、並びに少なくとも事前定義された最小数の光子(典型的には、数百、例えば250)が検出されることが予期される。これらの条件が満たされない場合、信号は破棄される。
- 「イベント」の形式で2つの検出器(イメージセンサ及び光子計数検出器のマトリクス)から導出するデータのバイナリ表現。空間的及び時間的に相関するイベントに対応する信号のみが、ステップg)の再構築に使用される。このステップの終わりに、それぞれの個々の蛍光発光体の位置が、その蛍光寿命に関連付けられる。
- 複数の蛍光発光体が、イメージセンサの1つの且つ同一の画素セット内で同時に検出される場合、様々な規則が適用され得る。1つの可能性は、対応する信号を純粋且つ単純に破棄することにある。別の可能性は、画素セットのエッジの近くに位置する発光体を無視することにある。第3の可能性は、DCPの応答が、EPXの中心及びそのエッジにある発光体について同一でないという事実に依存する。その結果、各発光体についてのDCPによって検出される光子の数の端数の知識が、信頼性スコアを寿命測定に割り当てることを可能にする。例えば、このスコアは、EPXの中心で1つの発光体を、エッジにおいて2つ目の発光体を同時に検出する場合に高くなり、中心から同じ距離において2つの発光体を同時に検出する場合に低くなる。最初の検出が保持され、2つ目は却下される。
- Gregory Giannone et al. “Dynamic-Superresolution Imaging of Endogenous Proteins on Living Cells of Ultra-High Density”,Biophysical Journal,Vol.99,August 2010,pages 1303-1310
- Joerg Schnitzbzauer et al. “Super-resolution microscopy with DNA-PAINT”,Nature Protocols,Vol.12,No.6,pages 1198-1228(2017)
Claims (20)
- 超解像蛍光顕微鏡方法であって、
a)観察対象の試料(E)に含まれる蛍光発光体の確率的活性化を誘発するステップ、及び活性化された前記発光体からの蛍光発光(FLF)を引き起こすのに適当な波長を有する励起光ビーム(FL2)で前記試料を照射するステップと、
b)マトリクスイメージセンサ(CIM)を含む結像系(SIM)によって、前記蛍光発光の画像(IM)シーケンスを取得するステップと、
を含み、
前記励起光ビームがパルス型であり、2つの連続するパルス間の時間間隔が、前記蛍光発光体の蛍光寿命よりも大きいことと、
前記方法が、前記励起光ビームの前記パルス(IL2)に対する光子の到達遅延を判定するために、前記蛍光発光の前記光子を計数するステップをさらに含み、前記計数するステップが、各光子が前記マトリクスイメージセンサの画素セット(EPX)に関連付けられることを可能にする空間解像度で実行されることと、
1つの前記画像の取得時間中に、多くとも1つの個々の蛍光発光体(EFI)が、前記マトリクスイメージセンサの1つの前記画素セットに対応する前記試料の領域において平均して活性化されるように、前記蛍光発光体の前記確率的活性化が実行されることと、
を特徴とする、方法。 - 前記光子を計数するステップが、
c)前記蛍光発光の一部を光子計数検出器又は検出器のマトリクス(MDCP)に向けるステップであって、前記検出器又は前記マトリクスの各検出器(DCP)が、前記マトリクスイメージセンサの画素セット(EPX)に関連付けられる、ステップと、
d)前記光子計数検出器を使用して、前記励起光ビームの前記パルスに対する蛍光光子の到達遅延(Δt1、Δt2)を測定するステップと、
を含む、請求項1に記載の方法。 - e)前記ステップb)において取得された前記画像シーケンスを使用して、前記個々の蛍光発光体を位置特定することによって超解像画像を構築するステップと、
f)ステップd)において測定された前記蛍光光子の前記到達遅延を使用して蛍光寿命を計算し、前記ステップe)において位置特定された前記個々の蛍光発光体に前記蛍光寿命を関連付けるステップと、をさらに含み、
前記ステップe)及びf)が、電子プロセッサ(PR)によって実施される、請求項2に記載の方法。 - 前記ステップe)が、前記ステップb)において取得された前記画像内に存在する回折スポット(TD)の中心を推定することによる、前記個々の蛍光発光体の位置特定を含む、請求項3に記載の方法。
- 前記個々の蛍光発光体に前記蛍光寿命を関連付けるための、前記ステップb)において取得された前記画像と、前記ステップd)において測定された前記蛍光光子の前記到達遅延との間の空間時間相関のステップg)をさらに含む、請求項3又は4に記載の方法。
- 前記光子計数検出器のマトリクスが、複数の行及び複数の列に従って配置された複数の前記検出器(DCP)を含む、請求項2~5のいずれか一項に記載の方法。
- 前記試料に含まれる前記蛍光発光体が、変換可能であり、前記ステップa)が、前記励起光ビーム(FL2)及び変換光ビーム(FL1)による前記試料の前記照射を含み、前記変換光ビームが、前記励起光ビームの波長とは異なる波長を有し、第1の状態から前記第1の状態とは異なる第2の状態への前記蛍光発光体の変換を誘発することによって前記蛍光発光体を活性化するように選択され、1つの前記画像の前記取得時間中に、多くとも1つの個々の蛍光発光体(EFI)が、前記マトリクスイメージセンサの1つの前記画素セットに対応する前記試料の領域において平均して活性化されるように、前記変換光ビームの強度が選択される、請求項1~6のいずれか一項に記載の方法。
- 前記試料が、
マイクロメートル未満の厚さを有し、
前記励起光ビームの前記波長に対して透明な、誘電体支持体(SDT)の面(SS)上に堆積され、
第1の種類の分子(BR1)で機能化される前記支持体に対向する面を有し、平均して、多くとも1つの第2の種類の分子が、前記マトリクスイメージセンサの1つの前記画素セットに対応する前記試料の領域において前記第1の種類の分子に結合されるように、蛍光発光体(EF)に結合された、且つ運動性を有する反応によって前記第1の種類の前記分子と一過的に結合しやすい、前記第2の種類の分子(BR2)を含む溶液に接触して置かれ、
前記ステップa)が、前記誘電体支持体の前記面からマイクロメートル未満の距離に位置する単独の前記蛍光発光体からの前記蛍光発光が活性化されるように、前記励起光ビームを用いた内部全反射による前記試料の前記照射を含む、請求項1~6のいずれか一項に記載の方法。 - 超解像蛍光顕微鏡デバイスであって、
観察対象の試料(E)に含まれる蛍光発光体の確率的活性化のための手段と、
励起光ビーム(FL2)と呼ばれる光ビームを、活性化された前記蛍光発光体からの蛍光発光を引き起こすのに適当な波長で放射するのに適当な、励起光ソースと呼ばれる光源(SL2)と、
前記励起光ビームを前記試料(E)の方に向けるように構成される光学系(MD1、L1、MD2、OBJ)と、
前記試料の蛍光画像(IM)のシーケンスを取得するように構成されるマトリクスイメージセンサ(CIM)を含む、光学検出系(SIM、SCP)と、を備え、
前記励起光ソースがパルス型ソースであり、前記ソースの2つの連続するパルス間の時間間隔が、前記蛍光発光体の蛍光寿命よりも大きいことと、前記光学検出系が、前記第2の光ビームの前記パルス(IL2)に対する光子の到達遅延(Δt1、Δt2)を判定するために、前記蛍光発光の前記光子の計数を実行するようにさらに構成され、前記計数が、各光子が前記マトリクスイメージセンサの画素セット(EPX)に関連付けられることを可能にする空間解像度で実行されることと、
を特徴とする、デバイス。 - 前記光学検出系が、
前記試料の前記蛍光画像のシーケンスを取得するように構成される、結像系(SIM)と、
前記試料から蛍光発光の一部を受けるように配置される光子計数検出器又は検出器のマトリクス(MDCP)であって、前記検出器又は前記マトリクスの各検出器(DCP)が、前記マトリクスイメージセンサの前記画素セット(EPX)に関連付けられる、光子計数検出器又は検出器のマトリクスと、
前記励起光ビームの前記パルスに対する前記検出器又は前記各検出器上に到達する光子の到達遅延を測定するように構成される、前記光子計数検出器又は検出器のマトリクスに関連付けられる電子回路(CMR)と、
を含む、請求項9に記載のデバイス。 - 前記マトリクスイメージセンサによって取得された前記蛍光画像のシーケンスを入力として受信し、前記蛍光画像のシーケンスを使用して、前記シーケンスの前記画像において個々の蛍光発光体を位置特定することによって超解像画像を構築し、
前記電子回路によって得られた遅延測定値を入力として受信し、前記遅延測定値を使用して蛍光寿命を計算し、
位置特定された前記個々の蛍光発光体に前記蛍光寿命を関連付ける、
ように構成される電子プロセッサ(PR)をさらに備える、請求項10に記載のデバイス。 - 前記電子プロセッサが、前記マトリクスイメージセンサによって取得された前記画像内に存在する回折スポット(TD)の中心を推定することにより、前記個々の蛍光発光体を位置特定するように構成される、請求項11に記載のデバイス。
- 前記電子プロセッサが、前記マトリクスイメージセンサによって取得された前記画像と前記電子回路によって得られた前記遅延測定値との間の空間時間相関を実行することによって、前記位置特定された個々の蛍光発光体に前記蛍光寿命を関連付けるように構成される、請求項11又は12に記載のデバイス。
- 前記光子計数検出器が、個々の光子アバランシェダイオードである、請求項11~13のいずれか一項に記載のデバイス。
- 1つの前記光子計数検出器のマトリクスを含む、請求項11~14のいずれか一項に記載のデバイス。
- 前記光子計数検出器のマトリクスが、不連続の個々の光子アバランシェダイオードのマトリクスであり、前記デバイスが、前記マトリクスのそれぞれの個々の光子アバランシェダイオードに対向して配置される1つのマイクロレンズを含む、連続収束マイクロレンズ(MML)のマトリクスをさらに含み、それぞれの前記マイクロレンズが、前記マトリクスイメージセンサの画素セットと光学的に共役である、請求項15に記載のデバイス。
- 複数の前記光子計数検出器(DCP)を備え、前記デバイスが、それぞれの光ファイバの第1の端面が前記マトリクスイメージセンサの画素セットと光学的に共役であるように配置される光ファイバ束(FF)をさらに含み、1つの前記光子計数検出器がそれぞれの前記光ファイバの第2の端面に対向して配置される、請求項11~14のいずれか一項に記載のデバイス。
- 前記蛍光発光体の確率的活性化のための手段が、変換光ビームと呼ばれ、前記励起光ビームの波長とは異なる波長を有し、且つ第1の状態から前記第1の状態とは異なる第2の状態への前記蛍光発光体の変換を誘発することによって光変換可能型である前記蛍光発光体を活性化するように選択される、光ビーム(FL1)を前記試料に向かって放射するのに適当な、変換光ソースと呼ばれる光源(SL1)を含み、前記変換光ビームの強度が、1つの前記画像の取得時間中に、多くとも1つの個々の蛍光発光体(EFI)が、前記マトリクスイメージセンサの1つの前記画素セットに対応する前記試料の領域において平均して活性化されるように選択される、請求項11~17のいずれか一項に記載のデバイス。
- 前記蛍光発光体の確率的活性化のための手段が、前記試料が堆積され得る面(SS)上において、前記励起光ビームの前記波長に対して透明な誘電体支持体(SDT)と、前記支持体を含む流体タンク(CF)と、を含み、前記光学系が、前記励起光ビームが前記面上での内部全反射を経験するように前記支持体を通って前記励起光ビームを方向付けるように構成される、請求項11~17のいずれか一項に記載のデバイス。
- コンピュータプログラム製品であって、前記プログラムがコンピュータ上で実行されるときに、
マトリクスイメージセンサ(CIM)を含む結像系(SIM)によって取得される、個々の蛍光発光体を含む試料(E)から蛍光発光の画像(IM)シーケンスを、入力として受信し、
パルス型光ビームのパルスに対する前記蛍光発光の光子の到達遅延(Δt1、Δt2)を入力として受信し、前記光子が、光子計数検出器又は検出器のマトリクス(MDCP)によって検出され、前記検出器又は前記マトリクスの各検出器(DCP)が、前記マトリクスイメージセンサの画素セット(EPX)に関連付けられ、
前記画像シーケンスを使用して、前記個々の蛍光発光体を位置特定することによって前記試料の超解像画像を構築し、
前記蛍光発光の前記光子の前記到達遅延を使用して蛍光寿命を計算し、前記個々の蛍光発光体に前記蛍光寿命を関連付ける、
ためのコンピュータ実行可能命令を含む、コンピュータプログラム製品。
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