JP5747690B2 - 顕微鏡装置及び画像形成方法 - Google Patents

Description

本発明は、顕微鏡装置及び画像形成方法に関するものである。

従来から、超解像顕微鏡として、ＳＴＯＲＭ（Stochastic Optical Reconstruction Microscopy）が知られている（例えば特許文献１参照）。この顕微鏡では、観察試料として、所定波長の活性化光を照射すると活性化し、後に活性化光とは異なる波長の励起光を照射すると蛍光を発して不活性化する特性を有する蛍光物質又はこの蛍光物質を付着させたものが用いられる。このような観察試料に対して微弱な活性化光を照射することで低密度に蛍光物質を活性化させ、その後に励起光を照射して蛍光物質を発光させることで蛍光画像を取得する。このようにして取得した蛍光画像では、蛍光輝点（蛍光物質の像）が低密度に配置され、個々に分離されたものとなるため、個々の像の重心位置を求めることができる。このような蛍光画像を得るステップを複数回、例えば数百回〜数万回以上繰り返し、得られた複数の蛍光画像を合成する画像処理を行うことにより、高分解能の試料画像を得ることができる。

米国特許出願公開第２００８／００３２４１４号明細書

しかし、従来の観察方法では、顕微鏡の一視野に収まりきらない観察試料の超解像画像を得ることができなかった。
本発明は、上記従来技術の問題点に鑑み成されたものであって、広視野の超解像画像が得られる顕微鏡装置、及び広視野の超解像画像を形成することができる画像形成方法を提供することを目的の一つとする。

本発明の顕微鏡装置は、活性化光及び励起光の照射、又は励起光の照射により蛍光を発する蛍光物質を含む試料に、前記活性化光及び前記励起光、又は前記励起光を照射する照明光学系と、前記試料の観察領域の蛍光画像を撮像する撮像装置と、前記試料に前記励起光を繰り返し照射することにより取得された複数の蛍光画像の各々において蛍光輝点の位置を解析し、分子リストとして構築する画像解析装置と、複数の前記観察領域において取得された複数の前記分子リストを、前記分子リスト同士が重なり合う領域における前記分子リスト間の前記蛍光輝点同士の相対位置情報に基づいて算出した位置補正情報を用いて連結する画像連結装置と、を備えたことを特徴とする。

本発明の画像形成方法は、活性化光及び励起光の照射、又は励起光の照射により蛍光を発する蛍光物質を含む試料に、前記活性化光及び前記励起光、又は前記励起光を照射する照明光学系と、前記試料の観察領域の蛍光画像を撮像する撮像装置と、を備えた顕微鏡装置における画像形成方法であって、前記試料に前記励起光を繰り返し照射することにより複数の蛍光画像を取得するステップと、取得した複数の前記蛍光画像の各々において蛍光輝点の位置を解析し、分子リストとして構築するステップと、複数の前記観察領域において取得された複数の前記分子リストを、前記分子リスト同士が重なり合う領域における前記分子リスト間の前記データ同士の相対位置情報に基づいて算出した位置補正情報を用いて連結するステップと、を有することを特徴とする。

本発明によれば、広視野の超解像画像が得られる顕微鏡装置、及び画像形成方法が提供される。

実施形態に係る顕微鏡装置を示す概略図。 制御部の詳細を示す図。 実施形態の画像形成方法を示すフローチャート。 実施形態の画像形成方法により得られるタイリング画像の一例を示す図。 画像連結ステップの詳細を示すフローチャート。 分子リスト間の重なり領域の抽出動作に関する説明図。 第２実施形態に係る画像形成方法の説明図。

以下、図面を参照して試料の観察方法、および顕微鏡装置の一実施形態について説明する。なお、本実施形態は、発明の趣旨をより良く理解させるために具体的に説明するものであり、特に指定のない限り、本発明を限定するものではない。また、以下の説明で用いる図面は、特徴をわかりやすくするために、便宜上、要部となる部分を拡大して示している場合があり、各構成要素の寸法比率などが実際と同じであるとは限らない。

（第１実施形態）
図１は本実施形態に係る顕微鏡装置を示す概略図である。
顕微鏡装置１０は、照明光学系１２と、制御部１４と、顕微鏡本体１５と、記憶部１６と、表示部１７とを備えている。

本実施形態の顕微鏡装置１０は超解像顕微鏡技術（Stochastic Optical Reconstruction Microscopy；ＳＴＯＲＭ）を用いた顕微鏡装置である。顕微鏡装置１０では、活性化状態で励起光Ｌ１が照射されると蛍光を発して不活性化する蛍光物質を標識として付与された試料を用いる。この蛍光物質は、励起光Ｌ１が照射されることで蛍光を発して不活性化した後、励起光Ｌ１とは異なる波長の活性化光Ｌ２が照射されると再度活性化状態となる特性を有している。そして、励起光Ｌ１と活性化光Ｌ２とを用いて試料中の一部の蛍光物質のみを発光させることで離散的に分布した蛍光を観察する動作を繰り返し、これにより取得した多数の蛍光画像を解析することにより超解像の試料画像を形成する。

本実施形態に係る照明光学系１２は、励起照明系１１と、活性化照明系１３と、を含む。
励起照明系１１は、レーザ光源２１と、シャッタ２２と、全反射ミラー３２とを備えており、全反射ミラー３２を介して励起照明系１１と顕微鏡本体１５とが接続されている。

レーザ光源２１は、試料に付与した蛍光物質を発光させるための励起光Ｌ１を顕微鏡本体１５に供給する光源である。レーザ光源２１は、試料に含まれる蛍光物質に適合する波長の励起光Ｌ１を射出するものであればよく、例えば、蛍光物質の種類に応じて、緑色レーザ（波長５３２ｎｍ）、赤色レーザ（波長６３３ｎｍ、６５７ｎｍ）、紫色レーザ（波長４０５ｎｍ）、青色レーザ（波長４５７ｎｍ）などを用いることができる。

シャッタ２２は、顕微鏡本体１５への励起光Ｌ１の供給、停止を切り替える装置であり、例えば、レーザ光源２１から射出される励起光Ｌ１を遮蔽する遮光部材と、この遮光部材を励起光Ｌ１の光路に対して進退させる駆動装置とを備えた構成とすることができる。あるいはシャッタ２２として、ＡＯＴＦ（Acousto-Optic Tunable Filter；音響光学フィルタ）を用いても良い。
全反射ミラー３２は、レーザ光源２１から照射される励起光Ｌ１を後述する顕微鏡本体１５のステージ３１に向けて全反射させる。
このような構成に基づき、励起照明系１１は、ステージ３１上の観察視野（観察領域）の全域に対して励起光Ｌ１を照射する。

一方、活性化照明系１３は、レーザ光源４２と、スキャナ４３と、ダイクロイックミラー３３とを備えている。ダイクロイックミラー３３は励起光Ｌ１の光路上に挿入され、これにより活性化照明系１３と顕微鏡本体１５とが接続されている。ダイクロイックミラー３３は、レーザ光源４２から照射される活性化光Ｌ２をステージ３１に向けて反射させる一方、励起照明系１１から供給される励起光Ｌ１をステージ３１に向けて透過させる。

レーザ光源４２は、試料に含まれる蛍光物質を活性化するための活性化光Ｌ２を顕微鏡本体１５に向けて照射する。レーザ光源４２は、試料に含まれる蛍光物質に適合する波長の活性化光Ｌ２を射出するものであればよく、例えば、蛍光物質の種類に応じて、緑色レーザ（波長５３２ｎｍ）、赤色レーザ（波長６３３ｎｍ、６５７ｎｍ）、紫色レーザ（波長４０５ｎｍ）、青色レーザ（波長４５７ｎｍ）などを用いることができる。

スキャナ４３は、活性化光Ｌ２を顕微鏡本体１５のステージ３１上で走査する。スキャナ４３としては、例えば、二軸のガルバノスキャナを用いることができる。
このような構成に基づき、活性化照明系１３は、ステージ３１上の観察視野（観察領域）に対して、活性化光Ｌ２をスキャナ４３により走査しながら照射可能になっている。

なお、照明光学系１２として、レーザ光源２１とレーザ光源４１とを１つの筐体内に備え、複数種のレーザ光を射出可能に構成されたレーザ光源装置を採用してもよい。このようなレーザ光源装置を備える場合、レーザ光源装置とともにシャッタ２２やスキャナ４３を備えた照明系を構成することで、１つの照明系により励起光Ｌ１と活性化光Ｌ２の両方を顕微鏡本体１５に供給可能となる。

顕微鏡本体１５は、例えば、倒立顕微鏡である。顕微鏡本体１５は、観察対象である試料を載置するステージ３１を備えている。また、顕微鏡本体１５には、ステージ３１に載置された試料の蛍光画像を撮像するカメラ（撮像装置）３４が接続されている。カメラ３４としては、例えば複数の画素を有したＣＣＤカメラを用いることができる。

また図示は省略しているが、顕微鏡本体１５には、ステージ３１に励起光Ｌ１及び活性化光Ｌ２を照射する対物レンズや、試料内の蛍光物質から放射された蛍光（観察光）をカメラ３４の受光面に結合させる結像レンズなどが設けられている。上記対物レンズ及び結像レンズは、ステージ３１に載置される試料を観察する本実施形態の顕微鏡装置における結像光学系を構成する。

ステージ３１は、試料とカバーガラスとの界面で励起光Ｌ１及び活性化光Ｌ２を全反射させる全反射照明が可能に構成されている。全反射照明によれば、照明光（励起光Ｌ１、活性化光Ｌ２）が全反射する際にカバーガラスから試料側へにじみ出るエバネッセント光により試料を浅く照明することができる。エバネッセント光が届く範囲は界面から１００〜１５０ｎｍ程度の範囲に限られるため、カバーガラス表面近傍に位置する蛍光物質のみを発光させることができ、バックグランウドの蛍光を著しく低減することで高いＳ／Ｎ比で実現することができる。

なお、本実施形態の顕微鏡本体１５は、上記の全反射照明と、通常の落射照明とを切り替えて使用可能に構成されている。

制御部１４は、顕微鏡装置１０を総合的に制御するコンピュータであり、記憶部１６と、表示部１７と、カメラコントローラ１９とに接続されている。本実施形態において、制御部１４は、少なくとも、これらの装置を制御するための制御信号を生成する制御信号生成機能を備えており、さらに図２に示すように、蛍光画像取得部１４ａと、画像解析部１４ｂと、画像連結部１４ｃとを備えている。

記憶部１６は、例えば半導体メモリやハードディスクなどからなり、制御部１４において使用されるプログラムや制御部１４から供給されるデータ（蛍光画像、分子リストなど）を、制御部１４から読出可能な状態で記憶する。
表示部１７は、例えばモニタ（表示装置）やプリンタ（印刷装置）であり、制御部１４から出力される画像データに基づく映像を表示、印刷する機能を提供する。本実施形態では、表示部１７としてモニタを用いている。
カメラコントローラ１９は、顕微鏡本体１５に接続されたカメラ３４を駆動制御する。カメラコントローラ１９は、制御部１４から入力される制御信号に基づいてカメラ３４を動作させ、試料から放射された蛍光の画像を取得し、取得した蛍光画像を制御部１４に出力する。

制御部１４の蛍光画像取得部１４ａは、カメラコントローラ１９と接続されており、カメラコントローラ１９を介してカメラ３４を作動させることにより試料の蛍光画像Ｒを取得する。取得された蛍光画像Ｒは、直接又は記憶部１６を介して画像解析部１４ｂに出力される。

画像解析部１４ｂは、入力された蛍光画像Ｒを解析することにより蛍光輝点Ｐｆに対応する蛍光物質の位置や蛍光強度を特定し、蛍光物質の位置に対応する分子リストＳを作成する。分子リストＳは、蛍光輝点Ｐｆの解析により得られた重心位置、ピーク強度、ピーク幅等を含むデータ構造体であり、図２では重心位置をプロットした図を用いて分子リストＳ１〜Ｓ４を概念的に表示している。作成された分子リストＳ（分子リストＳ１〜Ｓ４）は、直接又は記憶部１６を介して画像連結部１４ｃに出力される。

画像連結部１４ｃは、視野をずらしながら取得した複数の分子リストＳを連結することによりタイリング画像（試料画像）Ｉｍｔを形成する。例えば図２に示すように、４枚の分子リストＳ１〜Ｓ４の互いに重なり合う領域を利用して位置合わせすることにより、１枚の大きなタイリング画像Ｉｍｔを形成する。作成されたタイリング画像Ｉｍｔは例えば表示部１７に表示される。

顕微鏡装置１０は、制御部１４に備えられた上記の機能を組み合わせて実行することにより、後述する画像形成方法の実施に必要な各種の動作を実現する。したがって、顕微鏡装置１０は、試料の観察領域の蛍光画像を撮像する撮像装置と、試料に励起光Ｌ１を繰り返し照射することにより取得された複数の蛍光画像の各々において蛍光輝点の位置を解析し、分子リストとして構築する画像解析装置と、複数の観察領域において取得された複数の分子リストを、分子リスト同士が重なり合う領域における分子リスト間の蛍光輝点同士の距離に基づいて算出した位置補正情報を用いて連結する画像連結装置の機能を兼ね備えたものである。

次に、顕微鏡装置１０の動作、及び顕微鏡装置１０における画像形成方法について説明する。
図３は、本実施形態の画像形成方法を示すフローチャートである。本実施形態の画像形成方法は、観察領域設定ステップＳ１０１と、画像取得ステップＳ１０２と、画像連結ステップＳ１０３とを有する。
図４は、本実施形態の画像形成方法により得られるタイリング画像の一例を示す図である。図４に示すタイリング画像は、観察領域Ａ〜Ｄに対応する４枚の分子リストＳ１〜Ｓ４（ＳＴＯＲＭ画像）を連結することにより作成される。

観察領域設定ステップＳ１０１は、顕微鏡装置１０の顕微鏡本体１５において、対物レンズ（図示略）とステージ３１とを相対移動させ、試料上の観察領域（視野）を設定するステップＳ１１を含む。
画像取得ステップＳ１０２は、試料に対して活性化光Ｌ２を照射するステップＳ１２と、試料に対して励起光を照射して蛍光画像を取得するステップＳ１３と、撮像動作の終了を判定するステップＳ１４と、蛍光画像を解析して分子リストを形成するステップＳ１５と、を含む。
画像連結ステップＳ１０３は、画像取得ステップＳ１０２で作成された複数の分子リストを連結し、１枚のタイリング画像を形成するステップＳ１７を含む。

まず、顕微鏡装置１０のステージ３１上に、標識として蛍光物質を付与された試料がセットされる。観察対象となる試料は、例えば培養液に浸漬された細胞などである。蛍光物質としては、活性化光Ｌ２を照射されることにより活性化状態へ移行し、活性化状態で活性化光Ｌ２とは異なる波長の励起光Ｌ１を照射されると蛍光を発して不活性化する蛍光物質が用いられる。また、この蛍光物質は、励起光Ｌ１が照射されることで蛍光を発して不活性化した後、再び活性化光Ｌ２が照射されると再び活性化状態となる。具体的には、米国特許公開第２００８／００３２４１４号明細書に記載されたものを用いることができ、例えば、２種類のシアニン染料を結合させた染料対（Ｃｙ３−Ｃｙ５染料対、Ｃｙ２−Ｃｙ５染料対、Ｃｙ３−Ａｌｅｘａ６４７染料対など）を用いることができる。

上記の染料対において、一方の染料（第１の染料）が励起光により発光する光放射部分を形成し、他方の染料（第２の染料）が、光照射に応答して第１の染料を活性化するか、あるいは第１の染料の状態を切り替えるスイッチとして機能する活性化部分を形成する。例えば、Ｃｙ３−Ｃｙ５染料対では、Ｃｙ５が光放射部分であり、Ｃｙ３はＣｙ５を活性化可能な活性化部分である。したがって、Ｃｙ３−Ｃｙ５染料対を含む蛍光物質に、Ｃｙ３の吸収波長に対応する緑色レーザ（５３２ｎｍ）を照射すると、光放射部分であるＣｙ５が活性化され、Ｃｙ５が蛍光状態に移行する。そして、Ｃｙ５が蛍光状態にある蛍光物質に対してＣｙ５の吸収波長に対応する赤色レーザ（６３３ｎｍ）を照射すると、Ｃｙ５が発光するとともに、非活性状態（暗状態）に戻る。
ＳＴＯＲＭでは、蛍光物質における蛍光状態と暗状態とのスイッチング動作を制御することで、試料に付与された蛍光物質のごく一部のみを選択的に発光させ、蛍光物質を１分子レベルで検出可能としている。

ステージ３１への試料のセットが完了したならば、ステージ３１を駆動することにより、試料の観察視野が図４に示す観察領域Ａにセットされる。この最初の観察領域のセット動作は、ユーザーによる手動操作により行ってもよく、制御部１４によりステージ３１を移動させ、予め設定された座標位置にステージ３１を配置することにより行ってもよい。

観察領域のセットが完了したならば、次に、画像取得ステップＳ１０２に移行する。
画像取得ステップＳ１０２では、試料に対して制御された活性化光Ｌ２を照射するステップＳ１２と、試料に対して励起光を照射して蛍光画像を取得するステップＳ１３とを繰り返し実行する処理（ＳＴＯＲＭ撮影処理）と、取得した複数の蛍光画像を解析して分子リストを作成する処理（ステップＳ１５；ＳＴＯＲＭ画像処理）とが実行される。

まず、ステップＳ１２では、活性化照明系１３から射出される活性化光Ｌ２が顕微鏡本体１５に供給され、ステージ３１上の試料に対して活性化光Ｌ２が照射される。このとき、励起照明系１１のシャッタ２２が閉状態とされることで励起光Ｌ１が遮断され、顕微鏡本体１５には活性化光Ｌ２のみが入射する。

活性化照明系１３では、活性化光Ｌ２がスキャナ４３により位置制御されてダイクロイックミラー３３に入射し、ダイクロイックミラー３３で反射された活性化光Ｌ２がステージ３１上の観察視野の所定位置に照射される。すなわち、スキャナ４３により活性化光Ｌ２が観察視野全域に対して走査され、視野全域の試料に対して均一な強度の活性化光Ｌ２が照射される。ただし、このとき照射される活性化光Ｌ２の強度レベルは非常に低く抑えられており、これにより試料に含まれる蛍光物質のうちの一部のみが確率的に活性化される。なお、活性化光Ｌ２は全反射照明、落射照明のいずれの形態で試料に照射してもよい。

次に、ステップＳ１３に移行すると、活性化照明系１３が活性化光Ｌ２を射出しない状態とされるとともに、励起照明系１１のシャッタ２２が開状態とされる。これにより、レーザ光源２１から射出される励起光Ｌ１が全反射ミラー３２を介して顕微鏡本体１５に供給され、励起光Ｌ１が観察視野全域に照射される。すると、活性化光Ｌ２で活性化されている蛍光物質のみが選択的に発光し、蛍光を発した蛍光物質は不活性状態に移行する。制御部１４の蛍光画像取得部１４ａは、この蛍光物質が発する蛍光を、カメラコントローラ１９を介してカメラ３４を動作させることで撮影し、蛍光画像Ｒ（図２参照）を取得する。蛍光画像取得部１４ａは、取得した蛍光画像Ｒを必要に応じて記憶部１６に記憶させる。

次に、ステップＳ１４において、ＳＴＯＲＭ撮影処理が終了したか否かが判定される。すなわち、予め設定された枚数の蛍光画像Ｒの取得が終了したか否かが判定される。蛍光画像Ｒの枚数が予定枚数（例えば５０００枚）に達していない場合には、ステップＳ１２に戻り、上述したステップＳ１２〜Ｓ１４の実行動作が繰り返される。

なお、ステップＳ１３において発光した蛍光物質は、発光後に不活性化されるため、ステップＳ１４からステップＳ１２に戻って活性化光Ｌ２の照射が再度行われる際には、試料に含まれる蛍光物質は不活性状態に戻っている。そのため、ステップＳ１２を再実行するたびに、活性化される蛍光物質は確率的に異なるものとなり、その後のステップＳ１３で取得される蛍光画像Ｒは、前のサイクルで取得された蛍光画像Ｒと異なる蛍光輝点のパターンを示すものとなる。

ステップＳ１４において終了と判定された場合には、ステップＳ１５に移行する。
ステップＳ１５では、制御部１４の画像解析部１４ｂにより、記憶部１６に蓄積されている数百〜数万枚の蛍光画像Ｒが解析され、分子リストＳ１が作成される。

具体的に、画像解析部１４ｂは、図２に示した蛍光画像Ｒから蛍光輝点Ｐｆを特定し、その強度ピークをＧａｕｓｓｉａｎ関数又は楕円Ｇａｕｓｓｉａｎ関数にフィッティングすることで、蛍光輝点Ｐｆに対応する蛍光物質の位置、蛍光輝点Ｐｆの強度等を特定する。例えば、蛍光輝点Ｐｆの強度ピークを二次元Ｇａｕｓｓｉａｎ関数にフィッティングし、ピークの中心位置（重心位置）を特定することにより蛍光物質の位置を特定する。また蛍光輝点Ｐｆの輝度を、観測された強度ピークからバックグラウンドの蛍光輝度を差し引くことにより算出する。このようにして数百〜数万枚の蛍光画像Ｒについて重心位置の座標値や輝度値を取得し、それらを連結したデータ構造体として分子リストＳ１を作成する。作成された分子リストＳ１は、記憶部１６に記憶される。

また、蛍光画像Ｒを取得する際に、光路中にシリンドリカルレンズを介在させて蛍光輝点の撮像を行う三次元方式のＳＴＯＲＭ撮像処理（下記文献参照）を採用している場合には、試料の平面方向（ＸＹ方向）における蛍光物質の位置特定に加えて、試料の厚さ方向（Ｚ方向）における蛍光物質の位置特定も行われる。具体的には、画像解析部１４ｂは、蛍光輝点Ｐｆを解析する際に、蛍光輝点Ｐｆの強度ピークの楕円率からＺ方向の座標を算出し、分子リストＳ１に追加する。したがって、分子リストＳ１は、蛍光画像Ｒに含まれる蛍光輝点Ｐｆのそれぞれについて、Ｘ座標、Ｙ座標、Ｚ座標、輝度値の情報をリスト化したものとなる。

（文献）Bo Huang,et.al.Science 319,810-813(2008)

なお、蛍光画像Ｒの蛍光輝点Ｐｆを同定する際に、輪郭の曖昧な蛍光輝点や径が大きすぎる蛍光輝点、平面形状が曲がっている蛍光輝点などは、Ｇａｕｓｓｉａｎ関数にフィッティングすることができなかったり、正確な重心位置の特定が困難であったりするため、蛍光輝点Ｐｆを同定する際にこれらを除外してもよい。また、分子リストＳ１は、上記した位置情報及び輝度情報以外の情報（例えば蛍光輝点Ｐｆの楕円率など）を含んでいてもよい。

上記の動作により作成された分子リストＳ１は、観察視野における蛍光物質の位置情報を含んでおり、これをＸＹ平面上にプロットすると、図４に菱形の点の集合として例示するＳＴＯＲＭ画像が得られる。

次に、ステップＳ１６では、全ての観察領域（図４に示す分子リストＳ１〜Ｓ４に対応する観察領域Ａ〜Ｄ）について画像取得動作が終了したか否かが判定される。ここでは、観察領域Ａに対応する分子リストＳ１の取得までしか完了していないため、終了していないと判定され、観察領域設定ステップＳ１０１へ戻って分子リストＳ２の取得動作が開始される。

分子リストＳ２を取得する動作における観察領域設定ステップＳ１０１では、制御部１４は、ステージ３１を動作させ、観察視野を図４に示す観察領域Ａから観察領域Ｂへ、Ｘ軸方向のプラス側に所定距離だけ移動させて再設定する。このとき、制御部１４は、観察領域Ｂを観察領域Ａと部分的に重なる領域を有するように設定する。例えば、観察領域Ａの一辺の長さが２５μｍ（２５０００ｎｍ）であるときに、観察領域Ｂを、観察領域ＡからＸ軸方向に２０μｍ（２００００ｎｍ）移動した位置に設定し、観察領域Ａ、Ｂ間に、５μｍ（５０００ｎｍ）の幅を有する帯状の重なり領域を形成する。

観察領域の設定が完了したならば、設定された観察領域Ｂに対して画像取得ステップＳ１０２が実行される。すなわち、蛍光画像取得部１４ａにより数百〜数万枚の蛍光画像Ｒが取得され（ステップＳ１２〜Ｓ１４）、その後、画像解析部１４ｂにより観察領域Ｂに対応する分子リストＳ２が作成される（ステップＳ１５）。

分子リストＳ２の作成が完了した後、ステップＳ１６を経由して観察領域設定ステップＳ１０１に戻り、図４に示す分子リストＳ３の作成が開始される。観察領域設定ステップＳ１０１では、観察視野を観察領域Ｂから観察領域Ｃへ、Ｙ軸方向のプラス側に所定距離だけ移動させて再設定する。このとき、制御部１４は、観察領域Ｃを観察領域Ｂと部分的に重なるように設定する。例えば、観察領域Ｂの一辺の長さが２５μｍであるときに、観察領域Ｃを、観察領域ＢからＹ軸方向に２０μｍ移動した位置に設定し、観察領域Ｂ、Ｃ間に、Ｙ軸方向に５μｍの幅を有する帯状の重なり領域を形成する。

観察領域の設定が完了したならば、設定された観察領域Ｃに対して画像取得ステップＳ１０２が実行される。すなわち、蛍光画像取得部１４ａにより数百〜数万枚の蛍光画像Ｒが取得され（ステップＳ１２〜Ｓ１４）、その後、画像解析部１４ｂにより観察領域Ｃに対応する分子リストＳ３が作成される（ステップＳ１５）。

分子リストＳ３の作成が完了した後、ステップＳ１６を経由して観察領域設定ステップＳ１０１に戻り、図４に示す分子リストＳ４の作成が開始される。観察領域設定ステップＳ１０１では、観察視野を観察領域Ｃから観察領域Ｄへ、Ｘ軸方向のマイナス側に所定距離だけ移動させて再設定する。このとき、制御部１４は、観察領域Ｄを観察領域Ｃと部分的に重なるように設定する。例えば、観察領域Ｃの一辺の長さが２５μｍであるときに、観察領域Ｄを、観察領域ＣからＸ軸方向に−２０μｍ移動した位置に設定し、観察領域Ｃ、Ｄ間に、Ｘ軸方向に５μｍの幅を有する帯状の重なり領域を形成する。

観察領域の設定が完了したならば、設定された観察領域Ｄに対して画像取得ステップＳ１０２が実行される。すなわち、蛍光画像取得部１４ａにより数百〜数万枚の蛍光画像Ｒが取得され（ステップＳ１２〜Ｓ１４）、その後、画像解析部１４ｂにより観察領域Ｄに対応する分子リストＳ４が作成される（ステップＳ１５）。

分子リストＳ４の作成が完了した後のステップＳ１６では、観察領域Ａ〜Ｄのそれぞれに対応する分子リストＳ１〜Ｓ４の作成が完了しているため、終了と判定され、画像連結ステップＳ１０３へ移行する。

画像連結ステップＳ１０３では、上記ステップで作成された４つの分子リストＳ１〜Ｓ４を１つの分子リストに連結する動作が行われる。
図５は、画像連結ステップＳ１０３の詳細を示すフローチャートである。図６は、分子リスト間の重なり領域の抽出動作に関する説明図である。

図５に示すように、画像連結ステップＳ１０３は、連結する分子リストを選択するステップＳ２１と、分子リストの重なり領域のデータを抽出するステップＳ２２と、データ間の距離計算を行うステップＳ２３と、同一データペアとなる候補を選出するステップＳ２４と、データペアの候補数を判定するステップＳ２５と、各データペアにおける輝度値の一致度を比較するステップＳ２６と、同一データペアを確定するステップＳ２７と、分子リスト間の位置補正情報を計算するステップＳ２８と、終了判定を行うステップＳ２９と、分子リストを連結するステップＳ３０と、を有する。

まず、ステップＳ２１において、制御部１４の画像連結部１４ｃは、連結される２つの分子リストを選択し、これらを記憶部１６から読み出すことにより、データ処理可能な状態とする。ここでは、図６に示すように、分子リストＳ１と分子リストＳ２を連結する場合について説明する。

次に、ステップＳ２２において、画像連結部１４ｃは、分子リストＳ１と分子リストＳ２の重なり領域からデータを抽出する。
先に図４を参照して説明したように、分子リストＳ２に対応する観察領域Ｂは、観察領域設定ステップＳ１０１において、分子リストＳ１に対応する観察領域Ａと部分的に重なるように設定される。そのため、図６に示すように、分子リストＳ１、Ｓ２は、試料の同一部位を観察した画像を含んでいる。具体的には、分子リストＳ１には、分子リストＳ２側の辺（図示右辺）に沿って帯状の重なり領域Ｓ１ｘが形成されており、分子リストＳ２には、分子リストＳ１側の辺（図示左辺）に沿って帯状の重なり領域Ｓ２ｘが形成されている。これらの重なり領域Ｓ１ｘ、Ｓ２ｘは、試料の同一部位における蛍光輝点のデータ（座標値、輝度値）を含んでいる。

重なり領域Ｓ１ｘ、Ｓ２ｘは、観察領域設定ステップＳ１０１において観察領域Ｂが設定された時点で決定されているため、画像連結部１４ｃは、観察領域設定ステップＳ１０１において用いた観察領域Ａ、Ｂの位置情報に基づいて、分子リストＳ１、Ｓ２の所定領域を重なり領域Ｓ１ｘ、Ｓ２ｘとして設定する。そして、図６に示すように、重なり領域Ｓ１ｘに含まれる蛍光輝点のデータＡ１〜Ａ１１と、重なり領域Ｓ２ｘに含まれる蛍光輝点のデータＢ１〜Ｂ１１を抽出する。

次に、ステップＳ２３では、ステップＳ２２で抽出されたデータＡ１〜Ａ１１と、データＢ１〜Ｂ１１とについて、全てのデータ間の距離（相対位置情報）が算出される。すなわち、データＡ１−Ｂ１、データＡ１−Ｂ２、データＡ１−Ｂ３、…、データＡ１１−Ｂ１０、データＡ１１−Ｂ１１のように、全てのデータの組み合わせについて、ＸＹ平面（観察領域の平面）における距離計算が実行される。

下記の表１は重なり領域Ｓ１ｘに含まれるデータの一部（データＡ１〜Ａ５）について具体例を示したものである。表２は重なり領域Ｓ２ｘに含まれるデータの一部（データＢ１〜Ｂ５）について具体例を示したものである。表１及び表２において、「Ｘ」「Ｙ」「Ｚ」はそれぞれの蛍光輝点に対応する蛍光物質の位置座標であり、「Ｉ」は蛍光輝点の輝度値である。

なお、以下の説明では、演算処理の具体的内容を理解しやすくするために、一部のデータ（Ａ１〜Ａ５、Ｂ１〜Ｂ５）についてのみ演算処理を例示して説明する。また表１，２に示す数値も、理解を助けるために用意したものであり、図６に示すデータＡ１〜Ａ５、Ｂ１〜Ｂ５の位置とは一致しない。

ステップＳ２３では、下記表３に示すように、各データ間のＸＹ平面における距離が算出される。

次に、ステップＳ２４では、ステップＳ２３で算出した距離の値から、データＡ１〜Ａ５と、データＢ１〜Ｂ５とで、蛍光輝点が同一であるデータペアの候補を選出する。具体的には、まず、表３から距離の値が同じであるデータペアを抽出する。抽出結果を以下の表４に示す。

本実施形態の例では、表４に示すように、距離の値が同一であり、そのペア数が最大であるデータペア群が４種類存在し、いずれのペア数も２である。したがって、ステップＳ２４では、それぞれ２つのデータペアからなる４種類のデータペア群が同一データペア候補として選出される。そして、ステップＳ２５では、同一データペア候補が複数種類存在すると判定され、ステップＳ２６に移行する。

ステップＳ２６では、ステップＳ２４で候補に挙げられた４種類のデータペア群について、それぞれのデータペア群内での輝度値の一致度が比較される。より詳しくは、表４に示すペア１−１、ペア１−２において、データＡ１、Ｂ１、Ａ３、Ｂ３の輝度値はいずれも１００であり、一致度は１００％である。

これに対して、ペア２−１、２−２では、データＡ２とデータＢ１、データＡ４とデータＢ３の輝度値はいずれも一致しておらず、一致度は０％である。ペア３−１、３−２についても、データＡ２とデータＢ２、データＡ４とデータＢ４の輝度値はいずれも一致しておらず、一致度は０％である。ペア４−１、４−２では、データＡ３とデータＢ１の輝度値は一致しているが、データＡ５とデータＢ３の輝度値は一致しておらず、一致度は５０％である。

以上の結果から、ステップＳ２７において、輝度値の一致度が最も高いペア１−１、１−２が、同一データペアとして確定される。なお、距離の値が最大であるデータペアが１種類のみである場合には、ステップＳ２５からステップＳ２７へ移行し、上記１種類のデータペアが同一データペアとして確定される。

上記ステップＳ２７までの一連の動作により、重なり領域Ｓ１ｘと重なり領域Ｓ２ｘに共通する蛍光輝点のデータのペア（同一データペア）を特定することができる。
重なり領域Ｓ１ｘと重なり領域Ｓ２ｘは、試料上の同一部位における分子リストであるため、同一の蛍光輝点は同一座標に観測されるはずであるが、ステージ３１の位置精度に起因する位置ずれが生じる。そして、この位置ずれは、重なり領域Ｓ１ｘと重なり領域Ｓ２ｘとに共通する蛍光輝点については、試料の平面方向（ＸＹ方向）における一定の位置ずれとして観測され、蛍光輝点が異なるものであれば蛍光輝点間の距離が上記位置ずれの値とは異なる値になる。
そこで本実施形態の画像形成方法では、ステップＳ２３において全てのデータ間の距離を算出し、ステップＳ２４においてデータ間の距離が等しいデータペアからなるデータペア群を抽出するとともに、最もペア数が多いデータペア群を構成するデータペアを、原則的に同一データペアとすることとした。

通常、それぞれの分子リストＳ１〜Ｓ４は数万〜数百万の蛍光輝点のデータを含んでおり、重なり領域Ｓ１ｘ、Ｓ２ｘの面積率が分子リストＳ１、Ｓ２の１０％であるとしても、数千〜数十万の蛍光輝点のデータを含む。そして、これらの全ての蛍光輝点について距離を算出した場合に、重なり領域Ｓ１ｘ、Ｓ２ｘに共通の蛍光輝点では距離の値が同じになるが、異なる蛍光輝点間の距離は全くランダムであり、確率的に一致する場合があるのみである。したがって、距離の値が同じであるデータペアの数をカウントすれば、共通の蛍光輝点の位置ずれに対応する距離の値が突出して多くなると考えられる。よって通常は、距離の値が一致するペア数が最も多いものを同一データペアとして確定してもよい。

しかし、先の説明で用いたように重なり領域Ｓ１ｘ、Ｓ２ｘのデータ数が少ない場合には、ペア数が偶然に一致する場合が考えられる。この場合には、距離の値だけでは同一データペアにおける位置ずれであるのか、単に距離の値が偶然に一致したものであるのか判別できないので、各データペアにおける輝度値の一致度を比較し、その一致度が最も高いものを同一データペアとして確定することとした。
ＳＴＯＲＭでは、蛍光物質の発光単位の大きさが固定されているために、同一の蛍光輝点は同じ輝度で発光する。そこで、同一データペアの候補において各データペアを構成する２つのデータの輝度値が一致していれば、高い確度でそれらは同じ蛍光輝点であると判定することができる。

以上の動作により、重なり領域Ｓ１ｘ、Ｓ２ｘにおける同一データペアが確定されたならば、ステップＳ２８において、分子リストＳ１、Ｓ２間の位置補正情報が算出される。具体的には、同一データペアを構成する２つのデータのＸ座標の差（ΔＸ）、及びＹ座標の差（ΔＹ）が、位置補正情報として設定される。表１〜４に示した例では、データＡ１、Ｂ１間でＸ座標及びＹ座標を減算した値（ΔＸ，ΔＹ）＝（−５，０）となる。

なお、分子リストＳ１、Ｓ２が、Ｚ座標を含むデータを有している場合には、同一データペアを構成する２つのデータのＺ座標の差（ΔＺ）を算出し、位置補正情報に追加する。これにより、分子リストを連結する際に、試料の厚さ方向についても位置合わせすることができる。以下で説明する分子リストＳ２、Ｓ３間の位置補正情報、分子リストＳ３、Ｓ４間の位置補正情報についても同様である。

次に、ステップＳ２９において、全ての分子リスト間の位置補正情報の計算が終了したか否かが判定される。ここでは、分子リストＳ１、Ｓ２間の位置補正情報までしか計算が完了していないため、未終了と判定され、ステップＳ２１に戻り、ステップＳ２１〜Ｓ２８が再実行される。

２回目のステップＳ２１では、分子リストＳ２と分子リストＳ３とが選択され、続くステップＳ２２では、分子リストＳ２と分子リストＳ３との重なり領域のデータが抽出される。ステップＳ２３〜Ｓ２８の一連の動作は、先の分子リストＳ１、Ｓ２の位置補正情報を取得する動作と同様である。以上の動作により、分子リストＳ２と分子リストＳ３との位置補正情報が取得される。

次に、ステップＳ２９において、全ての計算が終了したか否かが再び判定される。ここでは、分子リストＳ２、Ｓ３間の位置補正情報までしか計算が完了していないため、未終了と判定され、ステップＳ２１に戻り、ステップＳ２１〜Ｓ２８が再実行される。

３回目のステップＳ２１では、分子リストＳ３と分子リストＳ４とが選択され、続くステップＳ２２では、分子リストＳ３と分子リストＳ４との重なり領域のデータが抽出される。ステップＳ２３〜Ｓ２８の一連の動作は、先の分子リストＳ１、Ｓ２の位置補正情報を取得する動作と同様である。以上の動作により、分子リストＳ３と分子リストＳ４との位置補正情報が取得される。

次に、ステップＳ２９において、全ての計算が終了したか否かが再び判定される。ここでは、分子リストＳ３、Ｓ４間の位置補正情報まで計算が完了しているので終了と判定され、ステップＳ３０に移行する。

次に、ステップＳ３０において、画像連結部１４ｃは、以上の動作により得られた位置補正情報を用いて、分子リストＳ１〜Ｓ４を順に連結する。本実施形態の場合、まず、分子リストＳ１を基準の分子リストに設定する。また分子リストＳ１に連結される分子リストＳ２の各データの座標値を、位置補正情報を用いて補正する。そして、補正された分子リストＳ２を分子リストＳ１に追加する。

このとき、分子リストＳ１と補正後の分子リストＳ２を単に連結すると、重なり領域Ｓ１ｘ、Ｓ２ｘにおいて共通する蛍光輝点のデータが重複するので、連結処理時に重複データを除外するようにしてもよい。しかし、連結時の重複データの除外は必須ではない。重複データはＸＹ座標が一致しており、タイリング画像を表示する際には１つのドットとして表示されるため、表示処理の無駄は生じるもののタイリング画像の品質にはほとんど影響しないからである。

次に、分子リストＳ１、Ｓ２を連結した分子リスト（連結分子リストＴＳ１２と称する。）に対して、分子リストＳ３を連結する。このとき、連結分子リストＴ１２に含まれる分子リストＳ２のデータの位置情報は、分子リストＳ１、Ｓ２間の位置補正情報を用いて補正された値であるため、連結分子リストＴＳ１２に対して分子リストＳ３を連結するに際しては、分子リストＳ３のデータの座標値を、分子リストＳ２、Ｓ３間の位置補正情報を用いて補正した後、さらに分子リストＳ１、Ｓ２間の位置補正情報を用いて補正する。これにより、連結分子リストＴＳ１２と分子リストＳ３との重なり領域のデータを正確に重ね合わせた上で、分子リストＳ１〜Ｓ３が連結された連結分子リストＴＳ１２３を得ることができる。

次に、連結分子リストＴＳ１２３に対して、分子リストＳ４を連結する。このときにも上記と同様に、分子リストＳ４のデータの座標値を、分子リストＳ３、Ｓ４間の位置補正情報、分子リストＳ２、Ｓ３間の位置補正情報、及び分子リストＳ１、Ｓ２間の位置補正情報により順に補正する。そうして得られた補正後の分子リストＳ４を、連結分子リストＴＳ１２３に追加することにより、分子リストＳ１〜Ｓ４が連結された連結分子リストＴＳ１２３４を得ることができる。

以上の工程により得られる連結分子リストＴＳ１２３４を構成するデータのＸＹ座標をプロットすると、図４に示すようなタイリング画像を得ることができる。

なお、上記のステップＳ３０では、分子リストＳ１に対して、分子リストＳ２〜Ｓ４を順に連結する場合について説明したが、逆順に連結してもよい。すなわち、分子リストＳ４と分子リストＳ３を連結した後、連結後の分子リストに対して分子リストＳ２を連結し、最後に分子リストＳ１を連結してもよい。このようにすれば、連結する分子リストの補正が１回のみで済むため、連結時の演算処理を削減することができ、高速にタイリング画像を作成することができる。

また、上記実施形態では、画像連結ステップＳ１０３において、ステップＳ２３のデータ間距離の算出とステップＳ２４の同一データペア候補の選出を行った後、ステップＳ２６の同一データペアの候補において輝度値の一致度の比較を行うこととしたが、これに限られない。例えば、まず、重なり領域Ｓ１ｘ、Ｓ２ｘのそれぞれのデータについての輝度値の比較を行って輝度値が一致するデータのペアを選出し、その後に、それぞれのデータペアについて、データ間距離の算出を行うことにより同一データペアを選出することもできる。

また上記実施形態では、ステップＳ２３においてデータ間の距離を計算することとしたが、これに限られない。ステップＳ２３では重なり領域Ｓ１ｘのデータと、重なり領域Ｓ２ｘのデータとの間における相対位置情報が取得できればよいため、上記データ間の距離に代えて、データ間を結んだ線分の角度を算出してもよい。角度を用いた場合には、ステップＳ２４において、角度の値が同じであるデータのペアからなるデータペア群に分類し、ペア数の最も多いデータペア群に属するデータのペアを同一データペアの候補とする。

また上記実施形態では、ステップＳ２６において、各データペアの輝度値の一致度を比較することとしたが、輝度値に代えて、データのＺ座標の値を用いてもよい。
具体的に、表４に示したペア１−１では、データＡ１（Ｚ：１００）とデータＢ１（Ｚ：１００）のＺ座標値が一致しており、データＡ３（Ｚ：１２０）とデータＢ３（Ｚ：１２０）もＺ座標値が一致している。これに対して、ペア３−１ではデータＡ２（Ｚ：１１０）とデータＢ２（Ｚ：６０）のＺ座標値は一致しておらず、ペア３−２についてもデータＡ４（Ｚ：１３０）とデータＢ４（Ｚ；６０）のＺ座標値は一致していない。したがって、データのＺ座標値を利用することにより同一データペアを確定することができる。

（第２実施形態）
上記実施形態では、試料の平面方向（ＸＹ方向）に配置された観察領域Ａ〜Ｄのタイリング画像を形成する場合について説明したが、試料の厚さ方向（Ｚ方向）に複数の観察領域を設定して取得した分子リストを連結することもできる。

図７は、第２実施形態に係る画像形成方法の説明図である。本実施形態では、図７に示すように、Ｚ方向に並んだ４つの観察領域ａ、ｂ、ｃ、ｄに対応する分子リストＺ１、Ｚ２、Ｚ３、Ｚ４をタイリングすることにより３Ｄタイリング画像を形成する場合について説明する。

各々の分子リストＺ１〜Ｚ４の作成手順は、図３に示したフローに準ずる。すなわち、観察領域設定ステップＳ１０１において観察視野をＺ方向にずらして観察領域ａ〜ｄを設定しつつ、先の実施形態と同様の画像取得ステップＳ１０２を実行することで、分子リストＺ１〜Ｚ４を順に作成する。

ＳＴＯＲＭ画像の取得に際して、観察領域ａ〜ｄは、それぞれ隣り合う観察領域と部分的に重なるように設定される。これにより、分子リストＺ１、Ｚ２の境界部分には、重なり領域Ｌｚ１が形成され、分子リストＺ２、Ｚ３の境界部分には重なり領域Ｌｚ２が形成され、分子リストＺ３、Ｚ４の境界部分には重なり領域Ｌｚ４が形成される。

画像連結ステップＳ１０３では、重なり領域Ｌｚ１〜Ｌｚ３のデータを利用して分子リストを位置合わせするための位置補正情報を算出する。

まず、ステップＳ２１において、制御部１４の画像連結部１４ｃは、連結される２つの分子リストＺ１、Ｚ２を選択する。次に、ステップＳ２２において、画像連結部１４ｃは、分子リストＺ１と分子リストＺ２の重なり領域Ｌｚ１からデータを抽出する。

次に、ステップＳ２３では、ステップＳ２２で抽出された、重なり領域Ｌｚ１に属する分子リストＺ１のデータと、分子リストＺ２のデータとについて、データ間の距離（相対位置情報）が算出される。このとき、第１実施形態ではデータのＸＹ座標を用いたが、第２実施形態では分子リストをＺ方向に連結するので、Ｚ座標を含む平面におけるデータ間の距離を算出する。具体的には、データのＸＺ座標、又はＹＺ座標を用いて、データ間の距離を算出する。なお、ＸＺ平面，ＹＺ平面以外のＺ軸を含む任意の面にデータを投影したときの座標値を用いてデータ間の距離を算出してもよい。

次に、ステップＳ２４では、ステップＳ２３で算出した距離の値から、分子リストＺ１に属するデータと、分子リストＺ２に属するデータとで、蛍光輝点が同一であるデータペアの候補を選出する。すなわち、算出した距離の値が同じであるデータペアからなるデータペア群を抽出する。そして、ステップＳ２５においてペア数が最も多いデータペア群が複数あるか否かが判定され、複数存在する場合には、ステップＳ２６へ移行する。一方、ペア数が最も多いデータペア群が１つのみである場合にはそのデータペア群のデータペアを同一データペアとして確定する（ステップＳ２７）。

ステップＳ２６では、複数のデータペア群について、データペアを構成するデータの輝度値の一致度が比較され、輝度値の一致度が最も高いデータペア群のデータペアを同一データペアとして確定する（ステップＳ２７）。

ステップＳ２７までの一連の動作により、重なり領域Ｌｚ１において共通する蛍光輝点のデータのペア（同一データペア）を特定することができる。その後、ステップＳ２８において、分子リストＺ１、Ｚ２間の位置補正情報が算出される。具体的には、同一データペアを構成する２つのデータの座標値の差が位置補正情報として設定される。このとき、先のステップＳ２３においてＸＺ座標を用いて距離を算出した場合には、Ｘ座標の差（ΔＸ）とＺ座標の差（ΔＺ）を、位置補正情報として設定する。次いで、同一データペアにおけるＹ座標の差（ΔＹ）を算出し、位置補正情報に追加する。これにより、分子リストＺ１、Ｚ２間のＸＹＺ方向における位置補正情報を得ることができる。

以上のステップＳ２１〜Ｓ２７の動作を、分子リストＺ２と分子リストＺ３、及び分子リストＺ３と分子リストＺ４とについて繰り返すことで、分子リストＺ１、Ｚ２間の位置補正情報、分子リストＺ２、Ｚ３間の位置補正情報、及び、分子リストＺ３、Ｚ４間の位置補正情報を得ることができる。

その後、ステップＳ３０において、上記の位置補正情報を用いて分子リストＺ２〜Ｚ４の座標値を補正しつつ連結して連結分子リストを作成する。作成された連結分子リストのデータをＸＹＺ空間にプロットすれば、Ｚ方向に並んだ４つの観察領域ａ〜ｄを含む３Ｄタイリング画像を得ることができる。

なお、本実施形態では、ステップＳ２８において、ΔＸ、ΔＹ、ΔＺの３種類の補正値を含む位置補正情報を算出することとしたが、本実施形態のように観察領域ａ〜ｄをＺ方向にずらしている場合、観察領域の変更時に試料を平面方向（ＸＹ方向）に移動させる必要がないため、ＸＹ方向のずれが生じることはほとんど無いと考えられる。したがって、位置補正情報としては、ΔＸ、ΔＹはいずれか一方のみであってもよい。具体的には、データ間距離の算出にＸＺ座標を用いている場合には、位置補正情報としてΔＸ、ΔＺのみを取得してもよい。

（第３実施形態）
上記実施形態では、活性化用と励起用に波長の異なる２つのレーザを用いる顕微鏡装置について説明してきた。一方、１つの短波長レーザのみを用いる超解像顕微鏡技術として、ｄＳＴＯＲＭ（direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy）が知られている（例えば、論文：Applied Physics B(2008)93: 725-731, Photoswitching microscopy with standard fluorophores、 S.van de Linde・R.Kasper・ M.Heilemann・ M.Sauer）。ｄＳＴＯＲＭによれば、従来のＳＴＯＲＭのように活性化用のレーザを照射することなく、蛍光物質の自発的な明滅を元に、少数の蛍光物質のみの画像を取得することができる。

第３実施形態の顕微鏡装置は、このｄＳＴＯＲＭを適用した構成である。
このような顕微鏡装置としては、図１に示した顕微鏡装置１０から活性化照明系１３を省略した構成を採用することができる。かかる構成の顕微鏡装置では、励起照明系１１によって所定波長の励起光を照射されると自発的に明滅する蛍光物質を含む試料を顕微鏡本体１５のステージ３１上の観察領域に配置し、この観察領域に対して、励起照明系１１から励起光を照射することで蛍光物質を明滅させ、蛍光物質から放射される光をカメラ３４により撮像することで蛍光画像を取得する。

第３実施形態に係る顕微鏡装置において、制御部１４は、観察領域に対して励起光を照射する動作と、観察領域の励起光で励起された蛍光画像を取得する動作とを交互に複数回繰り返すことで複数の蛍光画像を取得し、複数の蛍光画像から分子リストを生成する。このように本実施形態の場合、試料から蛍光を生じさせる手段として、活性化照明系１３ではなく、励起照明系１１が用いられる。

本実施形態においても、得られる分子リストは第１実施形態と同等のものであるため、全く同様の手順によって複数の分子リストを連結することができ、広視野のタイリング画像を生成することができる。

（第４実施形態）
先の第１実施形態では、活性化後に励起光を照射すると蛍光を発して不活性化する蛍光物質を用いた顕微鏡技術（ＳＴＯＲＭ）に関して説明したが、蛍光物質の種類が異なる同様の技術として、ＰＡＬＭ（Photoactivated Localization Microscopy）も知られている（例えば、特表２００８−５４２８２６号公報、論文：Proposed method for molecular optical imaging, Optics Letters, vol.20, No.3, (Feb.1, 1995), pp.237-239.）。

先の第１実施形態の分子リストの作成手順は、ＰＡＬＭを用いる場合にもそのまま適用され、顕微鏡装置１０の構成変更も不要である。顕微鏡装置１０において、制御部１４は、観察領域に対して所定の照射強度の活性化光を照射する動作と、励起光を照射して蛍光画像を取得する動作とを交互に複数回繰り返すことで複数の蛍光画像を取得し、複数の蛍光画像から分子リストを生成する。

ＰＡＬＭを用いる場合には、試料に付与される蛍光物質が変更される。具体的には、蛍光物質として、所定波長の活性化光を照射されると活性化し、活性化状態で活性化光とは異なる波長の励起光を照射されると蛍光を発する蛍光物質が用いられる。

このような蛍光物質としては、クラゲやサンゴ由来の蛍光タンパク質の変異種が挙げられる。例えば、クラゲ由来の蛍光タンパク質の変異種であるPA-GFPは、活性化光の照射により蛍光強度が大幅に上昇し、PS-CFPは、活性化光の照射により他の色の蛍光を発光可能に変化する。また、サンゴ由来の蛍光タンパク質の変異種であるDronpaは、活性化光の照射により励起波長の光の照射による発光が可能になり、Kaedeは、活性化光の照射により蛍光色が変化する。

本実施形態においても、得られる分子リストは第１実施形態と同等のものであるため、全く同様の手順によって複数の分子リストを連結することができ、広視野のタイリング画像を生成することができる。

Ａ１〜Ａ１１，Ｂ１〜Ｂ１１…データ、ａ〜ｄ，Ａ〜Ｄ…観察領域、Ｒ…蛍光画像、Ｓ，Ｓ１〜Ｓ４，Ｚ１〜Ｚ４…分子リスト、１０…顕微鏡装置、１２…照明光学系、３４…カメラ（撮像装置）、Ｌｚ１〜Ｌｚ４，Ｓ１ｘ，Ｓ２ｘ…重なり領域、Ｌ１…励起光、Ｌ２…活性化光、Ｐｆ…蛍光輝点

Claims (16)

1. 活性化光及び励起光の照射、又は励起光の照射により蛍光を発する蛍光物質を含む試料に、前記活性化光及び前記励起光、又は前記励起光を照射する照明光学系と、
   前記試料の観察領域の蛍光画像を撮像する撮像装置と、
   前記試料に前記励起光を繰り返し照射することにより取得された複数の蛍光画像の各々において蛍光輝点の位置を解析し、分子リストとして構築する画像解析装置と、
   複数の前記観察領域において取得された複数の前記分子リストを、前記分子リスト同士のうち前記試料の同一部位における前記分子リスト間の前記蛍光輝点同士の相対位置情報に基づいて算出した位置補正情報を用いて連結する画像連結装置と、を備え、
   前記画像連結装置は、
   複数の前記分子リストから連結対象とする第１の前記分子リストと第２の前記分子リストを選択する動作と、
   前記第１の分子リストと前記第２の分子リストから、それぞれ、前記分子リスト同士の前記同一部位に属する蛍光輝点のデータを抽出する動作と、
   前記第１の分子リストから抽出された複数の前記データと、前記第２の分子リストから抽出された複数の前記データとの相対位置情報をそれぞれ算出する動作と、
   算出した前記相対位置情報に基づいて、前記第１の分子リストおよび前記第２の分子リストにおけるデータを分類する動作と、
   前記分類したデータに基づいて、前記第１の分子リストにおけるデータと前記第２の分子リストにおけるデータとの位置ずれを補正するための位置補正情報を算出する動作と、
   を実行する顕微鏡装置。
2. 前記画像連結装置は、前記相対位置情報の算出に前記データのペアを用いており、
   前記相対位置情報の算出に用いた前記データのペアを、前記相対位置情報の値ごとのデータペア群に分類する、請求項１に記載の顕微鏡装置。
3. 前記画像連結装置は、最もペア数の多い前記データペア群に属する前記ペアを同一データペアとして選択し、前記同一データペアにおける前記相対位置情報を位置補正情報として算出する、請求項２に記載の顕微鏡装置。
4. 前記位置補正情報を算出する動作において、最もペア数の多い前記データペア群が複数存在する場合に、前記データに含まれる輝度値の一致度が最も高い前記データペア群に属する前記ペアを前記同一データペアとして選択し、前記同一データペアにおける前記相対位置情報を前記位置補正情報として取得する、請求項３に記載の顕微鏡装置。
5. 前記位置補正情報を算出する動作において、最も数の多い前記データペア群が複数存在する場合に、前記データのペアにおける前記試料の厚さ方向の位置の一致度が最も高い前記データペア群に属する前記ペアを前記同一データペアとして選択し、前記同一データペアにおける前記相対位置情報を前記位置補正情報として取得する、請求項３に記載の顕微鏡装置。
6. 前記画像連結装置は、前記位置補正情報に基づいて前記第１の分子リストと前記第２の分子リストの相対位置を補正し、前記第１の分子リストと前記第２の分子リストとを連結する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の顕微鏡装置。
7. 活性化光及び励起光の照射、又は励起光の照射により蛍光を発する蛍光物質を含む試料に、前記活性化光及び前記励起光、又は前記励起光を照射する照明光学系と、
   前記試料の観察領域の蛍光画像を撮像する撮像装置と、
   前記試料に前記励起光を繰り返し照射することにより取得された複数の蛍光画像の各々において蛍光輝点の位置を解析し、分子リストとして構築する画像解析装置と、
   複数の前記観察領域において取得された複数の前記分子リストを、前記分子リスト同士のうち前記試料の同一部位における前記分子リスト間の前記蛍光輝点同士の相対位置情報に基づいて算出した位置補正情報を用いて連結する画像連結装置と、を備え、
   前記画像連結装置は、
   複数の前記分子リストから連結対象とする第１の前記分子リストと第２の前記分子リストを選択する動作と、
   前記第１の分子リストと前記第２の分子リストから、それぞれ、前記分子リスト同士のうち前記試料の同一部位に属する蛍光輝点のデータを抽出する動作と、
   前記第１の分子リストから抽出された複数の前記データにおける輝度値と、前記第２の分子リストから抽出された複数の前記データにおける輝度値と比較し、前記輝度値が一致する前記データのペアを選出する動作と、
   各々の前記データのペアに属する前記データ同士の相対位置情報を算出する動作と、
   複数の前記ペアを、前記相対位置情報の値ごとのデータペア群に分類し、最もペア数の多い前記データペア群に属する前記ペアを同一データペアとして選択し、前記同一データペアにおける前記相対位置情報を位置補正情報として取得する動作と、
   前記位置補正情報に基づいて前記第１の分子リストと前記第２の分子リストの相対位置を補正し、前記第１の分子リストと前記第２の分子リストとを連結する動作と、
   を実行する顕微鏡装置。
8. 前記同一データペアに属する前記蛍光輝点同士の前記試料の厚さ方向の距離に基づいて前記第１の分子リストと前記第２の分子リストの前記厚さ方向における相対位置を補正し、前記第１の分子リストと前記第２の分子リストとを連結する、請求項３から５、７のいずれか１項に記載の顕微鏡装置。
9. 前記画像連結装置は、前記試料の厚さ方向の位置が異なる複数の前記分子リストを連結する、請求項１〜４、７のいずれか１項に記載の顕微鏡装置。
10. 前記画像連結装置は、
    複数の前記分子リストから連結対象とする第１の前記分子リストと第２の前記分子リストを選択する動作と、
    前記第１の分子リストと前記第２の分子リストから、それぞれ、前記分子リスト同士のうち前記試料の同一部位に属する蛍光輝点のデータを抽出する動作と、
    前記第１の分子リストから抽出された複数の前記データと、前記第２の分子リストから抽出された複数の前記データとの相対位置情報を、前記データに対応する蛍光輝点を前記厚さ方向に平行な投影面に投影したときの座標値を用いてそれぞれ算出する動作と、
    前記相対位置情報の算出に用いた前記データのペアを、前記相対位置情報の値ごとのデータペア群に分類し、最もペア数の多い前記データペア群に属する前記ペアを同一データペアとして選択し、前記同一データペアにおける前記相対位置情報を位置補正情報として取得する動作と、
    前記位置補正情報に基づいて前記第１の分子リストと前記第２の分子リストとの相対位置を補正し、前記第１の分子リストと前記第２の分子リストとを連結する動作と、
    を実行する、請求項９に記載の顕微鏡装置。
11. 前記同一データペアに属する前記データ同士の前記投影面の法線方向の距離に基づいて前記第１の分子リストと前記第２の分子リストの前記法線方向における相対位置を補正し、前記第１の分子リストと前記第２の分子リストとを連結する、請求項１０に記載の顕微鏡装置。
12. 活性化光及び励起光の照射、又は励起光の照射により蛍光を発する蛍光物質を含む試料に、前記活性化光及び前記励起光、又は前記励起光を照射する照明光学系と、前記試料の観察領域の蛍光画像を撮像する撮像装置と、を備えた顕微鏡装置における画像形成方法であって、
    前記試料に前記励起光を繰り返し照射することにより複数の蛍光画像を取得する撮像ステップと、
    取得した複数の前記蛍光画像の各々において蛍光輝点の位置を解析し、分子リストとして構築する画像解析ステップと、
    複数の前記観察領域において取得された複数の前記分子リストを、前記分子リスト同士のうち前記試料の同一部位における前記分子リスト間の前記データ同士の相対位置情報に基づいて算出した位置補正情報を用いて連結する画像連結ステップと、を有し、
    前記画像連結ステップは、
    複数の前記分子リストから連結対象とする第１の前記分子リストと第２の前記分子リストを選択するステップと、
    前記第１の分子リストと前記第２の分子リストから、それぞれ、前記分子リスト同士の前記同一部位に属する蛍光輝点のデータを抽出するステップと、
    前記第１の分子リストから抽出された複数の前記データと、前記第２の分子リストから抽出された複数の前記データとの相対位置情報をそれぞれ算出するステップと、
    算出した前記相対位置情報に基づいて、前記第１の分子リストおよび前記第２の分子リストにおけるデータを分類するステップと、
    前記分類したデータに基づいて、前記第１の分子リストにおけるデータと前記第２の分子リストにおけるデータとの位置ずれを補正するための位置補正情報を算出するステップと、を実行する画像形成方法。
13. 前記画像連結ステップにおいては、前記相対位置情報の算出に前記データのペアを用いており、
    前記相対位置情報の算出に用いた前記データのペアを、前記相対位置情報の値ごとのデータペア群に分類する、請求項１２に記載の画像形成方法。
14. 前記画像連結ステップにおいては、最もペア数の多い前記データペア群に属する前記ペアを同一データペアとして選択し、前記同一データペアにおける前記相対位置情報を位置補正情報として取得する、請求項１３に記載の画像形成方法。
15. 前記画像連結ステップにおいては、前記位置補正情報に基づいて前記第１の分子リストと前記第２の分子リストの相対位置を補正し、前記第１の分子リストと前記第２の分子リストとを連結する、請求項１２〜１４のいずれか１項に記載の画像形成方法。
16. 活性化光及び励起光の照射、又は励起光の照射により蛍光を発する蛍光物質を含む試料に、前記活性化光及び前記励起光、又は前記励起光を照射する照明光学系と、前記試料の観察領域の蛍光画像を撮像する撮像装置と、を備えた顕微鏡装置における画像形成方法であって、
    前記試料に前記励起光を繰り返し照射することにより複数の蛍光画像を取得する撮像ステップと、
    取得した複数の前記蛍光画像の各々において蛍光輝点の位置を解析し、分子リストとして構築する画像解析ステップと、
    複数の前記観察領域において取得された複数の前記分子リストを、前記分子リスト同士のうち前記試料の同一部位における前記分子リスト間の前記データ同士の相対位置情報に基づいて算出した位置補正情報を用いて連結する画像連結ステップと、を有し、
    前記画像連結ステップは、
    複数の前記分子リストから連結対象とする第１の前記分子リストと第２の前記分子リストを選択するステップと、
    前記第１の分子リストと前記第２の分子リストから、それぞれ、前記分子リスト同士のうち前記試料の同一部位に属する蛍光輝点のデータを抽出するステップと、
    前記第１の分子リストから抽出された複数の前記データにおける輝度値と、前記第２の分子リストから抽出された複数の前記データにおける輝度値と比較し、前記輝度値が一致する前記データのペアを選出するステップと、
    各々の前記データのペアに属する前記データ同士の相対位置情報を算出するステップと、
    複数の前記ペアを、前記相対位置情報の値ごとのデータペア群に分類し、最もペア数の多い前記データペア群に属する前記ペアを同一データペアとして選択し、前記同一データペアにおける前記相対位置情報を位置補正情報として取得するステップと、
    前記位置補正情報に基づいて前記第１の分子リストと前記第２の分子リストの相対位置を補正し、前記第１の分子リストと前記第２の分子リストとを連結するステップと、
    を実行する画像形成方法。

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