JP3766498B2 - 走査型細胞測定装置および細胞測定方法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、走査型細胞測定装置に関する。
【０００２】
スライドグラス上の細胞集団を光ビーム（レーザ光線）を収束させたスポット光で走査し、該細胞集団の個々の細胞が発する蛍光を検出し、走査画像データを画像処理して個々の細胞データを抽出して測定する「生物標本の複数の光学的特性を測定する方法及び装置」（以下、「走査型サイトメータ」と称する）が、特開平３−２５５３６５号公報に開示されている。
【０００３】
この走査型サイトメータは、レーザ及び該レーザビームを収束させたスポット光が固定され、単離細胞浮遊液標本の細胞集団が、超音波振動で毎秒数万個の水滴に分断されたジェット水流としてレーザスポット光上を流れて通過するフローサイトメータに対し、スライドグラス上に細胞が静置されており、レーザスポット光が光学的及び／又は機械的に走査される点で、基本構成に差がある。
【０００４】
しかし、走査型サイトメータは、蛍光色素で生化学的に標識された細胞集団にレーザスポット光を照射、励起し、個々の細胞の発する蛍光を測光して高速に測定し、個々の細胞の測定結果を細胞集団の免疫学的特性、遺伝学的特性、細胞増殖性等を表す統計的なデータとして提示することを目的としている点においては、フローサイトメータと同様である。
【０００５】
走査型サイトメータは、スライドグラス上の各細胞の座標位置を記録し、かつ座標位置の再現が可能である。これにより、フローサイトメータに比べて、統計データの中の特定のデータ領域内に細胞データを提示した個々の細胞を顕微鏡視野内で再現し、顕微鏡観察像と細胞データとを対応付けることができるという特徴をもつ。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、特定のデータを提示した個々の細胞又は細胞内成分の採取、分類を効率よく行う装置は未だ実現されていない。
【０００７】
一方、フローサイトメータでは、例えば免疫学的な陽性細胞と陰性細胞とを分離して成分分析する等、特定の性質を持った細胞を分類するソーティング機能がある。フローサイトメータによる細胞分類は、レーザスポット光を予め荷電された水滴に含まれる細胞が通過した直後に、選別分類すべき細胞を測光値の大小で認識し、ディフレクションプレートと称される偏向板に電荷をかけ、該当する細胞を含んだ水滴を静電気による吸引力又は反発力を利用して流路を分岐させ、別途用意された収集容器に収納することで達成される。
【０００８】
従来のフローサイトメータによる細胞分類作業においては、
１．動作原理上流路の分岐数に限りがあり（通常、吸引側、反発側の二つ）、分類する種類の数を増やせない。
２．測定細胞を含んだ水滴が、レーザ光路を通過して測光後、ディフレクションプレートを通過するまでの遅延時間（ｄｒｏｐ ｄｅｌａｙ ｔｉｍｅ）の調整状態によって、回収率の低下や誤入率の増加を引き起こす。
３．測定中及び分類中に細胞形態を観察できず、分類する細胞を形態的に確認して選別することができない。即ち、誤入率の増加を引き起こす可能性があっても、誤入した細胞を確認して除外することができない。
という種々の課題がある。
【０００９】
本発明は、サイトメータによる細胞集団の自動測定時に、特定のデータ領域内の各細胞又は各細胞内物質を、効率よく正確に採集できる走査型細胞測定装置を提供することを目的とする。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
請求項１記載の発明は細胞集団標本上で光ビームを顕微鏡対物レンズで集光して二次元走査し、細胞からの蛍光、反射光または透過光の少なくとも１つを検出器で検出し、検出器で検出した光電信号によって形成された走査画像データを取り込み、該走査画像データに対する画像処理によって細胞集団標本内の各細胞の細胞内成分量を定量測定する走査型細胞測定装置において、前記細胞集団標本内の各細胞の走査画像データを基にこれらの座標位置データを求める座標位置管理手段と、前記走査画像データから前記各細胞についての細胞情報を算出する情報算出手段と、前記細胞情報に関して特定のデータ範囲を指定する範囲指定手段と、前記各細胞又は各細胞内物質を操作又はマーキングする微小操作手段とを有し、前記指定されたデータ範囲にある細胞情報をもつ細胞の前記座標位置データを基に各細胞と前記微小操作手段との位置関係を制御するよう構成したことを特徴とするものである。
【００１１】
請求項２記載の発明は、請求項１記載の走査型細胞測定装置において、前記微小操作手段が前記顕徴鏡対物レンズに結合されていることを特徴とするものである。
【００１２】
請求項３記載の発明は、細胞集団標本上で光ビームを顕微鏡対物レンズで集光して二次元走査し、細胞からの蛍光、反射光または透過光の少なくとも１つを検出器で検出し、検出器で検出した光電信号によって形成された走査画像データを取り込み、該走査画像データに対する画像処理によって細胞集団標本内の各細胞の細胞内成分量を定量測定する走査型細胞測定装置において、前記細胞集団標本内の各細胞の走査画像データを基にこれらの座標位置データを求める座標位置管理手段と、前記顕微鏡対物レンズの視野内に至らない領域に操作先端が配置され、前記各細胞又は各細胞内物質を操作又はマーキングする微小操作手段と、前記微小操作手段の操作先端による操作又はマーキング位置を観察する実体顕微鏡とを有し、前記座標位置データを基に各細胞と前記微小操作手段との位置関係を制御しつつ前記実体顕微鏡により前記微小操作手段の操作先端による操作又はマーキング位置を観察可能に構成したことを特徴とするものである。
請求項４記載の発明は、請求項１〜３に記載の走査型細胞測定装置において、前記微小操作手段をレーザ又は電気的引力・反発力を利用した非接触方式で構成したことを特徴とする。
請求項５記載の発明は、請求項１〜３に記載の走査型細胞測定装置において、前記微小操作手段の操作針の駆動機構を顕微鏡の合焦機構を用いて構成し、標本を載置するステージの２次元移動と顕微鏡の合焦機構とにより前記操作針を３次元に駆動可能としたものである。
請求項６記載の発明は、細胞集団標本上で光ビームを顕微鏡対物レンズで集光して２次元走査し、細胞からの蛍光、反射光または透過光の少なくとも１つを検出器で検出し、検出器で検出した光電信号によって形成された走査画像データを取り込み、該走査画像データに対する画像処理によって細胞集団標本内の各細胞の細胞内成分量を定量測定する走査型細胞測定装置において、前記細胞集団標本内の各細胞の走査画像データを基にこれらの座標位置データを求める座標位置管理手段と、前記各細胞又は各細胞内物質を操作又はマーキングする微小操作手段とを有し、前記座標位置データを基に各細胞と前記微小操作手段との位置関係を制御するとともに、前記微小操作手段の操作針の駆動機構を顕微鏡の合焦機構を用いて構成し、標本を載置するステージの２次元移動と顕微鏡の合焦機構とにより前記操作針を３次元に駆動可能としたことを特徴とするとするものである。
請求項７の発明は、請求項１〜６記載の装置を利用し、個々の細胞にマーキングを施し、顕微鏡を用いてその接眼レンズを通して細胞を観察しながら走査ステージとマイクロマニピレータを手動で操作する細胞測定方法である。
【００１３】
本発明によれば、細胞集団標本を光ビームを収束させたスポットで走査し、例えば個々の細胞が発する蛍光を検出し、走査画像データを画像処理して個々の細胞データを抽出して測定する走査型サイトメータによる細胞集団の自動測定後に、座標位置管理手段により特定の細胞データ領域内の各細胞の座標位置データを順次再現し、顕微鏡で観察しながら前記微小操作手段を操作することにより、各細胞又は各細胞内物質を効率よく正確に採集したりマーキングすることができる。
【００１４】
また、本発明によれば、前記微小操作手段が前記顕徴鏡対物レンズ又は前記顕微鏡対物レンズと同形状の部品に結合されている構成としたので、前記微小操作手段を駆動する駆動機構を格別に設けなくても顕微鏡の合焦により代用することが可能となり、顕微鏡対物レンズ回りの構成の簡略化が図れる。
【００１５】
さらに、本発明によれば、前記座標位置データを基に、各細胞と前記顕微鏡対物レンズの光軸から所定の距離だけ離れた位置に操作先端が配置された前記微小操作手段との位置関係を制御しつつ対物レンズから離間した前記実体顕微鏡により前記微小操作手段の操作先端による操作又はマーキング位置を観察可能に構成したので、前記実体顕微鏡により前記微小操作手段の操作先端を立体的に観察しつつ確実に各細胞の採取等を実現できる。
【００１６】
【発明の実施の形態】
以下に、本発明の実施の形態で用いる走査型サイトメータの基本構成と基本動作を説明する。図１に機械−光学系を、図２に走査型サイトメータの電気系のブロック図を、図３に測定処理の大まかな流れを表すフローチャートを各々示す。
【００１７】
図１に示す走査型サイトメータの蛍光測光光学系において、レーザ１より出射したレーザビームは、ビームスプリッタとして例えばダイクロイックミラー２で反射され、図１の紙面に直交する図示されていない回転軸を中心に回動するガルバノメーターミラー３で反射し、偏向される。ガルバノメーターミラー３で反射、偏向されたレーザビームは、瞳投影レンズ４で対物レンズ像面２５上に結像され、紙面上で上下方向に走査される走査スポット光を形成する。該走査スポット光は、対物レンズ６によって標本７上に投影され、微小スポット光として標本７上の細胞集団を紙面上で左右方向に走査する。該微小スポット光によって励起された個々の細胞からの蛍光は、ガルバノメーターミラー３まで光路を逆行する。
【００１８】
ここで、ガルバノメーターミラー３は、瞳投影レンズ４によって対物レンズ６の瞳と共役の関係になっているため、標本７面からの蛍光は、ガルバノメーターミラー３の走査偏向角度に依存することなく、レーザ光路へ通って行く。標本７面からの蛍光は、ダイクロイックミラー２を透過し、光電子増倍管１５に入射して光電検出される。
【００１９】
また、前記レーザビームをガルバノメーターミラー３による光路偏向手段で標本７面上で紙面上の左右方向に走査しながら、走査ステージ１７で標本７を紙面に直交する方向に移動させる。これにより、標本７面をレーザスポット光で二次元走査することができ、蛍光色素標識された細胞成分の蛍光測光が可能となる。
【００２０】
ここで、光路切換ミラー５は光路から挿脱可能に設けられており、光路から取り除くことにより、標本像を顕微鏡観察光学系１６ヘ導くことができ、透過照明光学系１２や落射蛍光投光管１９による照明を用いて通常の顕微鏡として用いることができ、標本７の面を透過顕微鏡像や落射蛍光顕微鏡像を接眼レンズを通して肉眼で顕微鏡観察したり、テレビカメラや写真撮影装置で撮影したりすることができる。
【００２１】
また、光路切換ミラー５をビームスプリッターに置き換え、走査、測光光路と顕微鏡光路とを同時に使用可能に構成してもよい。
【００２２】
次に、図２に基づき、前記走査型サイトメータの電気系の構成と作用を説明する。光電子増倍管ＰＭＴ１，ＰＭＴ２で検出した光電信号は、各々の検出信号（チャンネルと呼ぶ）毎に設けられた信号処理系統で処理され、コンピュータ９０内の拡張スロット上のメモリーボード９１に設けられた各チャンネルｃｈ．１、ｃｈ．２毎のメモリー回路に転送され記憶されていく。
【００２３】
即ち、光電子増倍管ＰＭＴ１，ＰＭＴ２で検出した光電信号は、ヘッドアンプ（Ｈｅａｄ Ａｍｐ）７２ａ、７２ｂで増幅された後、アナログ積分器
（Ａｎａｌｏｇ Ｉｎｔｅｇ．）７３ａ、７３ｂでノイズを除去し、アナログ／ディジタル変換器（Ａ／Ｄ）７４ａ、７４ｂで１２ビットのディジタル信号に変換され、ディジタルシグナルプロセッサ（ＤＳＰ）（ＲＡＭ、ＲＯＭを含む）７５ａ、７５ｂによって信号処理され、メモリーボード９１に設けられた各チャンネルｃｈ．１、ｃｈ．２に転送される。
【００２４】
コンピュータ９０の拡張スロットには、ＩＥＥＥ−４８８規格に基づくＧＰＩＢ（Ｇｅｎｒａｌ Ｐｕｒｐｏｓｅ Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ Ｂｕｓ）制御を行うＧＰＩＢボード９２が設けられており、装置側のＧＰＩＢインタフェース制御回路（ＧＰＩＢ Ｉ／Ｆ）８４を介して、装置側のＣＰＵ８０（中央演算処理装置）とコンピュータ９０の間で通信を行うようになっている。
【００２５】
装置側のＣＰＵバス（ＣＰＵ Ｂｕｓ）８１には、走査ステージのＸ軸、Ｙ軸を各々駆動する二つのステッピングモータ８５ａ、８５ｂの駆動制御を行うモータコントローラ８２ａ、８２ｂ及び二つのステッピングモータ８５ａ、８５ｂを駆動するモータドライバ８３ａ、８３ｂ、ガルバノメータミラー３を駆動するガルバノメータモータ３ａの駆動波形を生成する波形発生回路であるディジタル／アナログ変換器（Ｄ／Ａ）８７、８８、それぞれの光電子増倍管ＰＭＴ１、ＰＭＴ２の陰極への印可電圧を発生し増倍率を制御するディジタル／アナログ変換器（Ｄ／Ａ）７６ａ、７６ｂ及び、それぞれの光電子増倍管ＰＭＴ１、ＰＭＴ２で検出した光電信号のオフセット調整電圧を発生するディジタル／アナログ変換器（Ｄ／Ａ）７７ａ、７７ｂが接続されている。さらに、ＣＰＵバス８１には、リモーコントロールユニット（ＲＣＵ）８９、入出力ユニット（Ｉ／Ｏ）７９等が接続されている。
【００２６】
本実施の形態で用いるコンピュータ９０は、例えばＩＢＭ社ＰＣ／ＡＴ又はそのコンバチブル機であり、コンピュータモニタディスプレイ用のビデオ・グラフィック・アダプター（ＶＧＡ）ボード以外に、少なくとも二つの拡張スロットを有していることが必要である。二つのスロットには、１枚のメモリーカードとＧＰＩＢボード９２を実装するようになっている。
【００２７】
以上の光学系及び電気系の構成において、コンピュータ９０からのＧＰＩＢ制御コマンドによって、走査及び信号処理等、装置の動作を包括的にコントロールし、標本をレーザビームで二次元走査して複数の蛍光を検出し、走査画像データを得ることができる。
【００２８】
図３に、走査型サイトメータによる測定の流れを示す。
まず、標本７を走査ステージ１７上にセットし（ステップＳ１）、標本走査領域、ゲイン、オフセット等の測定条件をコンピュータ９０に入力する（ステップＳ２）。次に、コンピュータ９０により細胞データリストを初期化し（ステップＳ３）、前記レーザビームにより標本７を走査画像メモリ１枚分のメモリ容量で限定される小走査領域ごとに区切って二次元走査しながら光電信号をディジタル化してコンピュータ９０上のメモリボード９１に走査画像データを転送する（ステップＳ４）。
【００２９】
各小走査領域毎の走査画像データは、その都度コンピュータ９０によって処理され（ステップＳ５）、各細胞毎に相当する領域を抽出し、細胞の座標位置を算出すると同時に、細胞内の測光値の総和である積算測光値（Ｖａｌｕｅ）、細胞内の測光値の最大値である最大測光値（Ｐｅａｋ）、面積（Ａｒｅａ）、外周長（Ｐｅｒｉｍｅｔｅｒ）等の細胞情報を算出し、細胞の細胞データリストを作成し追記して行く（ステップＳ６）。そして、所定の走査領域全体の細胞データリストを作成し終わったところで（ステップＳ７）測定は終了する（ステップＳ８）。
【００３０】
このような測定の結果得られた細胞データリストは、データファイルとして保存され、ドットヒストグラム表示等、統計的な演算処理を受けながらコンピュータ９０の表示画面に表示される（ステップＳ９）。
【００３１】
走査型サイトメーターによる測定結果の一例として、リンパ球の表面抗原を蛍光標識して測定したデータの、コンピュータ表示画面に表示されたドットヒストグラムを図４に示す。
【００３２】
ここで、コンピュータソフトウエアによって、コンピュータ表示画面上でデータの領域Ａ（図４に示す）を設定し、細胞のリコールを指示すると、測定された順番に細胞データリストを開きながら、領域Ａに該当する細胞データが出てきた時点で該当する細胞の座標位置データをＧＰＩＢ制御コマンドとしてコンピュータ９０から走査ステージ１７のモータコントローラ８２ａ、８２ｂヘ送り、走査ステージ１７のＸ軸、Ｙ軸の位置を再現することができる。
【００３３】
このとき、図１に示す光路切換ミラー５を光路から外すことにより、顕微鏡観察光学系１６によって、位置再現された標本７の細胞を観察し撮影することができる。図４に表示状態を示す標本７の場合、細胞集団内に面積が大小に異なる２つの部分集合が存在することが分かるが、それぞれの部分集合に属する個々の細胞を順次位置再現しながら顕微鏡観察、撮影することで形態的な解析を行うことができる。
【００３４】
このように本実施の形態に用いられる走査型サイトメータは、順次位置再現された個々の細胞観察・撮影し形態解析する装置である。
【００３５】
次に、本発明の具体的な実施の形態１乃至５を説明する。
（実施の形態１）
図５に実施の形態１の走査型サイトメータを示す。
顕微鏡本体２１内部には、既述した走査型サイトメータの光学系が構成されており、光切換レバー２２の操作によって、光路切換ミラー５の挿脱を行い、顕微鏡観察光学系１６へ光路を切り換えることが可能となっている。また、顕微鏡観察光学系１６においては、接眼レンズ２３を通して肉眼観察することもできるし、ＴＶカメラ２０で撮影することも可能である。
【００３６】
ＴＶカメラ２０の映像信号は、コンピュータ９０ヘ接続して、コンピュータモニタ９０ａ上で映像を観察することができる。顕微鏡本体２１の右側には、支持台３３、駆動機構３２、操作針３１によって構成される微小操作手段としてのマイクロマニピレータが配置されている。前記操作針３１の先端は、顕微鏡対物レンズ６の光軸中心に達するように構成されており、標本７の細胞を順次位置再現して顕微鏡観察しながら、駆動機構３２よって操作針３１を操作し、細胞を採取することができるようになっている。
【００３７】
尚、前記操作針３１には、用途に応じて吸引装置や注入装置、マーキング装置等を付加して、細胞に対する種々の操作を行ったり、微小電極を取り付けて電気生理学的な実験を行うことも可能である。また、取り付けるマイクロマニピレータの数は一個に限定されるものではなく、複数のマイクロニピレータを組み合わせて使用することで、複数種類の細胞を採取したり、より高度な実験を行うことを可能とする構成としてもよい。
【００３８】
前記駆動機構３２は、操作針３１を三次元駆動させることが望ましいが、顕微鏡本体２１の合焦機構によって、走査ステージ１７が対物レンズ６の光軸方向
（図５の紙面上、上下方向）に位置調整が可能であれば、該当方向への駆動は顕微鏡本体２１の合焦機構による代用が可能である。また、走査ステージ１７はＸ−Ｙ二次元に移動可能であり、走査ステージ１７の微小移動によって駆動機構３２の動作を代用することもできる。
【００３９】
前記駆動機構３２の制御は、油圧機構や機械的減速機構を介して顕微鏡を観察しながら手動で操作してもよいし、電動機構を採用してコンピュータ９０と接続し、コンピュータモニタ９０ａ上に映されるＴＶカメラ２０の映像を観察しながらコンピュータ９０を介して操作してもよい。ここで、ＴＶカメラ２０の画像をコンピュータ４１で画像認識し、コンピュータ９０からの指令によって電動機構を制御することも可能であり、自動化によって細胞採取をより容易に行うこができる。
【００４０】
前記標本７は、スライドグラス標本であり、細胞採取時にはカバーグラスを取り外しておく。本実施の形態１においては、顕微鏡本体２１を正立型顕微鏡として図示したが、同様の構成は倒立型顕微鏡によっても構成可能であることは言うまでもない。倒立型顕微鏡による場合、マイクロマニピレータはステージ上面（対物レンズの反対側）から標本７を操作することになり、シャーレ等の培養容器やマイクロテストプレート等、上面解放型の容器の中の標本７の細胞を操作することが可能になる。
【００４１】
本実施の形態１によれば、順次位置再現された個々の細胞を顕微鏡で観察し、その形態を確認しながら細胞を採集することができる。このため、細胞の誤入の虞れがなく正確に分類できる。また、顕微鏡による拡大倍率を上げて細胞内の一部分、例えば、染色体、ミトコンドリア、細胞膜、細胞質等を観察しながら選択的に採集し分類することも可能であり、より精度の高い実験が可能になる。
【００４２】
（実施の形態２）
図６に、本発明の実施の形態２を示す。
本実施の形態２では、操作針３１の針先は顕微鏡対物レンズ６の光軸から所定の距離だけ離間した顕微鏡本体２１の右側に配置されている。これにより、操作針３１の突き出し量が減少して剛性を高めることができるとともに、顕微鏡対物レンズ６の作動距離による高さ方向のスペースの制約から解放される。
【００４３】
走査ステージ１７は、右側へのストロークを拡張し、順次位置再現する個々の細胞の再現位置が操作針３１の直下になるように、顕微鏡対物レンズ６の光軸中心と操作針３１の先端との位置ズレ量を予めコンピュータ９０に設定し、個々の細胞の再現位置を補正する。
【００４４】
また、本実施の形態２では、順次位置再現された個々の細胞と操作針３１の先端部を観察するために、対物レンズ６と干渉しないように実体顕微鏡２４を離間して設置している。これにより、マイクロマニピレータの操作針３１を立体的に観察しながら操作でき、細胞採取が容易になる。また、作動距離の長い実体顕微鏡２４を用いることにより、対物レンズから試料までの距離を長くできるから、マイクロマニピレータの操作空間が増大し、複数のマイクロマニピレータによるより複雑な実験を実行することが容易となるとともに、操作針３１の傾斜角度を大きく設定できるので、細胞採取等の操作性が向上する。
【００４５】
（実施の形態３）
図７（ａ），（ｂ）に本発明の実施の形態３を示す。本実施の形態３においては、実施の形態１における操作針３１と駆動機構３２を一体化したマイクロマニピレータ６１（図７（ｂ）参照）を、固定アーム５１を介して顕微鏡対物レンズ６に取り付けた構成（図７（ａ）参照）が特徴である。この場合、操作針３１の先端を対向レンズ６の焦点位置に合致させ、操作時以外の通常の状態では駆動機構３２により試料面から離れる方向に退避せしめられている。駆動機構３２は、圧電アクチュエータによって構成する。対物レンズ６と走査ステージ１７上の標本７との間隔は合焦機構によって調整されるので、合焦時に駆動機構３２により操作針３１の先端を対物レンズ６の焦点位置まで復帰させることにより操作針３１が光軸上の細胞に自動的に操作される。
【００４６】
また、本実施の形態３においては、顕微鏡の側面にマイクロマニピレータの支持台を設置する必要がなくなるので、机上占有面積が小さくてすむ他、標本から針先までの機構保持部品の距離が短縮されるため、マイクロマニピレータの剛性及び機械的安定度が向上する。
【００４７】
さらに、マイクロマニピレータ６１の駆動機構３２を省略しても、顕微鏡の合焦機構と走査ステージ１７の二次元移動とを併用することによって、操作針３１と標本７とを相対的に三次元的に微小移動させることもできる。
また、合焦した状態で標本７をＸＹ方向に移動させても、操作時以外は操作針３１が標本７から離間しているので操作針３１により標本７にキズを付けることがない。
【００４８】
（実施の形態４）
図８に本発明の実施の形態４を示す。本実施の形態４においては、実施の形態３におけるマイクロマニピレータ６１を、対物レンズ６光軸上に配置した以外は同一構成を成している。これにより、突端の形態３と同様作用効果の他に操作針３１の針先は、顕微鏡視野の中央の一点として顕微鏡で観察できるので、操作位置を確認しながら所望する細胞を観察することができるとともに、素早く操作を開示できる。
【００４９】
また、コンピュータ９０からの指令によって走査ステージ１７の二次元移動と合焦機構を電動制御して各細胞の座標位置を記録しておくことにより、合焦機構と走査ステージ１７を予めプログラムした細胞採取動作にしたがって三次元的に駆動させる、各細胞の座標位置を順次再現することで、細胞採取を完全に自動化することができる。このことは、上記実施の形態３にも有効であり、同様の作用効果が得られることはいうまでもない。
【００５０】
（実施の形態５）
図９に本発明の実施の形態５を示す。本実施の形態５においては、倒立型顕微鏡２１に搭載された走査ステージ１７を、コンピュータ９０によって制御するように構成している。ここで、コンピュータ９０と走査ステージ１７は、上述した走査型サイトメータと互換性を持つように構成されている。
【００５１】
即ち、コンピュータ９０は走査型サイトメータで得られたデータを受け取ってコンピュータモニタ９０ａ上で図４に示すようなドットヒストグラムを表示することができ、ゴンピュータソフトウエアによって、コンピュータ画面上でデータの領域Ａ（図４に示す）を設定し、細胞のリコールを指示すると、既述したごとく測定された順番に細胞データリストを開きながら、領域Ａに該当する細胞データが出てきた時点で該当する細胞の座標位置データをＧＰＩＢ制御コマンドとしてコンピュータ９０から走査ステージ１７のＸ軸、Ｙ軸用の前記モータコントローラ８２ａ、８２ｂへ送り、走査ステージ１７のＸ軸、Ｙ軸の位置を再現することができる。
【００５２】
即ち、測定に用いた標本と同一の標本７を走査ステージ１７に載置しておけば、走査型サイトメータ内での動作と同様に、図４に示す領域Ａに入る細胞データを示した個々の細胞が、顕微鏡対物レンズ６の視野中央に順次位置再現されることになる。また、前記倒立型顕微鏡２１の傍らにおいて、支持台３３、駆動機構３２、操作針３１によって構成されるマイクロマニピレータを構成している。このマイクロマニピレータによって、順次位置再現された細胞又は細胞物質を採集し分類することができることはいうまでもない。
【００５３】
本実施の形態５では、倒立型顕微鏡２１を用いて動作を説明したが、実体顕微鏡２４や正立型顕微鏡を用いても、同様にして走査型サイトメータと互換性のある細胞採取専用のシステムを構成可能である。
【００５４】
また、実施の形態１の場合と同様に、駆動機構３２の制御に電動機構を採用してコンピュータ９０と接続し、ＴＶカメラ２０の画像をコンピュータ９０で画像認識し、コンピュータ９０からの指令によって電動機構を制御する自動化システムを構築することも可能である。
【００５５】
さらに、実施の形態１のシステムで標本７上の個々の細胞をマーキングしておけば、走査ステージ１７とコンピュータ９０とに依存せずに、接眼レンズ２３を通して細胞を観察しながら走査ステージ１７とマイクロマニピレータを手動で操作することによって、マーキングされた細胞を採集することも可能である。この場合、コンピュータ９０や、電動システムは不要であり、マイクロマニピレータの付いたどのような顕微鏡を用いても、採集・分類を行うことが可能となる。
【００５６】
以上、本発明の実施の形態１乃至５の説明においては、微小操作手段として、操作針を用いて細胞を機械的に操作・分類するメカニカルなマイクロマニピレータを用いる場合を示した。
【００５７】
しかしながら、本発明の趣旨は機械的な構成の微小操作手段を用いる場合に限定されるものではなく、レーザを用いて細胞を焼き切るレーザマニピュレータやレーザの屈折力によって細胞を保持するレーザトラッピング法等、光学的に細胞を操作する場合、あるいは、電気的引力・反発力を利用して細胞を移動させる場合等、非接触方式による微小操作手段を用いる場合にも同様に適用することが可能である。
【００５８】
以上説明した本発明の実施の形態によれば、以下の構成を付記することができる。
（１）請求項１記載の装置において、前記微小操作手段をレーザ又は電気的引力・反発力を利用した非接触方式で構成する。この構成によれば、コンピュータ９０による制御でメカニカルな操作針を使用しない細胞の採集・分類を行う自動化システムを構築することが可能となる。
（２）請求項１記載の装置の基本的構成を利用し、個々の細胞にマーキングを施し、顕微鏡を用いてその接眼レンズを通して細胞を観察しながら走査ステージとマイクロマニピレータを手動で操作する細胞測定方法。この細胞測定方法によれば、コンピュータ制御に依存することなく細胞の採集・分類を行うことが可能となる。
【００５９】
（３）前記微小操作手段の操作針の駆動機構を顕微鏡の合焦機構を用いて構成し、標本を載置するステージの２次元移動と顕微鏡の合焦機構とにより前記操作針を３次元に駆動可能とした走査型細胞測定装置。この構成により、微小操作手段のスペースが簡略化し省スペースを図れ、かつ、操作針の剛性強化、安定性の向上が可能となる。
【００６０】
【発明の効果】
以上説明した本発明によれば、標本の細胞集団の自動測定後に、特定のデータ領域内に入る細胞データを提示した各細胞又は各細胞内物質を、効率よく正確に採取し、所望の細胞分類を行うことが可能な走査型細胞測定装置を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の実施の形態の走査型細胞測定装置の機械−光学系を示す概略図である。
【図２】本発明の実施の形態の走査型サイトメータの電気系のブロック図である。
【図３】本発明の実施の形態の走査型サイトメータの測定処理の大まかな流れを表すフローチャートである。
【図４】本発明の実施の形態における特定領域の積算測光値と面積との関係を示すヒストグラムである。
【図５】本発明の実施の形態１の走査型サイトメータの構成を示す正面図である。
【図６】本発明の実施の形態２の走査型サイトメータの構成を示す正面図である。
【図７】（ａ）は、本発明の実施の形態３の走査型サイトメータの微小操作手段及び走査ステージを示す概略図、（ｂ）は、本発明の実施の形態３の走査型のサイトメータの微小操作手段としてのマイクロマニピレータの側面図である。
【図８】本発明の実施の形態４の走査型サイトメータの微小操作手段及び走査ステージを示す概略図である。
【図９】本発明の実施の形態５の走査型サイトメータの構成を示す正面図である。
【符号の説明】
１ レーザー
２ ダイクロイックミラー
３ ガルバノメーターミラー
４ 瞳投影レンズ
６ 対物レンズ
７ 標本
１２ 透過照明光学系
１５ 光電子増倍管
１６ 顕微鏡観察光学系
１７ 走査ステージ
１８ スポット投影レンズ
１９ 落射蛍光投光管
２１ 顕微鏡本体
２３ 接眼レンズ
２５ 対物レンズ像面
３１ 操作針
３２ 駆動機構
３３ 支持台
８０ ＣＰＵ
９０ コンピュータ
【発明の属する技術分野】
本発明は、走査型細胞測定装置に関する。
【０００２】
スライドグラス上の細胞集団を光ビーム（レーザ光線）を収束させたスポット光で走査し、該細胞集団の個々の細胞が発する蛍光を検出し、走査画像データを画像処理して個々の細胞データを抽出して測定する「生物標本の複数の光学的特性を測定する方法及び装置」（以下、「走査型サイトメータ」と称する）が、特開平３−２５５３６５号公報に開示されている。
【０００３】
この走査型サイトメータは、レーザ及び該レーザビームを収束させたスポット光が固定され、単離細胞浮遊液標本の細胞集団が、超音波振動で毎秒数万個の水滴に分断されたジェット水流としてレーザスポット光上を流れて通過するフローサイトメータに対し、スライドグラス上に細胞が静置されており、レーザスポット光が光学的及び／又は機械的に走査される点で、基本構成に差がある。
【０００４】
しかし、走査型サイトメータは、蛍光色素で生化学的に標識された細胞集団にレーザスポット光を照射、励起し、個々の細胞の発する蛍光を測光して高速に測定し、個々の細胞の測定結果を細胞集団の免疫学的特性、遺伝学的特性、細胞増殖性等を表す統計的なデータとして提示することを目的としている点においては、フローサイトメータと同様である。
【０００５】
走査型サイトメータは、スライドグラス上の各細胞の座標位置を記録し、かつ座標位置の再現が可能である。これにより、フローサイトメータに比べて、統計データの中の特定のデータ領域内に細胞データを提示した個々の細胞を顕微鏡視野内で再現し、顕微鏡観察像と細胞データとを対応付けることができるという特徴をもつ。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、特定のデータを提示した個々の細胞又は細胞内成分の採取、分類を効率よく行う装置は未だ実現されていない。
【０００７】
一方、フローサイトメータでは、例えば免疫学的な陽性細胞と陰性細胞とを分離して成分分析する等、特定の性質を持った細胞を分類するソーティング機能がある。フローサイトメータによる細胞分類は、レーザスポット光を予め荷電された水滴に含まれる細胞が通過した直後に、選別分類すべき細胞を測光値の大小で認識し、ディフレクションプレートと称される偏向板に電荷をかけ、該当する細胞を含んだ水滴を静電気による吸引力又は反発力を利用して流路を分岐させ、別途用意された収集容器に収納することで達成される。
【０００８】
従来のフローサイトメータによる細胞分類作業においては、
１．動作原理上流路の分岐数に限りがあり（通常、吸引側、反発側の二つ）、分類する種類の数を増やせない。
２．測定細胞を含んだ水滴が、レーザ光路を通過して測光後、ディフレクションプレートを通過するまでの遅延時間（ｄｒｏｐ ｄｅｌａｙ ｔｉｍｅ）の調整状態によって、回収率の低下や誤入率の増加を引き起こす。
３．測定中及び分類中に細胞形態を観察できず、分類する細胞を形態的に確認して選別することができない。即ち、誤入率の増加を引き起こす可能性があっても、誤入した細胞を確認して除外することができない。
という種々の課題がある。
【０００９】
本発明は、サイトメータによる細胞集団の自動測定時に、特定のデータ領域内の各細胞又は各細胞内物質を、効率よく正確に採集できる走査型細胞測定装置を提供することを目的とする。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
請求項１記載の発明は細胞集団標本上で光ビームを顕微鏡対物レンズで集光して二次元走査し、細胞からの蛍光、反射光または透過光の少なくとも１つを検出器で検出し、検出器で検出した光電信号によって形成された走査画像データを取り込み、該走査画像データに対する画像処理によって細胞集団標本内の各細胞の細胞内成分量を定量測定する走査型細胞測定装置において、前記細胞集団標本内の各細胞の走査画像データを基にこれらの座標位置データを求める座標位置管理手段と、前記走査画像データから前記各細胞についての細胞情報を算出する情報算出手段と、前記細胞情報に関して特定のデータ範囲を指定する範囲指定手段と、前記各細胞又は各細胞内物質を操作又はマーキングする微小操作手段とを有し、前記指定されたデータ範囲にある細胞情報をもつ細胞の前記座標位置データを基に各細胞と前記微小操作手段との位置関係を制御するよう構成したことを特徴とするものである。
【００１１】
請求項２記載の発明は、請求項１記載の走査型細胞測定装置において、前記微小操作手段が前記顕徴鏡対物レンズに結合されていることを特徴とするものである。
【００１２】
請求項３記載の発明は、細胞集団標本上で光ビームを顕微鏡対物レンズで集光して二次元走査し、細胞からの蛍光、反射光または透過光の少なくとも１つを検出器で検出し、検出器で検出した光電信号によって形成された走査画像データを取り込み、該走査画像データに対する画像処理によって細胞集団標本内の各細胞の細胞内成分量を定量測定する走査型細胞測定装置において、前記細胞集団標本内の各細胞の走査画像データを基にこれらの座標位置データを求める座標位置管理手段と、前記顕微鏡対物レンズの視野内に至らない領域に操作先端が配置され、前記各細胞又は各細胞内物質を操作又はマーキングする微小操作手段と、前記微小操作手段の操作先端による操作又はマーキング位置を観察する実体顕微鏡とを有し、前記座標位置データを基に各細胞と前記微小操作手段との位置関係を制御しつつ前記実体顕微鏡により前記微小操作手段の操作先端による操作又はマーキング位置を観察可能に構成したことを特徴とするものである。
請求項４記載の発明は、請求項１〜３に記載の走査型細胞測定装置において、前記微小操作手段をレーザ又は電気的引力・反発力を利用した非接触方式で構成したことを特徴とする。
請求項５記載の発明は、請求項１〜３に記載の走査型細胞測定装置において、前記微小操作手段の操作針の駆動機構を顕微鏡の合焦機構を用いて構成し、標本を載置するステージの２次元移動と顕微鏡の合焦機構とにより前記操作針を３次元に駆動可能としたものである。
請求項６記載の発明は、細胞集団標本上で光ビームを顕微鏡対物レンズで集光して２次元走査し、細胞からの蛍光、反射光または透過光の少なくとも１つを検出器で検出し、検出器で検出した光電信号によって形成された走査画像データを取り込み、該走査画像データに対する画像処理によって細胞集団標本内の各細胞の細胞内成分量を定量測定する走査型細胞測定装置において、前記細胞集団標本内の各細胞の走査画像データを基にこれらの座標位置データを求める座標位置管理手段と、前記各細胞又は各細胞内物質を操作又はマーキングする微小操作手段とを有し、前記座標位置データを基に各細胞と前記微小操作手段との位置関係を制御するとともに、前記微小操作手段の操作針の駆動機構を顕微鏡の合焦機構を用いて構成し、標本を載置するステージの２次元移動と顕微鏡の合焦機構とにより前記操作針を３次元に駆動可能としたことを特徴とするとするものである。
請求項７の発明は、請求項１〜６記載の装置を利用し、個々の細胞にマーキングを施し、顕微鏡を用いてその接眼レンズを通して細胞を観察しながら走査ステージとマイクロマニピレータを手動で操作する細胞測定方法である。
【００１３】
本発明によれば、細胞集団標本を光ビームを収束させたスポットで走査し、例えば個々の細胞が発する蛍光を検出し、走査画像データを画像処理して個々の細胞データを抽出して測定する走査型サイトメータによる細胞集団の自動測定後に、座標位置管理手段により特定の細胞データ領域内の各細胞の座標位置データを順次再現し、顕微鏡で観察しながら前記微小操作手段を操作することにより、各細胞又は各細胞内物質を効率よく正確に採集したりマーキングすることができる。
【００１４】
また、本発明によれば、前記微小操作手段が前記顕徴鏡対物レンズ又は前記顕微鏡対物レンズと同形状の部品に結合されている構成としたので、前記微小操作手段を駆動する駆動機構を格別に設けなくても顕微鏡の合焦により代用することが可能となり、顕微鏡対物レンズ回りの構成の簡略化が図れる。
【００１５】
さらに、本発明によれば、前記座標位置データを基に、各細胞と前記顕微鏡対物レンズの光軸から所定の距離だけ離れた位置に操作先端が配置された前記微小操作手段との位置関係を制御しつつ対物レンズから離間した前記実体顕微鏡により前記微小操作手段の操作先端による操作又はマーキング位置を観察可能に構成したので、前記実体顕微鏡により前記微小操作手段の操作先端を立体的に観察しつつ確実に各細胞の採取等を実現できる。
【００１６】
【発明の実施の形態】
以下に、本発明の実施の形態で用いる走査型サイトメータの基本構成と基本動作を説明する。図１に機械−光学系を、図２に走査型サイトメータの電気系のブロック図を、図３に測定処理の大まかな流れを表すフローチャートを各々示す。
【００１７】
図１に示す走査型サイトメータの蛍光測光光学系において、レーザ１より出射したレーザビームは、ビームスプリッタとして例えばダイクロイックミラー２で反射され、図１の紙面に直交する図示されていない回転軸を中心に回動するガルバノメーターミラー３で反射し、偏向される。ガルバノメーターミラー３で反射、偏向されたレーザビームは、瞳投影レンズ４で対物レンズ像面２５上に結像され、紙面上で上下方向に走査される走査スポット光を形成する。該走査スポット光は、対物レンズ６によって標本７上に投影され、微小スポット光として標本７上の細胞集団を紙面上で左右方向に走査する。該微小スポット光によって励起された個々の細胞からの蛍光は、ガルバノメーターミラー３まで光路を逆行する。
【００１８】
ここで、ガルバノメーターミラー３は、瞳投影レンズ４によって対物レンズ６の瞳と共役の関係になっているため、標本７面からの蛍光は、ガルバノメーターミラー３の走査偏向角度に依存することなく、レーザ光路へ通って行く。標本７面からの蛍光は、ダイクロイックミラー２を透過し、光電子増倍管１５に入射して光電検出される。
【００１９】
また、前記レーザビームをガルバノメーターミラー３による光路偏向手段で標本７面上で紙面上の左右方向に走査しながら、走査ステージ１７で標本７を紙面に直交する方向に移動させる。これにより、標本７面をレーザスポット光で二次元走査することができ、蛍光色素標識された細胞成分の蛍光測光が可能となる。
【００２０】
ここで、光路切換ミラー５は光路から挿脱可能に設けられており、光路から取り除くことにより、標本像を顕微鏡観察光学系１６ヘ導くことができ、透過照明光学系１２や落射蛍光投光管１９による照明を用いて通常の顕微鏡として用いることができ、標本７の面を透過顕微鏡像や落射蛍光顕微鏡像を接眼レンズを通して肉眼で顕微鏡観察したり、テレビカメラや写真撮影装置で撮影したりすることができる。
【００２１】
また、光路切換ミラー５をビームスプリッターに置き換え、走査、測光光路と顕微鏡光路とを同時に使用可能に構成してもよい。
【００２２】
次に、図２に基づき、前記走査型サイトメータの電気系の構成と作用を説明する。光電子増倍管ＰＭＴ１，ＰＭＴ２で検出した光電信号は、各々の検出信号（チャンネルと呼ぶ）毎に設けられた信号処理系統で処理され、コンピュータ９０内の拡張スロット上のメモリーボード９１に設けられた各チャンネルｃｈ．１、ｃｈ．２毎のメモリー回路に転送され記憶されていく。
【００２３】
即ち、光電子増倍管ＰＭＴ１，ＰＭＴ２で検出した光電信号は、ヘッドアンプ（Ｈｅａｄ Ａｍｐ）７２ａ、７２ｂで増幅された後、アナログ積分器
（Ａｎａｌｏｇ Ｉｎｔｅｇ．）７３ａ、７３ｂでノイズを除去し、アナログ／ディジタル変換器（Ａ／Ｄ）７４ａ、７４ｂで１２ビットのディジタル信号に変換され、ディジタルシグナルプロセッサ（ＤＳＰ）（ＲＡＭ、ＲＯＭを含む）７５ａ、７５ｂによって信号処理され、メモリーボード９１に設けられた各チャンネルｃｈ．１、ｃｈ．２に転送される。
【００２４】
コンピュータ９０の拡張スロットには、ＩＥＥＥ−４８８規格に基づくＧＰＩＢ（Ｇｅｎｒａｌ Ｐｕｒｐｏｓｅ Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ Ｂｕｓ）制御を行うＧＰＩＢボード９２が設けられており、装置側のＧＰＩＢインタフェース制御回路（ＧＰＩＢ Ｉ／Ｆ）８４を介して、装置側のＣＰＵ８０（中央演算処理装置）とコンピュータ９０の間で通信を行うようになっている。
【００２５】
装置側のＣＰＵバス（ＣＰＵ Ｂｕｓ）８１には、走査ステージのＸ軸、Ｙ軸を各々駆動する二つのステッピングモータ８５ａ、８５ｂの駆動制御を行うモータコントローラ８２ａ、８２ｂ及び二つのステッピングモータ８５ａ、８５ｂを駆動するモータドライバ８３ａ、８３ｂ、ガルバノメータミラー３を駆動するガルバノメータモータ３ａの駆動波形を生成する波形発生回路であるディジタル／アナログ変換器（Ｄ／Ａ）８７、８８、それぞれの光電子増倍管ＰＭＴ１、ＰＭＴ２の陰極への印可電圧を発生し増倍率を制御するディジタル／アナログ変換器（Ｄ／Ａ）７６ａ、７６ｂ及び、それぞれの光電子増倍管ＰＭＴ１、ＰＭＴ２で検出した光電信号のオフセット調整電圧を発生するディジタル／アナログ変換器（Ｄ／Ａ）７７ａ、７７ｂが接続されている。さらに、ＣＰＵバス８１には、リモーコントロールユニット（ＲＣＵ）８９、入出力ユニット（Ｉ／Ｏ）７９等が接続されている。
【００２６】
本実施の形態で用いるコンピュータ９０は、例えばＩＢＭ社ＰＣ／ＡＴ又はそのコンバチブル機であり、コンピュータモニタディスプレイ用のビデオ・グラフィック・アダプター（ＶＧＡ）ボード以外に、少なくとも二つの拡張スロットを有していることが必要である。二つのスロットには、１枚のメモリーカードとＧＰＩＢボード９２を実装するようになっている。
【００２７】
以上の光学系及び電気系の構成において、コンピュータ９０からのＧＰＩＢ制御コマンドによって、走査及び信号処理等、装置の動作を包括的にコントロールし、標本をレーザビームで二次元走査して複数の蛍光を検出し、走査画像データを得ることができる。
【００２８】
図３に、走査型サイトメータによる測定の流れを示す。
まず、標本７を走査ステージ１７上にセットし（ステップＳ１）、標本走査領域、ゲイン、オフセット等の測定条件をコンピュータ９０に入力する（ステップＳ２）。次に、コンピュータ９０により細胞データリストを初期化し（ステップＳ３）、前記レーザビームにより標本７を走査画像メモリ１枚分のメモリ容量で限定される小走査領域ごとに区切って二次元走査しながら光電信号をディジタル化してコンピュータ９０上のメモリボード９１に走査画像データを転送する（ステップＳ４）。
【００２９】
各小走査領域毎の走査画像データは、その都度コンピュータ９０によって処理され（ステップＳ５）、各細胞毎に相当する領域を抽出し、細胞の座標位置を算出すると同時に、細胞内の測光値の総和である積算測光値（Ｖａｌｕｅ）、細胞内の測光値の最大値である最大測光値（Ｐｅａｋ）、面積（Ａｒｅａ）、外周長（Ｐｅｒｉｍｅｔｅｒ）等の細胞情報を算出し、細胞の細胞データリストを作成し追記して行く（ステップＳ６）。そして、所定の走査領域全体の細胞データリストを作成し終わったところで（ステップＳ７）測定は終了する（ステップＳ８）。
【００３０】
このような測定の結果得られた細胞データリストは、データファイルとして保存され、ドットヒストグラム表示等、統計的な演算処理を受けながらコンピュータ９０の表示画面に表示される（ステップＳ９）。
【００３１】
走査型サイトメーターによる測定結果の一例として、リンパ球の表面抗原を蛍光標識して測定したデータの、コンピュータ表示画面に表示されたドットヒストグラムを図４に示す。
【００３２】
ここで、コンピュータソフトウエアによって、コンピュータ表示画面上でデータの領域Ａ（図４に示す）を設定し、細胞のリコールを指示すると、測定された順番に細胞データリストを開きながら、領域Ａに該当する細胞データが出てきた時点で該当する細胞の座標位置データをＧＰＩＢ制御コマンドとしてコンピュータ９０から走査ステージ１７のモータコントローラ８２ａ、８２ｂヘ送り、走査ステージ１７のＸ軸、Ｙ軸の位置を再現することができる。
【００３３】
このとき、図１に示す光路切換ミラー５を光路から外すことにより、顕微鏡観察光学系１６によって、位置再現された標本７の細胞を観察し撮影することができる。図４に表示状態を示す標本７の場合、細胞集団内に面積が大小に異なる２つの部分集合が存在することが分かるが、それぞれの部分集合に属する個々の細胞を順次位置再現しながら顕微鏡観察、撮影することで形態的な解析を行うことができる。
【００３４】
このように本実施の形態に用いられる走査型サイトメータは、順次位置再現された個々の細胞観察・撮影し形態解析する装置である。
【００３５】
次に、本発明の具体的な実施の形態１乃至５を説明する。
（実施の形態１）
図５に実施の形態１の走査型サイトメータを示す。
顕微鏡本体２１内部には、既述した走査型サイトメータの光学系が構成されており、光切換レバー２２の操作によって、光路切換ミラー５の挿脱を行い、顕微鏡観察光学系１６へ光路を切り換えることが可能となっている。また、顕微鏡観察光学系１６においては、接眼レンズ２３を通して肉眼観察することもできるし、ＴＶカメラ２０で撮影することも可能である。
【００３６】
ＴＶカメラ２０の映像信号は、コンピュータ９０ヘ接続して、コンピュータモニタ９０ａ上で映像を観察することができる。顕微鏡本体２１の右側には、支持台３３、駆動機構３２、操作針３１によって構成される微小操作手段としてのマイクロマニピレータが配置されている。前記操作針３１の先端は、顕微鏡対物レンズ６の光軸中心に達するように構成されており、標本７の細胞を順次位置再現して顕微鏡観察しながら、駆動機構３２よって操作針３１を操作し、細胞を採取することができるようになっている。
【００３７】
尚、前記操作針３１には、用途に応じて吸引装置や注入装置、マーキング装置等を付加して、細胞に対する種々の操作を行ったり、微小電極を取り付けて電気生理学的な実験を行うことも可能である。また、取り付けるマイクロマニピレータの数は一個に限定されるものではなく、複数のマイクロニピレータを組み合わせて使用することで、複数種類の細胞を採取したり、より高度な実験を行うことを可能とする構成としてもよい。
【００３８】
前記駆動機構３２は、操作針３１を三次元駆動させることが望ましいが、顕微鏡本体２１の合焦機構によって、走査ステージ１７が対物レンズ６の光軸方向
（図５の紙面上、上下方向）に位置調整が可能であれば、該当方向への駆動は顕微鏡本体２１の合焦機構による代用が可能である。また、走査ステージ１７はＸ−Ｙ二次元に移動可能であり、走査ステージ１７の微小移動によって駆動機構３２の動作を代用することもできる。
【００３９】
前記駆動機構３２の制御は、油圧機構や機械的減速機構を介して顕微鏡を観察しながら手動で操作してもよいし、電動機構を採用してコンピュータ９０と接続し、コンピュータモニタ９０ａ上に映されるＴＶカメラ２０の映像を観察しながらコンピュータ９０を介して操作してもよい。ここで、ＴＶカメラ２０の画像をコンピュータ４１で画像認識し、コンピュータ９０からの指令によって電動機構を制御することも可能であり、自動化によって細胞採取をより容易に行うこができる。
【００４０】
前記標本７は、スライドグラス標本であり、細胞採取時にはカバーグラスを取り外しておく。本実施の形態１においては、顕微鏡本体２１を正立型顕微鏡として図示したが、同様の構成は倒立型顕微鏡によっても構成可能であることは言うまでもない。倒立型顕微鏡による場合、マイクロマニピレータはステージ上面（対物レンズの反対側）から標本７を操作することになり、シャーレ等の培養容器やマイクロテストプレート等、上面解放型の容器の中の標本７の細胞を操作することが可能になる。
【００４１】
本実施の形態１によれば、順次位置再現された個々の細胞を顕微鏡で観察し、その形態を確認しながら細胞を採集することができる。このため、細胞の誤入の虞れがなく正確に分類できる。また、顕微鏡による拡大倍率を上げて細胞内の一部分、例えば、染色体、ミトコンドリア、細胞膜、細胞質等を観察しながら選択的に採集し分類することも可能であり、より精度の高い実験が可能になる。
【００４２】
（実施の形態２）
図６に、本発明の実施の形態２を示す。
本実施の形態２では、操作針３１の針先は顕微鏡対物レンズ６の光軸から所定の距離だけ離間した顕微鏡本体２１の右側に配置されている。これにより、操作針３１の突き出し量が減少して剛性を高めることができるとともに、顕微鏡対物レンズ６の作動距離による高さ方向のスペースの制約から解放される。
【００４３】
走査ステージ１７は、右側へのストロークを拡張し、順次位置再現する個々の細胞の再現位置が操作針３１の直下になるように、顕微鏡対物レンズ６の光軸中心と操作針３１の先端との位置ズレ量を予めコンピュータ９０に設定し、個々の細胞の再現位置を補正する。
【００４４】
また、本実施の形態２では、順次位置再現された個々の細胞と操作針３１の先端部を観察するために、対物レンズ６と干渉しないように実体顕微鏡２４を離間して設置している。これにより、マイクロマニピレータの操作針３１を立体的に観察しながら操作でき、細胞採取が容易になる。また、作動距離の長い実体顕微鏡２４を用いることにより、対物レンズから試料までの距離を長くできるから、マイクロマニピレータの操作空間が増大し、複数のマイクロマニピレータによるより複雑な実験を実行することが容易となるとともに、操作針３１の傾斜角度を大きく設定できるので、細胞採取等の操作性が向上する。
【００４５】
（実施の形態３）
図７（ａ），（ｂ）に本発明の実施の形態３を示す。本実施の形態３においては、実施の形態１における操作針３１と駆動機構３２を一体化したマイクロマニピレータ６１（図７（ｂ）参照）を、固定アーム５１を介して顕微鏡対物レンズ６に取り付けた構成（図７（ａ）参照）が特徴である。この場合、操作針３１の先端を対向レンズ６の焦点位置に合致させ、操作時以外の通常の状態では駆動機構３２により試料面から離れる方向に退避せしめられている。駆動機構３２は、圧電アクチュエータによって構成する。対物レンズ６と走査ステージ１７上の標本７との間隔は合焦機構によって調整されるので、合焦時に駆動機構３２により操作針３１の先端を対物レンズ６の焦点位置まで復帰させることにより操作針３１が光軸上の細胞に自動的に操作される。
【００４６】
また、本実施の形態３においては、顕微鏡の側面にマイクロマニピレータの支持台を設置する必要がなくなるので、机上占有面積が小さくてすむ他、標本から針先までの機構保持部品の距離が短縮されるため、マイクロマニピレータの剛性及び機械的安定度が向上する。
【００４７】
さらに、マイクロマニピレータ６１の駆動機構３２を省略しても、顕微鏡の合焦機構と走査ステージ１７の二次元移動とを併用することによって、操作針３１と標本７とを相対的に三次元的に微小移動させることもできる。
また、合焦した状態で標本７をＸＹ方向に移動させても、操作時以外は操作針３１が標本７から離間しているので操作針３１により標本７にキズを付けることがない。
【００４８】
（実施の形態４）
図８に本発明の実施の形態４を示す。本実施の形態４においては、実施の形態３におけるマイクロマニピレータ６１を、対物レンズ６光軸上に配置した以外は同一構成を成している。これにより、突端の形態３と同様作用効果の他に操作針３１の針先は、顕微鏡視野の中央の一点として顕微鏡で観察できるので、操作位置を確認しながら所望する細胞を観察することができるとともに、素早く操作を開示できる。
【００４９】
また、コンピュータ９０からの指令によって走査ステージ１７の二次元移動と合焦機構を電動制御して各細胞の座標位置を記録しておくことにより、合焦機構と走査ステージ１７を予めプログラムした細胞採取動作にしたがって三次元的に駆動させる、各細胞の座標位置を順次再現することで、細胞採取を完全に自動化することができる。このことは、上記実施の形態３にも有効であり、同様の作用効果が得られることはいうまでもない。
【００５０】
（実施の形態５）
図９に本発明の実施の形態５を示す。本実施の形態５においては、倒立型顕微鏡２１に搭載された走査ステージ１７を、コンピュータ９０によって制御するように構成している。ここで、コンピュータ９０と走査ステージ１７は、上述した走査型サイトメータと互換性を持つように構成されている。
【００５１】
即ち、コンピュータ９０は走査型サイトメータで得られたデータを受け取ってコンピュータモニタ９０ａ上で図４に示すようなドットヒストグラムを表示することができ、ゴンピュータソフトウエアによって、コンピュータ画面上でデータの領域Ａ（図４に示す）を設定し、細胞のリコールを指示すると、既述したごとく測定された順番に細胞データリストを開きながら、領域Ａに該当する細胞データが出てきた時点で該当する細胞の座標位置データをＧＰＩＢ制御コマンドとしてコンピュータ９０から走査ステージ１７のＸ軸、Ｙ軸用の前記モータコントローラ８２ａ、８２ｂへ送り、走査ステージ１７のＸ軸、Ｙ軸の位置を再現することができる。
【００５２】
即ち、測定に用いた標本と同一の標本７を走査ステージ１７に載置しておけば、走査型サイトメータ内での動作と同様に、図４に示す領域Ａに入る細胞データを示した個々の細胞が、顕微鏡対物レンズ６の視野中央に順次位置再現されることになる。また、前記倒立型顕微鏡２１の傍らにおいて、支持台３３、駆動機構３２、操作針３１によって構成されるマイクロマニピレータを構成している。このマイクロマニピレータによって、順次位置再現された細胞又は細胞物質を採集し分類することができることはいうまでもない。
【００５３】
本実施の形態５では、倒立型顕微鏡２１を用いて動作を説明したが、実体顕微鏡２４や正立型顕微鏡を用いても、同様にして走査型サイトメータと互換性のある細胞採取専用のシステムを構成可能である。
【００５４】
また、実施の形態１の場合と同様に、駆動機構３２の制御に電動機構を採用してコンピュータ９０と接続し、ＴＶカメラ２０の画像をコンピュータ９０で画像認識し、コンピュータ９０からの指令によって電動機構を制御する自動化システムを構築することも可能である。
【００５５】
さらに、実施の形態１のシステムで標本７上の個々の細胞をマーキングしておけば、走査ステージ１７とコンピュータ９０とに依存せずに、接眼レンズ２３を通して細胞を観察しながら走査ステージ１７とマイクロマニピレータを手動で操作することによって、マーキングされた細胞を採集することも可能である。この場合、コンピュータ９０や、電動システムは不要であり、マイクロマニピレータの付いたどのような顕微鏡を用いても、採集・分類を行うことが可能となる。
【００５６】
以上、本発明の実施の形態１乃至５の説明においては、微小操作手段として、操作針を用いて細胞を機械的に操作・分類するメカニカルなマイクロマニピレータを用いる場合を示した。
【００５７】
しかしながら、本発明の趣旨は機械的な構成の微小操作手段を用いる場合に限定されるものではなく、レーザを用いて細胞を焼き切るレーザマニピュレータやレーザの屈折力によって細胞を保持するレーザトラッピング法等、光学的に細胞を操作する場合、あるいは、電気的引力・反発力を利用して細胞を移動させる場合等、非接触方式による微小操作手段を用いる場合にも同様に適用することが可能である。
【００５８】
以上説明した本発明の実施の形態によれば、以下の構成を付記することができる。
（１）請求項１記載の装置において、前記微小操作手段をレーザ又は電気的引力・反発力を利用した非接触方式で構成する。この構成によれば、コンピュータ９０による制御でメカニカルな操作針を使用しない細胞の採集・分類を行う自動化システムを構築することが可能となる。
（２）請求項１記載の装置の基本的構成を利用し、個々の細胞にマーキングを施し、顕微鏡を用いてその接眼レンズを通して細胞を観察しながら走査ステージとマイクロマニピレータを手動で操作する細胞測定方法。この細胞測定方法によれば、コンピュータ制御に依存することなく細胞の採集・分類を行うことが可能となる。
【００５９】
（３）前記微小操作手段の操作針の駆動機構を顕微鏡の合焦機構を用いて構成し、標本を載置するステージの２次元移動と顕微鏡の合焦機構とにより前記操作針を３次元に駆動可能とした走査型細胞測定装置。この構成により、微小操作手段のスペースが簡略化し省スペースを図れ、かつ、操作針の剛性強化、安定性の向上が可能となる。
【００６０】
【発明の効果】
以上説明した本発明によれば、標本の細胞集団の自動測定後に、特定のデータ領域内に入る細胞データを提示した各細胞又は各細胞内物質を、効率よく正確に採取し、所望の細胞分類を行うことが可能な走査型細胞測定装置を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の実施の形態の走査型細胞測定装置の機械−光学系を示す概略図である。
【図２】本発明の実施の形態の走査型サイトメータの電気系のブロック図である。
【図３】本発明の実施の形態の走査型サイトメータの測定処理の大まかな流れを表すフローチャートである。
【図４】本発明の実施の形態における特定領域の積算測光値と面積との関係を示すヒストグラムである。
【図５】本発明の実施の形態１の走査型サイトメータの構成を示す正面図である。
【図６】本発明の実施の形態２の走査型サイトメータの構成を示す正面図である。
【図７】（ａ）は、本発明の実施の形態３の走査型サイトメータの微小操作手段及び走査ステージを示す概略図、（ｂ）は、本発明の実施の形態３の走査型のサイトメータの微小操作手段としてのマイクロマニピレータの側面図である。
【図８】本発明の実施の形態４の走査型サイトメータの微小操作手段及び走査ステージを示す概略図である。
【図９】本発明の実施の形態５の走査型サイトメータの構成を示す正面図である。
【符号の説明】
１ レーザー
２ ダイクロイックミラー
３ ガルバノメーターミラー
４ 瞳投影レンズ
６ 対物レンズ
７ 標本
１２ 透過照明光学系
１５ 光電子増倍管
１６ 顕微鏡観察光学系
１７ 走査ステージ
１８ スポット投影レンズ
１９ 落射蛍光投光管
２１ 顕微鏡本体
２３ 接眼レンズ
２５ 対物レンズ像面
３１ 操作針
３２ 駆動機構
３３ 支持台
８０ ＣＰＵ
９０ コンピュータ
Claims (7)
- 細胞集団標本上で光ビームを顕微鏡対物レンズで集光して二次元走査し、細胞からの蛍光、反射光または透過光の少なくとも１つを検出器で検出し、検出器で検出した光電信号によって形成された走査画像データを取り込み、該走査画像データに対する画像処理によって細胞集団標本内の各細胞の細胞内成分量を定量測定する走査型細胞測定装置において、
前記細胞集団標本内の各細胞の走査画像データを基にこれらの座標位置データを求める座標位置管理手段と、
前記走査画像データから前記各細胞についての細胞情報を算出する情報算出手段と、
前記細胞情報に関して特定のデータ範囲を指定する範囲指定手段と、
前記各細胞又は各細胞内物質を操作又はマーキングする微小操作手段とを有し、
前記指定されたデータ範囲にある細胞情報をもつ細胞の前記座標位置データを基に各細胞と前記微小操作手段との位置関係を制御するよう構成したことを特徴とする走査型細胞測定装置。 - 請求項１記載の走査型細胞測定装置において、
前記微小操作手段が前記顕徴鏡対物レンズに結合されていることを特徴とする走査型細胞測定装置。 - 細胞集団標本上で光ビームを顕微鏡対物レンズで集光して二次元走査し、細胞からの蛍光、反射光または透過光の少なくとも１つを検出器で検出し、検出器で検出した光電信号によって形成された走査画像データを取り込み、該走査画像データに対する画像処理によって細胞集団標本内の各細胞の細胞内成分量を定量測定する走査型細胞測定装置において、
前記細胞集団標本内の各細胞の走査画像データを基にこれらの座標位置データを求める座標位置管理手段と、
前記顕微鏡対物レンズの光軸から所定の距離だけ離れた位置に操作先端が配置され、前記各細胞又は各細胞内物質を操作又はマーキングする微小操作手段と、
前記顕微鏡対物レンズから離間し、前記微小操作手段の操作先端による操作又はマーキング位置を観察する実体顕微鏡とを有し、
前記座標位置データを基に各細胞と前記微小操作手段との位置関係を制御しつつ前記実体顕微鏡により前記微小操作手段の操作先端による操作又はマーキング位置を観察可能に構成したことを特徴とする走査型細胞測定装置。 - 請求項１〜３に記載の走査型細胞測定装置において、
前記微小操作手段をレーザ又は電気的引力・反発力を利用した非接触方式で構成したことを特徴とする走査型細胞測定装置。 - 請求項１〜３に記載の走査型細胞測定装置において、
前記微小操作手段の操作針の駆動機構を顕微鏡の合焦機構を用いて構成し、標本を載置するステージの２次元移動と顕微鏡の合焦機構とにより前記操作針を３次元に駆動可能とした走査型細胞測定装置。 - 細胞集団標本上で光ビームを顕微鏡対物レンズで集光して２次元走査し、細胞からの蛍光、反射光または透過光の少なくとも１つを検出器で検出し、検出器で検出した光電信号によって形成された走査画像データを取り込み、該走査画像データに対する画像処理によって細胞集団標本内の各細胞の細胞内成分量を定量測定する走査型細胞測定装置において、
前記細胞集団標本内の各細胞の走査画像データを基にこれらの座標位置データを求める座標位置管理手段と、
前記各細胞又は各細胞内物質を操作又はマーキングする微小操作手段とを有し、
前記座標位置データを基に各細胞と前記微小操作手段との位置関係を制御するとともに、
前記微小操作手段の操作針の駆動機構を顕微鏡の合焦機構を用いて構成し、標本を載置するステージの２次元移動と顕微鏡の合焦機構とにより前記操作針を３次元に駆動可能としたことを特徴とする走査型細胞測定装置。 - 請求項１〜６記載の装置を利用し、個々の細胞にマーキングを施し、顕微鏡を用いてその接眼レンズを通して細胞を観察しながら走査ステージとマイクロマニピレータを手動で操作する細胞測定方法。
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