JP6131568B2 - 顕微鏡装置及び画像形成方法 - Google Patents

Description

本発明は、顕微鏡装置及び画像形成方法に関する。

従来から、超解像顕微鏡として、ＳＴＯＲＭ（Stochastic Optical Reconstruction Microscopy）が知られている（例えば特許文献１、２参照）。この顕微鏡では、観察試料として、蛍光物質又は蛍光物質を付着させたものが用いられる。この蛍光物質は、所定波長の活性化光を照射すると活性化し、後に活性化光とは異なる波長の励起光を照射すると蛍光を発して不活性化する特性を有する。観察試料に対して微弱な活性化光を照射することで低密度で蛍光物質が活性化する。その後に励起光を照射して活性化状態の蛍光物質のみを発光させることで蛍光画像を取得する。このようにして取得した蛍光画像では、低密度で発光する蛍光物質の像が個々に分離されたものとなるため、個々の像の重心位置を求めることができる。このような蛍光物質の位置を求めるステップを複数回、例えば数百回〜数万回以上繰り返し、蛍光物質の全ての像を各々の位置に配置した一枚の画像を作成することにより、高分解能の観察画像を得ることができる。

また、超解像顕微鏡装置として、試料面（ＸＹ平面）内での分解能だけではなく、試料の厚み方向（Ｚ方向）の分解能も向上させることが可能となる三次元方式のＳＴＯＲＭが知られている（例えば、非特許文献１参照）。このような三次元方式のＳＴＯＲＭでは、結像光学系にシリンドリカルレンズを挿入して試料の像に所定の非点収差を与えることで、蛍光物質の像を楕円形状とし、その楕円率からＺ方向の座標を求めることができる。

米国特許出願公開第２００８／００３２４１４号 米国特許出願公開第２００８／０１８２３３６号

Bo Huang,et.al.Science 319,810-813(2008)

しかしながら、上記三次元方式のＳＴＯＲＭにおいては、結像光学系に用いられるシリンドリカルレンズにおいて曲率が付いている方向と付いていない方向とで結像倍率が異なるので、特定の方向に縮むことで観察画像に歪みが生じるという課題があった。

本発明は上記課題を解決するためになされたものであり、歪みの無い高分解能の観察画像を得ることができる顕微鏡装置及び画像形成方法を提供することを目的とする。

本発明の第１態様に従えば、活性化光及び励起光の照射、又は励起光の照射により蛍光を発する蛍光物質を含む試料に、前記活性化光及び前記励起光、又は前記励起光を照射する照明光学系と、対物レンズを介して前記試料から発生された蛍光を受けるとともに、非点収差が付与された前記試料の蛍光像を形成する結像系と、前記結像系からの前記試料の蛍光像を撮像する撮像装置と、前記非点収差が付与された前記試料の蛍光像における蛍光輝点の位置情報を、予め算出した位置補正係数を用いて補正する補正部と、補正された前記蛍光輝点の位置情報に基づいて、試料画像を生成する画像生成部とを備える顕微鏡装置が提供される。

また、本発明の第２態様に従えば、活性化光及び励起光の照射、又は励起光の照射により蛍光を発する蛍光物質を含む試料に、前記活性化光及び前記励起光、又は前記励起光を照射することにより発生した蛍光に対して非点収差が付与された前記試料の蛍光像を用いた画像形成方法であって、前記非点収差が付与された前記試料の蛍光像における蛍光輝点の位置情報を、予め算出した位置補正係数を用いて補正するステップと、補正された前記蛍光輝点の位置情報に基づいて、試料画像を生成するステップと、を備える画像形成方法が提供される。

本発明の態様によれば、歪みの無い高分解能の観察画像を得ることができる。

第一実施形態に係る顕微鏡装置の概略構成を示す図。 本実施形態に係るシリンドリカルレンズユニットの構成を示す図。 顕微鏡装置の結像光学系の概略構成を示す図。 １個の蛍光物質が撮像装置上に形成する像の形状を示す図。 蛍光物質のＺ座標と像のＸ，Ｙ方向各々の幅との関係を示すグラフ。 （ａ），（ｂ）は、対物レンズの倍率及びシリンドリカルレンズの焦点距離と非点隔差との関係を示す図。 シリンドリカルレンズによる倍率特性が像に与える影響を説明した図。 顕微鏡装置が取得するＳＴＯＲＭ画像を概念的に示した図。 （ａ），（ｂ）は、制御部の詳細構造を示す図。 本実施形態の画像形成方法を示すフローチャートである。 座標リストに基づいて位置補正係数を算出するステップを概念的に示す図。 座標リストに基づいて位置補正係数を算出するステップを概念的に示す図。 標本を用いた変形例を説明する図。 第ニ実施形態に係る顕微鏡装置の概略構成を示す図。 本実施形態に係るシリンドリカルレンズユニットの構成を示す図。 第三実施形態に係る顕微鏡装置の概略構成を示す図。 本実施形態に係るシリンドリカルレンズユニットの構成を示す図。 シリンドリカルレンズユニットを回転軸方向から視た構成を示す図。 （ａ），（ｂ）は、各シリンドリカルレンズの位置関係を示す図。 第四実施形態に係るシリンドリカルレンズユニットの概略構成を示す図。

以下、図面を参照して本発明の顕微鏡装置の一実施形態に係る構成について説明する。なお、本実施形態は、発明の要旨をより良く理解させるために具体的に説明するものであり、特に指定のない限り、本発明を限定するものではない。また、以下の説明で用いる図面は、特徴をわかりやすくするために、便宜上、要部となる部分を拡大して示している場合があり、各要請要素の寸法比率などが実際と同じであるとは限らない。

（第一実施形態）
図１は本実施形態に係る顕微鏡装置の概略構成を示す図である。顕微鏡装置１００は、図１に示されるように、制御部２５と、照明系（照明光学系）１０と、試料８を載置するステージ１２３と、ステージ１２３上の試料８に対向配置される対物レンズユニット１２Ａと、結像光学系（結像系）７と、結像光学系７により結像された試料８の像を撮像するカメラ（撮像装置）１４と、リレー光学系１５と、を備えている。

本実施形態に係る顕微鏡装置１００は、超解像顕微鏡技術（Stochastic Optical Reconstruction Microscopy；ＳＴＯＲＭ）を用い、二次元方式或いは三次元方式のＳＴＯＲＭに対応した顕微鏡装置である。顕微鏡装置１００では、蛍光物質を標識として付与された試料を用いる。この蛍光物質は、所定波長の活性化光を照射されると活性化する。また、この蛍光物質は、活性化状態で活性化光とは異なる波長の励起光を照射されると蛍光を発して不活性化する。そして、励起光と活性光とを用いて試料中の一部の蛍光物質のみを発光させることで離散的に分布した蛍光を観察する動作を繰り返す。これにより取得した多数の蛍光画像を用いて試料画像を形成することができる。なお、蛍光物質はＣｙ５やＡｌｅｘａ６４７などの有機化合物を含むことができる。また、蛍光物質は、ＰＡ−ＧＦＰなどの蛍光タンパク質を含むことができる。

制御部２５は、顕微鏡装置１００を総合的に制御するコンピュータであり、記憶部２６と、表示部２７と、カメラコントローラ３４と、照明系１０と、結像光学系７と、に接続されている。本実施形態において、制御部２５は、少なくとも、これらの装置を制御するための制御信号を生成する制御信号生成機能を備えている。

記憶部２６は、例えば半導体メモリやハードディスクなどからなり、制御部２５において使用されるプログラムや制御部２５から供給されるデータ（蛍光画像、座標リストなど）を、制御部２５から読出可能な状態で記憶する。
表示部２７は、例えばモニタ（表示装置）やプリンタ（印刷装置）であり、制御部２５から出力される画像データに基づく映像を表示、印刷する機能を提供する。本実施形態では、表示部２７としてモニタを用いている。
カメラコントローラ３４は、カメラ（撮像装置）１４を駆動制御する。カメラ１４は、例えばＣＣＤ等の撮像素子により構成されるものである。カメラコントローラ３４は、制御部２５から入力される制御信号に基づいてカメラ１４を動作させ、試料８から放射された蛍光の画像を取得し、取得した蛍光画像を制御部２５に出力する。

照明系１０は、レーザ台４０と、ファイバ９と、レンズ２，３と、エキサイタフィルター４と、を含む。レーザ台４０は、第１のレーザ光源４１ａと、第２のレーザ光源４１ｂとを有する。第１のレーザ光源４１ａは、試料に付与した蛍光物質を活性化するための活性化光Ｌ１を照射するものである。第１のレーザ光源４１ａは、試料に含まれる蛍光物質に適合する波長の活性化光Ｌ１を射出する。第１のレーザ光源４１ａとして、例えば、蛍光物質の種類に応じて、緑色レーザ（波長５３２ｎｍ）、赤色レーザ（波長６３３ｎｍ、６５７ｎｍ）、紫色レーザ（波長４０５ｎｍ）、青色レーザ（波長４５７ｎｍ）などを用いることができる。

第２のレーザ光源４１ｂは、試料に付与した蛍光物質を発光させるための励起光Ｌ２を照射するものである。第２のレーザ光源４１ｂは、試料に含まれる蛍光物質に適合する波長の励起光Ｌ２を射出する。第２のレーザ光源４１ｂとして、例えば、蛍光物質の種類に応じて、緑色レーザ（波長５３２ｎｍ）、赤色レーザ（波長６３３ｎｍ、６５７ｎｍ）、紫色レーザ（波長４０５ｎｍ）、青色レーザ（波長４５７ｎｍ）などを用いることができる。レーザ台４０は、レーザ光源４１ａ、４１ｂ各々の前に配置されたシャッター４２ａ、４２ｂと、レーザ光源４１ｂからの光Ｌ２を反射するミラー４３と、レーザ光源４１ａからの光Ｌ１は透過し、レーザ光源４１ｂからの光Ｌ２は反射するダイクロイックミラー４４と、入射したレーザ光の強度を調整する音響光学素子４５と、レーザ光をファイバ９の入射端に集光するためのカプラー４６と、を有する。なお、レーザ台４０には制御部２５が接続されている。制御部２５はシャッター４２ａおよびシャッター４２ｂの開閉を制御し、活性化光Ｌ１、励起光Ｌ２の照射を切り替えるようになっている。また、同時に、制御部２５は音響光学素子４５を制御し、ファイバに入射するレーザ光の強度を調整する。

照明系１０と対物レンズユニット１２Ａとの光路の間には、ダイクロイックミラー５が配置されている。対物レンズユニット１２Ａは、焦点深度の浅い低倍率対物レンズ１２ａと、焦点深度の深い高倍率対物レンズ１２ｂと、を含む。以下、説明の都合上、低倍率対物レンズ１２ａと高倍率対物レンズ１２ｂとを総称して対物レンズ１２と呼ぶこともある。照明系１０からの照明光は、ダイクロイックミラー５により反射されることで対物レンズ１２の瞳面に集光する。これにより、対物レンズ１２から射出された照明光が試料８を照明する。

上述のようにして制御部２５は、レーザ光源４１ａ、４１ｂから活性化光Ｌ１および励起光Ｌ２を試料８に照射する。試料８から発せられた光は対物レンズ１２に入射し、平行光となって射出される。その光は、ダイクロイックミラー５、バリアフィルター６を透過した後、結像光学系７に入射する。結像光学系７は、結像レンズ２０と、プリズム２１と、アフォーカル光学系を構成するレンズ２２，２３と、これらレンズ２２，２３間に設けられたシリンドリカルレンズユニット（非点隔差変更装置）５０と、を含む。

プリズム２１には制御部２５が接続されている。また、プリズム２１には不図示の進退機構が設けられており、プリズム２１が光路に対して出し入れ可能とされている。すなわち、プリズム２１は光路中に挿入された場合、対物レンズ１２からの光を反射してカメラ１４へと導くようになっている。

リレー光学系１５は、結像レンズ２０の後方に、ミラー１１、レンズ１３、ミラー１６、レンズ１７，１８、ミラー１９を配置することで構成される。上記プリズム２１が光路から退避することで、試料８からの光はリレー光学系１５によってリレーされ、接眼レンズ３７を介して観察者（観察眼）３８により試料８の像として観察される。

具体的に、結像レンズ２０からの光はミラー１１によって反射された後、一次像２４ａを形成する。また、一次像２４ａからの光はレンズ１３を通過した後ミラー１６によって反射され、レンズ１７，１８を通過し、ミラー１９によって反射され、二次像２４ｂを形成する。観察者３８は、接眼レンズ３７を通して二次像２４ｂを目視観察することができる。なお、リレー光学系１５は、例えば観察者３８が試料８における画像取得領域を設定する初期設定時に使用されるものである。

本実施形態に係る顕微鏡装置１００は、結像光学系７による試料８の像に後述する非点収差を付与し、この像をカメラ１４により撮像することで試料８の三次元情報を取得可能となっている。

本実施形態においては、結像光学系７による試料８の像に非点収差を付与すべく、結像光学系７がレンズ２２、２３間に図２に示すシリンドリカルレンズユニット５０を備えている。シリンドリカルレンズユニット５０には制御部２５が接続されている。シリンドリカルレンズユニット５０は、図２に示されるようにシリンドリカルレンズ１０１，１０２と、これらシリンドリカルレンズ１０１，１０２をレンズ２２、２３間に進退させるスライダ部（進退部）１０５と、を備えている。スライダ部１０５は、レンズ２２、２３間にシリンドリカルレンズ１０１，１０２をスライド可能に保持するスライド板１０５ａと、該スライド板１０５ａをスライドさせる駆動部１０５ｂとを含む。駆動部１０５ｂには制御部２５が接続されている。

スライド板１０５ａには、シリンドリカルレンズ１０１，１０２の保持部１０１ａ，１０２ａと、開口部１０６とが設けられている。これら保持部１０１ａ，１０２ａおよび開口部１０６は、スライド板１０５ａのスライド方向（水平方向）に沿って配置されている。開口部１０６は、レンズ２２を通過した光を遮ることなく通過させる大きさに設定されている。シリンドリカルレンズ１０１，１０２は、保持部１０１ａ，１０２ａに嵌合されることでスライド板１０５ａに保持されている。なお、シリンドリカルレンズ１０１、１０２は、それぞれが異なる焦点距離を有している。具体的に、シリンドリカルレンズ１０２はシリンドリカルレンズ１０１よりも焦点距離が短く設定されている。

シリンドリカルレンズ１０１，１０２の各矢印Ａ，Ｂは各レンズの母線方向を示し、本実施例においては、例えば共にスライド板１０５ａのスライド方向と直交する鉛直方向に設定されている。これにより、シリンドリカルレンズ１０１，１０２のいずれを用いた場合であっても、カメラ１４上に形成される試料８の像の楕円方向が変化するのを防止している。代替的に、シリンドリカルレンズ１０１，１０２は、その母線方向が共に水平方向（スライド板１０５ａのスライド方向）となるように配置できる。

シリンドリカルレンズユニット５０のこのような構成において、制御部２５が駆動部１０５ｂを駆動してスライド板１０５ａをスライドする。これに伴い、シリンドリカルレンズユニット５０は、結像光学系７の光路中に挿入するシリンドリカルレンズ１０１，１０２を切り替え可能である。これにより、顕微鏡装置１００は後述のように三次元方式にて試料８の画像を取得することが可能となっている。また、顕微鏡装置１００は、スライド板１０５ａを駆動することで結像光学系７内の光路中に開口部１０６を挿入可能となっており、二次元方式にて試料８の画像を取得することも可能となっている。

図３は、顕微鏡装置１００の結像光学系の概略構成図であり、具体的にはスライド板１０５ａによりシリンドリカルレンズ１０１が光路中に挿入された状態を示している。なお、説明を分かりやすくするため、照明系１０、結像レンズ２０、プリズム２１、およびレンズ２２，２３等については図示を省略している。また、説明の都合上、図３においてＸＹＺ座標系を設定し、適宜このＸＹＺ座標系を用いて説明を行う。ＸＹＺ座標系は、例えば、水平面に沿ってＸ軸及びＹ軸が設定され、鉛直方向に沿って上向きにＺ軸が設定される。なお、このＸＹＺ座標系は図３内においてのみ有効なものとする。

試料８からの光は対物レンズ１２に入射して平行光束となり、結像レンズ２０に入射する。図３に示す状態では、結像レンズ２０とカメラ１４との間にシリンドリカルレンズ１０１が配置された場合について説明する。シリンドリカルレンズ１０１は、母線方向がＹ方向となるように配置されている。シリンドリカルレンズ１０１はＸ方向には屈折力を持つが、Ｙ方向（母線方向）には屈折力を持たない状態とされている。

図４は試料８の表面に存在する１個の蛍光物質がカメラ１４上に形成する像の形状を示す図である。通常、結像光学系の分解能より小さい蛍光物質はカメラ１４上に円形の像を形成する。本実施形態では、シリンドリカルレンズ１０１を含む結像光学系７を用いることで、像はそのＺ座標によってＸ方向の幅（Ｗｘ）、Ｙ方向の幅（Ｗｙ）がそれぞれ変化する。像が円形（Ｗｘ＝Ｗｙ）となる蛍光物質のＺ座標をＺ＝０とする（対物レンズ１２の焦点面ではない）と、Ｚ＞０のとき、像はＸ方向に長軸を持った楕円（Ｗｘ＞Ｗｙ）となり、また、Ｚ＜０のとき、像はＹ方向に長軸を持った楕円（Ｗｘ＜Ｗｙ）となる。すなわち、試料８に付与した１個の蛍光物質がカメラ１４上に形成する像は、後述のようにＺ座標によって、Ｘ方向の幅とＹ方向の幅がそれぞれ変化する。

図５は蛍光物質のＺ座標（横軸）と像のＸ，Ｙ方向各々の幅（縦軸）との関係を示すグラフである。Ｘ，Ｙ方向の幅Ｗｘ、ＷｙはそれぞれＺ＜０、Ｚ＞０に極小値を持つ。換言すると、Ｗｘは、０未満の、あるＺ位置（シリンドリカルレンズ１０１のＸ方向における撮像面と共役な位置）で極小となる。Ｗｙは、０を超える、あるＺ位置（対物レンズ１２の焦点面）で極小となる。Ｚ＝０においてＷｘ＝Ｗｙとなる。Ｗｘ，Ｗｙがそれぞれ極小となるＺ座標の差Δが非点隔差である。換言すると、非点隔差は、Ｗｘが極小となるＺ位置と、Ｗｙが極小となるＺ位置との差である。

顕微鏡装置１００は、結像レンズ３とカメラ１４との間にシリンドリカルレンズ１０１を配置した場合の像の変化率（Ｘ方向の幅とＹ方向の幅との比率；Ｗｙ／Ｗｘ）とＺ座標とを関連付けたデータでありかつ予め実験等により求められたデータを記憶部２６に記憶している。顕微鏡装置１００において、試料８の表面に存在する蛍光物質の各々がカメラ１４上に形成する像の形状を撮像したデータと、記憶部２６内に記憶されているデータとを比較することで像（蛍光物質）のＺ座標を検出することが可能である。このように顕微鏡装置１００は非点収差が付与された像をカメラ１４で撮像し、各画像から蛍光物質の位置（Ｚ方向も含む）を求め、それらを一枚の画像中に配置する。したがって、顕微鏡装置１００を用いて三次元情報（Ｚ座標）を含む高解像度の試料８の画像を取得可能である。

上述の非点隔差は対物レンズの焦点深度に合わせて所定の量となるように調整する必要がある。図６（ａ）は対物レンズの焦点深度に対して非点隔差が比較的大きい場合の、ＺとＷｘ、Ｗｙの関係を示したグラフである。

対物レンズの焦点深度に対して非点隔差が比較的大きい場合には、図６（ａ）に示されるように、Ｚ＝０の位置からわずかにＺがずれただけでＷｘもしくはＷｙが非常に大きくなる。像が過度に大きくなると、カメラ１４上における強度が下がり、Ｓ／Ｎが低下する。その結果、取得した画像から求められるＷｘ、Ｗｙの誤差が大きくなる傾向にあり、像のＺ座標を正しく求めることができない可能性がある。

一方、図６（ｂ）は対物レンズの焦点深度に対して非点隔差が比較的小さい場合の、ＺとＷｘ、Ｗｙの関係を示したグラフである。対物レンズの焦点深度に対して非点隔差が比較的小さい場合には、図６（ｂ）に示されるように、Ｚ＝０近辺における楕円率（Ｗｙ／Ｗｘ）の変化率が小さい。その結果、像から求めたＷｘ，Ｗｙに含まれるわずかに誤差が、Ｚ座標の算出結果では大きな誤差となる傾向にあり、像のＺ座標を正しく求めることができない可能性がある。

そこで、三次元方式の画像観察を行う場合、対物レンズ１２の焦点深度に合わせて適切な焦点距離のシリンドリカルレンズを使用することで、非点隔差を最適な範囲に調整することができる。

具体的には、非点隔差を対物レンズの焦点深度の２倍程度とすることが望ましい。対物レンズの開口数をＮＡ、対物レンズの標本側の面に接する媒質の屈折率をｎ、色素の蛍光波長をλとすると、焦点深度ＦＤは下記の式で表される。
ＦＤ＝（ｎλ）／（２ＮＡ^２） …（１）

一方、シリンドリカルレンズの焦点距離をｆ、シリンドリカルレンズから像面までの距離をｄとすると、シリンドリカルレンズによって生じる像側での非点隔差Δ’は下記の式で表される。
Δ‘＝（Ｄ^２）／（Ｆ＋Ｄ） …（２）

また、対物レンズの倍率をβとすると、非点隔差を物体側に換算した値Δは下記の式で表される。
Δ＝（ｎΔ‘）／（β^２） …（３）

非点隔差を焦点深度の２倍とするためには、下記の条件式を満たせばよい。
Δ＝２ＦＤ …（４）

式（１）〜（４）をfについて解くと、下記の式が得られる。
Ｆ＝（Ｄ^２・ＮＡ^２）/（β^２・λ） …（５）

したがって、利用する対物レンズに合わせて、シリンドリカルレンズの焦点距離が式（５）を満たすように切り替えれば、適切な非点隔差が得られる。

例えば、倍率１００倍、ＮＡ１．４の対物レンズで蛍光波長５５０ｎｍの蛍光色素を観察する場合には、像面から５０ｍｍの位置に焦点距離841ｍｍのシリンドリカルレンズを配置すれば良い。また、倍率６０倍、ＮＡ１．４の対物レンズを用いる場合には、シリンドリカルレンズの焦点距離を２４２５ｍｍに切り替えればよい。また、倍率２０倍、ＮＡ０．７５の対物レンズを利用する場合には、シリンドリカルレンズの焦点距離を６３４２ｍｍに切り替えればよい。

本実施形態に係る顕微鏡装置１００は、シリンドリカルレンズユニット５０が焦点深度の浅い対物レンズ１２ａに対応するシリンドリカルレンズ１０１と、焦点深度の深い対物レンズ１２ａに対応するシリンドリカルレンズ１０２とを含む。シリンドリカルレンズ１０１の焦点距離は、シリンドリカルレンズ１０２の焦点距離と異なる。すなわち、顕微鏡装置１００は、焦点距離が互いに異なる複数のシリンドリカルレンズ１０１，１０２を含み、使用される対物レンズ１２の焦点深度に合わせて適切な焦点距離のシリンドリカルレンズを選択するように構成されている。

顕微鏡装置１００において、低倍率対物レンズ１２ａを使用して三次元方式による画像取得を行う場合、制御部２５がシリンドリカルレンズユニット５０の駆動部１０５ｂを駆動し、スライド板１０５ａをスライドさせることで結像光学系７内の光路にシリンドリカルレンズ１０１を挿入する。一方、顕微鏡装置１００において、観察者３８によって高倍率対物レンズ１２ｂが選択されると、制御部２５によりシリンドリカルレンズユニット５０の駆動部１０５ｂを駆動し、スライド板１０５ａをスライドさせて結像光学系７からの光の光路にシリンドリカルレンズ１０２を挿入する。

以上のように顕微鏡装置１００において、画像取得条件に応じて対物レンズ１２の倍率、開口数が変更される。また、顕微鏡装置１００において、焦点深度が変化した場合でも、対物レンズ１２に対応して最適な焦点距離を有するシリンドリカルレンズ１０１，１０２のいずれか一方が選択される。したがって、所定範囲の非点隔差を設定することができ、三次元方式による試料８の画像観察を精度良く行うことができる。

また、顕微鏡装置１００において、観察者３８が二次元方式による画像取得を希望した場合、制御部２５によりシリンドリカルレンズユニット５０の駆動部１０５ｂを駆動し、スライド板１０５ａをスライドさせて結像光学系７からの光の光路に開口部１０６を挿入する。このとき、試料８からの光は開口部１０６を通過するため、シリンドリカルレンズを通過する場合のように楕円状に像が変形することがなく、カメラ１４上において円形の像となる。これにより、顕微鏡装置１００において、カメラ１４が撮像した円形の像に基づき、試料８の二次元画像を取得することができる。

また、上述の実施形態では、シリンドリカルレンズ１０１，１０２と対物レンズ１２との対応関係が二種類の場合について説明したが、三種類以上のシリンドリカルレンズ及び対物レンズを組み合わせる場合についても本発明は適用可能である。例えば、シリンドリカルレンズの種類の数は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又はそれ以上にできる。この場合、各シリンドリカルレンズは、対応付けられた対物レンズ１２と組み合わされた際に最適な非点隔差を設定可能な焦点距離を有している。

ところで、顕微鏡装置１００においては、三次元方式による画像取得を行う場合に用いるシリンドリカルレンズ１０１、１０２は、試料８の像に上述のような非点収差を付与するため、例えば、一方向においては曲率が付いているものの、他方向においては曲率が付いていない形状を有している（図３に示されるシリンドリカルレンズ１０１参照）。そのため、シリンドリカルレンズ１０１、１０２は、曲率が付いている方向と曲率が付いていない方向とで倍率が異なる。具体的に、図７に示されるように、シリンドリカルレンズ１０１、１０２は、例えば、曲率が付いていない方向をＹ軸に一致させ、曲率が付いている方向をＸ軸に一致させた場合、Ｘ軸方向の倍率がＹ軸方向における倍率よりも数％程度小さくなる。そのため、取得されるＳＴＯＲＭ画像においては、その蛍光輝点の位置を規定するＹ座標はズレが無い値を得られるものの、Ｘ座標は所定方向にズレた値となってしまう。従って、図８に示されるように、顕微鏡装置１００が取得するＳＴＯＲＭ画像は、所定方向（Ｘ方向）に縮んで歪んでしまうといった問題が生じる。

そこで、結像系７（シリンドリカルレンズ１０１又は１０２とレンズ２３）の設計値に基づいて、シリンドリカルレンズ１０１、１０２の構造に起因した歪みを補正する設計補正係数（設計補正値）を算出し、該設計補正係数を用いることでＳＴＯＲＭ画像の座標を補正することが考えられる。設計補正係数は、Ｘ座標に関する設計補正係数ａと、Ｙ座標に関する設計補正係数ｂとを含み、予め下記の計算式に基づいて算出される。設計補正係数ａと設計補正係数ｂとは、異なる値となる。上記設計補正係数ａ，ｂは記憶部２６に記憶されている。

なお、シリンドリカルレンズ１０１、１０２は、Ｚ方向における倍率については倍率差を生じさせないため、顕微鏡装置１００により取得されるＳＴＯＲＭ画像についてＺ方向の歪みを考慮する必要は無い。そのため、以下の説明において、蛍光輝点の座標値の補正については、ｘ，ｙ座標のみを考慮するものとし、ｚ座標については考慮しない。

ここで、上記設計補正係数ａ、ｂは、以下のようにして算出することができる。
以下、例えば、シリンドリカルレンズ１０１がＸ方向に沿って曲率を有しているものとする。なお、カメラ１４に試料８の像を結像させるレンズ２３の焦点距離をｆ_ｔ、シリンドリカルレンズ１０１の焦点距離をｆ_ｃ、レンズ２３からシリンドリカルレンズ１０１までの距離をｄとする。

ここで、例えばレンズ２３とシリンドリカルレンズ１０１の合成焦点距離をＸ方向、Ｙ方向でそれぞれｆ_ｘ、ｆ_ｙとすると、これらｆ_ｘ及びｆ_ｙは、下記の式で規定される。

ｆ_ｘ＝１／（１／ｆ_ｔ＋１／ｆ_ｃ−ｄ／ｆ_ｔｆ_ｃ）＝ｆ_ｔｆ_ｃ／（ｆ_ｔ＋ｆ_ｃ−ｄ） …（６）

ｆ_ｙ＝ｆ_ｔ …（７）

また、対物レンズ１２の焦点距離をｆ_０とすると、Ｘ方向、Ｙ方向の倍率β_x、β_yはそれぞれ下記の式で規定される。

β_ｘ＝ｆ_ｘ／ｆ_０＝ｆ_ｔｆ_ｃ／ｆ_０（ｆ_ｔ＋ｆ_ｃ−ｄ) …（８）

β_ｙ＝ｆ_ｙ／ｆ_０＝ｆ_ｔ／ｆ_０ …（９）

また、シリンドリカルレンズ１０１を結像系７の光路から外した場合の倍率βは、下記の式で規定される。

β＝ｆ_ｔ／ｆ_ｏ …（１０）

したがって、設計補正係数ａ，ｂは、それぞれ下記の式で規定される。

ａ＝β／β_ｘ＝（ｆ_ｔ＋ｆ_ｃ−ｄ）／ｆ_ｃ …（１１）

ｂ＝β／β_ｙ＝１ …（１２）

例えば、レンズ２３の焦点距離が２００ｍｍ、シリンドリカルレンズ１０１の焦点距離が２０００ｍｍ、レンズ２３からシリンドリカルレンズ１０１までの距離を１００ｍｍとすると、設計補正係数ａ、は、１．０５、設計補正係数ｂは、１．０と算出される。

なお、上記説明においては、シリンドリカルレンズ１０１に対応した設計補正係数ａ，ｂを算出する場合を例に挙げたが、シリンドリカルレンズ１０２についても同様に算出することができる。

しかしながら、上記設計補正係数ａ，ｂであっても、シリンドリカルレンズ１０１、１０２の製造誤差や、シリンドリカルレンズユニット５０（シリンドリカルレンズ１０１、１０２）が結像系７に組み込まれた際の組み付け誤差を補正することは難しい。そのため、結像光学系７に生じる組み立て誤差（例えば、シリンドリカルレンズ１０１，１０２やレンズ２３におけるＺ軸回りの回転方向の位置ズレ）に起因した位置ズレ（座標値のズレ）は、上記設計補正係数ａ，ｂを用いても補正することができない。

これに対し、本実施形態に係る顕微鏡装置１００は、組み付け誤差等の影響を受けない、より正確な位置補正係数ａ´、ｂ´を算出し、該位置補正係数ａ´、ｂ´を用いて後述のように三次元方式で取得したＳＴＯＲＭ画像の歪みを補正することを可能としたものである。

具体的に本実施形態に係る顕微鏡装置１００において、制御部２５が、図９（ａ）に示すような蛍光画像取得部２５ａと、画像解析部２５ｂと、補正部２５ｃと、画像生成部２５ｄとを備えている。
制御部２５の蛍光画像取得部２５ａは、図９（ｂ）に示すようにカメラコントローラ３４と接続されており、カメラコントローラ３４を介してカメラ１４を作動させることにより試料８の蛍光画像Ｇ（Ｇ１，Ｇ２）を取得する。取得された蛍光画像は、直接又は記憶部２６を介して画像解析部２５ｂ及び画像生成部２５ｄに出力される。

画像解析部２５ｂは、入力された蛍光画像を解析することにより蛍光輝点Ｐに対応する蛍光物質の位置や蛍光強度を特定し、蛍光物質の位置に対応する座標リストＲを作成する。座標リストＲは、蛍光輝点Ｐの解析により得られた重心位置、ピーク強度、ピーク幅等を含むデータ構造体であり、図９（ｂ）では重心位置をプロットした図を用いて座標リストＲ（第１の座標リストＲ１及び第２の座標リストＲ２）を概念的に表示している。作成された座標リストＲは、直接又は記憶部２６を介して補正部２５ｃに出力される。詳細については後述するが、第１の座標リストＲ１とは、非点収差を付与しない試料８の蛍光画像（シリンドリカルレンズ１０１，１０２を介しない蛍光画像）を解析することで作成されるものである。第２の座標リストＲ２とは、非点収差を付与した試料８の蛍光画像（シリンドリカルレンズ１０１，１０２を介した蛍光画像）を解析することで作成されるものである。

補正部２５ｃは、第１の座標リストＲ１及び第２の座標リストＲ２を用いることにより補正された第２の座標リストＲ２’を作成する。例えば、補正部２５ｃは、第１の座標リストＲ１及び第２の座標リストＲ２を利用して位置補正係数ａ´，ｂ´を算出し、該位置補正係数ａ´，ｂ´を用いて第２の座標リストＲ２を補正し、補正された第２の座標リストＲ２’を作成する。
画像生成部２５ｄは、補正部２５ｃによって補正された第２の座標リストＲ２’を元に、各輝点を１枚の画像上に配置し、ＳＴＯＲＭ画像を作成する。
作成されたＳＴＯＲＭ画像は、例えば表示部２７に出力されることで表示される。

顕微鏡装置１００は、制御部２５に備えられた上記の機能を組み合わせて実行することにより、後述する画像形成方法の実施に必要な各種の動作を実現する。したがって、制御部２５は、試料８に励起光Ｌ２が繰り返し照射されることで撮像装置が撮像した複数の像に基づいて蛍光画像を取得する画像取得部と、撮像装置が撮像した非点収差が付与されていない試料８の蛍光像における蛍光輝点の位置を解析することで構築した第１の座標リストと、撮像装置が撮像した非点隔差を付与した試料８の像における蛍光輝点の位置を解析することで構築した第２の座標リストとから予め算出した位置補正係数を用いて、非点収差が付与された試料の蛍光像における蛍光輝点の位置情報（第２の座標リスト）を補正する補正部と、補正された蛍光輝点の位置情報に基づいて、試料８の画像を生成する画像生成部との機能を兼ね備えたものとなる。これにより、顕微鏡装置１００は、シリンドリカルレンズ１０１、１０２を用いて非点収差を付与することに起因して生じる歪みを補正したＳＴＯＲＭ画像を生成することができる。

続いて、顕微鏡装置１００の動作、及び顕微鏡装置１００における画像形成方法について説明する。
図１０は、本実施形態の画像形成方法を示すフローチャートである。本実施形態の画像形成方法は、観察条件設定ステップＳ１０１と、第１の座標リストＲ１を形成するステップＳ１０２と、画像取得ステップＳ１０３と、第２の座標リストＲ２を形成するステップＳ１０４と、補正ステップＳ１０５と、画像生成ステップＳ１０６とを有する。なお、以下では、顕微鏡装置１００にて、三次元方式によるＳＴＯＲＭ撮像処理を行う場合を前提として説明する。

まず、顕微鏡装置１００のステージ１２３上に、標識として蛍光物質を付与された試料８がセットされる。観察対象となる試料８は、例えば培養液に浸漬された細胞などである。蛍光物質としては、活性化光Ｌ１を照射されることにより活性化状態へ移行し、活性化状態で活性化光Ｌ１とは異なる波長の励起光Ｌ２を照射されると蛍光を発して不活性化する蛍光物質が用いられる。また、この蛍光物質は、励起光Ｌ２が照射されることで蛍光を発して不活性化した後、再び活性化光Ｌ１が照射されると再び活性化状態となる。具体的には、米国特許公開第２００８／００３２４１４号明細書に記載されたものを用いることができ、例えば、２種類のシアニン染料を結合させた染料対（Ｃｙ３−Ｃｙ５染料対、Ｃｙ２−Ｃｙ５染料対、Ｃｙ３−Ａｌｅｘａ６４７染料対など）を用いることができる。

上記の染料対において、一方の染料（第１の染料）が励起光により発光する光放射部分を形成し、他方の染料（第２の染料）が、光照射に応答して第１の染料を活性化するか、あるいは第１の染料の状態を切り替えるスイッチとして機能する活性化部分を形成する。
例えば、Ｃｙ３−Ｃｙ５染料対では、Ｃｙ５が光放射部分であり、Ｃｙ３はＣｙ５を活性化可能な活性化部分である。したがって、Ｃｙ３−Ｃｙ５染料対を含む蛍光物質に、Ｃｙ３の吸収波長に対応する緑色レーザ（５３２ｎｍ）を照射すると、光放射部分であるＣｙ５が活性化され、Ｃｙ５が蛍光状態に移行する。そして、Ｃｙ５が蛍光状態にある蛍光物質に対してＣｙ５の吸収波長に対応する赤色レーザ（６３３ｎｍ）を照射すると、Ｃｙ５が発光するとともに、非活性状態（暗状態）に戻る。
ＳＴＯＲＭでは、蛍光物質における蛍光状態と暗状態とのスイッチング動作を制御することで、試料８に付与された蛍光物質のごく一部のみを選択的に発光させ、蛍光物質を１分子レベルで検出可能としている。

ステージ１２３への試料８のセットが完了したならば、ステージ１２３を駆動することにより、試料８の観察視野がセットされる。この最初の観察領域のセット動作は、観察者３８による手動操作により行ってもよく、制御部２５によりステージ１２３を移動させ、予め設定された座標位置にステージ１２３を配置することにより行ってもよい。

観察領域のセットが完了したならば、次に、観察条件設定ステップＳ１０１に移行する。
観察条件設定ステップＳ１０１は、観察者３８により入力された条件に基づいて画像取得条件を選択するステップＳ１１と、ステップＳ１１で選択された対物レンズ１２に対応するシリンドリカルレンズ１０１，１０２を選択するステップＳ１２と、を含む。
まず、ステップＳ１１において、観察者３８が選択した対物レンズ１２の種類（倍率）についての情報が顕微鏡装置１００に対して入力される。
続いて、ステップＳ１２では、顕微鏡装置１００は、上記ステップＳ１１において選択された対物レンズ１２の焦点深度に合わせた適切な焦点距離を有するシリンドリカルレンズを上記シリンドリカルレンズ１０１，１０２の一方から選択するようにシリンドリカルレンズユニット５０を駆動させる。

（第１の座標リストＲ１の形成ステップＳ１０２）
本実施形態においては、観察条件設定ステップＳ１０１の終了後、第１の座標リストＲ１を形成するステップＳ１０２に移行する。
ステップＳ１０２において、顕微鏡装置１００は、スライド板１０５ａの開口部１０６を結像系７の光路に挿入した状態で試料８に対して活性化光Ｌ１を照射するとともに励起光Ｌ２を照射して蛍光画像Ｇ１を取得する。

具体的に、活性化光Ｌ１は、レーザ台４０内の第１のレーザ光源４１ａから試料８に対して照射される。なお、このとき照射される活性化光Ｌ１の強度レベルは非常に低く抑えられており、これにより試料８に含まれる蛍光物質のうちの一部のみが確率的に活性化される。また、活性化光Ｌ１は全反射照明、落射照明のいずれの形態で試料に照射してもよい。
励起光Ｌ２は、レーザ台４０内のシャッター４２ａ、４２ｂ及び音響光学素子４５を切り替えて第２のレーザ光源９ｂから試料８に照射される。すると、活性化光Ｌ１で活性化されている蛍光物質のみが選択的に発光する。なお、蛍光を発した蛍光物質は不活性状態に移行する。

顕微鏡装置１００において、制御部２５の蛍光画像取得部２５ａはこの蛍光物質が発する蛍光を、カメラコントローラ３４を介してカメラ１４を動作させることで撮影し、蛍光画像Ｇ１（図９参照）を取得する。蛍光画像取得部１４ａは、取得した１枚の蛍光画像Ｇ１を記憶部２６に記憶させる。
ここで、結像系７の光路には、シリンドリカルレンズ１０１，１０２が挿入されていないため、試料８の蛍光画像Ｇ１には非点収差が付与されない。制御部２５は、画像解析部２５ｂにより記憶部２６に蓄積されている蛍光画像Ｇ１を解析し、第１の座標リストＲ１を作成する。

具体的に、画像解析部２５ｂは、図９に示した蛍光画像Ｇ１から蛍光輝点Ｐｆを特定し、その強度ピークをＧａｕｓｓｉａｎ関数又は楕円Ｇａｕｓｓｉａｎ関数にフィッティングすることで、蛍光輝点Ｐｆに対応する蛍光物質の位置、蛍光輝点Ｐｆの強度等を特定する。例えば、蛍光輝点Ｐｆの強度ピークを二次元Ｇａｕｓｓｉａｎ関数にフィッティングし、ピークの中心位置（重心位置）を特定することにより蛍光物質の位置を特定する。また蛍光輝点Ｐｆの輝度を、観測された強度ピークからバックグラウンドの蛍光輝度を差し引くことにより算出する。このようにして蛍光画像Ｇ１について重心位置の座標値や輝度値を取得し、それらを連結したデータ構造体として第１の座標リストＲ１を作成する。作成された第１の座標リストＲ１は、記憶部２６に記憶される。なお、重心位置の座標値の原点は、結像系７の光軸上に設定される。

なお、蛍光画像Ｇ１を複数取得し、該複数の蛍光画像Ｇ１に基づいて上記第１の座標リストＲ１を作成するようにしてもよい。この場合、後述する画像取得ステップ（ＳＴＯＲＭ撮影処理）と同様、試料８に活性化光Ｌ１を照射するステップと、試料８に励起光Ｌ２を照射して蛍光画像Ｇ１を撮像するステップとを繰り返すようにすればよい。

（画像取得ステップＳ１０３）
上記ステップＳ１０２（第１の座標リストＲ１の形成ステップ）が完了したならば、次に、画像取得ステップＳ１０３に移行する。
画像取得ステップＳ１０３は、試料８に対して活性化光Ｌ１を照射するステップＳ１３と、試料８に対して励起光Ｌ２を照射して蛍光画像Ｇ２を取得するステップＳ１４と、撮像処理の終了を判定するステップＳ１５とを含む。

三次元方式の画像取得ステップＳ１０３においては、スライド板１０５ａによりシリンドリカルレンズ１０１又は１０２を結像系７の光路に挿入した状態で試料８の蛍光画像Ｇ２を取得する。そのため、試料８の蛍光画像Ｇ２には非点収差が付与されたものとされている。

まず、ステップＳ１３では、レーザ台４０内の第１のレーザ光源４１ａから試料８に対して活性化光Ｌ１を照射する。
次に、ステップＳ１４では、第２のレーザ光源９ｂから試料８に励起光Ｌ２が照射される。なお、蛍光を発した蛍光物質は不活性状態に移行する。制御部２５の蛍光画像取得部２５ａは、この蛍光物質が発する蛍光を、カメラコントローラ３４を介してカメラ１４を動作させることで撮影し、蛍光画像Ｇ２（図２参照）を取得する。蛍光画像取得部１４ａは、取得した蛍光画像Ｇ２を記憶部２６に記憶させる。取得された蛍光画像Ｇ２は、直接又は記憶部２６を介して画像解析部２５ｂに出力される。

次に、ステップＳ１５において、予め設定された枚数の蛍光画像Ｇ２の取得が終了したか否かが判定される。蛍光画像Ｇ２の枚数が予定枚数（例えば数百〜数万枚）に達していない場合には、ステップＳ１３に戻り、上述したステップＳ１３〜Ｓ１５の実行動作が繰り返される。

なお、ステップＳ１４において発光した蛍光物質は、発光後に不活性化されるため、ステップＳ１５からステップＳ１３に戻って活性化光Ｌ１の照射が再度行われる際には、試料８に含まれる蛍光物質は不活性状態に戻っている。そのため、ステップＳ１３を再実行するたびに、活性化される蛍光物質は確率的に異なるものとなり、その後のステップＳ１４で取得される蛍光画像Ｇ２は、前のサイクルで取得された蛍光画像Ｇ２とは概ね異なる蛍光輝点のパターンを示すものとなる。

ステップＳ１５において終了と判定された場合には、ステップＳ１７に移行する。
これにより、画像取得ステップＳ１０３が完了する。

（第２の座標リストＲ２の形成ステップＳ１０４）
本実施形態においては、上記画像取得ステップＳ１０３とともに、第２の座標リストＲ２を形成するステップＳ１０４を並行して進めている。
ステップＳ１０４において、画像解析部２５ｂは、蛍光画像Ｇ２から蛍光輝点Ｐｓを特定し、その強度ピークをＧａｕｓｓｉａｎ関数又は楕円Ｇａｕｓｓｉａｎ関数にフィッティングすることで、蛍光輝点Ｐｓに対応する蛍光物質の位置、蛍光輝点Ｐｓの強度等を特定する。

例えば、蛍光輝点Ｐｓの強度ピークを二次元Ｇａｕｓｓｉａｎ関数にフィッティングし、ピークの中心位置（重心位置）を特定することにより蛍光物質の位置を特定する。また、蛍光輝点Ｐｓの輝度を、観測された強度ピークからバックグラウンドの蛍光輝度を差し引くことにより算出する。このようにして蛍光画像Ｇ２について重心位置の座標値や輝度値を取得し、それらを連結したデータ構造体として第２の座標リストＲ２を作成する。作成された第２の座標リストＲ２は、記憶部２６に記憶される。なお、重心位置の座標値の原点は、結像系７の光軸上に設定される。

本実施形態において、第２の座標リストＲ２の形成ステップは、上述のように画像取得ステップＳ１０３と並行して進行されるため、画像取得ステップＳ１０３において取得される蛍光画像Ｇ２の増加に伴って、第２の座標リストＲ２を随時更新する。すなわち、第２の座標リストＲ２は、画像取得ステップＳ１０３において全ての蛍光画像Ｇ２の撮像が終了したタイミングで、全ての蛍光画像Ｇ２の蛍光輝点Ｐｓについての座標をリストとして取得する。

画像取得ステップＳ１０３及びステップＳ１０４（第２の座標リストＲ２の形成ステップ）が完了したならば、次に、補正ステップＳ１０５に移行する。
補正ステップＳ１０５は、上記ステップにより記憶部２６に記憶された第１の座標リストＲ１及び第２の座標リストＲ２を用いて位置補正係数ａ´，ｂ´を算出するステップＳ１７と、算出した位置補正係数ａ´，ｂ´を用いて第２の座標リストＲ２を補正するステップＳ１８と、を含む。

ここで、位置補正係数ａ´，ｂ´は、第１の座標リストＲ１の情報（蛍光画像Ｇ１における蛍光輝点Ｐｆの各座標（ｘ，ｙ））と、第２の座標リストＲ２の情報（蛍光画像Ｇ２における蛍光輝点Ｐｓの各座標（Ｘ，Ｙ））とを直接比較し、同一の蛍光輝点同士の座標の差分を取ることで算出できる。

しかしながら、蛍光画像Ｇ２における蛍光輝点の座標は、シリンドリカルレンズを用いて非点収差を付与することの影響によって試料８上で実際に蛍光を発している輝点の位置（座標）とは異なる。そのため、蛍光画像Ｇ２に含まれる複数の蛍光輝点Ｐｓのそれぞれが、蛍光画像Ｇ１に含まれる複数の蛍光輝点Ｐｆのうちのいずれと対応するものであるかは判断不可である。

そこで、本実施形態では、上記ステップＳ１７にて以下の各ステップを採用している。
ステップＳ１７は、第２の座標リストＲ２を設計補正係数ａ，ｂを用いて補正することで補正座標リストＣＲ２を取得するステップＳＳ１と、第１の座標リストＲ１と補正座標リストＣＲ２とを比較し、該リストＲ１，Ｒ２の中からそれぞれ同一の蛍光輝点を選択するステップＳＳ２と、選択した同一の蛍光輝点の座標に基づいて位置補正係数ａ´，ｂ´を算出するステップＳＳ３と、を含む。なお、位置補正係数ａ´，ｂ´は一度算出してしまえば、結像系７の光学特性等が変化しない限り、それ以降の画像取得ステップ１０３（ＳＴＯＲＭ撮像処理）において再度算出する必要は無く、共通に使用することができる。

まず、顕微鏡装置１００は、結像系７の設計値に基づいて設定された上記設計補正係数ａ，ｂを用いて、第２の座標リストＲ２の蛍光画像Ｇ２についての座標（ｘ，ｙ）を補正し、仮の座標データ（ｘ´，ｙ´）を含む補正座標リストＣＲ２を取得する（ステップＳＳ１）。
具体的に、制御部２５の画像解析部２５ｂは、記憶部２６に記憶された上記設計補正係数ａ，ｂを読み出し、第２の座標リストＲ２の各座標データ（Ｘ，Ｙ）に掛けることで補正座標（Ｘ´，Ｙ´）＝（ａＸ，ｂＹ）を求めて上記補正座標リストＣＲ２を形成する。補正座標リストＣＲ２の補正座標（Ｘ´，Ｙ´）は、シリンドリカルレンズ１０１又は１０２に起因して生じた歪みを補正した座標である。

続いて、画像解析部２５ｂは、第１の座標リストＲ１における各座標（ｘ，ｙ）と、上記補正座標リストＣＲ２における補正座標（Ｘ´，Ｙ´）とを比較し、該リストＲ１，ＣＲ２の中からそれぞれ同一の蛍光輝点を選択する（ステップＳＳ２）。その後、選択した同一の蛍光輝点の座標に基づいて位置補正係数ａ´，ｂ´を算出する（ステップＳＳ３）。

図１１、１２は、ステップＳＳ２、ＳＳ３を概念的に示す図である。
具体的に、ステップＳＳ２において、画像解析部２５ｂは、図１１に示すように、各リストＣＲ２、Ｒ１の各々において各座標間の距離ｄを演算により算出する。そして、距離ｄが所定の閾値Ｓ以下となる関係を有する蛍光輝点同士を概ね同一の蛍光輝点ペアと判定し、各座標リストＣＲ２、Ｒ１から同一の蛍光輝点ペアをそれぞれ選択する。

ここで、上記所定の閾値Ｓとは、結像系７において生じる可能性のある組み立て誤差に起因する歪み（例えば、０．０５ｍｍ）程度に設定されているものである。すなわち、各座標間の距離ｄが所定の閾値Ｓ以下の場合とは、各座標リストＣＲ２、Ｒ１の蛍光輝点同士の座標が組み立て誤差程度しか相違しない事を意味する。そこで、本実施形態においては、座標位置が組み立て誤差程度だけ異なる蛍光輝点同士を同一の蛍光輝点とみなすこととした。

なお、結像系７に生じる組み立て誤差が完全にゼロであれば、補正座標（Ｘ´，Ｙ´）のいずれかが座標（ｘ，ｙ）のいずれかに一致することもあり得る。この場合、距離ｄがゼロとなる。しかしながら、上述したように結像系７に生じる組み立て誤差を完全にゼロとする（無くす）ことは困難であることから、本実施形態においては、各座標が概ね一致する場合（距離ｄが閾値Ｓ以下となる場合）を、各座標が同一の蛍光輝点であると判定し、同一の蛍光輝点ペアとして選択する。

画像解析部２５ｂは、上記演算の結果、第１の座標リストＲ１及び第２の座標リストＲ２の各々から蛍光輝点ペアを複数選択する。
具体的に、画像解析部２５ｂは、図１２（ａ）、（ｂ）に示されるように、第１の座標リストＲ１における複数の蛍光輝点Ｐｆの中から選択した蛍光輝点Ｐｆ１〜Ｐｆ８と、第２の座標リストＲ２における複数の蛍光輝点Ｐｓの中から選択した蛍光輝点Ｐｓ１〜Ｐｓ８とから構成される蛍光輝点ペアＰ１〜Ｐ８を選択する。すなわち、蛍光輝点Ｐｆ１及び蛍光輝点Ｐｓ１は同一の蛍光輝点ペアの１つであり、蛍光輝点Ｐｆ２及び蛍光輝点Ｐｓ２、蛍光輝点Ｐｆ３及び蛍光輝点Ｐｓ３、蛍光輝点Ｐｆ４及び蛍光輝点Ｐｓ４、蛍光輝点Ｐｆ５及び蛍光輝点Ｐｓ５、蛍光輝点Ｐｆ６及び蛍光輝点Ｐｓ６、蛍光輝点Ｐｆ７及び蛍光輝点Ｐｓ７、蛍光輝点Ｐｆ８及び蛍光輝点Ｐｓ８はそれぞれ同一の蛍光輝点ペアである。

このように複数の蛍光輝点ペアが選択された場合、画像解析部２５ｂは、以下のようにして２組の蛍光輝点ペアを選択する。
具体的に、画像解析部２５ｂは、第１の座標リストＲ１及び第２の座標リストＲ２のそれぞれにおいて、他の蛍光輝点ペアの蛍光輝点に対する距離が最も離間した関係となる蛍光輝点ペアを２組選択する。

画像解析部２５ｂは、図１２（ａ）、（ｂ）に示すように、第１の座標リストＲ１における８個の蛍光輝点ペアＰ１〜Ｐ８のうちの、蛍光輝点Ｐｆ１、Ｐｆ２の各座標（Ｕ_１，Ｖ_１）、（Ｕ_２，Ｖ_２）と蛍光輝点Ｐｓ１、Ｐｓ２の補正座標（Ｘ_１´，Ｙ_１´）、（Ｘ_２´，Ｙ_２´）との距離が最も離間した関係にあると判定した。この場合、画像解析部２５ｂは、他の蛍光輝点ペアの蛍光輝点に対する距離が最も離間した関係となる蛍光輝点ペアを２組として、第１の座標リストＲ１の中の蛍光輝点Ｐｆ１、Ｐｆ２と第２の座標リストＲ２の中の蛍光輝点Ｐｓ１、Ｐｓ２とを含む蛍光輝点ペアＰ１，Ｐ２を選択する。

このように、ステップＳＳ２においては、蛍光画像Ｇ２の座標（Ｘ，Ｙ）として、設計補正係数ａ，ｂにより、シリンドリカルレンズを用いて非点収差を付与することの影響によるズレの無い座標（Ｘ´，Ｙ´）に変換（補正）したものを用いることで、蛍光画像Ｇ１の蛍光輝点Ｐｆと蛍光画像Ｇ２の蛍光輝点Ｐｓとを直接的に比較することとした。従って、蛍光画像Ｇ１及び蛍光画像Ｇ２の中から、それぞれ概ね同一の蛍光輝点（すなわち、それぞれの座標が概ね一致することで試料８上の同じ輝点から照射されたとみなされた蛍光）を選択できる。

上記ステップＳＳ２が終了した後、ステップＳＳ３に移行する。
ステップＳＳ３において、画像解析部２５ｂは、選択した蛍光輝点ペアＰ１，Ｐ２の各座標からより正確な位置補正係数ａ´，ｂ´を演算により算出する。具体的に、画像解析部２５ｂは、蛍光輝点Ｐｆ１、Ｐｆ２におけるＸ座標間の距離ｕ（ｕ＝Ｕ_２−Ｕ_１）と、Ｙ座標間の距離ｖ（ｖ＝Ｖ_２−Ｖ_１）とを算出する。また、画像解析部２５ｂは、蛍光輝点Ｐｓ１、Ｐｓ２においてもＸ座標間の距離ｘ（ｘ＝Ｘ_２−Ｘ_１）と、Ｙ座標間の距離ｙ（ｙ＝Ｙ_２−Ｙ_１）とを算出する。

上記演算結果から、画像解析部２５ｂは、位置補正係数ａ´（ａ´＝ｕ／ｘ），ｂ´（ｂ´＝ｖ／ｙ）を算出する。この位置補正係数ａ´，ｂ´によれば、同一の蛍光輝点において、非点収差が付与されない座標（ズレの無い座標）と、非点収差が付与された座標（ズレのある座標）とを直接比較することで算出されたものである。そのため、位置補正係数ａ´，ｂ´は、シリンドリカルレンズ１０１，１０２の設計値から算出された上記設計補正係数ａ，ｂでは補正ができない、結像系７において生じる組み立て誤差についても補正可能なものとなる。
画像解析部２５ｂは、算出した位置補正係数ａ´，ｂ´を画像生成部２５ｄに出力する。
以上のステップにより、位置補正係数ａ´，ｂ´を算出するステップＳ１７が完了する。

位置補正係数ａ´，ｂ´を算出するステップＳ１７の完了後、ステップＳ１８に移行する。
ステップＳ１８において、補正部２５ｃは、位置補正係数ａ´，ｂ´を用いてステップＳ１０４によって得られた第２の座標リストＲ２を補正する。具体的に、補正部２５ｃは、第２の座標リストＲ２のＸ，Ｙ座標にそれぞれ位置補正係数ａ´，ｂ´を掛ける演算を行い、補正された第２の座標リストＲ２´を作成する。

（画像生成ステップＳ１０６）
上記ステップＳ１０５が完了したならば、次に、画像生成ステップＳ１０６に移行する。
ステップＳ１９において、画像生成部２５ｄは、補正された第２の座標リストＲ２´を元に、各輝点を１枚の画像上に配置し、ＳＴＯＲＭ画像を生成する。

位置補正係数ａ´，ｂ´は、上述のように設計補正係数ａ，ｂが補正できない結像系７の組み立て誤差も補正できるので、より精度の高いＳＴＯＲＭ画像を三次元方式で取得することができる。

以上のように顕微鏡装置１００によれば、シリンドリカルレンズ１０１，１０２を用いることで三次元方式のＳＴＯＲＭ撮像処理を行った場合であっても、位置補正係数ａ´，ｂ´により歪みの無い状態に補正された精度の良いＳＴＯＲＭ画像を得ることができる。よって、三次元方式による試料８の画像観察を精度良く行うことができる。

なお、上記説明では、画像取得ステップＳ１０３の完了後に、補正ステップＳ１０５を開始する場合を例に挙げた。位置補正係数ａ´，ｂ´の算出に使用される第２の座標リストＲ２は、画像取得ステップＳ１０３の進行とともに随時更新される。すなわち、第２の座標リストＲ２に含まれる蛍光輝点Ｐｓは、画像取得ステップＳ１０３の進行に伴って増加する。そのため、画像取得ステップＳ１０３の途中で補正ステップＳ１０５を開始すると、第２の座標リストＲ２に含まれる蛍光輝点Ｐｓと、第１の座標リストＲ１に含まれる蛍光輝点Ｐｆとの中から同一の蛍光輝点が選択されないおそれがあるためである。

これに対し、補正ステップＳ１０５のうち位置補正係数ａ´，ｂ´を算出するステップＳ１７については、画像取得ステップＳ１０３の途中から開始してもよい。
第１の座標リストＲ１の蛍光輝点Ｐｆと同じ輝点から発せられた蛍光が、補正ステップＳ１０５におけるいずれのタイミングで撮像された蛍光画像Ｇ２に含まれるかを判断するのは難しい。そのため、補正ステップＳ１０５の途中からステップＳ１７を開始した場合であっても、第１の座標リストＲ１に含まれる蛍光輝点Ｐｆと、随時更新される第２の座標リストＲ２の蛍光輝点Ｐｓとの中から同一の蛍光輝点が選択され、位置補正係数ａ´，ｂ´を算出できる可能性もあり得る。

また、上記実施形態においては、補正ステップＳ１０５で使用する第１の座標リストＲ１及び第２の座標リストＲ２を試料８の撮像結果に基づいて作成する場合を例に挙げた。すなわち、上記実施形態においては、試料８の蛍光画像を用いて位置補正係数ａ´，ｂ´を算出していた。
これに対し、試料８に代えて図１３に示されるような格子状の標本８０を用いることで、ＳＴＯＲＭ撮像ステップよりも先に、上記位置補正係数ａ´，ｂ´を算出することもできる。標本８０は、格子部分８０ａに、試料８と同様の蛍光を発する蛍光物質が複数設けられている。

この場合、まず、顕微鏡装置１００は、スライド板１０５ａの開口部１０６を結像系７の光路に挿入した状態で標本８０の蛍光画像Ｇ１を取得し、記憶部２６に記憶させる。この場合、結像系７の光路には、シリンドリカルレンズ１０１，１０２が挿入されていないため、標本８０の蛍光画像Ｇ１には非点収差が付与されない。制御部２５は、画像解析部２５ｂにより記憶部２６に蓄積されている蛍光画像Ｇ１を解析し、上記実施形態と同様に第１の座標リストＲ１を作成する。

続いて、顕微鏡装置１００は、スライド板１０５ａにより例えばシリンドリカルレンズ１０１を光路中に挿入した状態で標本８０の蛍光画像Ｇ２（非点収差が付与された蛍光画像）を取得し、記憶部２６に記憶させる。制御部２５は、画像解析部２５ｂにより記憶部２６に蓄積されている蛍光画像Ｇ２を解析し、第２の座標リストＲ２を作成する。

制御部２５は、上記第１の座標リストＲ１及び第２の座標リストＲ２に基づいて、上記実施形態と同様のステップを行うことで、シリンドリカルレンズ１０１に対応する位置補正係数ａ´，ｂ´を算出し、記憶部２６に記憶しておく。

なお、標本８０から取得される蛍光画像Ｇ１、Ｇ２は、試料８から取得される離散的な蛍光輝点とは異なり、全ての蛍光輝点が同時に発光することで構成される。蛍光画像Ｇ１、Ｇ２は、格子部分８０ａに設けられた複数の蛍光物質により平面形状が格子状となる。そのため、画像解析部２５ｂは、蛍光画像Ｇ１、Ｇ２を解析することで、図１３に示されるように格子部分８０ａのＸ、Ｙ方向の距離を算出する。画像解析部２５ｂは、例えば、蛍光画像Ｇ１におけるＸ、Ｙ方向の距離をそれぞれｕ，ｖとし、蛍光画像Ｇ２におけるＸ、Ｙ方向の距離をそれぞれｘ，ｙと算出する。この場合、画像解析部２５ｂは、位置補正係数ａ´（ａ´＝ｕ／ｘ），ｂ´（ｂ´＝ｖ／ｙ）を算出することができる。

このように標本８０を用いれば、試料８の画像取得ステップ１０３(ＳＴＯＲＭ撮像ステップ)よりも先に、位置補正係数ａ´，ｂ´を取得できるので、ＳＴＯＲＭ撮影ステップと並行して位置補正係数を算出する場合に比べて、制御部２５による処理フローを単純化することができる。

また、上記実施形態においては、第１の座標リストＲ１を画像取得ステップ１０３の前に作成した後、画像取得ステップ１０３の途中で第２の座標リストＲ２を作成する場合を例に挙げた。しかしながら、第１の座標リストＲ１を作成するタイミング（蛍光画像Ｇ１を撮像するタイミング）は、上記実施形態に限られることはない。
例えば、シリンドリカルレンズ１０１を用いた画像取得ステップ１０３において複数の蛍光画像Ｇ２を取得している途中で、一時的にシリンドリカルレンズ１０１を結像系７の光路から退避させて蛍光画像Ｇ１を取得することで第１の座標リストＲ１を形成し、その後、再度シリンドリカルレンズ１０１を結像系７の光路に挿入することで画像取得ステップ１０３を再開して蛍光画像Ｇ２を取得することで第２の座標リストＲ２を更新するようにしてもよい。或いは、シリンドリカルレンズ１０１を用いた三次元方式の画像取得ステップ１０３が終了して第２の座標リストＲ２が形成された後、シリンドリカルレンズ１０１を結像系７の光路から退避させ、蛍光画像Ｇ１を取得することで第１の座標リストＲ１を形成するようにしてもよい。

また、上記実施形態においては、顕微鏡装置１００として、シリンドリカルレンズユニット５０が２つのシリンドリカルレンズ１０１、１０２を結像系７の光路上に入れ替え可能に挿入することができる場合を例に挙げた。しかしながら、顕微鏡装置の態様としては、例えば、試料８の像に非点収差を付与可能となるように結像系７の光路上に１つのシリンドリカルレンズを進退可能な構成であってもよい。この場合、対物レンズ１２の倍率は固定となる。すなわち、顕微鏡装置が、試料８の像に非点収差を付与した状態と付与しない状態とを切り替え可能な光学部材を備えた態様であればよい。よって、シリンドリカルレンズに代えて、シリンドリカルレンズと同様の円柱表面状の凸面を有するミラーや、前記円柱表面状を反対に凹ませた凹面を有するミラーを備えることで、試料８の像に非点収差を付与する状態と付与しない状態とを切り替え可能な態様の顕微鏡装置であってもよい。

また、上記実施形態においては、第１の座標リストＲ１及び第２の座標リストＲ２のそれぞれにおいて、他の蛍光輝点ペアの蛍光輝点に対する距離が最も離間した関係となる蛍光輝点ペアを２組選択し、選択した蛍光輝点ペアの座標データを用いて位置補正係数ａ´，ｂ´を算出する場合を説明した。
しかしながら、補正部２５ｃは、第１の座標リストＲ１及び第２の座標リストＲ２から選択した複数の蛍光輝点ペアＰ１〜Ｐ８の座標データに関する演算値の平均値に基づいて位置補正係数ａ´，ｂ´を算出するようにしてもよい。すなわち、各蛍光輝点ペアＰ１〜Ｐ８を用いて、位置補正係数ａ´，ｂ´を複数パターン算出し、これら複数の演算値（位置補正係数ａ´、ｂ´）の平均値に基づいて１つの位置補正係数ａ´，ｂ´を算出するようにしてもよい。これによれば、１個の演算値を用いる場合よりも高精度な位置補正係数ａ´，ｂ´を得ることができる。

また、上記実施形態においては、補正部２５ｃが第１の座標リストＲ１及び第２の座標リストＲ２を用いることにより算出した位置補正係数ａ´，ｂ´を用いて第２の座標リストＲ２を補正し、補正された第２の座標リストＲ２´を元に各輝点を１枚の画像上に配置してＳＴＯＲＭ画像を作成する場合を説明した。
しかしながら、例えばＳＴＯＲＭ画像の精度要求が比較的低い場合は、シリンドリカルレンズ１０１、１０２の製造誤差や、シリンドリカルレンズユニット５０（シリンドリカルレンズ１０１、１０２）が結像系７に組み込まれた際の組み付け誤差が許容されることも想定される。

このような場合、補正部２５ｃは、位置補正係数として設計補正係数（設計補正値）ａ，ｂのみを用いて第２の座標リストＲ２を補正して第２の座標リストＲ２´を作成するようにしてもよい。画像生成部２５ｄは、補正部２５ｃが設計補正係数ａ，ｂに基づいて補正した第２の座標リストＲ２´を元に、各輝点を１枚の画像上に配置し、ＳＴＯＲＭ画像を作成する。なお、この場合においては、顕微鏡装置１００は、第１の座標リストＲ１を取得する必要が無い。そのため、第１の座標リストＲ１の形成ステップＳ１０２が不要となるので、ＳＴＯＲＭ画像の作成処理を短縮することができる。

この構成によれば、顕微鏡装置１００は、予め算出されて記憶部２６に記憶された設計補正係数ａ，ｂを用いて、第２の座標リストＲ２を補正することができるので、位置補正係数ａ´，ｂ´を算出するステップＳ１７を無くすことができる。よって、顕微鏡装置１００は、ステップＳ１７の終了を待つことなく、第２の座標リストＲ２の取得と並行して補正された第２の座標リストＲ２´を作成するステップＳ１８を行うことができる。よって、上記実施形態に比べて、ＳＴＯＲＭ画像を短時間で表示部２７に出力させることができる。

（第二実施形態）
次に、顕微鏡装置の第二実施形態について説明する。なお、本実施形態に係る構成と第一実施形態に係る構成とは、対物レンズユニット及びシリンドリカルレンズユニットの構成のみが異なる。そのため、以下の説明ではシリンドリカルレンズユニットの構成を主に説明し、第一実施形態と同じ構成及び部材については同一の符号を付し、その詳細な説明については省略若しくは簡略化するものとする。

図１４は本実施形態に係る顕微鏡装置の概略構成を示す図であり、図１５は本実施形態におけるシリンドリカルレンズユニットの構成を示す図である。
本実施形態においては、図１４に示すように対物レンズユニット１１２Ａが、第１の対物レンズ１１２ａ、第２の対物レンズ１１２ｂ、第３の対物レンズ１１２ｃ、第４の対物レンズ１１２ｄ、および第５の対物レンズ１１２ｅを含んでいる。これら第１〜第５の対物レンズ１１２ａ〜１１２ｅは、この順に焦点深度が深く設定されている。すなわち、第１対物レンズ１１２ａの焦点深度が最も浅く、対物レンズ１１２ｅの焦点深度が最も深く設定されている。以下、説明の都合上、第１〜第５の対物レンズ１１２ａ〜１１２ｅを総称して対物レンズ１１２と呼ぶこともある。

本実施形態に係る顕微鏡装置２００において、図１４に示すように、結像光学系７におけるレンズ２２、２３間にシリンドリカルレンズユニット１５０が設けられている。本実施形態に係るシリンドリカルレンズユニット１５０は、図１４，１５に示すように複数のシリンドリカルレンズ２０１〜２０５と、これらシリンドリカルレンズ２０１〜２０５をレンズ２２、２３間に進退させるターレット部（進退部）２１５と、を備えている。ターレット部２１５は、シリンドリカルレンズ２０１〜２０５を保持する円板部材２１５ａと、該円板部材２１５ａの中心を通る回転軸Ｊ周りに回転させることでレンズ２２、２３間にシリンドリカルレンズ２０１〜２０５の各々を進退可能とする回転駆動部２１５ｂと、を含む。

円板部材２１５ａには、シリンドリカルレンズ２０１〜２０５の保持部２０１ａ〜２０５ａと、開口部２０６とが設けられている。これら保持部２０１ａ〜２０５ａおよび開口部２０６は、円板部材２１５ａの周方向（回転方向）に沿って配置されている。開口部２０６は、レンズ２２を通過した光を遮ることなく通過させる大きさに設定されている。シリンドリカルレンズ２０１〜２０５は、例えば保持部２０１ａ〜２０５ａに嵌合されることで円板部材２１５ａに保持されている。

シリンドリカルレンズ２０１〜２０５内の矢印は各レンズの母線方向を示し、本実施例においては、例えばそれぞれが円板部材２１５ａの径方向に向かうように取り付けられている。すなわち、各レンズの母線方向は回転軸Ｊが通る円板部材２１５ａの中心に対して放射方向に設定されており、各シリンドリカルレンズ２０１〜２０５がレンズ２２、２３間に挿入された場合に、各々のレンズの母線が鉛直方向となるように配置されている。これにより、シリンドリカルレンズ２０１〜２０５のいずれを用いた場合においても、カメラ１４上に形成される試料８の楕円方向の向きが変化してしまうのを防止している。なお、シリンドリカルレンズ２０１〜２０５は、その母線方向が共に円周方向（径方向と直交する方向）となるように配置されていても構わない。シリンドリカルレンズ２０１〜２０５は、それぞれが異なる焦点距離を有しており、具体的にシリンドリカルレンズ２０５からシリンドリカルレンズ２０１の順に焦点距離が短く設定されている。すなわち、シリンドリカルレンズ２０５の焦点距離が最も長く、シリンドリカルレンズ２０１の焦点距離が最も短く設定されている。

本実施形態において、対物レンズ１１２のうち、最も焦点深度の浅い第１の対物レンズ１１２ａと、シリンドリカルレンズユニット１５０のうち最も焦点距離の長いシリンドリカルレンズ２０５とが対応付けられている。一方、最も焦点深度の深い第５の対物レンズ１１２ｅと、シリンドリカルレンズユニット１５０のうち最も焦点距離の短いシリンドリカルレンズ２０１とが対応付けられている。また、第２の対物レンズ１１２ｂとシリンドリカルレンズ２０４とが対応付けられており、第３の対物レンズ１１２ｃとシリンドリカルレンズ２０３とが対応付けられており、第４の対物レンズ１１２ｄとシリンドリカルレンズ２０２とが対応付けられている。

このような構成に基づいて、顕微鏡装置２００は、観察者３８によって選択された対物レンズ１１２の種類に応じて、制御部２５によりシリンドリカルレンズユニット１５０の回転駆動部２１５ｂを駆動し、円板部材２１５ａを回転させて結像光学系７の光路中に対応するシリンドリカルレンズ２０１〜２０５を挿入する。これにより、顕微鏡装置２００において、観察者３８が希望する画像取得条件に応じて対物レンズ１１２の倍率、開口数を変更した場合でも、対物レンズ１１２に対応する最適なシリンドリカルレンズ２０１〜２０５を設定することができ、三次元方式による試料８の画像観察を精度良く行うことができる。

また、顕微鏡装置２００において、観察者３８が二次元方式による画像取得を希望した場合、制御部２５によりシリンドリカルレンズユニット１５０の回転駆動部２１５ｂを駆動し、円板部材２１５ａを回転させて結像光学系７の光路に開口部２０６を挿入する。このとき、試料８からの光は開口部２０６を通過するため、シリンドリカルレンズ２０１〜２０５を通過する場合のように楕円状に像が変形することがなく、カメラ１４上において円形の像となる。これにより、顕微鏡装置２００において、カメラ１４が撮像した円形の像に基づき、二次元方式で試料８の二次元画像を取得することができる。

また、本実施形態に係る顕微鏡装置２００においても、各シリンドリカルレンズ２０１〜２０５の設計値に基づいて予め算出された設計補正係数ａ，ｂが記憶部２６にそれぞれ記憶されている。
顕微鏡装置２００は、上記実施形態と同様、観察条件設定ステップＳ１０１において観察者３８により選択された対物レンズ１１２ａ〜１１２ｅの焦点深度に合わせた適切な焦点距離を有するシリンドリカルレンズを上記シリンドリカルレンズ２０１〜２０５の中から選択するようにシリンドリカルレンズユニット１５０を駆動させる。

顕微鏡装置２００は、上記実施形態と同様、蛍光画像Ｇ１，Ｇ２から取得した第１の座標リストＲ１及び第２の座標リストＲ２を解析することで、シリンドリカルレンズ２０１〜２０５毎に位置補正係数ａ´，ｂ´を算出し、記憶部２６にそれぞれ記憶する。なお、各シリンドリカルレンズ２０１〜２０５の位置補正係数ａ´，ｂ´を算出する場合、各々の設計補正係数ａ，ｂが使用される。

これにより、顕微鏡装置２００は、シリンドリカルレンズ２０１〜２０５毎に異なるＳＴＯＲＭ画像の歪みをそれぞれ補正することができる。よって、シリンドリカルレンズ２０１〜２０５を変更した場合であっても、種々の倍率で歪みの無いＳＴＯＲＭ画像を精度良く取得することができる。

なお、上述の実施形態では、シリンドリカルレンズ２０１〜２０５と対物レンズ１１２との対応関係が五種類の場合について説明したが、それ以下、或いは六種類以上の場合についても本発明は適用可能である。例えば、シリンドリカルレンズ２０１〜２０５と対物レンズ１１２との対応関係の数は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又はそれ以上にできる。

（第三実施形態）
次に、顕微鏡装置の第三実施形態について説明する。なお、本実施形態に係る構成と第一、第二実施形態に係る構成とは、シリンドリカルレンズユニットの構成のみが異なる。そのため、以下の説明ではシリンドリカルレンズユニットの構成を主に説明し、上記実施形態と同じ構成及び部材については同一の符号を付し、その詳細な説明については省略若しくは簡略化するものとする。

図１６は本実施形態に係る顕微鏡装置３００の概略構成を示す図であり、図１７は本実施形態におけるシリンドリカルレンズユニットの構成を示す図である。
本実施形態に係る顕微鏡装置３００は、図１６に示すように、結像光学系７におけるレンズ２２、２３間にシリンドリカルレンズユニット２５０が設けられている。本実施形態に係るシリンドリカルレンズユニット２５０は、一対のシリンドリカルレンズ３０１，３０２と、これらシリンドリカルレンズ３０１，３０２を保持する回転シリンダー部３１５と、を含む。回転シリンダー部３１５は、一対のシリンドリカルレンズ３０１，３０２の各々が所定の回転軸Ｋ周りに回転可能な状態で保持している。ここで、シリンドリカルレンズ３０１，３０２における所定の回転軸Ｋは、結像光学系７内の像の光線束の中心軸と平行な軸により規定される。これらシリンドリカルレンズ３０１，３０２が互いに回転することで非点隔差を連続的に変化させることが可能となっている。

シリンドリカルレンズ３０１，３０２は互いの焦点距離の正負が異なり、絶対値が等しい関係となっている。具体的に本実施形態では、図１７に示すようにシリンドリカルレンズ３０１として凹型シリンドリカルレンズを用い、シリンドリカルレンズ３０２として凸型シリンドリカルレンズを用いた。

図１８はシリンドリカルレンズユニット２５０を回転軸Ｋの軸方向から視た図である。図１８における矢印Ａはシリンドリカルレンズ３０１の母線方向を示し、図１８における矢印Ｂはシリンドリカルレンズ３０２の曲率方向（母線方向と垂直な方向）を示しており、矢印Ａ，Ｂがなす角度をθとする。なお、図１８においては、説明を分かり易くするため、シリンドリカルレンズ３０１，３０２の形状を円形で簡略化して示している。図１９（ａ）は矢印Ａ，Ｂのなす角度θが０度の場合におけるシリンドリカルレンズ３０１，３０２の状態を示す平面図であり、図１９（ｂ）は矢印Ａ，Ｂのなす角度θが９０度の場合におけるシリンドリカルレンズ３０１，３０２の状態を示す平面図である。

シリンドリカルレンズ３０１，３０２は、２本の矢印Ａ，Ｂの中線Ｃ（合成母線）を常に鉛直方向に保ちつつ、θが変化するように互いが回転するようになっている。すなわち、シリンドリカルレンズ３０１，３０２は、各々が反対方向に同じ角度ずつ回転するようになっており、矢印Ａ及びＢと中線Ｃとのなす角度はそれぞれθ／２となっている。このようにシリンドリカルレンズユニット２５０は、矢印Ａ，Ｂの中線Ｃを常に鉛直方向に保つことでカメラ１４上に形成される試料８の像の楕円方向が回転してしまうのを防止している。

シリンドリカルレンズユニット２５０は、図１９（ａ）に示されるようにθが０度の時、鉛直方向と水平方向でのレンズの屈折力の差が最大となるため、非点隔差が最大となる。一方、図１９（ｂ）に示されるようにθが９０度の時、鉛直方向と水平方向でのレンズの屈折力の差が無くなるため、非点隔差は０となる。このようにシリンドリカルレンズユニット２５０は、θを０度から９０度の間で調整することで、非点隔差を連続的に変化させることが可能となっている。なお、顕微鏡装置３００は、予め実験等により求めた、対物レンズ１１２の焦点深度と、この焦点深度に対応した非点隔差を発生させるレンズ３０１，３０２の回転角度θとを関連付けたデータを記憶部２６内に記憶している。

顕微鏡装置３００において、観察者３８によって選択された対物レンズ１１２の種類に応じて、制御部２５によりシリンドリカルレンズユニット２５０の回転シリンダー部３１５を駆動し、一対のシリンドリカルレンズ３０１，３０２の所定角度だけ回転させる。これにより、顕微鏡装置３００において、観察者３８が希望する画像取得条件に応じて対物レンズ１１２の倍率、開口数を変更した場合でも、対物レンズ１１２の焦点深度に対応した最適な非点隔差を設定することができ、精度の高い三次元方式による試料８の画像観察を提供できる。

また、顕微鏡装置３００において、観察者３８が二次元方式による画像取得を希望した場合、制御部２５によりシリンドリカルレンズユニット２５０の回転シリンダー部３１５を駆動し、一対のシリンドリカルレンズ３０１，３０２の角度θを９０度とする。このとき、試料８からの光はシリンドリカルレンズ３０１，３０２を通過する際に非点収差が生じないため、像が変形することがなく、カメラ１４上において円形の像となる。これにより、顕微鏡装置３００において、カメラ１４が撮像した円形の像に基づき、二次元方式で試料８の画像を取得することができる。

また、本実施形態に係る顕微鏡装置３００においても、シリンドリカルレンズユニット２５０の設計値に基づいて予め算出された設計補正係数ａ，ｂが記憶部２６にそれぞれ記憶されている。具体的にシリンドリカルレンズユニット２５０は、一対のシリンドリカルレンズ３０１，３０２の角度θに応じて非点隔差が変化する。本実施形態に係る設計補正係数ａ，ｂは、例えばシリンドリカルレンズ３０１，３０２の回転角度θと非点隔差とを関連付けたデータに基づいて算出される。

顕微鏡装置３００は、上記実施形態と同様、観察条件設定ステップＳ１０１において観察者３８により選択された対物レンズ１１２の焦点深度に合わせた適切な焦点距離を有するようにシリンドリカルレンズ３０１，３０２の回転角度θを調整するようにシリンドリカルレンズユニット２５０を駆動させる。

顕微鏡装置３００は、上記実施形態と同様、蛍光画像Ｇ１，Ｇ２から取得した第１の座標リストＲ１及び第２の座標リストＲ２を解析することで、シリンドリカルレンズユニット２５０の非点隔差（シリンドリカルレンズ３０１，３０２の回転角度θ）毎に位置補正係数ａ´，ｂ´を算出し、記憶部２６にそれぞれ記憶する。なお、本実施形態において、シリンドリカルレンズユニット２５０において非点隔差を生じさせない場合は、シリンドリカルレンズ３０１，３０２の角度θを９０度とすればよい。また、シリンドリカルレンズユニット２５０の非点隔差毎の位置補正係数ａ´，ｂ´を算出する場合、シリンドリカルレンズ３０１，３０２の回転角度θに対応した設計補正係数ａ，ｂが使用される。

これにより、顕微鏡装置３００は、シリンドリカルレンズ３０１，３０２の回転角度θに応じて異なるＳＴＯＲＭ画像の歪みをそれぞれ補正することができる。よって、対物レンズ１１２に対応させてシリンドリカルレンズ３０１，３０２の回転角度θを変化させた場合であっても、種々の倍率において歪みの無いＳＴＯＲＭ画像を精度良く取得することができる。

（第四実施形態）
次に、顕微鏡装置の第四実施形態について説明する。なお、本実施形態に係る構成は、上記第二、第三実施形態に係る構成とは、シリンドリカルレンズユニットの構成のみが異なる。そのため、以下の説明ではシリンドリカルレンズユニットの構成を主に説明し、第一実施形態と同じ構成及び部材については同一の符号を付し、その詳細な説明については省略若しくは簡略化するものとする。

図２０は本実施形態に係るシリンドリカルレンズユニットの構成を示す図である。本実施形態に係るシリンドリカルレンズユニットは、第一実施形態のシリンドリカルレンズユニットの一部構成と第三実施形態のシリンドリカルレンズユニットの一部構成とを組み合わせたものである。
具体的に、本実施形態に係るシリンドリカルレンズユニット３５０は、図２０に示すように、一対のシリンドリカルレンズ４０１，４０２を保持した回転シリンダー部４１５と、スライダ部（進退部）４０５と、を備えている。スライダ部４０５は、回転シリンダー部４１５をスライド可能に保持するスライド板４０５ａと、該スライド板４０５ａをスライドさせる駆動部４０５ｂとを含む。

スライド板４０５ａには、回転シリンダー部４１５の保持部４１５ａと、開口部３０６とが設けられている。これら保持部３１５ａおよび開口部３０６は、スライド板４０５ａのスライド方向（水平方向）に沿って配置されている。開口部３０６は、レンズ２２を通過した光を遮ることなく通過させる大きさに設定されている。回転シリンダー部４１５は、保持部４１５ａに嵌合されることでスライド板４０５ａに保持されている。

本実施形態においては、シリンドリカルレンズ４０１、４０２のいずれも凸型シリンドリカルレンズを用いた。そのため、凸型凹型のシリンドリカルレンズを組み合わせた第三実施形態のように非点隔差を０にすることができないものの、本実施形態では上記開口部３０６を組み合わせることで非点隔差が０の状態（二次元方式による画像観察）を可能としている。

本実施形態に係る顕微鏡装置において、三次元方式による画像取得を行う場合、制御部２５によってシリンドリカルレンズユニット３５０の駆動部４０５ｂを駆動し、スライド板４０５ａをスライドさせて結像光学系７内の光路に回転シリンダー部４１５を挿入する。このとき、制御部２５は観察者３８によって選択された対物レンズ１１２の種類に応じて、回転シリンダー部４１５を駆動し、一対のシリンドリカルレンズ４０１，４０２の所定角度だけ回転させる。これにより、顕微鏡装置において、観察者３８が希望する画像取得条件に応じて対物レンズの倍率、開口数を変更した場合でも、対物レンズの焦点深度に対応した最適な非点隔差を設定することができ、三次元方式による試料８の画像観察を精度良く行わせることができる。

また、本実施形態に係る顕微鏡装置において、観察者３８が二次元方式による画像取得を希望した場合、制御部２５によりシリンドリカルレンズユニット３５０の駆動部４０５ｂを駆動し、スライド板４０５ａをスライドさせて結像光学系７からの光の光路に開口部３０６を挿入する。このとき、試料８からの光は開口部３０６を通過するため、シリンドリカルレンズを通過する場合のように楕円状に像が変形することがなく、カメラ１４上において円形の像となる。これにより、顕微鏡装置は、カメラ１４が撮像した円形の像に基づき、二次元方式にて試料８の画像を取得することができる。

また、本実施形態においても、シリンドリカルレンズユニット３５０の設計値に基づいて予め算出された設計補正係数ａ，ｂが記憶部２６にそれぞれ記憶されている。具体的にシリンドリカルレンズユニット３５０は、一対のシリンドリカルレンズ４０１，４０２の角度θに応じて非点隔差が変化する。そのため、設計補正係数ａ，ｂは、例えばシリンドリカルレンズ４０１，４０２の回転角度θと非点隔差とを関連付けたデータに基づいて算出される。

本実施形態に係る顕微鏡装置は、上記第三実施形態と同様、観察条件設定ステップＳ１０１において観察者３８により選択された対物レンズ１１２の焦点深度に合わせた適切な焦点距離を有するようにシリンドリカルレンズ４０１，４０２の回転角度θを調整するようにシリンドリカルレンズユニット３５０を駆動させる。

本実施形態に係る顕微鏡装置は、上記第三実施形態と同様、蛍光画像Ｇ１，Ｇ２から取得した第１の座標リストＲ１及び第２の座標リストＲ２を解析することで、シリンドリカルレンズユニット３５０の非点隔差（シリンドリカルレンズ４０１，４０２の回転角度θ）毎に位置補正係数ａ´，ｂ´を算出し、記憶部２６にそれぞれ記憶する。なお、本実施形態において、シリンドリカルレンズユニット３５０において非点隔差を生じさせない場合は、スライド板４０５ａをスライドさせて結像光学系７からの光の光路に開口部３０６を挿入すればよい。また、シリンドリカルレンズユニット３５０の非点隔差毎の位置補正係数ａ´，ｂ´を算出する場合、シリンドリカルレンズ４０１，４０２の回転角度θに対応した設計補正係数ａ，ｂが使用される。

これにより、本実施形態に係る顕微鏡装置は、シリンドリカルレンズ４０１，４０２の回転角度θに応じて異なるＳＴＯＲＭ画像の歪みをそれぞれ補正することができる。よって、対物レンズ１１２に対応させてシリンドリカルレンズ４０１，４０２の回転角度θを変化させた場合であっても、種々の倍率において歪みの無いＳＴＯＲＭ画像を精度良く取得することができる。

なお、第二実施形態に係るターレット部を用いて、回転シリンダーと開口部とを切り替える構成を採用するようにしてもよい。また、上記第四実施形態では、一対のシリンドリカルレンズ４０１、４０２として、凸型シリンドリカルレンズと凸型シリンドリカルレンズとの組み合わせを用いたが、凹型シリンドリカルレンズと凹型シリンドリカルレンズとの組み合わせを用いるようにしてもよい。

以上の実施例では、活性化用と励起用に波長の異なる２つのレーザを用いる顕微鏡装置について説明してきた。一方、励起用のレーザのみを用いた顕微鏡として、ｄＳＴＯＲＭ（direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy）が知られている。ｄＳＴＯＲＭにおいては、従来のＳＴＯＲＭのように活性化用のレーザを照射することなく、蛍光物質の自発的な明滅を元に、少数の蛍光色素のみの画像を取得する。本発明の非点隔差変更装置は、ｄＳＴＯＲＭにも適用可能である。

また、本発明は、米国発行特許発明第７６２６６９５号明細書等に開示されたＰＬＡＭ（"Photo Activated Localization Microscopy（光活性化ローカライゼーション顕微鏡法）"）や、米国発行特許発明第８１７４６９２号明細書等に開示された ＧＳＤＩＭ（"Ground State Depletion and Individual Molecular return（基底状態抑制及び個別分子復帰）"）にも適用可能である。
なお、上述の各実施形態の要件は、適宜組み合わせることができる。また、一部の構成要素を用いない場合もある。また、法令で許容される限りにおいて、上述の各実施形態及び変形例で引用した装置などに関する全ての公開公報及び米国特許の開示を援用して本文の記載の一部とする。

７…結像光学系（結像系）、１０…照明系（照明光学系）、１２，１１２…対物レンズ、１４…カメラ（撮像装置）、２５…制御部、２５ｃ…画像生成部、２５ｄ…画像補正部、１００，２００，３００…顕微鏡装置、１０１，１０２、２０１〜２０５…シリンドリカルレンズ、Ｒ１…第１の座標リスト、Ｒ２…第２の座標リスト、Ｐ１〜Ｐ８…蛍光輝点ペア、Ｓ…閾値、ａ，ｂ…設計補正係数、ａ´，ｂ´…位置補正係数

Claims (16)

1. 活性化光及び励起光の照射、又は励起光の照射により蛍光を発する蛍光物質を含む試料に、前記活性化光及び前記励起光、又は前記励起光を照射する照明光学系と、
   対物レンズと、シリンドリカルレンズと、結像レンズとを含み、前記試料の像を形成する結像光学系と、
   前記結像光学系において形成された前記試料の像を撮像する撮像装置と、
   制御部とを有し、
   前記制御部は、前記撮像装置により撮像された前記試料の像に含まれる非点収差に関する情報に基づいて、前記試料の像に含まれる蛍光輝点の位置情報を算出し、
   前記算出した位置情報を、予め算出した位置補正係数を用いて補正し、
   前記補正した位置情報に基づいて、前記蛍光物質の三次元における位置情報を示す画像を生成し、
   前記結像レンズの焦点距離をｆｔとし、前記シリンドリカルレンズの焦点距離をｆｃとし、前記結像レンズから前記シリンドリカルレンズまでの距離をｄとしたとき、
   前記シリンドリカルレンズの曲率を有する方向に対応する前記位置補正係数ａが以下の式１で規定される
   顕微鏡装置。
   

   
2. 活性化光及び励起光の照射、又は励起光の照射により蛍光を発する蛍光物質を含む試料に、前記活性化光及び前記励起光、又は前記励起光を照射する照明光学系と、
   対物レンズを介して前記試料の像を形成する結像光学系と、
   前記結像光学系において形成された前記試料の像を撮像する撮像装置と、
   制御部とを有し、
   前記制御部は、前記撮像装置により撮像された前記試料の像に含まれる蛍光輝点の位置情報を算出し、
   前記算出した位置情報を、予め算出した位置補正係数を用いて補正し、
   前記補正した位置情報に基づいて、前記蛍光物質の三次元における位置情報を示す画像を生成し、
   前記結像光学系は、非点収差が付与された前記試料の像と、前記非点収差が付与されていない前記試料の像とを形成し、
   前記制御部は、前記位置補正係数を、前記非点収差が付与された前記試料の像における蛍光輝点の位置情報と前記非点収差が付与されていない前記試料の像における蛍光輝点の位置情報とを用いて算出する顕微鏡装置。
3. 前記非点収差が付与されていない前記試料の像における蛍光輝点の位置情報は、座標データで表された第１の座標リストであり、
   前記非点収差が付与された前記試料の像における蛍光輝点の位置情報は、座標データで表された第２の座標リストであり、
   前記制御部は、
   前記第１の座標リストにおける蛍光輝点と前記第２の座標リストにおける蛍光輝点との距離が所定の閾値以下となる関係を有する蛍光輝点同士を蛍光輝点ペアとして前記第１の座標リスト及び前記第２の座標リストそれぞれから選択する動作と、
   前記第１の座標リスト及び前記第２の座標リストから選択した前記蛍光輝点ペアに関する情報を用いて前記位置補正係数を算出する動作と、を実行する
   請求項２記載の顕微鏡装置。
4. 前記制御部は、前記蛍光輝点ペアを複数選択する
   請求項３記載の顕微鏡装置。
5. 前記制御部は、前記複数の蛍光輝点ペアの中から、前記第１の座標リストにおいて距離が最も離間した関係となる２つの蛍光輝点と、前記第２の座標リストにおいて距離が最も離間した関係となる２つの蛍光輝点とを含む２組の蛍光輝点ペアを選択し、該選択した２組の蛍光輝点ペアの座標データを用いて前記位置補正係数を算出する
   請求項４記載の顕微鏡装置。
6. 前記制御部は、前記第１の座標リスト及び前記第２の座標リストから選択した前記複数の蛍光輝点ペアの座標データに関する演算値の平均値に基づいて前記位置補正係数を算出する
   請求項４記載の顕微鏡装置。
7. 前記制御部における前記蛍光輝点ペアを選択する動作は、
   前記結像光学系の設計値に基づいて設定される設計補正値を用いて、前記第２の座標リストの前記蛍光輝点の座標データを補正した補正座標リストを算出する動作と、
   前記第１の座標リストにおける蛍光輝点と前記補正座標リストにおける蛍光輝点との距離が所定の閾値以下となる関係を有する蛍光輝点同士を前記蛍光輝点ペアとして前記第１の座標リスト及び前記補正座標リストそれぞれから選択する動作と含む
   請求項３に記載の顕微鏡装置。
8. 前記撮像装置は、前記非点収差を付与した前記試料の像を複数回撮像し、前記非点収差を付与しない前記試料の像を少なくとも１回撮像する
   請求項２〜７のいずれか一項に記載の顕微鏡装置。
9. 前記撮像装置は、前記非点収差を付与しない前記試料の像を撮像する動作を、前記非点収差を付与した前記試料の像を撮像する動作よりも先のタイミング又は後のタイミングで行う
   請求項２〜８のいずれか一項に記載の顕微鏡装置。
10. 活性化光及び励起光の照射、又は励起光の照射により蛍光を発する蛍光物質を含む試料に、前記活性化光及び前記励起光、又は前記励起光を照射して撮像された前記試料の像を用いて画像を形成する画像形成方法であって、
    前記試料の像における蛍光輝点の位置情報を、前記試料の像に含まれる非点収差に関する情報に基づいて算出し、前記算出した位置情報を、予め算出した位置補正係数を用いて補正するステップと、
    補正した位置情報に基づいて、前記蛍光物質の三次元における位置情報を示す画像を生成するステップと、を備え、
    前記試料の像を形成する結像光学系は、前記試料の像を形成する結像レンズと、シリンドリカルレンズと、を含み、
    前記結像レンズの焦点距離をｆｔとし、前記シリンドリカルレンズの焦点距離をｆｃとし、前記結像レンズから前記シリンドリカルレンズまでの距離をｄとしたとき、
    前記試料の像において前記非点収差が付与される方向に対応する前記位置補正係数ａが以下の式１で規定される画像形成方法。
    

    
11. 活性化光及び励起光の照射、又は励起光の照射により蛍光を発する蛍光物質を含む試料に、前記活性化光及び前記励起光、又は前記励起光を照射して撮像された前記試料の像を用いて画像を形成する画像形成方法であって、
    前記試料の像に含まれる蛍光輝点の位置情報を算出し、前記算出した位置情報を、予め算出した位置補正係数を用いて補正するステップと、
    補正した位置情報に基づいて、前記蛍光物質の三次元における位置情報を示す画像を生成するステップと、を備え、
    前記補正するステップは、非点収差が付与された前記試料の像における蛍光輝点の位置情報と、前記非点収差が付与されていない前記試料の像における蛍光輝点の位置情報とを用いて前記位置補正係数を算出する
    画像形成方法。
12. 前記非点収差が付与されていない前記試料の像における蛍光輝点の位置情報は、座標データで表された第１の座標リストであり、
    前記非点収差が付与された前記試料の像における蛍光輝点の位置情報は、座標データで表された第２の座標リストであり、
    前記補正するステップは、
    前記第１の座標リストにおける蛍光輝点と前記第２の座標リストにおける蛍光輝点との距離が所定の閾値以下となる関係を有する蛍光輝点同士を蛍光輝点ペアとして前記第１の座標リスト及び前記第２の座標リストそれぞれから選択するステップと、
    前記第１の座標リスト及び前記第２の座標リストから選択した前記蛍光輝点ペアに関する情報を用いて前記位置補正係数を算出するステップと、を実行する
    請求項１１記載の画像形成方法。
13. 前記補正するステップは、前記蛍光輝点ペアを複数選択するステップを含む
    請求項１２記載の画像形成方法。
14. 前記補正するステップは、前記複数の蛍光輝点ペアの中から、前記第１の座標リストにおいて距離が最も離間した関係となる２つの蛍光輝点と、前記第２の座標リストにおいて距離が最も離間した関係となる２つの蛍光輝点とを含む２組の蛍光輝点ペアを選択し、該選択した２組の蛍光輝点ペアの座標データを用いて前記位置補正係数を算出する
    請求項１３記載の画像形成方法。
15. 前記補正するステップは、前記第１の座標リスト及び前記第２の座標リストから選択した前記複数の蛍光輝点ペアの座標データに関する演算値の平均値に基づいて前記位置補正係数を算出する
    請求項１３記載の画像形成方法。
16. 前記蛍光輝点ペアを選択するステップは、
    前記試料の像を形成する結像光学系の設計値に基づいて設定される設計補正値を用いて、前記第２の座標リストの前記蛍光輝点の座標データを補正した補正座標リストを算出するステップと、
    前記第１の座標リストにおける蛍光輝点と前記補正座標リストにおける蛍光輝点との距離が所定の閾値以下となる関係を有する蛍光輝点同士を前記蛍光輝点ペアとして前記第１の座標リスト及び前記補正座標リストそれぞれから選択するステップと含む
    請求項１２記載の画像形成方法。

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