JP6453220B2 - Ｓｐｉｍ顕微鏡法のための顕微鏡および方法 - Google Patents

Description

本発明は顕微鏡に関し、この顕微鏡は、検出器上に試料を結像するための結像対物レンズと、結像対物レンズの焦点平面およびこの焦点平面の近傍に形成された平面内で、試料を光シートで照明するための手段とを含む。この照明するための手段は、好ましくは干渉性（コヒーレント）光を放射する照明源を含む。

照明ビーム光路および検出ビーム光路が基本的に相互に垂直に配置され、試料が光シートによって結像対物レンズの焦点平面内で、すなわち結像対物レンズの光学軸に対して垂直に照明される顕微鏡が、選択的平面照明顕微鏡法（ＳＰＩＭ）による試料の検査のために設計されている。３次元の試料が、個々の、異なる深さの位置内で、点から点へと走査され、ここから得られた画像情報が、続いて試料の３次元の結像に組み合わされる共焦点レーザ走査型顕微鏡法（ＬＳＭ）とは異なり、ＳＰＩＭ技術は、広視野顕微鏡法に基づき、また試料の個々の平面を通る光学的切片に基づいて試料を画像として表示することが可能である。

ＳＰＩＭ技術の利点は、特に、より速い速度で画像情報を捕捉すること、生物性試料の退色の危険をより低くすること、および試料内への焦点のより大きな侵入深さにある。
基本的にＳＰＩＭ技術では、試料に含まれているか、またはその中に持ち込まれた蛍光色素分子は、いわゆる光シートに成形されたレーザ光で励起される。試料の深さ内で、それぞれ１つの選択された位置がこの光シートを用いて照明され、この試料平面の画像が結像光学系によって１つの光学的切片の形で得られる。このような静的な光シートでの励起と基本的に同等であるのは、細い、回転対称なレーザビームの、結像対物レンズの焦点平面内での迅速な往復運動である。実質的に、すなわち観察期間を介した時間的手段で、こうして同じく１つのＳＰＩＭ光シートの形状が結果として生じる。

このＳＰＩＭ技術は、例えば（非特許文献１）、（非特許文献２）、（特許文献１）および（特許文献２）の中で説明されている。
最初に、図１にＳＰＩＭ顕微鏡の基本的な構成が示されている。照明源１の光は照明光学系２を介して１つの光シートに成形され、試料３に方向付けされる。試料と光シートは結像対物レンズ４の焦点平面内にある。結像対物レンズ４の光学軸は、試料３が照明される方向に対して垂直に位置している。通常、この照明光学系２は、照明源１の干渉性（コヒーレント）光を平行化し、１つの光シートを成形する複数の光学系構成要素を含む。従来技術では、通常、この照明光学系２は１つの円筒レンズ（シリンドリカルレンズ）を含み、その平面状の面が試料の方向に、またその湾曲突出した面が照明源の方向を向いている。

概略的に試料ホルダＰＨが示されていて、これを使って試料は、例えば制御ユニットＡを介して制御されて、対物レンズ４の光学軸方向にモータで移動させられる。
説明されている「光シート顕微鏡法」（Ｌｉｇｈｔ ｓｈｅｅｔ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）は、検出対物レンズの方位の焦点平面（ｘｙ−平面）の全てが薄い光シートで照明されることによって、光学的切片を、空間分解能を持つカメラ（ＣＣＤカメラ）を介した広視野検出と組み合わせる（図１）。この光シート照明は検出軸（ｚ軸）に対して直角に行われる。

試料は、照明と検出が重なり合う領域内に置かれる。照明用光シートによって励起される蛍光信号は、検出用対物レンズの全視野を介してカメラに結像される。薄い光シートを用いた直角な照明によって、検出用光学系の軸方向の範囲の小さな部分のみが照明され、こうして光学的切片が形成される。試料内の別の領域を観察するために、試料は、光学系からは独立して、試料位置付けユニットによって光シート内を移動される。光学的切片を、検出軸に沿って異なる試料位置で撮影することで、３次元的な画像セットの撮影が可能になる。この画像セットは続いて１つの３Ｄ画像に再現することができる。

このためには、異なる角度からの複数の３次元の画像セットの撮影が必要である。１つの画像セットは、例えば２００の画像を含む。少なくとも４つの、異なる照射角度が３次元の画像のためには必要になる。

良好な画質と、正確な「セクショニング」のためには、照明位置と検出位置との完全な重複が特に問題である。試料と屈折率の入れ替わりによって、これは毎日の作業において繰り返し現れる課題である。

光シートの試料と対物レンズに対する周知の相対的移動は、試料内の照明されているｚ平面の調整中に、評価に使われる試料平面が変化することに繋がる。このような調整方法が実際の試料に適用される場合、このｚ移動は、各々の調整画像内で情報が大きく異なることへと繋がり、このために調整画像の評価がもはや可能ではなくなる。この問題は基準試料を用いた調整方法においても僅かな規模で関与する。しかしながら、これら試料は、より均質であり、そのため、ほとんど目立たない。

手動による、使用者が制御する調整は、時間がかかり、また豊富な経験を必要とする。この場合、使用者は、より簡単に評価するために、主に豊富な構造のある、しかしながら、その情報内容は有意に試料のｚ平面に影響される画像領域に注意力を集中する。調整方法中にｚ平面が変化する場合は、このことが、しばしば誤った評価を導く。

従来技術は、さらに特許出願公開（特許文献３）および（特許文献４）に示されている。周知の調整方法は、一方では蛍光性の基準物体（例えばビーズ／基準マーカまたは均質な蛍光性物体）が試料の代わりに、または試料内に置かれることを前提としている。これらの基準物体は面状の光シートで照明され、コントラストまたは点拡がり関数（ＰＳＦ）（例えばビーズの場合）を参照に最適な調整点が探求される。他方、幾つかの方法では、蛍光性の基準物体は基準構造を持つ照明光によって励起されるようになっている。これは、例えば物体平面に共役な平面内の格子によって、または走査された光シートを変調することで実施される。

基準試料を使った調整方法は、基準試料が全ての光学的特性（屈折率、表面弯曲、侵入深さ、．．．）において、実際の使用者試料と完全に同一であることを前提としている。このことは予期される試料の既存の多彩性から実現不可能である。その限りにおいて、この調整方法は、最適な調整から逸脱することとなる。例えば、異なる細胞構造のような、均質ではない試料構造による光学的効果は全く考慮され得ない。類似の効果は、例えば１つの画像セットの撮影中に試料媒体内への侵入深さが著しく変化する場合にも現れる。

従来技術に沿った一般的な光シート調整は、例えば（非特許文献３）に記述されている（第ＩＩ項Ｂ。）。この場合は、ジンバル式マウントと望遠鏡が、角度運動の助けで、検出用光学系のｚ方向に沿って、光シートだけを移動させるために使用される。照明光学系の検出用光学系に対して相対的なこの方向付けは（非特許文献４）または（非特許文献５）の、より古い従来技術にも相応する。（非特許文献６）には、蛍光性の溶液を照明する、「停留している」レーザビームの助けを借りた、走査を行う光シートのための３次元の光シート調整が説明されている。この場合、特にレーザビームのウエストが利用される。同じく散乱光の利用も説明されている。ここには蛍光性の溶液中または基準試料内で、光シートに対して相対的な検出用光学系の移動を介して、どのように光シート調整が成されるかも説明されている。（非特許文献７）には、可動性の検出用光学系を持つ構成が説明されているが、ここでは、その構成は光シート調整の意味では説明されていない。

独国特許出願公開第１０２５７４２３号明細書 国際公開第２００４／０５３０５５８号 独国特許出願公開第１０２００７０１７５９８号明細書 独国特許出願公開第１０２００７０４５８９７号明細書

シュテルツァー（Ｓｔｅｌｚｅｒ）他，Ｏｐｔｉｃｓ Ｌｅｔｔｅｒｓ ３１，１４７７（２００６） シュテルツァー（Ｓｔｅｌｚｅｒ）他，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０５，１００７（２００４） グレッジャー他（Ｇｒｅｇｅｒ ｅｔ ａｌ．），Ｒｅｖ．Ｓｃｉ．Ｉｎｓｔｒ．７８，０２３７０５，２００７） ヴォア（Ｖｏｉｅ）他（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ １７０，２２９，１９９２；段落"Ｉｌｌｕｍｉｎａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ"） サンティ（Ｓａｎｔｉ）他（Ｂｉｏ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ４６，２８７，２００９，Ｓｕｐｐｌ．Ｍａｔ．） クルチッチ（Ｋｒｚｉｃ）他（Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ ９，７３０，２０１２，Ｓｕｐｐｌ．） ケラー（Ｋｅｌｌｅｒ）他（Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２２，１０６５，２００８，Ｓｕｐｐ）

本発明による解決法および実施形態の説明
本発明は特に、この開示に含まれている、独立項および従属項の特徴によって特徴付けられる。

良好な、自動化された調整のための有利な前提条件は、正しい評価項目の選択と、基準構造に代わる、本物の試料への適用の可能性である。
従来技術からは、検査する試料が直接光シート調整に使用され、この際に試料が光シートと共に対物レンズまたは検出平面に対して相対的に移動されるという方法は、知られていない。

本発明は特に、事前に与えられた検出ユニットの焦点平面に対して相対的な、好ましくは制御ユニットを介して連係されている光シートおよび試料の移動にある。
もちろん逆に、本発明の効果を得るために、検出対物レンズのみが移動され、または全ての構成要素が共通の１つの制御ユニットを介して連係されて相互に移動することもできる。光シートの変位に対して、試料が、その後または同時に追従移動されると、観察された試料平面、および基本的画像内容は同一のままとなる。画像内の差は、調節位置によってのみ引き起こされる。正しく連係された動きを行い得るために、両者の個々の動きは、有利には事前のキャリブレーションによって充分に正確に相互に調節することができる。

加えて、以下に説明する方法のために、調整に使用される試料構造を事前に別の対照方法によって確認し、この試料をその後、検出に対して相対的に方向付けることは可能でありまた有利である。

図２には本発明の方法を実施するためのＳＰＩＭ顕微鏡の基本的構造が示されている。
試料Ｐは試料チャンバＰＫ内に存在することが可能であり、この場合、試料または試料チャンバは、Ｚ軸方向に調節可能に配置されており、また検出対物レンズの光学軸を中心に回転可能に配置され、その検出軸または光学軸がＺ方向に存在する垂直に調節可能な検出対物レンズＯからなる検出ビーム光路によって捉えられる。この検出ビーム光路には、交換可能な光フィルタＦ、チューブレンズＴＬおよび平面受像器ＣＣＤが検出方向に接続されていることが好ましい。

検出軸Ｚに対して基本的に垂直に、ここではＸ方向にビームスプリッタＢＳを介して連結されている２つのレーザＬ１、Ｌ２からなる照明ビーム光路が位置し、レーザビームは波長選択および強度設定のためのＡＯＴＦ、偏向ミラーＳ、ビームエキスパンダＢＥ、円筒レンズＺＬのようなビーム成形のための１つのアナモルフィック光学系を介して平面状の光線分布が形成され、試料に侵入する。

概略的に調整ユニットＢＬｊｕｓｔが示されており、このユニットは例えば構成要素Ｓ、ＢＥおよびＺＬを複数の方向に調整または傾動させることができる。好ましくは、垂直矢印によって示されている照明のＺ調整、およびＺ軸を中心とした照明ユニットの回転、ならびに、ここでは例えばＹ軸を中心とした、傾動が実施され、この場合、連係されたＺ調整を介した傾動および対照軸を中心とした回転の回転中心は、試料内、例えば検出対物レンズ光学軸ＯＡ内にも位置し得る。

通常１つのコンピュータと１つの表示ユニット（ディスプレイ）で形成されている、共通の管理および制御ユニットＣＵは、本発明の方法が実施できるように、ＡＯＴＦ、試料チャンバ調整ＰＫおよび照明調整ＢＬＪｕｓｔのような、全ての調整装置と接続されている。

図３〜図６は図２からの部分図である。
Ｏ：検出対物レンズ
Ｐ：試料として、例示的な試料位置に対してマーカが付けられた細胞核を持つ組織
Ｋ：細胞核を持つ試料のカメラ画像
ＬＢ：光シート照明の領域（例えばガウシアンビーム）
ＯＡ：照明の光学軸（点線）
ＦＥ 検出用光学系の焦点平面
図３ａ、図３ｂは、３ａ）では焦点が外れている光シートの出発時点の状態、また３ｂ）では光シートを移動させて調整された状態を示している。図３ａおよび図３ｂでは異なった標本領域Ｐ１，Ｐ２が対物レンズＯによって結像されていることが明らかである。

本発明によって、完全な試料切片を実現するために、全ての通過する試料平面に対して図３ｂにおける状態が等しく確保されることが保証される。
このためには以下の有利な方法が提案される。
方法１
試料または試料ホルダを、対物レンズの検出軸（Ｚ軸）の方向へ移動することにより、使用者が試料のピント合わせをする場合、実際に存在する試料の屈折率の差異または屈折率の変化により、光シートが検出対物レンズの焦点平面内に正確に位置していないということが生じることがあり得る。

そのため本来の試料測定の前にキャリブレーション工程によってキャリブレーション表が作成され、これは実際に使用される試料のためにＺ軸調整を実施し、この場合、試料の垂直位置に応じて（およびこれに伴って試料の屈折率に応じて）光シートの実際の位置が捕捉される。

この目的で、異なるピントが合わされた、すなわち焦点が合わされた実際の試料の試料領域に対して、その時その時の光シートの高さ位置が、その調節手段に対する位置と共に捕捉され、記憶される。

光シート位置の捕捉は例えば以下のように行われる。
試料のＺ調整が行われ、その時その時のＺ位置が１つの記憶値Ｚ１−Ｚｉ（ｉ＝１−ｎ）を形成する。

Ｚ１−Ｚｉに対して、それぞれ光シートが少なくとも垂直に調整され、好ましくは、それ以前、またはその後に傾動される（例えば図２内の制御ユニットＣｕにより）。
調整および傾動のうちの少なくとも一方は、その時の値Ｚｉの周辺で行うことが好ましい。

図２におけるＣＣＤによるピント測定またはコントラスト分析から（観察者による視覚的なものも考えられる）、評価ユニットＣＵによって、最も良いピントまたは最適なコントラストの値が、その値に調整された図２の調整ユニットＢＬＪｕｓｔの値と共に、それぞれの値Ｚｉに割り当てられて（キャリブレーション表内に）記憶され、これによって調整された光シート位置が付加的な測定のために直接使用される。

Ｚｉ値に対する光シートの位置を使用して、使用者が試料内の１つの特定のＺ平面を観察して検出される場合、適切な補正が行われ、実際の光シートの位置が正確にピントが合わされた試料平面に調整され、実際の光シートが上述した屈折率の変動にもかかわらず常に実際に観察されるか、または検出される焦点平面内に位置するようになる。
方法２
新しいＺ位置に試料が調整されている間に、同時にまたはその直後に光シートが試料に対して相対的に少なくともＺ方向に移動され（例えば最適なコントラストの測定の下で）、好ましくは、回転軸を中心に、例えば検出対物レンズの焦点平面の中央で傾動される。

例えば、試料内の湾曲した表面または境界面が、その屈折率分布により、光シートが１つの水平位置から傾動された位置へ屈曲することになる。
この方法によって再度補正される点で有利である。

これは視覚的に、または自動的に行うことができる（コントラス調整機能を伴うオートフォーカス方法に相応）。
Ｚ方向への試料の移動と、光シートの調整との連携、および試料のコントラストの評価は、好ましくは、制御および計算ユニットＸＸ内で行われる。

有利には、方法１および２を連携し形で適用され得る。
図４〜図６には、例えば前述の画像セットの撮影の際に生じ得る、試料の光学的特性によって引き起こされる効果が示されている。図４〜図６には、検出対物レンズＯに対して相対的に、３つの試料Ｐの位置が示されている。液浸媒体の入った試料チャンバのような場合によってはあり得る付加的な装置は、この図では排除されている。試料は、例えば例として、細胞核が蛍光マーカによって可視化されている、細胞組織の切片であり得る。

図４ａ）および図４ｂ）の位置では、光シート照明領域は、完全に検出対物レンズの焦点平面と重複しており、その結果、検出用光学系Ｏの焦点平面内にある細胞核ＺＫはほぼ同じコントラストでカメラ画像Ｋ内に記録される。

図５ａ）および図５ｂ）の位置では、今度は異なる試料位置によって変更された光路長のために２つの対応が行われる。１つは、検出の焦点平面ＦＥの照明ＬＢの基準光学軸からｚ方向へのシフトである。焦点平面内にある細胞核は、今度は光シート照明との重複が減少したことから、もはや完全なコントラストでは表現され得ない。さらに照明においてもｘ方向に沿った焦点のシフトを行って、その結果、照明光線の不均質な強度分布に対応して画像均質性をもたせる。

図６ａ）および図６ｂ）の位置では、照明ビームが試料の表面上で屈折率段差によって相応に屈折されることから、検出における拡大された焦点のシフトに加えて光シートの傾動が付加的に行われる。

前述の効果は例として示されている。もちろん通常の場合の状況は、試料が往々にして複雑で不均質な誘電率を示し、例えば、数々の光学的境界面の発生として試料体積内で表現され得るため、さらに複雑である。

従来技術では、この種の誤差を、上述の方法のように直接補償する方法は知られていない。
本発明のさらなる有利な効果と特徴
［Ａ］
光シートと試料の、相互に相対的な連係された移動により、手動による調整方法が非常に簡単になる。この方法では、使用者は通常視覚的に画質を評価する。ここでは使用者は固定維持された試料平面内の画像情報に集中できることから、調整方法は、より直感的にまたより目的に添って行われる。従って、上述の問題はもはや生じない。
［Ｂ］
第２の特徴では、連係された移動を用いることにより、自動的な光シート調整が実際の試料内で可能なことにある。均質な蛍光性試料の実施においてであれ、または例えばビーズのような特定の基準物体によってであれ、基準試料の補助手段をもはや必要とはしない。連係されている調整移動によって、常に同じ試料平面が評価に取り入れられることから、一般的に存在する画像情報は重要ではない。この連係されている移動は、面状または構造化された光シートの適用下であっても、コントラスト、変調の深さ、またはＰＳＦの評価の場合であっても、全ての自動調整方法にとって有利である。
［Ｃ］
この光シート顕微鏡法の方法は、試料と検出の焦点平面との相対的移動によって１つの画像セット（ｚセット）が撮影されるということに基づいている。試料の不均質性のため、またはさらに試料媒体内への侵入深さのため、最適な光シートの調整位置はｚ平面に依存する。本発明の有利な１つの特徴は、連係された移動と、全ての試料、特に実際の試料に対してこの調整方法を利用することとにより、位置に応じて別の最適な調整位置を必要とする、異なる試料位置の対象物固有の非均質性をキャリブレーションできることにある。この方法は、例えば以下のような形を取る。
１．ｚ位置（＝試料位置）の一部に対して、好ましい評価アルゴリズムを使って実際の試料内で、最適な調整位置を測定する。
２．これらの補助位置間のｚ平面に対する最適な調整位置は、適切な関数（多項式、スプライン曲線、．．．）を介して補間法によって求められる。
３．ｚセットが撮影されている間、各々のｚ位置に対して光シートの固有の最適な調整位置が調節される。これは、例えば試料と光シートとの、連係されている動きに対応する。特に、これは、角度調整も含むことができる（図６を参照）。
４．各々の画像平面それぞれに対して最適な調整位置であることから、最適な画質のｚセットが得られる。
５．光シートの追従移動により場合によっては出現し得る、試料の３Ｄ全体像内のゆがみは、付加的に計算により修正され得る。
［Ｄ］
さらに、この光シート顕微鏡法の方法では、検出方向および照明方向に対する試料の相対的な回転、およびそれに続く、異なる角度下（＝視野）での複数のｚセットの撮影に基づき、１つの３Ｄ画像の復元が可能となる。最適な画像結果のためには、それぞれの照明方向からの侵入深さおよび試料の光学的特性が異なるため、１つずつの照明方向について、光シートの最適な調整位置が設定されることもここでは重要である。これは、試料と光シートの移動が同時に、または連続して実施されることによってのみ可能である。
［Ｅ］
さらにより良い画像結果は、特徴［Ｂ］、特徴［Ｃ］および特徴［Ｄ］が組み合わされた場合に得ることができる。
［Ｆ］
試料の移動によってｚセットの撮影および多視点撮影のうちの少なくとも一方が行われて、画像フィールドに対して相対的に焦点位置が照明方向へ変更されることがあり得る。それに対応して光シートの位置がｘ方向へ追従することは有利であり得る。これは、もちろん前述のｚ方向への移動と連結することができる。

Claims (13)

1. １つの照明光源と、試料を光シートで照明するための照明ビーム光路とを含む照明装置と、
   該試料から放射される光を検出するための対物レンズを有する検出手段と、
   ここで、該対物レンズの焦点内または結像対物レンズの焦点の近傍において形成された平面の該光シートが、基本的に平面状であって、また該対物レンズが、該光シートの該平面とゼロではない角度で交差する光学軸を持ち、
   ここで、少なくとも検出対物レンズの該光学軸の方向に沿って該照明ビーム光路を調節するための調整手段とを備え、
   該光シートによる異なる試料平面の検出のために試料と検出の焦点平面との相対移動が対物レンズの光軸方向において行われる顕微鏡を用いたＳＰＩＭ顕微鏡法のための方法において、
   該光シートの実際の位置および向きが、該試料内の位置および向きに応じて異なる試料平面内で捕捉され記憶されるように、検査をする試料に対してキャリブレーションを行う第１のステップと、
   前記第１のステップで記憶された値に基づいて該試料の観察および検出のうちの少なくとも一方を行う際に、該光シートの記憶された位置および向きを用いて、該検出対物レンズの焦点平面に対する該光シートの位置および向きを補正する第２のステップとを含むことを特徴とする方法。
2. 前記第２のステップにおいて、前記光シートおよび前記検出対物レンズのうちの少なくとも１つの位置および向きが、試料の移動と同時に補正または調整されるか、もしくは試料の移動に続いて補正または調整される、請求項１に記載の方法。
3. 相対的移動の際に、前記試料のコントラストの検出および評価が行われる、請求項１または２に記載の方法。
4. 相対的移動が、最大画像コントラスト、または基準を参照した最適な画像コントラストになるまで実施される、請求項１から３のいずれか１項に記載の方法。
5. 最大コントラストまたは最適なコントラストに調節するために、前記光シートの相対的移動が、前記検出対物レンズの調整された垂直な焦点位置の周辺で実施される、請求項１から４のいずれか１項に記載の方法。
6. 前記試料に対して相対的な、前記光シートおよび前記検出対物レンズのうちの少なくとも一つの前記移動の連係が、前記対物レンズのための前記調整手段および前記照明のための調整手段のうちの少なくとも一方と接続されている１つの制御ユニットを介して行われる、請求項１から５のいずれか１項に記載の方法。
7. 前記照明ビーム光路の傾動が、少なくとも１つの軸を中心として実施される、請求項１から６のいずれか１項に記載の方法。
8. 前記照明ビーム光路の傾動が、前記対物レンズの前記光学軸に配置された傾斜軸を中心として実施される、請求項７に記載の方法。
9. 前記対物レンズは、該対物レンズの光学軸方向に調節可能である、請求項１から８のいずれか１項に記載の方法。
10. 前記対物レンズの光学軸は、該光シートの該平面と垂直に交差する、請求項１から９のいずれか１項に記載の方法。
11. 請求項１から１０のいずれか１項に記載の方法を実施するための手段を備える顕微鏡。
12. 請求項１から１０のいずれか１項に記載の方法を実施するための命令を含むコンピュータプログラム。
13. 請求項１から１０のいずれか１項に記載の方法を実施するための手段を備える制御装置。

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