JP2016212388A - 顕微鏡および顕微鏡画像取得方法 - Google Patents

Abstract

【課題】シート照明方式により、標本における照明光学系の光軸方向に異なる位置を観察する場合に鮮明な画像を取得する。【解決手段】空気と異なる屈折率を有する媒質に浸漬されて容器に収容されている標本Ｓから発せられる蛍光を検出して蛍光画像を取得する検出光学系１３と、励起光源から発せられる励起光を検出光学系１３の光軸Ｑに交差する平面に沿って平面状に集光させて、容器内の標本Ｓに入射させる照明装置５と、シリンドリカルレンズの光軸方向に標本Ｓを移動させる駆動部１２と、駆動部１２により移動させられる標本Ｓの移動量に基づき、照明装置５から検出光学系１３の光軸Ｑまでの励起光の光路に沿う空気換算長を一定に維持するように、照明装置５の焦点位置を調節する照明制御部３７とを備える顕微鏡１を提供する。【選択図】図１

Description

本発明は、顕微鏡および顕微鏡画像取得方法に関するものである。

従来、標本からの蛍光を検出する検出光学系の光軸に対して交差する入射平面に沿って、照明光学系により平面状に集光させた励起光を標本に入射させるシート照明方式の顕微鏡が知られている（例えば、特許文献１参照。）。落射照明方式あるいは透過照明方式においては、１点または複数点に集光させた励起光を２次元的に走査することにより２次元的な画像を取得するが、シート照明方式によれば、１度に広い範囲に照明でき、検出光学系の焦点面内で励起光の焦点があった範囲のみが照明されるため、画像の取得に要する時間を短縮することができる。

国際公開第２０１１／１２０６２９号

しかしながら、従来のシート照明方式の顕微鏡では、空気と異なる屈折率を有する媒質に浸漬されて容器に収容されている標本を容器ごと照明光学系の光軸方向に移動させると、照明光学系から検出光学系の光軸までの励起光の光路上に介在する空気、容器内の媒質および標本における照明光学系の光軸方向の厚さの比率が変化することにより、検出光学系の光軸に対して励起光の焦点位置にずれが生じてしまう。そのため、標本における照明光学系の光軸方向に異なる位置を観察しようとしても、鮮明な画像が得られなくなるという問題がある。

本発明は上述した事情に鑑みてなされたものであって、シート照明方式により、標本における照明光学系の光軸方向に異なる位置を観察する場合に鮮明な画像を取得することができる顕微鏡および顕微鏡画像取得方法を提供することを目的としている。

上記目的を達成するために、本発明は以下の手段を提供する。
本発明は、空気と異なる屈折率を有する媒質に浸漬されて容器に収容されている標本から発せられる蛍光を検出して蛍光画像を取得する検出光学系と、光源から発せられる励起光を前記検出光学系の光軸に交差する平面に沿って平面状に集光させて、前記容器内の前記標本に入射させるシート照明光学系と、該シート照明光学系の光軸方向に前記標本を移動させる駆動部と、該駆動部によって前記標本が移動させられることにより、前記シート照明光学系から前記検出光学系の光軸までの前記励起光の光路に沿う空気換算長に変化が生じる場合に、前記シート照明光学系の焦点位置を前記検出光学系の光軸位置からずれないように調節する焦点位置調節部とを備える顕微鏡を提供する。

本発明によれば、光源から発せられた励起光がシート照明光学系により検出光学系の光軸に交差する平面に沿って平面状に集光されて容器内の標本に入射されると、励起光の入射平面に沿って標本内の蛍光物質が励起されて蛍光が発生する。したがって、標本における励起光の入射平面に検出光学系の焦点面を一致させることにより、検出光学系の焦点面に沿う広い範囲において発生する蛍光を１度に検出することができる。また、駆動部の作動により、シート照明光学系の光軸方向に標本を移動させることで、標本における蛍光画像の取得位置をシート照明光学系の光軸方向に変えて標本を観察することができる。

この場合において、シート照明光学系の焦点位置は、シート照明光学系から検出光学系の光軸までの励起光の光路に沿う方向に介在する空気や容器内の媒質、標本等におけるシート照明光学系の光軸方向の厚さの比率に応じて変動し、シート照明光学系の焦点位置が検出光学系の光軸からずれると蛍光画像の解像度が低下してしまう。

これに対し、駆動部によって標本がシート照明光学系の光軸方向に移動させられることにより、シート照明光学系から検出光学系の光軸までの励起光の光路に沿う空気換算長に変化が生じる場合に、焦点位置調節部により、シート照明光学系の焦点位置が調節されて、検出光学系の光軸に対してシート照明光学系の焦点位置がずれることが防止される。したがって、シート照明方式により、標本におけるシート照明光学系の光軸方向に異なる位置を鮮明な蛍光画像を取得して観察することができる。空気換算長とは、空気と異なる屈折率を有する物質中における光路長を空気中における光路長に換算した長さをいう。

上記発明においては、前記駆動部が、前記シート照明光学系の光軸方向に前記容器ごと前記標本を移動させることとしてもよい。
また、上記発明においては、前記容器が、前記検出光学系が備えられる顕微鏡本体部に固定され、前記駆動部が、前記顕微鏡本体部に固定された前記容器内の前記標本を前記シート照明光学系の光軸方向に移動させることとしてもよい。

上記発明においては、前記焦点位置調節部が、前記駆動部により移動させられる前記標本の移動量に基づき、前記空気換算長を一定に維持するように前記シート照明光学系の焦点位置を調節することとしてもよい。

このように構成することで、標本を移動させて蛍光画像の取得位置をシート照明光学系の光軸方向に変更した場合であっても、検出光学系の光軸に対してシート照明光学系の焦点位置がずれるのを防ぐことができる。

上記発明においては、前記焦点位置調節部が、前記シート照明光学系を光軸方向に移動させることにより、前記シート照明光学系の焦点位置を調節することとしてもよい。
このように構成することで、検出光学系の光軸に対してシート照明光学系の焦点位置がずれる分だけ、予めシート照明光学系を光軸方向にずらすだけの簡易な方法で、シート照明光学系の焦点位置と検出光学系の光軸とを一致させた状態を維持することができる。

上記発明においては、前記駆動部が、前記励起光の入射平面に沿う２次元方向に前記標本を移動可能であることとしてもよい。
このように構成することで、励起光の入射平面に沿って、標本におけるより広範囲を鮮明な画像によって観察することができる。

上記発明においては、前記駆動部により移動させられる前記標本の座標ごとに、前記検出光学系により取得される前記標本の蛍光画像を配列して貼り合わせ画像を生成する画像処理部を備えることとしてもよい。
このように構成することで、駆動部による標本の移動に伴い、焦点位置調節部によりシート照明光学系の焦点位置と検出光学系の光軸とが一致した状態が維持された状態で検出光学系により取得された鮮明な蛍光画像が、画像処理部により標本の座標ごとに配列されて貼り合わせ画像が生成される。したがって、より大きい鮮明な画像によって標本を観察することができる。

本発明は、空気と異なる屈折率を有する媒質に浸漬されて容器に収容されている標本を検出光学系の光軸に交差するシート照明光学系の光軸に沿う方向に移動させる移動ステップと、光源から発せられた励起光を前記シート照明光学系により前記検出光学系の光軸に交差する平面に沿って平面状に集光させて前記標本に入射させる入射ステップと、前記移動ステップによって前記標本が移動させられることにより、前記シート照明光学系から前記検出光学系の光軸までの前記励起光の光路に沿う空気換算長に変化が生じる場合に、前記シート照明光学系の焦点位置を前記検出光学系の光軸位置からずれないように調節する焦点位置調節ステップと、前記入射ステップにより前記励起光が入射された前記標本において発生する蛍光を前記検出光学系より検出する検出ステップとを含む顕微鏡画像取得方法を提供する。

本発明によれば、移動ステップにより、シート照明光学系の光軸方向に標本を移動させることで、入射ステップにおいて、標本の移動方向の異なる位置に検出光学系の光軸に交差する平面に沿う平面状の励起光を集光させることができる。ここで、移動ステップによって標本がシート照明光学系の光軸に沿う方向に移動させられることにより、シート照明光学系から検出光学系の光軸までの励起光の光路に沿う空気換算長に変化が生じる場合に、焦点位置調節ステップにより、シート照明光学系の焦点位置が調節されて、検出光学系の光軸に対してシート照明光学系の焦点位置がずれることが防止される。

したがって、標本における励起光の入射平面に検出光学系の焦点面を一致させておけば、シート照明光学系の光軸方向における標本の位置に関わらず、検出ステップにおいて、検出光学系の焦点面に沿う広い範囲において発生する蛍光を１度に検出して鮮明な画像を取得することができる。したがって、シート照明方式により、標本におけるシート照明光学系の光軸方向に異なる位置を鮮明な蛍光画像を取得して観察することができる。

上記発明においては、前記移動ステップが、前記シート照明光学系の光軸方向に前記容器ごと前記標本を移動させることとしてもよい。
また、上記発明においては、前記容器が、前記検出光学系が備えられる顕微鏡本体部に固定され、前記移動ステップが、前記顕微鏡本体部に固定された前記容器内の前記標本を前記シート照明光学系の光軸方向に移動させることとしてもよい。

また、上記発明においては、前記焦点位置調節ステップが、前記移動ステップにより移動させられる前記標本の移動量に基づき、前記空気換算長を一定に維持するように、前記シート照明光学系の焦点位置を調節することとしてもよい。

このように構成することで、標本を移動させて蛍光画像の取得位置をシート照明光学系の光軸方向に変更した場合であっても、検出光学系の光軸に対してシート照明光学系の焦点位置がずれるのを防ぐことができる。

本発明によれば、シート照明方式により、標本における照明光学系の光軸方向に異なる位置を観察する場合に鮮明な画像を取得することができるという効果を奏する。

本発明の第１実施形態に係る顕微鏡を示す概略構成図である。 （ａ）は図１の照明装置および標本を検出光軸と照明光軸に垂直な方向から見た図であり、（ｂ）は図１の照明装置および標本を検出光軸に沿う方向から見た図である。 （ａ）は観察視野内に標本の観察領域Ａを配置した状態を検出光軸に沿う方向から見た図であり、（ｂ）は観察視野内に標本の観察領域Ｂを配置した状態を検出光軸に沿う方向から見た図である。 （ａ）は観察視野内に標本の観察領域Ａを配置した状態を検出光軸と照明光軸に垂直な方向からに見た図であり、（ｂ）は観察視野内に標本の観察領域Ｂを配置した状態を検出光軸と照明光軸に垂直な方向からに見た図である。 本発明の第１実施形態に係る顕微鏡画像取得方法を説明するフローチャートである。 （ａ）は本発明の第２実施形態に係る顕微鏡により、観察視野内に標本の観察領域Ａを配置した状態を検出光軸と照明光軸に垂直な方向から見た図であり、（ｂ）は観察視野内に標本の観察領域Ｂを配置した状態を検出光軸と照明光軸に垂直な方向から見た図である。 （ａ）は図６（ａ）を検出光軸に沿う方向から見た図であり、（ｂ）は図６（ｂ）を検出光軸に沿う方向から見た図である。

〔第１実施形態〕
本発明の第１実施形態に係る顕微鏡および顕微鏡画像取得方法について図面を参照して以下に説明する。
本実施形態に係る顕微鏡１は、図１に示されるように、顕微鏡本体３と、顕微鏡本体（顕微鏡本体部）３に接続される照明装置５と、顕微鏡本体３および照明装置５を制御する制御装置７とを備えている。制御装置７にはモニタ９が接続され、顕微鏡本体３により取得された画像をモニタ９に表示することができるようになっている。

顕微鏡本体３は、標本Ｓを載置するステージ１１と、ステージ１１を駆動する駆動部１２と、照明光軸（以下、光軸Ｐとする。）とは垂直な方向に延びる検出光軸（以下、光軸Ｑとする。）を有し、ステージ１１上の標本Ｓにおいて発生する蛍光を検出して標本Ｓの画像（蛍光画像）を取得する検出光学系１３とを備えている。

標本Ｓは、図２（ａ）に示すように、ステージ１１に搭載された容器１５に収容されている。容器１５には水（媒質）Ｗが充填されており、標本Ｓが水Ｗに浸漬されている。容器１５は、照明装置５から発せられる励起光を透過可能な材質で形成されており、検出光学系１３に対向する方向が開口している。
ステージ１１は、駆動部１２により、検出光軸方向およびそれと垂直な面内の２次元方向に移動することができるようになっている。

検出光学系１３は、図１に示されるように、ステージ１１上の標本Ｓに対して垂直な方向、すなわち、ステージ１１の載置面に対して垂直な方向において標本Ｓに対向して配置される対物レンズ１７と、対物レンズ１７により集光された標本Ｓからの蛍光を結像させる結像レンズ１９と、結像レンズ１９により結像された蛍光を撮影して画像信号を取得するＣＣＤのような撮像素子２１とを備えている。図中、符号２３は、蛍光に含まれる励起光を除去するバリアフィルタを備えるフィルタホイールである。

照明装置５は、図２（ａ），（ｂ）に示されるように、略平行光からなる励起光Ｌを射出する励起光源（光源）２５と、励起光源２５から発せられた励起光Ｌをその光束径寸法と同じ所定の幅寸法を有するライン状（平面状）に集光させるシリンドリカルレンズ（シート照明光学系）２７と、シリンドリカルレンズ２７を光軸Ｐに沿う方向に移動可能な移動機構２９とを備えている。

シリンドリカルレンズ２７は、光軸Ｐに直交する一方向にパワーを有している。このシリンドリカルレンズ２７は、検出光学系１３の光軸Ｑに直交する平面に沿ってシート状に励起光Ｌを集光させて、光軸Ｑと垂直な方向に広がる入射平面に沿うシート状の励起光Ｌを容器１５を介して標本Ｓに入射させることができるようになっている。

移動機構２９は、図２（ａ）に示す例では、シリンドリカルレンズ２７を支持するスライダ３１と、スライダ３１をシリンドリカルレンズ２７の光軸Ｐに沿う方向に移動可能に案内する直線ガイド３３と、直線ガイド３３に沿ってスライダ３１を直線的に移動させる図示しないモータとを備えている。

制御装置７は、ＰＣ（Ｐｅｒｓｏｎａｌ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ、図示略）と、ＰＣとステージ１１および照明装置５の移動機構２９などの各種電動部との間で信号の入出力を行う制御基板（図示略）とを備えている。ＰＣは、画像処理プログラム、顕微鏡制御プログラムおよび照明制御プログラムが記憶されたメモリ（図示略）と、メモリに記憶されているこれらのプログラムを読み込んで、各プログラムを実行する機能を有する演算処理装置（図示略）とを備えている。

すなわち、ＰＣの演算処理装置は、顕微鏡制御プログラムの実行により顕微鏡本体３を制御する顕微鏡制御部としての機能と、照明制御プログラムの実行により照明装置５を制御する照明制御部としての機能と、画像処理プログラムの実行により撮像素子２１によって取得された画像信号を処理する画像処理部としての機能とを有している。以下、ＰＣの演算処理装置を顕微鏡制御部３５、照明制御部（焦点位置調節部）３７および画像処理部３９として説明する。また、図１には、制御装置７の構成要素として、顕微鏡制御部３５、照明制御部（焦点位置調節部）３７および画像処理部３９を表示する。なお、制御装置７には、ユーザに指示を入力させるマウスやキーボード等の入力部４１が接続されている。

顕微鏡制御部３５は、ＰＣのメモリに記憶されている顕微鏡制御プログラムの実行により、入力部４１によって入力されるユーザの指示に基づいて、対物レンズ１７や結像レンズ１９を交換あるいは倍率調節したり、フィルタホイール２３を作動させてフィルタを交換したりする等、顕微鏡本体３の制御を行うことができるようになっている。また、顕微鏡制御部３５は、同じく顕微鏡制御プログラムの実行により、ユーザが入力するステージ１１の移動方向および移動量の情報に基づいて駆動部１２を制御し、ステージ１１を移動させて標本Ｓの位置を変更するようになっている。

照明制御部３７は、ステージ１１がシリンドリカルレンズ２７の光軸Ｐに沿う方向に移動させられる場合に、ＰＣのメモリに記憶されている照明制御プログラムの実行により、ステージ１１の移動に連動して、シリンドリカルレンズ２７の焦点位置を調節するようになっている。具体的には、照明制御部３７は、ステージ１１によって容器１５と共に移動させられる標本Ｓの移動方向および移動量に基づいて、シリンドリカルレンズ２７から検出光学系１３の光軸Ｑまでの励起光の光路に沿う空気換算長を一定に維持するように、シリンドリカルレンズ２７の焦点位置を調節するようになっている。

空気換算長とは、空気と異なる屈折率を有する物質中における光路長を空気中における光路長に換算した長さをいい、屈折率ｎの物質における光路の空気換算長はその光路長に１／ｎを乗じた値である。本実施形態においては、シリンドリカルレンズ２７から検出光学系１３の光軸Ｑまでの空気、水Ｗおよび標本Ｓの各層における励起光の光路に沿う空気換算長の和が一定に維持される。空気の層における空気換算長は空気の層の厚さそのものである。

この照明制御部３７は、光軸Ｐに沿う方向への標本Ｓの移動に伴って検出光学系１３の光軸Ｑに対してシリンドリカルレンズ２７の焦点位置が光軸Ｐに沿う方向にずれる分だけ、移動機構２９によりシリンドリカルレンズ２７の位置を光軸Ｐに沿う方向にずらすことで、シリンドリカルレンズ２７から検出光学系１３の光軸Ｑまでの励起光の光路に沿う空気換算長を一定に維持するようになっている。シリンドリカルレンズ２７の移動量は、ＰＣが、照明制御部３７による照明制御プログラムの実行により、ステージ１１の移動量に基づいて算出するようになっている。

ここで、検出光学系１３の光軸Ｑに対するシリンドリカルレンズ２７の焦点位置のずれ量、すなわち、シリンドリカルレンズ２７を光軸Ｐに沿う方向に移動させる量は、シリンドリカルレンズ２７から検出光学系１３の光軸Ｑまでの間に介在する空気、水Ｗおよび標本Ｓの屈折率と、標本Ｓが光軸Ｐに沿う方向に移動した移動量とに基づいて算出することができる。

本実施形態においては、標本Ｓの屈折率は水Ｗの屈折率と同視できるものとする。空気の屈折率を１．０とし、水Ｗおよび標本Ｓの屈折率をｎとした場合、水中での光路長（Ｌｂ）は下記の式（１）から求められる。
Ｌｂ＝（ｆ−Ｌａ）×（ｎ）・・・（１）
ここで、ｆ：シリンドリカルレンズ２７の焦点距離、Ｌａ：空気中での光路長である。

また、標本Ｓの光軸Ｐに沿う方向への移動に伴いシリンドリカルレンズ２７を移動させる量（Ｘ）は、下記の式（２）から求められる。
Ｘ＝（Δｘ）×（１−１／ｎ）・・・（２）
ここで、Δｘ：標本Ｓの移動量である。

また、標本Ｓを容器１５ごと光軸Ｐに沿ってシリンドリカルレンズ２７に近づける方向に移動させると、シリンドリカルレンズ２７から検出光学系１３の光軸Ｑまでの範囲において、屈折率が小さい空気の層の厚さの比率が小さくなり、その分、屈折率が大きい標本Ｓの層の厚さの比率が大きくなる。このため、検出光学系１３の光軸Ｑに一致させられていたシリンドリカルレンズ２７の焦点位置は、シリンドリカルレンズ２７から遠ざかる方向にずれることになる。

この場合、照明制御部３７は、標本Ｓの移動量に基づいて算出されるシリンドリカルレンズ２７の移動量の分だけ、光軸Ｐに沿って検出光学系１３の光軸Ｑから遠ざける方向にシリンドリカルレンズ２７を移動させるようになっている。

一方、標本Ｓを容器１５ごと光軸Ｐに沿ってシリンドリカルレンズ２７から遠ざける方向に移動させると、シリンドリカルレンズ２７から検出光学系１３の光軸Ｑまでの範囲において、屈折率が小さい空気の層の厚さの比率が大きくなり、その分、屈折率が大きい標本Ｓの層の厚さの比率が小さくなる。このため、検出光学系１３の光軸Ｑに一致させられていたシリンドリカルレンズ２７の焦点位置は、シリンドリカルレンズ２７に近づく方向にずれることになる。

この場合、照明制御部３７は、標本Ｓの移動量に基づいて算出されるシリンドリカルレンズ２７の移動量の分だけ、光軸Ｐに沿って検出光学系１３の光軸Ｑに近づける方向にシリンドリカルレンズ２７を移動させるようになっている。
画像処理部３９は、ＰＣのメモリに記憶されている画像処理プログラムの実行により、撮像素子２１から送られてくる画像信号を処理して画像化するようになっている。

次に、本実施形態に係る顕微鏡画像取得方法について説明する。
本実施形態に係る顕微鏡画像取得方法は、図５のフローチャートに示されるように、水Ｗに浸漬されて容器１５に収容されている標本Ｓをシリンドリカルレンズ２７の光軸Ｐに沿う方向に容器１５ごと移動させる移動ステップＳ１と、移動ステップＳ１により移動させられる標本Ｓの移動量に基づき、照明装置５から検出光学系１３の光軸Ｑまでの励起光の光路に沿う空気換算長を一定に維持するように、シリンドリカルレンズ２７の焦点位置を調節する焦点位置調節ステップＳ２と、励起光源２５から発せられた励起光を、シリンドリカルレンズ２７により検出光学系１３の光軸Ｑに交差する平面に沿ってシート状に集光させて標本Ｓに入射させる入射ステップＳ３と、入射ステップＳ３により励起光が入射された標本Ｓにおいて発生する蛍光を検出光学系１３より検出する検出ステップＳ４とを含んでいる。

このように構成された顕微鏡１および顕微鏡画像取得方法の作用について説明する。
本実施形態に係る顕微鏡１および顕微鏡画像取得方法により標本Ｓを観察する場合は、水Ｗに標本Ｓを浸漬させた容器１５をステージ１１上に載置し、標本Ｓに対して垂直な方向に対物レンズ１７を対向させて配置する。そして、励起光源２５を作動させて励起光を射出させる。

励起光源２５から射出された励起光は、シリンドリカルレンズ２７により検出光学系１３の光軸Ｑに交差する平面に沿ってシート状に集光されて容器１５を透過し、水Ｗを介して標本Ｓに入射される。標本Ｓにシート状の励起光が入射することにより、励起光の入射平面に沿って標本Ｓ内の蛍光物質が励起されて蛍光が発生する。

標本Ｓにおいて発生した蛍光の内、検出光学系１３の光軸Ｑに沿う方向に放射された蛍光は、対物レンズ１７により集光されてフィルタホイール２３のバリアフィルタを通過した後、結像レンズ１９により結像されて撮像素子２１により撮影される。そして、画像処理部３９により画像処理プログラムが実行され、撮像素子２１により取得される標本Ｓにおける画像信号が画像化されてモニタ９に表示される。

光軸Ｑと垂直な方向に広がる入射平面に沿うシート状の励起光を標本Ｓに入射させることで、例えば、励起光の入射平面に検出光学系１３の焦点面を一致させた状態で、図３（ａ）および図４（ａ）に示すように、シリンドリカルレンズ２７の焦点位置と検出光学系１３の光軸Ｑとを一致させることにより、検出光学系１３の焦点面に沿う広い範囲において発生する蛍光を撮像素子２１により１度に検出して、標本Ｓにおける観察領域Ａの鮮明な蛍光画像を取得することができる。

続いて、標本Ｓの観察領域を変更する場合について、図５のフローチャートを参照して説明する。
まず、顕微鏡制御部３５により、顕微鏡制御プログラムが実行され、ステージ１１を光軸Ｐに沿ってシリンドリカルレンズ２７に近づける方向に移動させて、図３（ｂ）および図４（ｂ）に示すように、標本Ｓにおける観察領域Ｂを観察視野内に移動させる（移動ステップＳ１）。

ここで、標本Ｓを容器１５ごとシリンドリカルレンズ２７の光軸Ｐに沿う方向に移動させると、シリンドリカルレンズ２７から検出光学系１３の光軸までの励起光の光路に沿う方向に介在する空気や容器１５内の水Ｗ、標本Ｓにおけるシリンドリカルレンズ２７の光軸Ｐに沿う方向の厚さの比率が変わるため、検出光学系１３の光軸Ｑに対するシリンドリカルレンズ２７の焦点位置が変化することになる。

この場合、観察領域Ａの場合と比較して、シリンドリカルレンズ２７から検出光学系１３の光軸Ｑまでの範囲において、屈折率が小さい空気の層の厚さの比率が小さくなり、その分、屈折率が大きい標本Ｓの層の厚さの比率が大きくなる。このため、検出光学系１３の光軸Ｑに一致させられていたシリンドリカルレンズ２７の焦点位置が、シリンドリカルレンズ２７から遠ざかる方向にずれることになる。

例えば、図３（ａ）に示すように、観察領域Ａにおいては容器１５の壁面からＬｂ１の位置に集光させた励起光は、標本Ｓを容器１５ごと光軸Ｐに沿ってΔＸ移動させることにより、図３（ｂ）に示すように、容器１５の壁面からＬｂ１＋Δｘの位置ではなく、Ｌｂ１＋（Δｘ）×（ｎ）の位置（図３（ｂ）において、容器１５の壁面からＬｂ２の位置。）に集光することになる。

この場合、照明制御部３７により、照明制御プログラムが実行され、シリンドリカルレンズ２７の焦点位置が調節される。具体的には、照明制御部３７により、まず、シリンドリカルレンズ２７から検出光学系１３の光軸Ｑまでの励起光の光路に沿う空気換算長が一定に維持されるように、上記式（２）に基づいて、シリンドリカルレンズ２７を移動させる量（Ｘ）が算出される。そして、照明制御部３７により、算出された移動量（Ｘ）の分だけ、シリンドリカルレンズ２７の位置が検出光学系１３の光軸Ｑから遠ざかる方向に移動させられる（焦点位置調節ステップＳ２）。

これにより、標本Ｓの観察領域Ｂにおいて、検出光学系１３の光軸Ｑに対してシリンドリカルレンズ２７の焦点位置がずれるのを防ぐことができる。したがって、この状態で、シリンドリカルレンズ２７によりシート状に集光される励起光が標本Ｓに入射されることで（入射ステップＳ３）、標本Ｓにおいて発せられる蛍光に基づき観察領域Ｂの鮮明な蛍光画像を取得することができる（検出ステップＳ４）。

同様にして、ステージ１１を移動させて観察視野を観察領域Ｂから観察領域Ｃに切り替える場合も、観察領域Ａから観察領域Ｂに切り替える場合と同様に、照明制御部３７により、標本Ｓの移動量に基づきシリンドリカルレンズ２７の位置が調節されて、検出光学系１３の光軸Ｑとシリンドリカルレンズ２７の焦点位置とが一致した状態が維持される。これにより、標本Ｓにおける観察領域Ｃの鮮明な蛍光画像が取得される。

次に、ステージ１１を移動させて観察視野を観察領域Ｃから観察領域Ｄに切り替える場合は、標本Ｓの移動に伴う検出光学系１３の光軸Ｑに対するシリンドリカルレンズ２７の焦点位置のずれが発生しない。したがって、照明制御部３７によるシリンドリカルレンズ２７の位置の調節が行われることなく、標本Ｓにおける観察領域Ｄの鮮明な蛍光画像が取得される。

次に、ステージ１１を移動させて観察視野を観察領域Ｄから観察領域Ｅに切り替える場合、すなわち、標本Ｓを容器１５ごと光軸Ｐに沿ってシリンドリカルレンズ２７から遠ざける方向に移動させる場合は、観察領域Ｄの場合と比較して、シリンドリカルレンズ２７から検出光学系１３の光軸Ｑまでの範囲において、屈折率が小さい空気の層の厚さの比率が大きくなり、その分、屈折率が大きい標本Ｓの層の厚さの比率が小さくなる。このため、検出光学系１３の光軸Ｑに一致させられていたシリンドリカルレンズ２７の焦点位置が、シリンドリカルレンズ２７に近づく方向にずれることになる。

この場合、照明制御部３７により、シリンドリカルレンズ２７から検出光学系１３の光軸Ｑまでの励起光の光路に沿う空気換算長が一定に維持されるように、上記式（２）に基づいて、シリンドリカルレンズ２７を移動させる量（Ｘ）が算出され、算出された移動量（Ｘ）の分だけシリンドリカルレンズ２７の位置が検出光学系１３の光軸Ｑに近づく方向に移動させられる。これにより、標本Ｓの観察領域Ｅにおいても、検出光学系１３の光軸Ｑに対してシリンドリカルレンズ２７の焦点位置がずれるのを防いで鮮明な蛍光画像を取得することができる。

同様にして、ステージ１１を移動させて観察視野を観察領域Ｅから観察領域Ｆに切り替える場合も、観察領域Ｄから観察領域Ｅに切り替える場合と同様に、照明制御部３７により、標本Ｓの移動量に基づきシリンドリカルレンズ２７の位置が調節されて、検出光学系１３の光軸Ｑとシリンドリカルレンズ２７の焦点位置とが一致した状態が維持されて、鮮明な蛍光画像が取得される。

以上説明したように、本実施形態に係る顕微鏡および顕微鏡画像取得方法によれば、標本Ｓを移動させて蛍光画像の取得位置をシリンドリカルレンズ２７の光軸方向に変更した場合であっても、標本Ｓの移動量に基づき、シリンドリカルレンズ２７の焦点位置が調節されて、シリンドリカルレンズ２７から検出光学系１３の光軸Ｑまでの励起光の光路に沿う空気換算長が一定に維持されることで、検出光学系１３の光軸Ｑに対してシリンドリカルレンズ２７の焦点位置がずれるのを防ぐことができる。したがって、シート照明方式により、標本Ｓにおける異なる観察領域を鮮明な蛍光画像を取得して観察することができる。

〔第２実施形態〕
次に、本発明の第２実施形態に係る顕微鏡および顕微鏡画像取得方法について説明する。
本実施形態に係る顕微鏡１は、図６（ａ），（ｂ）および図７（ａ），（ｂ）に示すように、ステージ１１に代えて、容器１５に収容された防水型ＸＹステージ４３を備え、顕微鏡本体３に容器１５が固定された状態で標本Ｓのみをシリンドリカルレンズ２７の光軸方向に移動させる点で第１実施形態と異なる。
以下、第１実施形態に係る顕微鏡および顕微鏡画像取得方法と構成を共通する箇所には、同一符号を付して説明を省略する。

容器１５は、顕微鏡本体３に固定されている。
防水型ＸＹステージ４３は、液体（媒質）ｍが充填された容器１５内で、駆動部１２により検出光軸方向に垂直な面内の２次元方向に移動することができるようになっている。

顕微鏡制御部３５は、顕微鏡制御プログラムの実行により、ユーザが入力する防水型ＸＹステージ４３の移動方向および移動量の情報に基づいて駆動部１２を制御し、防水型ＸＹステージ４３を移動させて、容器１５内で標本Ｓの位置を変更するようになっている。

本実施形態においては、空気の屈折率を１．０とし、液体ｍの屈折率をｎ１とし、標本Ｓの屈折率をｎ２とする。そして、標本Ｓを移動させる前の光軸Ｐに沿う方向のシリンドリカルレンズ２７から容器１５の端面までの間に介在する空気中での光路長をＬａ１、光軸Ｐに沿う方向の容器１５の壁面から標本Ｓまでの間に介在する液体ｍ中での光路長Ｌｂ１の空気換算長をＬｂ１／ｎ１、光軸Ｐに沿う方向の標本Ｓの端面から検出光学系１３の光軸Ｑまでの標本Ｓ中での光路長Ｌｃ１の空気換算長をＬｃ１／ｎ２とする。また、標本Ｓを移動させた後の光軸Ｐに沿う方向のシリンドリカルレンズ２７から容器１５の端面までの間に介在する空気中での光路長をＬａ２＋Ｘ、光軸Ｐに沿う方向の容器１５から標本Ｓまでの間に介在する液体ｍ中での光路長Ｌｂ２の空気換算長をＬｂ２／ｎ１、光軸Ｐに沿う方向の標本Ｓの端面から検出光学系１３の光軸Ｑまでの標本Ｓ中での光路長Ｌｃ２の空気換算長をＬｃ２／ｎ２とする。Ｘは、標本Ｓの光軸Ｐに沿う方向への移動に伴いシリンドリカルレンズ２７を移動させる量である。

照明制御部３７は、標本Ｓの移動の前後におけるシリンドリカルレンズ２７から検出光学系１３の光軸Ｑまでの励起光の光路に沿う空気換算長を一定に維持するように、シリンドリカルレンズ２７の焦点位置を調節するので、下記の式（３）が成り立つ。
Ｌａ１＋Ｌｂ１／ｎ１＋Ｌｃ１／ｎ２＝Ｌａ２＋Ｘ＋Ｌｂ２／ｎ１＋Ｌｃ２／ｎ２・・・（３）

また、下記の式（４），（５），（６）が成り立つ。
Ｌａ１＝Ｌａ２・・・（４）
Ｌｂ１−Ｌｂ２＝Δｘ・・・（５）
Ｌｃ２−Ｌｃ１＝Δｘ・・・（６）

よって、標本Ｓの光軸Ｐに沿う方向への移動に伴いシリンドリカルレンズ２７を移動させる量（Ｘ）は、上記式（３）−（６）に基づいて、下記の式（７）から求められる。
Ｘ＝（Δｘ）×（１／ｎ１−１／ｎ２）・・・（７）

このように構成された顕微鏡１および顕微鏡画像取得方法の作用について説明する。
本実施形態に係る顕微鏡１および顕微鏡画像取得方法により標本Ｓの観察領域を変更する場合は、顕微鏡制御部３５により、顕微鏡制御プログラムが実行されて、容器１５内で防水型ＸＹステージ４３が光軸Ｐに沿って移動される（移動ステップＳ１）。

ここで、顕微鏡本体３に容器１５が固定された状態で標本Ｓのみをシリンドリカルレンズ２７の光軸Ｐに沿う方向に移動させると、シリンドリカルレンズ２７から検出光学系１３の光軸Ｑまでの励起光の光路に沿う方向に介在する空気や容器１５内の液体ｍ、標本Ｓにおけるシリンドリカルレンズ２７の光軸Ｐに沿う方向の厚さの比率が変わるため、検出光学系１３の光軸Ｑに対するシリンドリカルレンズ２７の焦点位置が変化することになる。

この場合、例えば、図６（ａ），（ｂ）および図７（ａ），（ｂ）に示すように、標本Ｓの観察領域Ａから観察領域Ｂに観察視野を切り替えた場合のように、防水型ＸＹステージ４３を光軸Ｐに沿ってシリンドリカルレンズ２７に近づける方向に移動させた場合は、シリンドリカルレンズ２７から検出光学系１３の光軸Ｑまでの範囲において、空気の層の厚さの比率は変わらず、容器１５内の液体ｍの層の厚さが小さくなる分、標本Ｓの層の厚さの比率が大きくなる。

この場合は、照明制御部３７において、上記式（７）により、標本Ｓの光軸Ｐに沿う方向への移動に伴いシリンドリカルレンズ２７を移動させる量（Ｘ）が算出される。算出された移動量Ｘが正の値の場合は、照明制御部３７により、図６（ｂ）および図７（ｂ）に示すように、算出された移動量の分だけ、シリンドリカルレンズ２７の位置が検出光学系１３の光軸Ｑから遠ざかる方向に移動させられる（焦点位置調節ステップＳ２）。一方、算出された移動量Ｘが負の値の場合は、照明制御部３７により、算出された移動量の分だけ、シリンドリカルレンズ２７の位置が検出光学系１３の光軸Ｑに近づく方向に移動させられる（焦点位置調節ステップＳ２）。

一方、標本Ｓの観察領域Ｂから観察領域Ａに観察視野を切り替えた場合のように、防水型ＸＹステージ４３を光軸Ｐに沿ってシリンドリカルレンズ２７から遠ざかる方向に移動させた場合は、シリンドリカルレンズ２７から検出光学系１３の光軸Ｑまでの範囲において、空気の層の厚さの比率は変わらず、容器１５内の液体ｍの層の厚さが大きくなる分、標本Ｓの層の厚さの比率が小さくなる。

この場合も、上記式（７）により、算出された移動量Ｘが正の値の場合は、照明制御部３７により、算出された移動量の分だけ、シリンドリカルレンズ２７の位置が検出光学系１３の光軸Ｑから遠ざかる方向に移動させられる（焦点位置調節ステップＳ２）。一方、算出された移動量Ｘが負の値の場合は、照明制御部３７により、算出された移動量の分だけ、シリンドリカルレンズ２７の位置が検出光学系１３の光軸Ｑに近づく方向に移動させられる（焦点位置調節ステップＳ２）。

これにより、シリンドリカルレンズ２７から検出光学系１３の光軸Ｑまでの励起光の光路に沿う空気換算長が一定に維持され、標本Ｓの切り替え後の観察領域において、検出光学系１３の光軸Ｑに対してシリンドリカルレンズ２７の焦点位置がずれるのを防ぐことができる。したがって、この状態で、シリンドリカルレンズ２７によりシート状に集光される励起光が標本Ｓに入射されることで（入射ステップＳ３）、標本Ｓにおいて発せられる蛍光に基づき切り替え後の観察領域の鮮明な蛍光画像を取得することができる（検出ステップＳ４）。

以上説明したように、本実施形態に係る顕微鏡および顕微鏡画像取得方法によれば、顕微鏡本体３に固定された容器１５内で標本Ｓのみがシリンドリカルレンズ２７の光軸Ｐに沿う方向に移動する場合において、液体ｍと標本Ｓとの屈折率差を無視できないときは、上記式（７）に基づいて、シリンドリカルレンズ２７の励起光の焦点位置のずれを補正し、より鮮明な観察画像を得ることができる。

上記各実施形態においては、画像処理部３９が、ＰＣのメモリに記憶されている画像処理プログラムの実行により、駆動部１２により移動させられる標本Ｓの座標ごとに、検出光学系１３により取得される標本Ｓの蛍光画像を配列して貼り合わせ画像を生成することとしてもよい。この場合、上記のように、標本Ｓの移動に伴い、シリンドリカルレンズ２７の位置が調節されて取得された観察領域Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅ，Ｆの蛍光画像を座標ごとに配列して貼り合わせることとすればよい。
このようにすることで、より大きい鮮明な蛍光画像によって標本Ｓを観察することができる。

また、上記各実施形態においては、照明制御部３７が、シリンドリカルレンズ２７の移動量をステージ１１の移動量に基づいて算出することとしたが、これに代えて、例えば、照明制御部３７が、予め記憶したステージ１１の移動量と焦点調節量の対照表を参照して、シリンドリカルレンズ２７の移動量を求めることとしてもよい。

以上、本発明の実施形態について図面を参照して詳述してきたが、具体的な構成はこの実施形態に限られるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲の設計変更等も含まれる。例えば、本発明を上記各実施形態および変形例に適用したものに限定されることなく、これらの実施形態および変形例を適宜組み合わせた実施形態に適用してもよく、特に限定されるものではない。また、第１実施形態においては、容器１５に充填する媒質として水を例示して説明したが、これに限定されるものではなく、液体またはゲル状の物質を採用することとすればよい。

また、上記各実施形態においては、シリンドリカルレンズ２７のみを移動させてシリンドリカルレンズ２７の焦点位置を調節することとしたが、これに代えて、照明装置５全体を光軸Ｐに沿う方向に移動させてシリンドリカルレンズ２７の焦点位置を調節することとしてもよい。また、シリンドリカルレンズ２７を移動させる代わりに、シリンドリカルレンズ２７と容器１５との間に複数のミラーで構成される迂回光路を設け、これらのミラーを移動させて迂回光路の光路長を変化させることで焦点の位置を移動させてもよい。

１ 顕微鏡
３ 顕微鏡本体（顕微鏡本体部）
１２ 駆動部
１３ 検出光学系
２７ シリンドリカルレンズ（シート照明光学系）
３７ 照明制御部（焦点位置調節部）
３９ 画像処理部
Ｓ１ 移動ステップ
Ｓ２ 焦点位置調節ステップ
Ｓ３ 入射ステップ
Ｓ４ 検出ステップ

Claims (11)

1. 空気と異なる屈折率を有する媒質に浸漬されて容器に収容されている標本から発せられる蛍光を検出して蛍光画像を取得する検出光学系と、
   光源から発せられる励起光を前記検出光学系の光軸に交差する平面に沿って平面状に集光させて、前記容器内の前記標本に入射させるシート照明光学系と、
   該シート照明光学系の光軸方向に前記標本を移動させる駆動部と、
   該駆動部によって前記標本が移動させられることにより、前記シート照明光学系から前記検出光学系の光軸までの前記励起光の光路に沿う空気換算長に変化が生じる場合に、前記シート照明光学系の焦点位置を前記検出光学系の光軸位置からずれないように調節する焦点位置調節部とを備える顕微鏡。
2. 前記駆動部が、前記シート照明光学系の光軸方向に前記容器ごと前記標本を移動させる請求項１に記載の顕微鏡。
3. 前記容器が、前記検出光学系が備えられる顕微鏡本体部に固定され、
   前記駆動部が、前記顕微鏡本体部に固定された前記容器内の前記標本を前記シート照明光学系の光軸方向に移動させる請求項１に記載の顕微鏡。
4. 前記焦点位置調節部が、前記駆動部により移動させられる前記標本の移動量に基づき、前記空気換算長を一定に維持するように前記シート照明光学系の焦点位置を調節する請求項１から請求項３のいずれかに記載の顕微鏡。
5. 前記焦点位置調節部が、前記シート照明光学系を光軸方向に移動させることにより、前記シート照明光学系の焦点位置を調節する請求項１から請求項４のいずれかに記載の顕微鏡。
6. 前記駆動部が、前記励起光の入射平面に沿う２次元方向に前記標本を移動可能である請求項１から請求項５のいずれかに記載の顕微鏡。
7. 前記駆動部により移動させられる前記標本の座標ごとに、前記検出光学系により取得される前記標本の蛍光画像を配列して貼り合わせ画像を生成する画像処理部を備える請求項１から請求項６のいずれかに記載の顕微鏡。
8. 空気と異なる屈折率を有する媒質に浸漬されて容器に収容されている標本を検出光学系の光軸に交差するシート照明光学系の光軸に沿う方向に移動させる移動ステップと、
   光源から発せられた励起光を前記シート照明光学系により前記検出光学系の光軸に交差する平面に沿って平面状に集光させて前記標本に入射させる入射ステップと、
   前記移動ステップによって前記標本が移動させられることにより、前記シート照明光学系から前記検出光学系の光軸までの前記励起光の光路に沿う空気換算長に変化が生じる場合に、前記シート照明光学系の焦点位置を前記検出光学系の光軸位置からずれないように調節する焦点位置調節ステップと、
   前記入射ステップにより前記励起光が入射された前記標本において発生する蛍光を前記検出光学系より検出する検出ステップとを含む顕微鏡画像取得方法。
9. 前記移動ステップが、前記シート照明光学系の光軸方向に前記容器ごと前記標本を移動させる請求項８に記載の顕微鏡画像取得方法。
10. 前記容器が、前記検出光学系が備えられる顕微鏡本体部に固定され、
    前記移動ステップが、前記顕微鏡本体部に固定された前記容器内の前記標本を前記シート照明光学系の光軸方向に移動させる請求項８に記載の顕微鏡画像取得方法。
11. 前記焦点位置調節ステップが、前記移動ステップにより移動させられる前記標本の移動量に基づき、前記空気換算長を一定に維持するように、前記シート照明光学系の焦点位置を調節する請求項８から請求項１０のいずれかに記載の顕微鏡画像取得方法。

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