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Aus Veröffentlichungen und Patenten sind Anordnungen zur Strahlvervielfachung bekannt.
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Eine vorteilhafte Anwendung erfolgt in Laser-Scanning-Mikroskopen (LSM) weil hierdurch die Scangeschwindigkeit gegenüber einer Einpunktabtastung erhöht wird.
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Man kann einen Strahl teilen, indem man entweder separate Strahlteile in verschiedene Richtungen lenkt (geometrische Teilung), oder indem man Strahlteiler benutzt und den reflektierten und transmittierten Anteil des Strahls weiter verwendet (physikalische Teilung). Beispiele zu beiden Prinzipien sind in z. B. Naumann/Schröder „Bauelemente der Optik” (Seite 182 ff) oder auch in Patenten (
DE19535525A1 ,
US20090016400A1 ,
DE19904592C2 ) erwähnt.
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Für die Anwendung in LSM wichtig ist eine Strahlteilung, bei der die Teilbündel eine möglichst hohe Homogenität über das sichtbare Spektrum hinweg und untereinander aufweisen. Weiterhin soll die Strahlteilung sehr langzeitstabil und temperaturunempfindlich sein.
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Die Anordnung nach
DE19535525A1 weist pro Teilbündel eine gerade Anzahl an Reflektionen auf, womit die Anordnung unempfindlich gegen Lagetoleranzen ist. Da die optisch wirksamen Flächen fest über das Glassubstrat verbunden sind ist diese Anordnung zwar stabil und auch temperaturunempfindlich. Ein Nachteil ist jedoch, dass alle Teilbündel parallel zueinander entstehen und somit keine Feldwinkel erzeugt werden können. Diese sind aber erforderlich damit das Objektiv die Teilstrahlen an unterschiedliche Stellen auf der Probe fokussieren kann.
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Mit der Anordnung nach
DE19904592C2 ist es zwar möglich, durch Verkippen der Spiegelflächen Winkel zwischen den Teilbündeln zu erzeugen, allerdings verliert man durch die nötige separate Halterung der Spiegel die Stabilität und auch die Temperaturunempfindlichkeit.
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Aufgabe der Erfindung ist es, einen Strahlvervielfacher mit vorzugsweise äquidistanten Winkeln zwischen den Teilbündeln und gleichzeitig hoher Stabilität zu realisieren.
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Die Aufgabe wird durch ein Mikroskop und ein optisches Bauelement gemäß den unabhängigen Patentansprüchen gelöst.
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Bevorzugte Weiterbildungen sind Gegenstand der abhängigen Ansprüche.
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In einem erfindungsgemässen Mikroskop zur Mehrstrahlabtastung mit einem Beleuchtungs- und einem Detektionsstrahlengang und einem Mikroskopobjektiv, wobei sich im Beleuchtungsstrahlengang ein Bauelement zur Erzeugung mehrerer Abtaststrahlen aus mindestens einem Beleuchtungsstrahl befindet, ist zur Erzeugung räumlich versetzter Teilstahlen ein keilförmiges lichtdurchlässiges erstes Bauteil im Beleuchtungsstrahlengang vorgesehen, an dem durch Mehrfachreflektion an einer zumindest teilweise teilreflektierenden Fläche die Abtaststrahlen erzeugt werden.
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Das Mikroskop ist als Laser-Scanning Mikroskop ausgebildet und weist mindestens einen eindimensionalen Scanner zur scannenden Bewegung der Abtaststrahlen über eine Probe im Beleuchtungsstrahlengang auf.
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Vorteilhaft weisen die Abtaststrahlen in Beleuchtungsrichtung vor dem Objektiv zumindest teilweise zueinander einen Winkel ungleich Null Grad auf.
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Bevorzugt können sich die Abtaststrahlen zumindest teilweise in der Objektivpupille des Mikroskopobjektives schneiden. Für die Abtaststrahlen sind zumindest teilweise zusätzliche Kompensationselemente vorgesehen, zur Kompensation einer spektralen Dispersion und/oder der Strahlrichtung.
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Bei n Abtaststrahlen können n Kompensationselemente vorgesehen sein, die vorzugsweise als weitere keilförmige lichtdurchlässige Bauteile ausgebildet sind. Kompensationselemente können dabei dem ersten Bauteil vor und/oder nachgeordnet sein.
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Es können auch bei geringeren Anforderungen teilweise verstellbare Planplatten zur Einstellung eines Schnittpunktes der Abtaststrahlen oder ihrer Strahlrichtung und/oder des Strahlversatzes vorgesehen sein.
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Die Erfindung betrifft weiterhin ein Bauelement zur Erzeugung mehrerer Abtaststrahlen aus mindestens einem Beleuchtungsstrahl, insbesondere in einem Mikroskop angeordnet, das zur Erzeugung räumlich versetzter Teilstahlen keilförmig und lichtdurchlässig ist und durch Mehrfachreflektion an einer zumindest teilweise teilreflektierenden Fläche des Bauelementes mehrere Abtaststrahlen erzeugt.
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Die Beleuchtungsmittel können vorteilhaft Beleuchtungslaser sein.
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1 zeigt zunächst eine grundsätzliche optische Anordnung in einem Mikroskop mit einer Mehrfachstrahllichtquelle.
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Das Licht eines Lasers L gelangt auf eine Anordnung zur Strahlvervielfachung MBL wie sie nachfolgend für die vorliegende Erfindung näher beschrieben wird.
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Das Licht der Multibeamlichtquelle MBL gelangt über eine Optik, hier einen Zoom ZO, auf einen Hauptfarbteiler MBD zur Trennung des Beleuchtungslichtes vom Probenlicht und von dort, von MDB reflektiert, über einen Reflektor R und ein Objektiv O auf eine Probe S. Das Probenlicht, insbesondere das interessierende Fluoreszenzlicht, gelangt zurück über den Reflektor R und transmittierend durch MDB hindurch über eine Detektoroptik DEO und eine Mehrfach-Pinholeanordnung PH auf eine Detektorgruppe DE.
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Bevorzugt wird das durch die Beleuchtung mit mehreren Strahlfoki über das Objektiv O auf oder in der Probe erzeugte Probenlicht in Detektionsrichtung durch mehrere Pinhole PH geführt, wobei jedem Einzelstrahl ein Einzelpinhole zugeordnet ist. Es ist auch für jeden detektierten Einzelstrahl ein Einzeldetektor vorgesehen. Optional kann der Detektor DE auch als ortsauflösender Flächenempfänger ausgebildet sein.
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In 2 ist ein bevorzugtes Ausführungsbeispiel einer erfindungsgemässen optischen Anordnung zur Strahlvervielfachung dargestellt.
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Die Begriffe Keile und Keilplatten werden nachstehend synonym verwendet.
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Unter Keilförmig wird verstanden dass zumindest zwei lichtwirkende vorzugsweise gegenüberliegende Seitenflächen der Keilplatten zueinander einen Winkel kleiner 90 Grad aufweisen.
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Spektral unabhängig heißt dass jede Wellenlängendispersion durch die verwendeten Elemente zum Schluss vorteilhaft kompensiert ist.
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Das Beleuchtungslicht L gelangt in einen ersten keilförmigen Glaskörper oder eine Keilplatte K1 und von diesem in eine zweite Keilplatte K2, in der durch mehrfache Totalreflektion Einzelstrahlen ST1–ST4 erzeugt werden.
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Während der Strahl ST2 nach K2 keine weitere Beeinflussung erfährt, geht ST1 durch eine weitere Keilplatte K5 hindurch, ST3 durch K3 und ST4 durch K3 und K4.
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Hierdurch wird durch geeignete Dimensionierung der Keilplatten K3, K4, K5 erreicht dass die Strahlen ST1–ST4 nicht zueinander parallel verlaufen sondern zueinander einen konvergierenden Winkel aufweisen, auf den später noch eingegangen wird.
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In 2 sind weiterhin Senkrechte s zur jeweiligen Lichtrichtung eingezeichnet, um die Winkel α1–α4 der Eintrittsflächen E1–E5 von K1–K5 jeweils zu s zu charakterisieren.
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In 3 sind die Keilwinkel β1–β5 der Keilplatten K1–K5 dargestellt.
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In
4 ist die Keildicke d1–d5 von K1–K5 dargestellt. Sie bemisst sich jeweils von der dargestellten Mitte der Eintrittsflächen von K1–K5 aus senkrecht zur Eintrittsfläche durch den jeweiligen Keilkörper hindurch. In der Tabelle T1 sind nachstehende die beispielhaften Bemessungen der Keilplatten und ihre Lage zueinander sowie das verwendete Material zusammengestellt. Tabelle T1:
| Keil-Nr | Material | Dicke [mm] | Keilwinkel | Globaler Kippwinkel |
| K1 | N-PSK3 | d1: 30 | β1: 2,096° | α1: –25,3° |
| K2 | Quarz Glas | d2: 17 | β2: 0,582° | α2: 14,0° |
| K3 | N-BaF4 | d3: 15 | β3: –0.294° | α3: 24,5° |
| K4 | S-NBH53 | d4: 15 | β4: –0.236° | α4: 15,0° |
| K5 | N-BaF4 | d5: 15 | β5: 0.266° | α5: –25,1° |
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Gegenstand der Erfindung ist eine Anordnung von Keilplatten derart, daß am Ausgang dieser Anordnung 3 oder mehr Teilbündel entstehen, die eine spektral unabhängige äquidistante Winkelseparation aufweisen und sich vorzugsweise spektral unabhängig im gleichen Punkt (Objektivpupille) schneiden. In 1 würde der Schnittpunkt der Teilstrahlen beispielsweise auf dem Reflektor R vor dem Objektiv O liegen und die Eintrittspupille des Objektives O zentrisch ausfüllen.
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Zur Korrektur oben genannter Effekte:
- a) Winkel zw. Teilbündeln sind nicht äquidistant,
- b) mehr als 2 Teilbündel schneiden sich nicht an der gleichen Stelle,
- c) die Winkel der Teilbündel sind wellenlängenabhängig wegen der Dispersion der Gläser
ist pro Teilbündel ein Kompensationselement erforderlich. Die Freiheitsgrade für ein solches Element sind Dicke, Keilwinkel, Kippung und Material. Damit ist es möglich, sowohl Farbquerfehler durch den Keilwinkel als auch einen farbabhängigen Lateralversatz der Bündel durch die Wahl der Keildicke und Kippung zu kompensieren. Durch geeignete Materialwahl wird weiterhin erreicht, dass sich alle Bündel spektral unabhängig im gleichen Punkt (Pupille) schneiden.
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Für geringere Anforderungen an die Äquidistanz der Winkel der Teilbündel sowie an die spektrale Unabhängigkeit dieser Winkel könnten statt der Keilplatten K3, K4, K5 auch verkippbare Planparallelplatten zur Kompensation der Pupillenlage (Vereinigung in der Pupille) durch ihren Parallelversatz und ihre Verkippung verwendet werden.
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K1 könnte dann sogar entfallen.
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Wenn auch die Pupillenlage der Teilbündel nur eine untergeordnete Rolle spielen sollte, können selbst die Planparallelplatten noch weggelassen werden, so dass nur noch ein Teilerkeil zur Winkelseparation erforderlich ist.
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– zeigen einen Aufbau für 4 Teilbündel. Keil K1 kompensiert die Farbfehler des Teilerkeils K2 für das Teilbündel ST2. Die Effekte auf den Teilbündeln ST3 und ST4 werden durch die Keile K3 und K4 kompensiert, wobei aus Platzgründen der Keil K3 auf beide Bündel wirkt. Teilbündel ST1 wird durch Keil K5 kompensiert. Vorteil der Anordnung nach – ist, dass die Keile groß gebaut werden können, da sie von außen in den Aufbau ragen. Damit ist eine hochgenaue Fertigung der benötigten Keilwinkel möglich. Die Lagetoleranzen der Teile sind dabei entspannt, womit ein thermisch sehr stabiler Aufbau automatisch gegeben ist, denn die Winkel der Teilbündel sind durch die Lagetoleranzen der Keile unbeeinflußt. Sie werden ausschließlich durch die Keilwinkel bestimmt und dabei hauptsächlich durch den Keilwinkel des Teilers K2. Dadurch sind problemlos Winkelgenauigkeiten im Sekundenbereich möglich, die natürlich im Subsekundenbereich stabil bleiben. Das ist für eine Anwendung im Laser Scanning Mikroskop (LSM) mit Multi-Spot-Anregung und Detektion sehr vorteilhaft.
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K2 kann auch limitiert zur Einstellung des Strahlabstandes verkippt werden solange die Teilstrahlen ST1–4 noch den nachfolgenden Durchgang wie dargestellt realisieren können.
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Damit alle 4 Teilbündel die gleiche Intensität haben, ist eine spezielle Beschichtung der 4 Austrittsbereiche des Teilers K2 erforderlich. Wenn man die spektralen Transmissionen aller übrigen Kompensationskeile und Beschichtungen mit berücksichtigt, können spektrale Transmissionsverläufe derart angegeben werden, dass pro Wellenlänge exakt die gleichen Transmissionswerte für die 4 Teilbündel erzielt werden. zeigt ein Beispiel für eine solche Auslegung.
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In 5 ist beispielhaft Spektrale Transmission der Teilerschichten am Ausgang von K2 für die Teilbündel ST4, ST3 und ST2.
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Die dargestellten Teilerschichten regeln die gleichmäßige Intensität an allen Ausgängen von K2 durch unterschiedliche Transmission/Reflektivität, zunächst ca. 25% für ST4, dann 33% für ST3 und dann 50% für ST2 wobei für Teilstrahl ST4 dann eine maximale Transmission beschichtet wird.
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Die Abschwächung der Teilstrahlen ST4, ST3 und ST1 durch die Keile 3, 4, 5 ist hierbei durch geringe Transmissionsverluste vernachlässigbar.
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Die Winkel zueinander dienen dem Zweck dass das Objektiv sie an unterschiedliche Orte fokussiert, im Gegensatz zu Parallelstahlen.
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Die Strahlen werden vorzugsweise in der Eintrittspupille des Mikroskopobjektives vereinigt und füllen diese zentrisch aus.
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Die Aufspreizung der Teilstrahlen (Winkel zueinander) wird durch den Keilwinkel von K2 festgelegt weil die Ablenkung an der Ausgangsfläche zu einem unterschiedlichen Winkel erfolgt während die Verkippung von K2 den gegenseitigen Abstand der Teilstrahlen zueinander festlegt. Gemeint ist hier der laterale Teilbündelabstand am Ausgang von K2, d. h. an der Seite, die segmentiert mit verschiedenen Teilverspiegelungen beschichtet ist.
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Element 2 ist in der Darstellung limitiert variabel verkippbar solange die Keile 3, 4, 5 noch getroffen werden die zum Dispersionsausgleich erforderlich sind.
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Durch K1 erfolgt eine wellenlängenabhängige (Vor) Dispersion die in 2 bzw. 3, 4 und 5 jeweils kompensiert wird.
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Strahl 3 geht nach 2 durch (WL Kompensiert).
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Die Lage der Keile ist bautechnisch so festgelegt dass sie von außen hineinragen können.
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3, 4, 5 können als Planparallelplatten ausgelegt sein, 1 kann dabei entfallen (bei geringen Anforderungen an den Dispersionsausgleich). Sie dienen dazu, durch ihren Winkel und Parallelversatz ein Schneiden aller Strahlen in der Objektivpupille zu gewährleisten.
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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur
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- DE 19535525 A1 [0003, 0005]
- US 20090016400 A1 [0003]
- DE 19904592 C2 [0003, 0006]
