DE102006034907A1

DE102006034907A1 - Laser-Scanning-Mikroskop

Info

Publication number: DE102006034907A1
Application number: DE200610034907
Authority: DE
Inventors: Jörg PACHOLIK; Dieter Dr. Huhse
Original assignee: Carl Zeiss MicroImaging GmbH
Current assignee: Carl Zeiss Microscopy GmbH
Priority date: 2006-07-28
Filing date: 2006-07-28
Publication date: 2008-01-31
Also published as: WO2008012056A1

Abstract

Laser-Scanning-Mikroskop mit einem Beleuchtungsstrahlengang zur Beleuchtung einer Probe und einem Detektionsstrahlengang zur Detektion des Probenlichtes, wobei im Detektionsstrahlengang ein dispersives Element zur wellenlängenabhängigen Aufspaltung des Probenlichtes vorgesehen ist und über mindestens erste und zweite Detektoren unterschiedliche Wellenlängenbereiche detektiert werden, wobei mindestens ein Wellenlängenbereich des aufgespaltenen Probenlichtes über ein verstellbares reflektierendes Element in Richtung der Detektion umgelenkt wird, und erste und zweite Lichtleitfasern zur Übertragung des Probenlichtes zu den ersten und zweiten Detektoren vorgesehen sind und das dispersive Element zur Bildung eines vorjustierten Strahlenganges mit dem reflektierenden Element in einem Gehäuse angeordnet ist, an das die Lichtleitfasern angekoppelt sind.

Description

Stand der Technik
In einem Laser-Scanning-System werden Laser unterschiedlicher Leistungsklassen verwendet. Weiterhin ist ein Laser-Scanning-System durch eine grosse Anzahl von variablen Modulen gekennzeichnet, die als Detektor oder zur Beleuchtung dienen.
In 1 ist schematisch ein Strahlengang eines Laser-Scanning-Mikroskopes dargestellt.
Ein LSM gliedert sich im wesentlichen wie in 1 dargestellt in 4 Module: Lichtquelle, Scanmodul, Detektionseinheit und Mikroskop. Diese Module werden im folgenden näher beschrieben. Es wird zusätzlich auf DE 197 02 753 A1 verwiesen.
Zur spezifischen Anregung der verschiedenen Farbstoffe in einem Präparat werden in einem LSM Laser mit verschiedenen Wellenlängen eingesetzt. Die Wahl der Anregungswellenlänge richtet sich nach den Absorptionseigenschaften der zu untersuchenden Farbstoffe. Der Anregungsstrahlung wird im Lichtquellenmodul erzeugt. Zum Einsatz kommen hierbei verschiedene Laser (Argon, Argon Krypton, TiSa-Laser). Weiterhin erfolgt im Lichtquellenmodul die Selektion der Wellenlängen und die Einstellung der Intensität der benötigten Anregungswellenlänge, z.B. durch den Einsatz eines akusto-optischen Kristalls. Anschließend gelangt die Laserstrahlung über eine Faser oder eine geeignete Spiegelanordnung in das Scanmodul.
Die in der Lichtquelle erzeugte Laserstrahlung wird mit Hilfe des Objektivs beugungsbegrenzt über die Scanner, die Scanoptik und die Tubuslinse in das Präparat fokussiert. Der Fokus rastert punktförmig die Probe in x-y-Richtung ab. Die Pixelverweilzeiten beim Scannen über die Probe liegen meist im Bereich von weniger als einer Mikrosekunde bis zu einigen 100 Mikrosekunden.
Bei einer konfokalen Detektion (descanned Detection) des Fluoreszenzlichtes, gelangt das Licht das aus der Fokusebene (Specimen) und aus den darüber- und darunterliegenden Ebenen emittiert wird, über die Scanner auf einen dichroitischen Strahlteiler (MD). Dieser trennt das Fluoreszenzlicht vom Anregungslicht. Anschließend wird das Fluoreszenzlicht auf eine Blende (konfokale Blende/Pinhole) fokussiert, die sich genau in einer zur Fokusebene konjugierten Ebene befindet. Dadurch werden Fluoreszenzlichtanteile außerhalb des Fokus unterdrückt. Durch Variieren der Blendengröße kann die optische Auflösung des Mikroskops eingestellt werden.
Hinter der Blende befindet sich ein weiterer dichroitischer Blockfilter (EF) der nochmals die Anregungsstrahlung unterdrückt. Nach Passieren des Blockfilters wird das Fluoreszenzlicht mittels eines Punktdetektors (PMT) gemessen.
Bei Verwendung einer Mehrphotonen-Absorption erfolgt die Anregung der Farbstofffluoreszenz in einem kleinen Volumen an dem die Anregungsintensität besonders hoch ist. Dieser Bereich ist nur unwesentlich größer als der detektierte Bereich bei Verwendung einer konfokalen Anordnung. Der Einsatz einer konfokalen Blende kann somit entfallen und die Detektion kann direkt nach dem Objektiv erfolgen (non descannte Detektion).
In einer weiteren Anordnung zur Detektion einer durch Mehrphotonenabsorption angeregten Farbstofffluoreszenz erfolgt weiterhin eine descannte Detektion, jedoch wird diesmal die Pupille des Objektives in die Detektionseinheit abgebildet (nichtkonfokal descannte Detektion).
Von einem dreidimensional ausgeleuchteten Bild wird durch beide Detektionsanordnungen in Verbindung mit der entsprechenden Einphotonen bzw. Mehrphotonen-Absorption nur die Ebene (optischer Schnitt) wiedergegeben, die sich in der Fokusebene des Objektivs befindet. Durch die Aufzeichnung mehrerer optische Schnitte in der x-y Ebene in verschiedenen Tiefen z der Probe kann anschließend rechnergestützt ein dreidimensionales Bild der Probe generiert werden.
Das LSM ist somit zur Untersuchung von dicken Präparaten geeignet. Die Anregungswellenlängen werden durch den verwendeten Farbstoff mit seinen spezifischen Absorptionseigenschaften bestimmt. Auf die Emissionseigenschaften des Farbstoffes abgestimmte dichroitische Filter stellen sicher, dass nur das vom jeweiligen Farbstoff ausgesendete Fluoreszenzlicht vom Punktdetektor gemessen wird.
In biomedizinischen Applikationen werden zur Zeit mehrere verschiedene Zellregionen mit verschiedenen Farbstoffe gleichzeitig markiert (Multifluoreszenz). Die einzelnen Farbstoffe können mit den Stand der Technik entweder aufgrund verschiedener Absorptionseigenschaften oder Emissionseigenschaften (Spektren) getrennt nachgewiesen werden. Dazu erfolgt eine zusätzliche Aufspaltung des Fluoreszenzlichts von mehreren Farbstoffen mit den Nebenstrahlteilern (DBS) und eine getrennte Detektion der einzelnen Farbstoffemissionen in getrennten Punktdetektoren (PMT x).
Das LSM LIVE der Carl Zeiss Micolmaging GmbH realisiert einen sehr schnellen Linienscanner mit einer Bilderzeugung um 120 Bildern pro Sekunde (http://www.zeiss.de/c12567be00459794/Contents-Frame/fd9fa0090eee01a641256a550036267b).
In DE 197 02 753 A1 wird beschrieben, dass, beispielsweise hinter einem Pinhole in der Detektion, eine Lichtleitfaser zur Übertragung eines Teils der Detektionsstrahlung zu einem weiteren Detektor erfolgen kann.
Es sind unterschiedliche Lösungen bekannt, das Detektionslicht spektral aufzufächern und einzelne Spektralko0mponenten zu detektieren ( DE 199 02 625 A1 , DE 100 33 180 A1 ).
Erfindung:
In 2 ist die Erfindung schematisch dargestellt.
In einem Gehäuse sind, vorteilhaft fest zueinander justiert, ein Kollimator KO1 zur Kollimierung von Licht aus einer Lichtleitfaser LF1 in Richtung eines Prismas P sowie Linsen L1, L2 zur Abbildung des durch das Prisma spektral aufgespaltenen Lichtes auf Eingänge von Lichtleitfasern LF2, LF3 vorgesehen. Zumindest in einem Teil des von P kommenden spektral aufgespaltenen Lichtes ist ein verschiebbarer Spiegel SP angeordnet, der mehr oder weniger und verschieblich in die Spektralverteilung hineinragt und einen wählbaren Teil des Detektionslichtes in Richtung LF2 reflektiert.
LF2 und LF3 können hierbei in Richtung von externen Detektoren gerichtet sein.
Durch die kompakte Anordnung im Gehäuse G und die mögliche flexible An- und Auskopplung von Licht an den vorjustierten Lichtleitern LF1, LF2, LF3 kann die eingehenden Strahlung sowie die Wahl externer Detektoren an LF2, LF3 sehr flexibel und außerdem schnell und quasi justierfrei erfolgen.
Die Erfindung besteht im Wesentlichen aus einem mit Lichtleitern (z.B. Glasfasern) angekoppelten Modul zum Aufteilen der Wellenlängen.
Grundsätzlich könnten auch sämtliche Detektoren mit Glasfasern an das Scanmodul gekoppelt sein. Im eigentlichen Scanmodul des LSM wird das Licht also, nachdem es das konfokale Pinhole passiert hat, in einer Glasfaser gesammelt.
Erfindungsgemäss wird das vorteilhaft aus einem Lichtleiter kommende Licht in einen parallelen Strahlengang kollimiert, dieser spektral aufgespalten (mittels Prisma oder Gitter), und dann über einen beweglichen Spiegel einen Teil des Lichtes in einen Ausgangslichtleiter abgebildet, während der andere Teil des Lichtes direkt in einen zweiten Ausgangslichtleiter abgebildet wird.
An diese Lichtleiter können dann über weitere Lichtleiter verschiedenste weitere Komponenten, insbesondere Detektoren, angeschlossen werden. Zudem kann auch zur Kaskadierung mindestens ein genau gleiches Modul noch einmal angeschlossen werden, um auf diese Weise eine Aufteilung in drei Bereiche zu ermöglichen.
Über eine zentrale Ansteuereinheit erfolgt die Ansteuerung der beweglichen Spiegel, die vorteilhaft motorisch betrieben werden.
Statt Linsen können auch andere Elemente zur Kollimation verwendet werden, beispielsweise Hohlspiegel.
Es ist sowohl vorteilhaft möglich, die Faser über einen Stecker am Gehäuse an eine (justierte) Buchse zu stecken. Es kann aber die Faser auch fest (mit einem Ende im Inneren) mit dem Gehäuse verbunden sein, so dass ein Ende der Faser am Gehäuse baumelt und an einen Detektor angeschlossen werden kann.

Claims

Laser-Scanning-Mikroskop mit einem Beleuchtungsstrahlengang zur Beleuchtung einer Probe und einem Detektionsstrahlengang zur Detektion des Probenlichtes, wobei im Detektionsstrahlengang ein dispersives Element zur wellenlängenabhängigen Aufspaltung des Probenlichtes vorgesehen ist und über mindestens erste und zweite Detektoren unterschiedliche Wellenlängenbereiche detektiert werden, wobei mindestens ein Wellenlängenbereich des aufgespaltenen Probenlichtes über ein verstellbares reflektierendes Element in Richtung der Detektion umgelenkt wird, dadurch gekennzeichnet, dass erste und zweite Lichtleitfasern zur Übertragung des Probenlichts zu den ersten und zweiten Detektoren vorgesehen sind und das dispersive Element zur Bildung eines vorjustierten Strahlenganges mit dem reflektierenden Element in einem Gehäuse angeordnet ist, an das die Lichtleitfasern angekoppelt sind.
Laser-Scanning-Mikroskop nach Anspruch 1, wobei zur Zuführung des Probenlichtes in Richtung des dispersiven Elementes eine dritte Lichtleitfaser vorgesehen ist.
Laser-Scanning-Mikroskop nach Anspruch 1 oder 2, wobei im Gehäuse Anschlussstecker für den Anschluss der Lichtleitfasern vorgesehen sind.
Laser-Scanning-Mikroskop nach A einem der Ansprüche 1–3, wobei das dispersive Element ein Prisma oder Gitter ist.
Laser-Scanning-Mikroskop nach A einem der Ansprüche 1–4 wobei zur Kaskadierung mindestens der ersten und/oder zweiten Lichtleitfaser ein weiteres Gehäuse mit den Elementen nach Anspruch 1 nachgeordnet ist.
Modul zur wellenlängenabhängigen Aufspaltung des Probenlichtes für ein Laser-Scanning-Mikroskop, wobei in einem Gehäuse angeordnet ein dispersives Element zur wellenlängenabhängigen Aufspaltung des Probenlichtes und ein verstellbares reflektierendes Element zur Umlenkung mindestens eines Wellenlängenbereiches des aufgespaltenen Probenlichtes vorgesehen sind und am Gehäuse Lichtleitfasern angeordnet sind, die unterschiedliche Wellenlängenbereiche zu unterschiedlichen Detektoren übertragen.