WO2008012000A1 - Laser-scanning-mikroskop - Google Patents

Laser-scanning-mikroskop Download PDF

Info

Publication number
WO2008012000A1
WO2008012000A1 PCT/EP2007/006280 EP2007006280W WO2008012000A1 WO 2008012000 A1 WO2008012000 A1 WO 2008012000A1 EP 2007006280 W EP2007006280 W EP 2007006280W WO 2008012000 A1 WO2008012000 A1 WO 2008012000A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
scanning microscope
laser scanning
aotf
laser
light sources
Prior art date
Application number
PCT/EP2007/006280
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Ralf Wolleschensky
Original Assignee
Carl Zeiss Microimaging Gmbh
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Carl Zeiss Microimaging Gmbh filed Critical Carl Zeiss Microimaging Gmbh
Publication of WO2008012000A1 publication Critical patent/WO2008012000A1/de

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B27/00—Optical systems or apparatus not provided for by any of the groups G02B1/00 - G02B26/00, G02B30/00
    • G02B27/09—Beam shaping, e.g. changing the cross-sectional area, not otherwise provided for
    • G02B27/0905—Dividing and/or superposing multiple light beams
    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B21/00—Microscopes
    • G02B21/0004—Microscopes specially adapted for specific applications
    • G02B21/002—Scanning microscopes
    • G02B21/0024—Confocal scanning microscopes (CSOMs) or confocal "macroscopes"; Accessories which are not restricted to use with CSOMs, e.g. sample holders
    • G02B21/0032—Optical details of illumination, e.g. light-sources, pinholes, beam splitters, slits, fibers
    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B27/00—Optical systems or apparatus not provided for by any of the groups G02B1/00 - G02B26/00, G02B30/00
    • G02B27/09—Beam shaping, e.g. changing the cross-sectional area, not otherwise provided for
    • G02B27/0938—Using specific optical elements
    • G02B27/0944—Diffractive optical elements, e.g. gratings, holograms
    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B21/00—Microscopes
    • G02B21/0004—Microscopes specially adapted for specific applications
    • G02B21/002—Scanning microscopes
    • G02B21/0024—Confocal scanning microscopes (CSOMs) or confocal "macroscopes"; Accessories which are not restricted to use with CSOMs, e.g. sample holders
    • G02B21/0052—Optical details of the image generation
    • G02B21/0076—Optical details of the image generation arrangements using fluorescence or luminescence
    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B21/00—Microscopes
    • G02B21/16—Microscopes adapted for ultraviolet illumination ; Fluorescence microscopes

Definitions

  • An LSM is essentially divided into 4 modules as shown in FIG. 1: light source,
  • Scan module detection unit and microscope. These modules are described in more detail below. Reference is additionally made to DE19702753A1.
  • Excitation wavelength depends on the absorption properties of the dyes to be investigated.
  • the excitation radiation is generated in the light source module.
  • Various lasers are used here (argon, argon krypton, TiSa laser).
  • the combination of different wavelengths in the light source module is carried out as in
  • Adjusting the intensity of the required excitation wavelength e.g. through the use of an acousto-optical crystal (AOTF).
  • AOTF acousto-optical crystal
  • the laser radiation passes through a fiber or a suitable
  • the laser radiation generated in the light source is focused by means of the diffraction-limited diffraction lens via the scanner, the scanning optics and the tube lens into the specimen.
  • the focus scans the sample punctiformly in the x-y direction.
  • Pixel dwell times when scanning over the sample are usually in the range of less than one microsecond to several seconds.
  • the light emitted from the focal plane (specimen) and from the planes above and below passes through the scanners to a dichroic one
  • MDB Beam splitter
  • the fluorescent light is focused on a diaphragm (confocal aperture / pinhole), which is located exactly in a plane conjugate to the focal plane.
  • a diaphragm confocal aperture / pinhole
  • EF dichroic block filter
  • PMT point detector
  • a descanned detection also takes place, but this time the pupil of the objective is imaged into the detection unit (nonconfocally descanned detection).
  • the plane (optical section) which is located in the focal plane of the objective is reproduced by both detection arrangements in conjunction with the corresponding one-photon absorption or multiphoton absorption.
  • a three-dimensional image of the sample can then be generated computer-aided.
  • the LSM is therefore suitable for the examination of thick specimens.
  • the excitation wavelengths are determined by the dye used with its specific absorption properties. Dichroic filters tuned to the emission characteristics of the dye ensure that only the fluorescent light emitted by the respective dye is measured by the point detector.
  • This can be laser L1 emitting multiple wavelengths and
  • Diffraction order irradiated in the AOTF and other lasers for example, under the +/- first diffraction order.
  • the frequency of the acoustic wave of the AOTF is adjusted accordingly.
  • v is the velocity of the acoustic wave in the crystal.
  • the angle splitting (theta) at constant frequency (F) is thus very small.
  • the splitting can be increased by operating the acousto-optic crystal with different frequencies (F). These frequencies can also be fed into the crystal in parallel.
  • prism P or mirror element or other deflecting element which is transparent to the multiline laser L1, and by which a plurality of light beams L2.L3 are deflected so as to be relatively small
  • Angles of incidence of the AOTF e.g., using a constant frequency (F)).
  • a coupling point to a microscope here for example two ports for two scan modules of an LSM is provided.
  • optical fibers F takes place in the prior art, for example via
  • a fiber be firmly coupled (pre-adjustment of the crystal to the fiber).

Landscapes

  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Microscoopes, Condenser (AREA)

Abstract

Laser-Scanning-Mikroskop mit einem Beleuchtungsmodul zur Einkopplung und Vereinigung mehrerer Lichtquellen, dadurch gekennzeichnet dass die Einkopplung und Vereinigung über einen akustooptischen Modulator (AOTF) erfolgt.

Description

Laser-Scanning-Mikroskop
Bei einigen Applikationen der Laser-Scanning-Mikroskopie ist es erforderlich, mit sehr hohen Scangeschwindigkeiten zu arbeiten, um schnell ablaufende Vorgänge zu erfassen, wie beispielsweise in der Physiologie bei der Beobachtung extrem schneller
Vorgänge.
Ein LSM gliedert sich im wesentlichen wie in Fig. 1 dargestellt in 4 Module: Lichtquelle,
Scanmodul, Detektionseinheit und Mikroskop. Diese Module werden im folgenden näher beschrieben. Es wird zusätzlich auf DE19702753A1 verwiesen.
Zur spezifischen Anregung der verschiedenen Farbstoffe in einem Präparat werden in einem LSM Laser mit verschiedenen Wellenlängen eingesetzt. Die Wahl der
Anregungswellenlänge richtet sich nach den Absorptionseigenschaften der zu untersuchenden Farbstoffe. Die Anregungsstrahlung wird im Lichtquellenmodul erzeugt.
Zum Einsatz kommen hierbei verschiedene Laser (Argon, Argon Krypton, TiSa-Laser).
Die Vereinigung unterschiedlicher Wellenlängen im Lichtquellenmodul erfolgt wie in
Fig.1 im Lichtquellenmodul rechts dargestellt über Strahlteiler bzw. Spiegel.
Weiterhin erfolgt im Lichtquellenmodul die Selektion der Wellenlängen und die
Einstellung der Intensität der benötigten Anregungswellenlänge, z.B. durch den Einsatz eines akusto- optischen Kristalls (AOTF) .
Anschließend gelangt die Laserstrahlung über eine Faser oder eine geeignete
Spiegelanordnung in das Scanmodul.
Die in der Lichtquelle erzeugte Laserstrahlung wird mit Hilfe des Objektivs beugungsbegrenzt über die Scanner, die Scanoptik und die Tubuslinse in das Präparat fokussiert. Der Fokus rastert punktförmig die Probe in x-y-Richtung ab. Die
Pixelverweilzeiten beim Scannen über die Probe liegen meist im Bereich von weniger als einer Mikrosekunde bis zu einigen Sekunden.
Bei einer konfokalen Detektion (descanned Detection) des Fluoreszenzlichtes, gelangt das Licht das aus der Fokusebene (Specimen) und aus den darüber- und darunterliegenden Ebenen emittiert wird, über die Scanner auf einen dichroitischen
Strahlteiler (MDB). Dieser trennt das Fluoreszenzlicht vom Anregungslicht.
Anschließend wird das Fluoreszenzlicht auf eine Blende (konfokale Blende / Pinhole) fokussiert, die sich genau in einer zur Fokusebene konjugierten Ebene befindet. Dadurch werden Fluoreszenzlichtanteile außerhalb des Fokus unterdrückt. Durch Variieren der Blendengröße kann die optische Auflösung des Mikroskops eingestellt werden. Hinter der Blende befindet sich ein weiterer dirchroitischer Blockfilter (EF) der nochmals die Anregungsstrahlung unterdrückt. Nach Passieren des Blockfilters wird das Fluoreszenzlicht mittels eines Punktdetektors (PMT) gemessen. Bei Verwendung einer Mehrphotonen-Absorption erfolgt die Anregung der Farbstofffluoreszenz in einem kleinen Volumen an dem die Anregungsintensität besonders hoch ist. Dieser Bereich ist nur unwesentlich größer als der detektierte Bereich bei Verwendung einer konfokalen Anordnung. Der Einsatz einer konfokalen Blende kann somit entfallen und die Detektion kann direkt nach dem Objektiv erfolgen (non descannte Detektion).
In einer weiteren Anordnung zur Detektion einer durch Mehrphotonenabsorption angeregten Farbstofffluoreszenz erfolgt weiterhin eine descannte Detektion, jedoch wird diesmal die Pupille des Objektives in die Detektionseinheit abgebildet (nichtkonfokal descannte Detektion).
Von einem dreidimensional ausgeleuchteten Bild wird durch beide Detektionsanordnungen in Verbindung mit der entsprechenden Einphotonen bzw. Mehrphotonen-Absorption nur die Ebene (optischer Schnitt) wiedergegeben, die sich in der Fokusebene des Objektivs befindet. Durch die Aufzeichnung mehrerer optische Schnitte in der x-y Ebene in verschiedenen Tiefen z der Probe kann anschließend rechnergestützt ein dreidimensionales Bild der Probe generiert werden. Das LSM ist somit zur Untersuchung von dicken Präparaten geeignet. Die Anregungswellenlängen werden durch den verwendeten Farbstoff mit seinen spezifischen Absorptionseigenschaften bestimmt. Auf die Emissionseigenschaften des Farbstoffes abgestimmte dichroitische Filter stellen sicher, dass nur das vom jeweiligen Farbstoff ausgesendete Fluoreszenzlicht vom Punktdetektor gemessen wird.
In biomedizinischen Applikationen werden zur Zeit mehrere verschiedene Zellregionen mit verschiedenen Farbstoffe gleichzeitig markiert (Multifluoreszenz). Die einzelnen Farbstoffe können mit dem Stand der Technik entweder aufgrund verschiedener Absorptionseigenschaften oder Emissionseigenschaften (Spektren) getrennt nachgewiesen werden. Dazu erfolgt eine zusätzliche Aufspaltung des Fluoreszenzlichts von mehreren Farbstoffen mit den Nebenstrahlteilem (DBS) und eine getrennte Detektion der einzelnen Farbstoffemissionen in getrennten Punktdetektoren (PMT x). Das LSM LIVE der Carl Zeiss Microlmaging GmbH realisiert einen sehr schnellen Linienscanner mit einer Bilderzeugung um 120 Bildern pro Sekunde (http://www.zeiss.de/c12567be00459794/Contents- Frame/fd9fa0090eee01a641256a550036267b).
Unterschiedliche diskrete Laserwellenlängen werden über einen durchstimmbaren
AOTF in einem Strahlengang vereinigt.
Das können Laser L1 sein die mehrere Wellenlängen ausstrahlen und
Einzelwellenlängenlaser L2, L3.
Laser mit mehreren Wellenlängen werden vorteilhaft unter der nullten
Beugungsordnung in den AOTF eingestrahlt und weitere Laser beispielsweise unter der +/- ersten Beugungsordnung.
Es können auch mehrere Laser unter unterschiedlichen Winkeln eingestrahlt werden, hierzu wird die Frequenz der akustischen Welle des AOTF entsprechend angepasst. Es besteht folgender Zusammenhang zwischen dem Beugungswinkel zwischen gebeugter und ungebeugter Strahlung (Theta), der Wellenlänge (lambda) und der Frequenz der akustischen Wellen (F):
Theta = lambda * F / v
wobei v die Geschwindigkeit der akustischen Welle im Kristall ist.
Nimmt man typische Werte v=4000 m/s und F=IOOMHz an, dann ergeben sich folgende
Winkel für folgende Wellenlängen:
Figure imgf000005_0001
Die Winkelaufspaltung (theta) bei konstanter Frequenz (F) ist somit sehr klein. Die Aufspaltung kann zusätzlich noch erhöht werden, indem der akustooptische Kristall mit verschiedenen Frequenzen (F) betrieben wird. Diese Frequenzen können zusätzlich auch parallel in den Kristall eingespeist werden.
Bisherige Lasermodule ( siehe oben) wiesen zwar bereits AOTF zum schnellen wellenlängenabhängigen Strahlschalten bzw. Abschwächen ( DE 19829981 A1 ) auf, neu und vorteilhaft ist hier die Verwendung zur variablen und flexiblen Kombination unterschiedlicher Lichtquellen.
Eine weitere Möglichkeit ist die Verwendung eines Prismas P (oder Spiegelelements oder anderes Umlenkelements), das für den Multilinelaser L1 durchlässig ist, und durch das mehrere Lichtstrahlen L2.L3 so umgelenkt werden, dass sie für die relativ kleinen
Einfallswinkel des AOTF (z.B. bei Verwendung einer konstanten Frequenz (F)) geeignet sind.
Dieses Prisma P oder Spiegelelement kann vorteilhaft drehbar zur Einstellung des
Einfallswinkels oder verschiebbar zur Einstellung des Auftrefffortes angeordnet werden.
Wie im Stand der Technik ist eine Koppelstelle zu einem Mikroskop , hier beispielsweise zwei Ports für zwei Scanmodule eines LSM vorgesehen.
Die Einkopplung in Lichtleitfasern F erfolgt im Stand der Technik beispielsweise über
Kollimatoroptiken KO
Vorteilhaft kann am Ausgang des AOTF zur Weiterleitung der Strahlung in Richtung des Mikroskops eine Faser fest angekoppelt sein ( Vorjustierung des Kristalls zur Faser).

Claims

Patentansprüche
1.
Laser - Scanning-Mikroskop mit einem Beleuchtungsmodul zur Einkopplung und Vereinigung mehrerer Lichtquellen, dadurch gekennzeichnet dass die Einkopplung über einen akustooptischen Modulator ( AOTF) erfolgt.
2.
Laser - Scanning-Mikroskop nach Anspruch 1 , wobei unterschiedliche Wellenlängen über unterschiedlichen Beugungsordnungen entsprechende unterschiedliche Winkel in den AOTF eingestrahlt werden.
3.
Laser - Scanning-Mikroskop nach Anspruch 1 oder 2, wobei eine mehrere Wellenlängen enthaltende Lichtquelle über die nullte
Beugungsordnung des AOTF eingestrahlt wird.
4.
Laser - Scanning-Mikroskop nach einem der Ansprüche 1-3, wobei die Lichtquellen Laser sind .
5.
Laser- Scanning-Mikroskop nach einem der Ansprüche 1-4, wobei die Einstrahlung mindestens einer Wellenlänge über einen verstellbaren Spiegel zur Winkeljustierung erfolgt .
PCT/EP2007/006280 2006-07-28 2007-07-16 Laser-scanning-mikroskop WO2008012000A1 (de)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE200610034915 DE102006034915A1 (de) 2006-07-28 2006-07-28 Laser-Scanning-Mikroskop
DE102006034915.6 2006-07-28

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2008012000A1 true WO2008012000A1 (de) 2008-01-31

Family

ID=38573309

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/EP2007/006280 WO2008012000A1 (de) 2006-07-28 2007-07-16 Laser-scanning-mikroskop

Country Status (2)

Country Link
DE (1) DE102006034915A1 (de)
WO (1) WO2008012000A1 (de)

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE19906757A1 (de) * 1998-02-19 1999-12-02 Leica Microsystems Optische Anordnung
US20010028031A1 (en) * 2000-04-04 2001-10-11 Johann Engelhardt Apparatus for combining light and confocal scanning microscope
EP1591825A2 (de) * 1998-12-22 2005-11-02 CARL ZEISS JENA GmbH Vorrichtung zur Einkopplung von Licht in einen Strahlengang eines Mikroskops

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE19906757A1 (de) * 1998-02-19 1999-12-02 Leica Microsystems Optische Anordnung
EP1591825A2 (de) * 1998-12-22 2005-11-02 CARL ZEISS JENA GmbH Vorrichtung zur Einkopplung von Licht in einen Strahlengang eines Mikroskops
US20010028031A1 (en) * 2000-04-04 2001-10-11 Johann Engelhardt Apparatus for combining light and confocal scanning microscope

Also Published As

Publication number Publication date
DE102006034915A1 (de) 2008-01-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE102006034908B4 (de) Laser-Scanning-Mikroskop
DE10257237B4 (de) Anordnung zur optischen Erfassung von in einer Probe angeregter und/oder rückgestreuter Lichtstrahlung
EP2535754B1 (de) Abtastmikroskop und Verfahren zur lichtmikroskopischen Abbildung eines Objektes
DE102005020545A1 (de) Vorrichtung zur Steuerung von Lichtstrahlung
EP1882970A1 (de) Laser-Scanning-Mikroskop zur Fluoreszenzuntersuchung
DE102005020543A1 (de) Verfahren und Vorrichtung zur einstellbaren Veränderung von Licht
WO2008098875A1 (de) Mikroskop zur herkömmlichen fluoreszenzmikroskopie und zur totalinternen-reflexions-mikroskopie
EP1664888A1 (de) Rastermikroskop mit evaneszenter beleuchtung
EP1496386A2 (de) Anordnung zur optischen Erfassung von in einer Probe angeregter oder rückgestreuter Lichtstrahlung mit Doppelobjektivanordnung
DE10139754B4 (de) Beleuchtungsverfahren für ein Scanmikroskop und Scanmikroskop
EP1678545B1 (de) Mikroskop mit evaneszenter probenbeleuchtung
EP2290423B1 (de) Scan-Mikroskop zum optische Abtasten von Proben mit einer Streuscheibe vor einem Durchlicht-Detektor
WO2008012056A1 (de) Laser-scanning-mikroskop
DE102013222562B4 (de) Mikroskop und Verfahren sowie Verwendung eines Mikroskops für evaneszente Beleuchtung und punktförmige Rasterbeleuchtung
EP2122404B1 (de) Konfokales lasermikroskop
WO2008043459A2 (de) Anordnung zur aufteilung von detektionslicht
WO2007121864A1 (de) Laser-scanning-mikroskop mit hauptstrahlteiler zur räumlichen trennung von beleuchtungs- und detektionsstrahlung
WO2008012000A1 (de) Laser-scanning-mikroskop
DE102019119147A1 (de) Mikroskop und verfahren zur mikroskopie
DE102007009659B4 (de) Verwendung eines diodengepumpten Festkörperlasers und Laser-Scanning-Mikroskop mit einem UV-Beleuchtungsstrahlengang
LU92846B1 (de) Verfahren und Beleuchtungsanordnung zum Beleuchten einer Probenschicht mit einem Lichtblatt
DE102021134427A1 (de) Mikroskop und verfahren zur mikroskopie
WO2009027024A1 (de) Verfahren zur laser-scanning-mikroskopie und strahlverteiler
DE102006034909A1 (de) Verfahren zur Laser-Scanning-Mikroskopie und Strahlvereiniger

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 07786082

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: RU

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 07786082

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1