WO2017207807A1 - Lichtblattmikroskop und mikroskopisches verfahren mit einem lichtblattmikroskop - Google Patents

Lichtblattmikroskop und mikroskopisches verfahren mit einem lichtblattmikroskop Download PDF

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illumination
light
light sheet
objective
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Sebastian Tille
Florian Fahrbach
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Leica Microsystems Cms Gmbh
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    • G02B21/367—Control or image processing arrangements for digital or video microscopes providing an output produced by processing a plurality of individual source images, e.g. image tiling, montage, composite images, depth sectioning, image comparison

Definitions

  • the invention relates to a light sheet microscope with a sample-side lens, with a lighting device for providing a first illumination beam, which is focused to form a obliquely inclined to an optical axis of the lens and guided through the lens first light sheet for illuminating a sample from a first direction, and with a detection device for passing through the lens detection light.
  • the invention further relates to a microscopic method with a light-beam microscope, wherein a first illumination beam is provided by means of an illumination device which is used to form a first light sheet inclined obliquely to an optical axis of a sample-side objective and guided through the objective for illuminating a sample from a first direction is focused, and wherein passing through the lens detection light is detected with a detection device.
  • Light sheet microscopes and microscopic methods with such light sheet microscopes are known in practice and exist in different embodiments.
  • light-sheet microscopes for illuminating a sample with an obliquely tilted against an optical axis light sheet from US 8 619 237 B2, WO 2015/109323 A2 and US 8 582 203 B2 are known.
  • OPM / SCAPE Orthogonal Plane Microscopy / Swept Confocal Aligned Planar Excitation
  • fluorophores are excited by an illumination beam, which is guided over a sample-side objective and tilted with respect to the optical axis of the objective.
  • the light emanating from the light sheet is picked up by the same sample-side lens.
  • Via a telecentric lens and a second lens an image is generated by this light, which is tilted in the same way with respect to the optical axis of the second lens.
  • This so-called “aerial image” can be imaged by a further optics, typically a third objective and a tube lens, onto a sensor, wherein the optical axis or the optical path of the optics and the sensor is tilted so that the optics is directed perpendicular to the aerial image and the aerial image lies in the focal plane of the optics, eg the third objective.
  • a further optics typically a third objective and a tube lens
  • the present invention has the object, a light sheet microscope and a microscopic method with a light sheet microscope of the type mentioned in such a way and further, that high-resolution images of a sample with structurally simple means can be realized.
  • the light-sheet microscope is configured and further developed such that the illumination device is further configured to provide at least a second illumination beam which is used to form an obliquely inclined to the optical axis of the lens and guided through the lens at least a second sheet of light Illumination of the sample is focused from a different from the first direction at least one second direction.
  • the method according to claim 11 is then designed and refined in such a way that at least one second illumination beam is provided by means of the illumination device, which is used to form an at least one second light sheet inclined at an angle to the optical axis of the objective and guided through the objective Illumination of the sample is focused from a different from the first direction at least one second direction.
  • the above object is achieved in a surprisingly simple manner by skilfully implementing the beam guidance in the light-beam microscope and by skilfully designing the illumination device.
  • the additional design of the illumination device for providing at least one second illumination beam can enable reliable additional illumination of the sample from at least one further direction.
  • the at least one second illumination beam is focussed in a further concrete manner to form a at least one second light sheet inclined obliquely to the optical axis of the objective lens and guided through the objective for illuminating the sample from a at least one second direction which differs from the first direction.
  • the sample is illuminated from two directions, with the illumination of the sample in each case with a light sheet, wherein the sample does not have to be moved, for example, to receive three-dimensional image stacks from the at least two directions.
  • the images can be offset in a post-processing step to obtain an image stack with approximately isotropic resolution.
  • the light-sheet microscope according to the invention and the method according to the invention disclose a light-sheet microscope and a method according to which high-resolution images of a sample can be realized with structurally simple means, in particular without the need for movement of a sample.
  • a second illumination and detection beam path can be integrated into an existing optical system such that the illumination and the detection direction are respectively interchanged.
  • the equivalent Illumination beam path of the first illumination beam to the detection beam path of the second illumination beam and vice versa can be integrated into an existing optical system such that the illumination and the detection direction are respectively interchanged.
  • the sample-side objective of the light-sheet microscope is an objective which serves both to illuminate the sample with at least two illumination beams and to detect the detection light generated by these illumination beams, for example excited fluorescent light.
  • the first direction and the second direction of at least two illumination beams may be perpendicular to one another or approximately perpendicular to one another.
  • the illumination beams may be directed into the periphery of the pupil or the back focal plane of the sample-side objective to ensure the required oblique illumination of the sample from the side. If the aperture of the sample-side objective is insufficient to radiate the illumination beams into the sample volume at an angle of 90 °, the first direction and the second direction may not be perpendicular to one another but at a smaller angle to one another.
  • the detection device may comprise a first sensor for the first detection beam caused by the first illumination beam and along a first detection beam path in the lens first detection light and at least one second sensor for caused by the at least one second illumination beam and along at least one second detection beam path have at least second detection light extending in the lens.
  • a separate sensor can be provided for each detection light caused by a respective illumination beam, in order to then precisely detect this detection light which runs along its individual detection beam path.
  • the beam paths can be suitable and / or set up to erect oblique image planes to an optical axis.
  • the illumination device can be designed to simultaneously provide the first illumination beam and the at least one second illumination beam or to provide the first illumination beam and the at least one second illumination beam at different times, preferably alternately or in a predeterminable sequence.
  • the detection device or the sensors of the detection device for simultaneous detection of the first detection light and the at least one second detection light or for detecting the first detection light and the at least one second detection light at different times, preferably alternately or in a predeterminable sequence be trained. Not only by a predefinable chronological sequence of the provision of the illumination beams but also by a predeterminable sequence of the detection function of the detection device or the sensors, a particularly high flexibility and adaptation to different requirements and examination methods can be achieved with the light-sheet microscope according to the invention.
  • a recording of images can be realized such that the illumination beam is switched so that the first beam path is used for illumination at a first time and a first sensor takes an image and then - at a second time - a second illumination beam path activated and with a second sensor an image from, for example, approximately orthogonal direction is recorded.
  • an emission filter, bandpass filter or filter for the first and / or the at least one second detection light can be arranged in the beam path in front of the detection device or in front of at least one sensor.
  • Such emission filters can be implemented in various forms, for example, a prism or a grid can be used.
  • an emission filter, bandpass filter or filter can be positioned in a beam path that is not assigned to at least one of the sensors.
  • the light in the Beam path, in which the filter is located mapped to at least one sensor and not shown on at least one other sensor.
  • Such filters are usually arranged in an infinity beam path, ie in a beam path in which the detection light is neither focused nor divergent, but is collimated.
  • the illumination device may comprise a dichroic, a galvanometer, plane-parallel glass blocks, optical fibers or a polarization-rotating element with a polarization-dependent beam splitter for coupling the illumination beams into an illumination beam path.
  • the detection device can comprise means for merging first detection light caused by the first illumination beam and along a first detection beam path in the objective and at least a second detection light caused by the at least one second illumination beam and along at least one second detection beam path in the objective have on a sensor. In this case, detection light from different detection beam paths is guided on one and the same sensor.
  • the at least one second detection light can be deflected by suitable optical means to a sensor or the first sensor, so that no further sensor is required.
  • This Umlenkaufwand may be cheaper than the realization of one or more other sensors, on the one hand in terms of system costs and on the other hand in terms of a required Justage- and calibration effort with respect to the possible other sensors or cameras. It should be noted in particular that it is usually quite complicated to match several sensors or cameras to each other, also because they usually differ in their performance from each other.
  • the illumination device may comprise means for displacing the first light sheet and / or the at least one second light sheet for generating image stacks from preferably mutually parallel image planes, and the detection device may comprise an evaluation device for processing the images. be assigned to the stack.
  • the first illumination beam and the at least one second illumination beam can be scanned by a single common optical element along a direction perpendicular to the optical axis of the lens through the sample, preferably this optical element for Entscannen returned via this optical element detection light can be used.
  • a single common optical element along a direction perpendicular to the optical axis of the lens through the sample, preferably this optical element for Entscannen returned via this optical element detection light can be used.
  • Such an optical element may, for example, have a tilting mirror or a galvanometer. Upon descent, the variable position of the illumination plane in the sample can be imaged onto a stationary sensor.
  • a microscopic method is provided with a light sheet microscope, characterized by the steps of: taking images of a sample, wherein the angle between the image planes and the optical axis is ideally equal and the angle between the image planes is ideally 90 °, producing image stacks of Images of ideally mutually parallel planes and fusion of the image stack, for example, by a multiview deployment.
  • FIG. 1 a in a schematic representation of an embodiment with three
  • FIG. 2 is a schematic representation of two possibilities of coupling two illumination beams
  • FIG. 4 shows a schematic representation of a beam path in a light-sheet microscope according to a further exemplary embodiment
  • Fig. 5 is a schematic representation of an image taken to the same
  • Fig. 1 shows a schematic representation of a beam path in a light-sheet microscope according to a first embodiment of the invention.
  • the beam path is shown in the upper half of Fig. 1 in a yz plane and in the lower half of Fig. 1 in an xz plane.
  • the exemplary embodiment comprises a sample-side first objective 1 with an optical axis 2, wherein a first illumination beam 3 is generated at a time 1 which is used to form a first light sheet inclined at an angle to the optical axis 2 of the objective 1 and guided through the objective 1 first image plane 28 is focused to illuminate a sample from a first direction.
  • the illumination device is for providing a second illumination beam 4 at a time 2 formed, wherein the second illumination beam 4 is focused to form a obliquely to the optical axis 2 of the lens 1 and guided by the lens 1 second light sheet in a second image plane 29 for illuminating the sample from a second direction different from the first direction.
  • the detection device has a first sensor 5 for first detection beam 21 caused by the first illumination beam 3 and along a first detection beam path in objective 1 and a second sensor 6 for second detection light 22 caused by second illumination beam 4 and along a second detection beam path in objective 1 on.
  • an aerial image of the first and second detection light 21 and 22 is generated.
  • the detection light 21 caused by the first illumination beam 3 generates an aerial image in an image plane which is imaged onto the first sensor 5 by a first detection optic (comprising a third objective 10 and a tube lens 24) perpendicular to this image plane.
  • the second detection light 22 also generates a second aerial image in a second image plane, which is mirrored on the optical axis 23 of the objective 9.
  • This aerial image is imaged onto a second sensor 6 by means of a second detection optics (comprising a fourth objective 11 and a tube lens 25) perpendicular to this second image plane.
  • the aerial images are captured by detection systems and imaged aberration-free on sensors 6 and 5, wherein the detection systems for the first and the second aerial image are "mirrored" to each other on the optical axis of the lens 9.
  • the system consisting of the third lens 10, a tube lens 24 and the sensor 5 to rotate about the optical axis 23 of the second lens 9, however, this is very complicated and due to the required precision in the dimensions and mass of the components to be moved
  • the advantage of constructing a second detection system with a second sensor 6 for detecting the images from the second direction, as shown in FIG is also due to the fact that images from the first and the second direction can be recorded simultaneously or within a very short period of time, which would be inconceivable with a mechanical rotation of the entire detection system.
  • the coupling of illumination light can also take place via one or more dichroic mirrors between the third objectives 10, 11 and / or the tube lenses 24, 25. In this case, no dichroic mirror between galvanometer 7 and second lens 9
  • a simple recording of image stacks is possible, in which case a tilting of a galvanometer 7 located in a rear focal plane of the sample-side detection objective 1 takes place.
  • the displacement of the aerial image-generating objective 9 along its optical axis 23, for example by means of a piezo-actuator (SPIM according to Dunsby) enable the generation and recording of image stacks.
  • the object may simply be displaced relative to the lens 1 for generating and picking up image stacks, preferably along the Y axis.
  • FIG. 1 further shows a control unit 12, which may be formed for example by a computing device, a computer or the like, wherein the control unit 12 may be configured to take over a plurality of tasks.
  • This can be, for example, the control of the actuators for the relative offset of the illumination / detection plane relative to the object, the three particularly advantageous methods being described above.
  • the control unit 12 may perform, alternatively or additionally, for example, the reading out and processing of the images of the sensors 5, 6 or of the sensor elements, see FIG. 3 c.
  • a light-beam microscope according to the invention is also conceivable with more than two such erection units 26 and 27, which here according to FIG Elements 5, 24 and 10 or 6, 25 and 1 1 have. With three units, these could then be arranged so that the optical axes are each at angles of 120 ° to each other, wherein respective focal planes can be parallel to the surfaces of a tetrahedron, see Fig. 1 a.
  • a galvanometer or galvanometer mirror could be designed as a preferably 2-axis gimbal galvanometer in order to be able to operate the lenses oriented in different directions.
  • Another alternative is four pairs of opposing lenses. Their advantage is that each two opposite directions can be operated simultaneously.
  • a method for capturing images may be configured such that a first illumination beam 3 is used at a first time to illuminate the sample, and a sensor 5 captures / picks up a corresponding image. Thereafter, a second illumination beam path is activated with a second illumination beam 4, wherein a second sensor 6 captures an image from an approximately orthogonal direction at a second time.
  • Such images can also be taken at the same time or in the same period of time when different dyes are excited in the sample with light from illumination beams 3 and 4 having different wavelengths. It is advantageous if the emission spectra of the dyes or fluorophores overlap each other as little as possible and with the excitation wavelengths of the illumination beams 3 and 4.
  • emission filters, bandpass filters or filters can be positioned in front of the sensors 5 and 6, which respectively cut out regions from the regions of the spectra of the fluorophores or dyes where neither the other fluorophore radiates light nor the light used to excite it. In these cases, one can measure from two directions in time. Essentially, there are two possibilities for accommodating 3D volumes.
  • images of mutually parallel planes from one direction can be recorded successively by tilting the galvanometer 7. Subsequently, the lighting is switched and taken with the second sensor 6, a stack of images from the other direction. This can happen either on the "return path" of the galvanometer, sending a zigzag control signal to the galvanometer, or in the same direction, sending a sawtooth signal to the galvanometer Alternatively, the illumination can be switched so fast that images of the sample are taken from two directions for each angular position of the galvanometer 7.
  • the movement of the galvanometer 7 can take place stepwise, advantageously however, continuously at a speed which avoids image blurring due to the relative movement of the imaged plane relative to the sample during the exposure time, ie, the motion is significantly less than the effective depth of field of detection.
  • the first or second mode is preferred lies in FIG In essence, how fast the circuit bez ie the switching of the lighting can be made. If fast and wear-free switches are used, the second mode can be advantageously used. Otherwise, the first mode represents a simple alternative.
  • the illumination beams 3 and 4 are coupled via a dichroic 8 between the galvanometer 7 and the second lens 9.
  • a further actuator may be necessary, which can generate the necessary parallel beam offset of the illumination beams 3 and 4.
  • an illumination beam can be provided alternately at two positions.
  • FIG. 2 a further exemplary embodiment of a device for providing two illumination beams 3, 4 at two different positions is shown at the upper position a).
  • a device for providing two illumination beams 3, 4 at two different positions is shown at the upper position a).
  • one or more plane-parallel glass blocks 34 can be introduced into the beam path 33 of the light source, which deflect the beam respectively into one or the other beam path in order to generate the two illumination beams 3, 4. Only by turning a glass block 34, the switching operation can be realized.
  • FIG. 2 shows at b) a combination of a fast polarization-rotating element 35 such as an EOM (electro-optical modulator) and a polarization-dependent beam splitter 36 in the beam path 33 of the light source.
  • a fast polarization-rotating element 35 such as an EOM (electro-optical modulator)
  • EOM electro-optical modulator
  • a polarization-dependent beam splitter 36 in the beam path 33 of the light source.
  • reflection takes place through the polarization-dependent beam splitter at one or the other position.
  • a downstream mirror 37 can optionally be used, for example.
  • two optical fibers could be placed in a suitable position, the light between the fibers being switchable with a fast switch.
  • dichroics can also be used in the erection units 26 and 27.
  • 3a, b and c show further embodiments of a beam path in a light sheet microscope, wherein two different detection beam paths are combined in order to be able to image them on a single sensor 5 can.
  • the tube lens 43 can also be configured in duplicate, in each case in the two beam paths.
  • a tilting mirror 39 and further mirrors 40, 41 and a tube lens 43 are used in the exemplary embodiment in FIG.
  • the tilting mirror can assume two orientations (mirror positions), which are defined by the fact that in the first mirror position (at a time 1) the first detection light 21 via a first detection beam path and in the case of the second mirror position (at a time 2) the second detection light 22 passes to the sensor 5 via a second detection beam path.
  • the times must be selected so that they correspond to the times of illumination by means of the illumination beams 3, 4 suitably, so are defined so that detection light generated by the illumination beam 3 at one of the two mirror positions of the tilting mirror 39 reaches the sensor 5 and generates detection light through the illumination beam 4 at the other mirror position.
  • a fixed mirror system formed by the mirrors 40, 41, 42
  • this has the disadvantage that it can potentially lead to disturbing artifacts in the detection or to a lower image quality, partly because of the non-ideal image, since both detection beam paths are always open.
  • the image (via the mirrors 39, 40, 41, 42 and the lens 43) takes place in the case of the embodiments shown in FIGS. 3a and 3b at two detection times, for example alternately, on the same area of the sensor 5.
  • the beam paths for the two But views can also be designed so that the images are offset next to each other on the sensor 5.
  • a corresponding embodiment is shown in Fig. 3c.
  • FIGS. 3 a, 3 b, 3 c The illustration of the detection beam path between sample-side lens 1 and objective 9 is shown in simplified form in FIGS. 3 a, 3 b, 3 c without galvanometer 7 and lens 31.
  • the scan actuator (galvanometer mirror) and / or any number of telecentric optical imaging systems may be inserted at designated location 45.
  • an optical system as shown in Figure 1 may be used or the objective 9 may be mechanically slidably mounted along its optical axis.
  • FIG. 4 shows a further exemplary embodiment of a beam path in a light-beam microscope, this embodiment being designed to avoid a steric collision in the case of a realization with third lenses 10, 11 with a high numerical aperture.
  • the illustration is realized analogously to the figures 3a, 3b, 3c simplified without galvanometer. Similar to FIG. 3a, a switchable mirror is used here, but this is used to split the detection path even before an objective producing the aerial image (objective 9 in the other exemplary embodiments).
  • the mirrors 50, 51 serve in this embodiment, only the compactness of the structure.
  • the lenses 52 and 53 take over the function of the objective 9 from the previous embodiments.
  • the scan actuator galvanometer mirror
  • the scan actuator galvanometer mirror
  • any number of telecentric optical imaging systems may be inserted at the designated location 45, for example.
  • elements designated by the same reference numerals as in FIG. 1 correspond to the elements shown in FIG.
  • FIG. 5 shows a schematic illustration of a scanning movement in which different dyes 1 and 2 having different wavelengths are excited to emit detection light with likewise different wavelengths.
  • both illumination beams 3, 4 are always directed simultaneously to the sample at successive points in time, whereby the different dyes 1 and 2 contained in the sample are excited at the same time to emit detection light 21, 22.
  • Such for example with a Structure as shown in Fig. 1) generated and collected detection light 21, 22 of both dyes can be gradually processed from time 1 to time n to an image stack, as shown in the lower part of Fig. 5.
  • elements of the figure designated by the same reference numerals as in FIG. 1 correspond to the elements shown in FIG.
  • NAw 1, 2
  • FIG. 7 1, 1
  • the light generated by the illumination beam 3 light sheet is tilted against the optical axis 2 by an angle ßi_s.
  • two beam paths 60, 61 for the vertical and 62, 63 and the non-perpendicular detection are drawn in each case, wherein the main beams 61 and 63 are shown in dashed lines and in each case an edge beam 60, 62 is drawn. 60, 61 a beam path is shown, which guarantees a detection perpendicular to the illumination and in which the edge rays 60 are arranged symmetrically about the main beam 61.
  • half the aperture angle 0: 3 of these lenses is given by the tilt angle between the optical axis 2 and the main beam 61 less the above-mentioned angle to avoid the steric collision, ie in this example 5 °. While for a NA of the sample-side lens 1 of 1, 2 so the third and fourth lens 10, 1 1 limit the effective detection aperture, this is not the case for smaller values of the aperture from the sample-side lens 1 of 1, 1 or 1, 0.
  • the beam path 60, 61 ensures the detection perpendicular to the excitation.
  • the alternative beam path 62, 63 is dualview-compatible, ie it is possible to use two objectives with a half opening angle CID tilted by ß D against the optical axis, in order to tap off tilted aerial images.

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Abstract

Im Hinblick auf die Realisierung hochauflösender Bilder einer Probe mit konstruktiv einfachen Mitteln ist ein Lichtblattmikroskop mit einem probenseitigen Objektiv (1 ), mit einer Beleuchtungseinrichtung zur Bereitstellung eines ersten Beleuchtungsstrahls (3), der zur Bildung eines schräg zu einer optischen Achse (2) des Objektivs (1 ) geneigten und durch das Objektiv (1 ) geführten ersten Lichtblatts zur Beleuchtung einer Probe aus einer ersten Richtung fokussiert ist, und mit einer Detektions- einrichtung für durch das Objektiv (1) gelangendes Detektionslicht derart ausgestaltet und weitergebildet, dass die Beleuchtungseinrichtung des Weiteren zur Bereitstellung mindestens eines zweiten Beleuchtungsstrahls (4) ausgebildet ist, der zur Bildung eines schräg zu der optischen Achse (2) des Objektivs (1 ) geneigten und durch das Objektiv (1) geführten mindestens einen zweiten Lichtblatts zur Beleuchtung der Probe aus einer sich von der ersten Richtung unterscheidenden mindestens einen zweiten Richtung fokussiert ist. Des Weiteren ist ein mikroskopisches Verfahren mit einem Lichtblattmikroskop, insbesondere mit einem wie oben beschriebenen Lichtblattmikroskop, angegeben.

Description

Lichtblattmikroskop und mikroskopisches Verfahren mit einem
Lichtblattmikroskop
Die Erfindung betrifft ein Lichtblattmikroskop mit einem probenseitigen Objektiv, mit einer Beleuchtungseinrichtung zur Bereitstellung eines ersten Beleuchtungsstrahls, der zur Bildung eines schräg zu einer optischen Achse des Objektivs geneigten und durch das Objektiv geführten ersten Lichtblatts zur Beleuchtung einer Probe aus einer ersten Richtung fokussiert ist, und mit einer Detektionseinrichtung für durch das Objektiv gelangendes Detektionslicht.
Des Weiteren betrifft die Erfindung ein mikroskopisches Verfahren mit einem Lichtblattmikroskop, wobei ein erster Beleuchtungsstrahl mittels einer Beleuchtungseinrichtung bereitgestellt wird, der zur Bildung eines schräg zu einer optischen Achse eines probenseitigen Objektivs geneigten und durch das Objektiv geführten ersten Lichtblatts zur Beleuchtung einer Probe aus einer ersten Richtung fokussiert wird, und wobei durch das Objektiv gelangendes Detektionslicht mit einer Detektionseinrichtung detektiert wird.
Lichtblattmikroskope und mikroskopische Verfahren mit derartigen Lichtblattmikro- skopen sind aus der Praxis bekannt und existieren in unterschiedlichen Ausführungsformen. Beispielsweise sind Lichtblattmikroskope zur Beleuchtung einer Probe mit einem schräg gegen eine optische Achse gekippten Lichtblatt aus der US 8 619 237 B2, aus der WO 2015/109323 A2 und aus der US 8 582 203 B2 bekannt. Gemäß diesem Stand der Technik wird eine Probe beispielsweise bei der OPM/SCAPE (Oblique Plane Microscopy/Swept Confocally-Aligned Planar Excitation)-Mikroskopie immer nur von einer feststehenden Seite aus oder aus einer Richtung beleuchtet und annähernd senkrecht dazu detektiert. Die Möglichkeit zur Fusion und Entfaltung von Bildern, die aus mehreren Richtungen aufgenommen werden, ist daher nicht möglich, ohne das Objekt oder die Probe zu drehen. Damit entfällt auch eine einfache, erprobte und etablierte Möglichkeit zur Erzeugung von Bilddaten mit isotroper Auflösung. Es wäre kompliziert, aufwändig und teuer, eine Möglichkeit in das System zu integrieren, die die Beleuchtung der Probe aus mehreren Richtungen ermöglicht, beispielsweise durch die Rotation des optischen Strahlengangs. Dabei könnte es in besonders aufwändiger Weise erforderlich sein, eine Aufrichtungseinheit inklusive Kamera und möglicherweise weiteren Bauteilen mit zu rotieren. Eine Beleuchtung und Betrachtung einer Probe aus zwei oder mehreren Richtungen wurde im Bereich der SPIM (Single Plane Illumination Microscopy)-Mikroskopie weiterhin durch Drehung der Probe erreicht.
Bei dem Lichtblattmikroskop gemäß der WO 2015/109323 A2 werden beispielsweise Fluorophore durch einen Beleuchtungsstrahl angeregt, der über ein probenseitiges Objektiv geführt und gegenüber der optischen Achse des Objektivs verkippt ist. Das von dem Lichtblatt ausgehende Licht wird vom selben probenseitigen Objektiv aufgefangen. Über eine telezentrische Optik und ein zweites Objektiv wird durch dieses Licht ein Bild erzeugt, das in gleicher weise gegenüber der optischen Achse des zweiten Objektivs verkippt ist. Dieses sogenannte „Luftbild" kann durch ein weitere Optik, typischerweise ein drittes Objektiv und eine Tubuslinse, auf einen Sensor abgebildet werden, wobei die optische Achse oder der Strahlengang der Optik und des Sensors so verkippt ist, dass die Optik senkrecht auf das Luftbild gerichtet ist und das Luftbild in der Fokusebene der Optik, z.B. des dritten Objektivs liegt.
Ausgehend von diesem Stand der Technik liegt der vorliegenden Erfindung die Aufgabe zugrunde, ein Lichtblattmikroskop sowie ein mikroskopisches Verfahren mit einem Lichtblattmikroskop der eingangs genannten Art derart auszugestalten und weiterzubilden, dass hochauflösende Bilder einer Probe mit konstruktiv einfachen Mitteln realisierbar sind.
Erfindungsgemäß wird die voranstehende Aufgabe durch ein Lichtblattmikroskop mit den Merkmalen des Anspruchs 1 sowie durch mikroskopische Verfahren mit den Merkmalen der Ansprüche 1 1 und 12 gelöst.
Danach ist gemäß Anspruch 1 das Lichtblattmikroskop derart ausgestaltet und weitergebildet, dass die Beleuchtungseinrichtung des Weiteren zur Bereitstellung min- destens eines zweiten Beleuchtungsstrahls ausgebildet ist, der zur Bildung eines schräg zu der optischen Achse des Objektivs geneigten und durch das Objektiv geführten mindestens einen zweiten Lichtblatts zur Beleuchtung der Probe aus einer sich von der ersten Richtung unterscheidenden mindestens einen zweiten Richtung fokussiert ist. Des Weiteren ist danach das Verfahren gemäß Anspruch 1 1 derart ausgestaltet und weitergebildet, dass des Weiteren nnindestens ein zweiter Beleuchtungsstrahl mittels der Beleuchtungseinrichtung bereitgestellt wird, der zur Bildung eines schräg zu der optischen Achse des Objektivs geneigten und durch das Objektiv geführten mindestens einen zweiten Lichtblatts zur Beleuchtung der Probe aus einer sich von der ersten Richtung unterscheidenden mindestens einen zweiten Richtung fokussiert wird.
In erfindungsgemäßer Weise ist zunächst erkannt worden, dass durch geschickte Realisierung der Strahlführung in dem Lichtblattmikroskop und durch geschickte Ausgestaltung der Beleuchtungseinrichtung die voranstehende Aufgabe auf überraschend einfache Weise gelöst wird. In weiter erfindungsgemäßer Weise ist hierzu im Konkreten erkannt worden, dass die zusätzliche Ausbildung der Beleuchtungseinrichtung zur Bereitstellung mindestens eines zweiten Beleuchtungsstrahls eine sichere zusätzliche Beleuchtung der Probe aus mindestens einer weiteren Richtung ermöglichen kann. Dabei ist der mindestens eine zweite Beleuchtungsstrahl in weiter konkreter Weise zur Bildung eines schräg zu der optischen Achse des Objektivs geneigten und durch das Objektiv geführten mindestens einen zweiten Lichtblatts zur Beleuchtung der Probe aus einer sich von der ersten Richtung unterscheidenden mindestens einen zweiten Richtung fokussiert. Im Ergebnis wird die Probe aus zwei Richtungen beleuchtet, wobei die Beleuchtung der Probe jeweils mit einem Lichtblatt erfolgt, wobei die Probe nicht bewegt werden muss, um beispielsweise dreidimensionale Bilderstapel aus den mindestens zwei Richtungen aufzunehmen. Die Bilder können in einem Post-Processing-Schritt verrechnet werden, um einen Bilderstapel mit ungefähr isotroper Auflösung zu erhalten.
Folglich sind mit dem erfindungsgemäßen Lichtblattmikroskop und dem erfindungsgemäßen Verfahren ein Lichtblattmikroskop und ein Verfahren angegeben, wonach hochauflösende Bilder einer Probe mit konstruktiv einfachen Mitteln, insbesondere ohne das Erfordernis der Bewegung einer Probe, realisierbar sind.
Bei einer konkreten Ausgestaltung eines Lichtblattmikroskops und mikroskopischen Verfahrens kann beispielsweise ein zweiter Beleuchtungs- und Detektionsstrahlen- gang in eine vorhandene Optik derart integriert werden, dass die Beleuchtungs- und die Detektionsrichtung jeweils vertauscht sind. Mit anderen Worten entspricht der Beleuchtungsstrahlengang des ersten Beleuchtungsstrahls dem Detektionsstrahlen- gang des zweiten Beleuchtungsstrahls und umgekehrt.
Bei dem probenseitigen Objektiv des Lichtblattmikroskops handelt es sich um ein Objektiv, welches sowohl zur Beleuchtung der Probe mit mindestens zwei Beleuchtungsstrahlen als auch zur Detektion des von diesen Beleuchtungsstrahlen erzeugten Detektionslichts, beispielsweise angeregtes Fluoreszenzlicht, dient.
Bei einer konkreten Ausführungsform des Lichtblattmikroskops können - beispiels- weise im Fall von zwei bereitgestellten Beleuchtungsstrahlen - die erste Richtung und die zweite Richtung mindestens zweier Beleuchtungsstrahlen senkrecht zueinander oder ungefähr senkrecht zueinander stehen. Grundsätzlich können die Beleuchtungsstrahlen in den Randbereich der Pupille oder der hinteren Brennebene des probenseitigen Objektivs gelenkt sein, um die erforderliche schräge Beleuchtung der Probe von der Seite aus zu gewährleisten. Falls die Apertur des probenseitigen Objektivs nicht dazu ausreicht, um die Beleuchtungsstrahlen in einem Winkel von 90° gegeneinander in das Probenvolumen einzustrahlen, können die erste Richtung und die zweite Richtung auch nicht senkrecht zueinander sondern in einem kleineren Winkel zueinander stehen.
Im Hinblick auf eine besonders sichere Detektion eines Detektionslichts kann die Detektionseinrichtung einen ersten Sensor für durch den ersten Beleuchtungsstrahl verursachtes und entlang einem ersten Detektionsstrahlengang im Objektiv verlaufendes erstes Detektionslicht und mindestens einen zweiten Sensor für durch den mindestens einen zweiten Beleuchtungsstrahl verursachtes und entlang mindestens einem zweiten Detektionsstrahlengang im Objektiv verlaufendes mindestens zweites Detektionslicht aufweisen. Insoweit kann für jedes durch einen jeweiligen Beleuchtungsstrahl verursachtes Detektionslicht ein eigener Sensor bereitgestellt sein, um dann genau dieses Detektionslicht, das entlang seinem individuellen Detekti- onsstrahlengang verläuft, zu detektieren. Dabei können die Strahlengänge dazu geeignet und/oder eingerichtet sein, zu einer optischen Achse schräge Bildebenen aufzurichten. Durch die Realisierung derartiger mehrerer Sensoren für mehrere Detektionslichter ist weiterhin ein besonders individueller Betrieb - je nach Erfordernis - ermöglicht, da ausgewählt werden kann, welche Beleuchtungsstrahlen erzeugt und verarbeitet werden sollen. Hierdurch ist eine besonders hohe Flexibilität beim Gebrauch des Lichtblattmikroskops gewährleistet.
Die Beleuchtungseinrichtung kann bei einem konkreten Ausführungsbeispiel zur gleichzeitigen Bereitstellung des ersten Beleuchtungsstrahls und des mindestens einen zweiten Beleuchtungsstrahls oder zur Bereitstellung des ersten Beleuchtungsstrahls und des mindestens einen zweiten Beleuchtungsstrahls zu unterschiedlichen Zeitpunkten, vorzugsweise alternierend oder in einer vorgebbaren Abfolge, ausgebildet sein.
Alternativ oder zusätzlich hierzu kann die Detektionseinrichtung oder können die Sensoren der Detektionseinrichtung zur gleichzeitigen Detektion des ersten Detek- tionslichts und des mindestens einen zweiten Detektionslichts oder zur Detektion des ersten Detektionslichts und des mindestens einen zweiten Detektionslichts zu unterschiedlichen Zeitpunkten, vorzugsweise alternierend oder in einer vorgebbaren Abfolge, ausgebildet sein. Nicht nur durch eine vorgebbare zeitliche Abfolge der Bereitstellung der Beleuchtungsstrahlen sondern auch durch eine vorgebbare Abfolge der Detektionsfunktion der Detektionseinrichtung oder der Sensoren kann eine besonders hohe Flexibilität und Anpassung an unterschiedliche Erfordernisse und Untersuchungsmethoden mit dem erfindungsgemäßen Lichtblattmikroskop erreicht werden. In einer einfachen Situation kann eine Aufnahme von Bildern derart realisiert werden, dass der Beleuchtungsstrahl so geschaltet wird, dass zu einem ersten Zeitpunkt der erste Strahlengang zur Beleuchtung genutzt wird und ein erster Sensor ein Bild aufnimmt und anschließend - zu einem zweiten Zeitpunkt - ein zweiter Beleuchtungsstrahlengang aktiviert und mit einem zweiten Sensor ein Bild aus beispielsweise annähernd orthogonaler Richtung aufgenommen wird.
Bei einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung des Lichtblattmikroskops kann im Strahlengang vor der Detektionseinrichtung oder vor mindestens einem Sensor ein Emissionsfilter, Bandpassfilter oder Filter für das erste und/oder das mindestens eine zweite Detektionslicht angeordnet sein. Derartige Emissionsfilter können in verschiedenen Ausprägungen implementiert werden, wobei beispielsweise ein Prisma oder ein Gitter eingesetzt werden kann. Dabei kann ein Emissionsfilter, Bandpassfilter oder Filter in einem Strahlengang positioniert werden, der mindestens einem der Sensoren nicht zugeordnet ist. Mit anderen Worten wird das Licht in dem Strahlengang, in dem sich der Filter befindet, auf nnindestens einen Sensor abgebildet und auf nnindestens einen anderen Sensor nicht abgebildet. Derartige Filter sind üblicherweise in einem Unendlich-Strahlengang angeordnet, also in einem Strahlengang, in dem das Detektionslicht weder fokussiert noch divergent verläuft, sondern kollimiert ist.
Im Hinblick auf eine konstruktiv besonders einfache Ausgestaltung des Lichtblattmikroskops kann die Beleuchtungseinrichtung einen Dichroiten, ein Galvanometer, planparallele Glasblöcke, Lichtleitfasern oder ein polarisationsdrehendes Element mit einem polarisationsabhängigen Strahlteiler zur Einkopplung der Beleuchtungsstrahlen in einen Beleuchtungsstrahlengang aufweisen. Je nach Anwendungsfall kann eine für diesen Anwendungsfall besonders geeignete Einkopplungstechnik verwendet werden. Bei einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung kann die Detektionseinrichtung Mittel zum Zusammenführen von durch den ersten Beleuchtungsstrahl verursachtem und entlang einem ersten Detektionsstrahlengang im Objektiv verlaufendem ersten Detektionslicht und von durch den mindestens einen zweiten Beleuchtungsstrahl verursachtem und entlang mindestens einem zweiten Detektionsstrahlengang im Ob- jektiv verlaufendem mindestens zweitem Detektionslicht auf einen Sensor aufweisen. Dabei wird Detektionslicht aus unterschiedlichen Detektionsstrahlengängen auf ein und denselben Sensor geführt. Bei dieser Ausgestaltung ist es also nicht erforderlich, jedem Detektionsstrahlengang einen separaten Sensor zuzuordnen. Grundsätzlich kann das mindestens eine zweite Detektionslicht mit geeigneten optischen Mitteln auf einen Sensor oder den ersten Sensor umgelenkt werden, so dass kein weiterer Sensor erforderlich ist. Dieser Umlenkaufwand kann günstiger sein, als die Realisierung eines oder mehrerer weiterer Sensoren, und zwar einerseits in Bezug auf System-Kosten und andererseits in Bezug auf einen erforderlichen Justage- und Kalibrations-Aufwand bezüglich der möglichen weiteren Sensoren oder Kameras. Dabei ist insbesondere zu berücksichtigen, dass es meist recht aufwändig ist, mehrere Sensoren oder Kameras aufeinander abzustimmen, auch weil sie sich meist in ihrer Performance voneinander unterscheiden. Das Führen oder Umlenken des mindestens einen zweiten Detektionslichts auf einen oder den ersten Sensor bietet sich beispielsweise an, wenn eine Detektion des Detektionslichts unterschiedlicher Beleuchtungsstrahlen alternierend erfolgen soll. Detektionslicht aus unterschiedlichen Detektionsstrahlengängen kann auch nebeneinander auf ein und denselben Sensor geführt werden. Im Hinblick auf eine besonders sichere Erzeugung hochauflösender Bilder einer Probe kann die Beleuchtungseinrichtung Mittel zur Verschiebung des ersten Lichtblatts und/oder des mindestens einen zweiten Lichtblatts zur Erzeugung von Bilderstapeln aus vorzugsweise parallel zueinander liegenden Bildebenen aufweisen und kann der Detektionseinrichtung eine Auswerteeinrichtung zur Verarbeitung der Bil- derstapel zugeordnet sein.
Bei einer weiter konkreten Ausführungsform können der erste Beleuchtungsstrahl und der mindestens eine zweite Beleuchtungsstrahl durch ein einziges gemeinsames optisches Element entlang einer zur optischen Achse des Objektivs senkrechten Richtung durch die Probe scanbar sein, wobei vorzugsweise dieses optische Element zum Entscannen von über dieses optische Element zurückgeführtem Detektionslicht einsetzbar ist. Ein derartiges optisches Element kann beispielsweise einen Kippspiegel oder ein Galvanometer aufweisen. Bei dem Entscannen kann die veränderliche Position der Beleuchtungsebene in der Probe auf einen ortsfesten Sensor abgebildet werden.
Des Weiteren ist ein mikroskopisches Verfahren mit einem Lichtblattmikroskop angegeben, gekennzeichnet durch die Schritte: Aufnehmen von Bildern einer Probe, wobei der Winkel zwischen den Bildebenen und der optischen Achse idealerweise gleich ist und der Winkel zwischen den Bildebenen idealerweise 90° beträgt, Erzeugen von Bilderstapeln von Bildern idealerweise parallel zueinander liegender Ebenen und Fusion der Bilderstapel beispielsweise durch eine Multiview-Entfaltung.
Es gibt nun verschiedene Möglichkeiten, die Lehre der vorliegenden Erfindung in vorteilhafter Weise auszugestalten und weiterzubilden. Dazu ist einerseits auf die nachgeordneten Ansprüche und andererseits auf die nachfolgende Erläuterung bevorzugter Ausführungsbeispiele der Erfindung anhand der Zeichnung zu verweisen. In Verbindung mit der Erläuterung der bevorzugten Ausführungsbeispiele der Erfindung anhand der Zeichnung werden auch im Allgemeinen bevorzugte Ausgestal- tungen und Weiterbildungen der Lehre erläutert. In der Zeichnung zeigen Fig. 1 in einer schematischen Darstellung einen Strahlengang in einem Lichtblattmikroskop gemäß einem Ausführungsbeispiel der Erfindung, wobei der Strahlengang zum einen in der y-z-Ebene und zum anderen in der x-z-Ebene gezeigt ist,
Fig. 1 a in einer schematischen Darstellung ein Ausführungsbeispiel mit drei
Aufrichtungseinheiten, Fig. 2 in einer schematischen Darstellung zwei Möglichkeiten der Einkopplung zweier Beleuchtungsstrahlen,
Fig. 3a, b, c in schematischen Darstellungen einen Strahlengang in einem Lichtblattmikroskop gemäß weiterer Ausführungsbeispiele,
Fig. 4 in einer schematischen Darstellung einen Strahlengang in einem Lichtblattmikroskop gemäß einem weiteren Ausführungsbeispiel,
Fig. 5 in einer schematischen Darstellung eine Bildaufnahme zum gleichen
Zeitpunkt bei Emissionen mit unterschiedlichen Wellenlängen,
Fig. 6 bis 8 in schematischen Darstellungen Strahlengänge, Beleuchtungswinkel und Aperturen für Beleuchtungsobjektive mit NA = 1 ,2, 1 ,1 und 1 ,0.
Fig. 1 zeigt in einer schematischen Darstellung einen Strahlengang in einem Lichtblattmikroskop gemäß einem ersten Ausführungsbeispiel der Erfindung. Dabei ist der Strahlengang in der oberen Hälfte der Fig. 1 in einer y-z-Ebene und in der unteren Hälfte der Fig. 1 in einer x-z-Ebene gezeigt. Das Ausführungsbeispiel umfasst ein probenseitiges erstes Objektiv 1 mit einer optischen Achse 2, wobei ein erster Beleuchtungsstrahl 3 zu einem Zeitpunkt 1 erzeugt wird, der zur Bildung eines schräg zu der optischen Achse 2 des Objektivs 1 geneigten und durch das Objektiv 1 geführten ersten Lichtblatts in einer ersten Bildebene 28 zur Beleuchtung einer Probe aus einer ersten Richtung fokussiert ist. Des Weiteren ist die Beleuchtungseinrichtung zur Bereitstellung eines zweiten Beleuchtungsstrahls 4 zu einem Zeitpunkt 2 ausgebildet, wobei der zweite Beleuchtungsstrahl 4 zur Bildung eines schräg zu der optischen Achse 2 des Objektivs 1 geneigten und durch das Objektiv 1 geführten zweiten Lichtblatts in einer zweiten Bildebene 29 zur Beleuchtung der Probe aus einer sich von der ersten Richtung unterscheidenden zweiten Richtung fokussiert ist.
Die Detektionseinrichtung weist einen ersten Sensor 5 für durch den ersten Beleuchtungsstrahl 3 verursachtes und entlang einem ersten Detektionsstrahlengang im Objektiv 1 verlaufendes erstes Detektionslicht 21 und einen zweiten Sensor 6 für durch den zweiten Beleuchtungsstrahl 4 verursachtes und entlang einem zweiten Detektionsstrahlengang im Objektiv 1 verlaufendes zweites Detektionslicht 22 auf. Eine Verschiebung der Lichtblätter entlang der y-Richtung erfolgt mittels eines Galvanometers 7 um einen Bilderstapel aus parallel zueinander liegenden Bildebenen zu erzeugen. Die Einkopplung der Beleuchtungsstrahlen 3, 4 erfolgt über einen Dichroiten 8.
Durch ein zweites Objektiv 9 wird ein Luftbild vom ersten und zweiten Detektionslicht 21 und 22 erzeugt. Wie weiter oben beschrieben erzeugt das vom ersten Beleuchtungsstrahl 3 verursachte Detektionslicht 21 ein Luftbild in einer Bildebene, welches durch eine senkrecht auf dieser Bildebene stehende erste Detektionsoptik (umfassend ein drittes Objektiv 10 und eine Tubuslinse 24) auf den ersten Sensor 5 abgebildet wird. Darüber hinaus wird auch vom zweiten Detektionslicht 22 ein zweites Luftbild in einer zweiten Bildebene erzeugt, das an der optischen Achse 23 des Objektivs 9 gespiegelt ist. Dieses Luftbild wird durch eine senkrecht auf dieser zweiten Bildebene stehende zweite Detektionsoptik (umfassend ein viertes Objektiv 1 1 und eine Tubuslinse 25) auf einen zweiten Sensor 6 abgebildet. Zusammenfassend werden die Luftbilder durch Detektionssysteme aufgefangen und aberrationsfrei auf Sensoren 6 und 5 abgebildet, wobei die Detektionssysteme für das erste und das zweite Luftbild zueinander an der optischen Achse des Objektivs 9 „gespiegelt" liegen. Es wäre zwar alternativ möglich (bei NichtVerwendung einer zweiten Detektionsoptik), das System bestehend aus dem dritten Objektiv 10, einer Tubuslinse 24 und dem Sensor 5 um die optische Achse 23 des zweiten Objektivs 9 zu drehen, jedoch ist dies aufgrund der erforderlichen Präzision bei den Abmessungen und der Masse der zu bewegenden Bauteile sehr aufwändig und fehleranfällig. Der Vorteil, ein zweites Detektionssystem mit einem zweiten Sensor 6 zur Detektion der Bilder aus der zweiten Richtung aufzubauen, wie dies in Fig. 1 dargestellt ist, liegt auch darin, dass Bilder aus der ersten und der zweiten Richtung gleichzeitig oder innerhalb einer sehr kurzen Zeitspanne aufgenommen werden können, was bei einer mechanischen Rotation des gesamten Detektionssystems nicht denkbar wäre. Die Einkopplung von Beleuchtungslicht kann auch über einen oder mehrere dichroitische Spiegel zwischen den dritten Objektiven 10, 1 1 und/oder den Tubuslinsen 24, 25 erfolgen. In diesem Fall ist kein dichroitischer Spiegel zwischen Galvanometer 7 und zweitem Objektiv 9 notwendig.
Mit dem in Fig. 1 dargestellten Ausführungsbeispiel ist eine einfache Aufnahme von Bilderstapeln möglich, wobei hier ein Verkippen eines in einer hinteren Brennebene des probenseitigen Detektionsobjektivs 1 liegenden Galvanometers 7 erfolgt. Alternativ hierzu kann auch das Verschieben des das Luftbild erzeugenden Objektivs 9 entlang seiner optischen Achse 23, beispielsweise mittels eines Piezo-Aktuators (SPIM nach Dunsby), die Erzeugung und Aufnahme von Bilderstapeln ermöglichen. Weiter alternativ hierzu kann einfach das Objekt relativ zum Objektiv 1 zum Erzeugen und Aufnehmen von Bilderstapeln verschoben werden, vorzugsweise entlang der Y- Achse. Die Vorteile der ersten beiden Varianten liegen darin, dass das Objekt nicht bewegt werden muss. Die letzte Variante ist optisch einfacher und auch günstiger umzusetzen.
Fig. 1 zeigt des Weiteren eine Steuereinheit 12, die beispielsweise durch eine Recheneinrichtung, einen Computer oder dergleichen gebildet sein kann, wobei die Steuereinheit 12 zur Übernahme mehrerer Aufgaben ausgebildet sein kann. Dabei kann es sich beispielsweise um die Steuerung der Aktorik zum relativen Versatz von Beleuchtungs-/Detektionsebene relativ zum Objekt handeln, wobei die drei dazu besonders vorteilhaften Verfahren oben beschrieben sind. Des Weiteren kann die Steuereinheit 12 - alternativ oder zusätzlich - beispielsweise das Auslesen und Verarbeiten der Bilder der Sensoren 5, 6 beziehungsweise der Sensorelemente, siehe Fig. 3c, durchführen. Alternativ oder zusätzlich hierzu kann die Steuereinheit 12 das Verrechnen der Bilder zu einem 3D-Bilderstapel, beispielsweise ein Bilderstapel gemäß Fig. 5, beispielsweise mittels Multi-View-Deconvolution, durchführen.
Grundsätzlich ist ein erfindungsgemäßes Lichtblattmikroskop auch mit mehr als zwei derartigen Aufrichtungseinheiten 26 und 27 denkbar, die hier gemäß Fig. 1 die Elemente 5, 24 und 10 bzw. 6, 25 und 1 1 aufweisen. Mit drei Einheiten könnten diese dann so angeordnet sein, dass die optischen Achsen jeweils in Winkeln von 120° zueinander stehen, wobei jeweilige Fokusebenen parallel zu den Oberflächen eines Tetraeders liegen können, siehe hierzu Fig. 1 a. In diesem Fall könnte ein Galvanometer oder Galvanometerspiegel als vorzugsweise kardanischer 2-Achsen- Galvanometer ausgeführt sein, um die in verschiedene Richtungen orientierten Objektive bedienen zu können. Eine weitere Alternative besteht in vier paarweise gegenüberliegenden Objektiven. Deren Vorteil besteht darin, dass jeweils zwei gegenüberliegende Richtungen gleichzeitig bedient werden können. Durch mehr als zwei gegenüberliegende Objektive lässt sich die Auflösung des Systems allerdings nur geringfügig steigern, da der Hauptvorteil der Fusion oder Zusammenführung von Aufnahmen aus mehreren Richtungen darin besteht, zwei vorzugsweise senkrecht zueinander orientierte Bilderstapel zu verrechnen, so dass jeweils anstelle der - schlechteren - axialen Auflösung in einem Bilderstapel die - bessere - laterale Auflösung des anderen Bilderstapels verwendet werden kann. Der Hauptvorteil der Beleuchtung und der Detektion aus mehr als zwei Richtungen besteht in der Möglichkeit der Reduzierung von Abschattungseffekten, die durch streuende und/oder absorbierende Teile in der Probe entstehen können. Ein Verfahren zur Aufnahme von Bildern kann derart ausgestaltet sein, dass ein erster Beleuchtungsstrahl 3 zu einem ersten Zeitpunkt zur Beleuchtung der Probe genutzt wird und ein Sensor 5 ein entsprechendes Bild auffängt/aufnimmt. Danach wird ein zweiter Beleuchtungsstrahlengang mit einem zweiten Beleuchtungsstrahl 4 aktiviert, wobei mit einem zweiten Sensor 6 ein Bild aus annähernd orthogonaler Richtung zu einem zweiten Zeitpunkt aufgenommen wird.
Derartige Bilder können auch zeitgleich oder im selben Zeitraum aufgenommen werden, wenn in der Probe unterschiedliche Farbstoffe mit Licht aus Beleuchtungsstrahlen 3 und 4 mit unterschiedlichen Wellenlängen angeregt werden. Dabei ist es vorteilhaft, wenn die Emissionsspektren der Farbstoffe oder Fluorophore möglichst wenig gegenseitig und mit den Anregungswellenlängen der Beleuchtungsstrahlen 3 und 4 überlappen. In weiter vorteilhafter Weise können vor den Sensoren 5 und 6 Emissionsfilter, Bandpassfilter oder Filter positioniert werden, die jeweils Bereiche aus den Bereichen der Spektren der Fluorophore oder Farbstoffe ausschneiden, in denen weder das jeweils andere Fluorophor Licht abstrahlt noch das zu dessen Anregung verwendete Licht liegt. In diesen Fällen kann man zeitglich aus zwei Richtungen messen. Zur Aufnahme von 3D-Volumina bestehen im Wesentlichen zwei Möglichkeiten. Für die Abbildung eines Farbstoffs können Bilder von parallel zueinander liegenden Ebenen aus einer Richtung nacheinander durch Verkippen des Galvanometers 7 aufgenommen werden. Anschließend wird die Beleuchtung umgeschaltet und mit dem zweiten Sensor 6 ein Bilderstapel aus der anderen Richtung aufgenommen. Dies kann entweder auf dem„Rückweg" des Galvanometers passieren, wobei ein Zick- Zack-Steuersignal an den Galvanometer gesendet wird, oder in der gleichen Richtung, wobei ein Sägezahn-Signal an den Galvanometer gesendet wird. Für das Zurückfahren an den Startpunkt kann eine Pause - wenige Millisekunden - in der Bildaufnahme vorgesehen sein. Alternativ kann auch die Beleuchtung so schnell geschaltet werden, dass für jede Winkelposition des Galvanometers 7 aus zwei Richtungen Bilder der Probe aufgenommen werden. Die Bewegung des Galvanometers 7 kann dabei schrittweise erfolgen, in vorteilhafter Weise jedoch kontinuierlich mit einer Geschwindigkeit, die ein Verwaschen des Bilds durch die Relativbewegung von abgebildeter Ebene gegenüber der Probe während der Belichtungszeit vermeidet, d. h. die Bewegung beträgt deutlich weniger als die effektive Schärfentiefe der Detektion. Ob der erste oder der zweite Modus bevorzugt wird, liegt im Wesentlichen daran, wie schnell die Schaltung beziehungsweise die Umschaltung der Beleuchtung vorgenommen werden kann. Werden schnelle und verschleißfreie Schalter verwendet, kann der zweite Modus in vorteilhafter Weise verwendet werden. Ansonsten stellt der erste Modus eine einfache Alternative dar.
Gemäß dem Ausführungsbeispiel aus Fig. 1 werden die Beleuchtungsstrahlen 3 und 4 über einen Dichroiten 8 zwischen dem Galvanometer 7 und dem zweiten Objektiv 9 eingekoppelt. Im Gegensatz zur Realisierung und Darstellung gemäß dem Ausführungsbeispiel in Fig. 1 ist es jedoch besonders vorteilhaft, die Beleuchtungsstrahlen 3 und 4 über den Dichroiten 8 in den Strahlengang zu reflektieren und nicht zu transmittieren. In entsprechender Weise würde dann das Bild oder Detek- tionslicht transmittiert und nicht - wie in Fig. 1 dargestellt - reflektiert. Zur Schaltung der Beleuchtung kann ein weiterer Aktuator notwendig sein, der den notwendigen parallelen Strahlenversatz der Beleuchtungsstrahlen 3 und 4 erzeugen kann. Dabei ist es leidglich erforderlich, dass ein Beleuchtungsstrahl vorzugsweise abwechselnd an zwei Positionen bereitgestellt werden kann. Daher erscheint eine Ausführung mit einenn kontinuierlich arbeitenden Bauteil wie beispielsweise einenn Galvanometer oder einer Wackelplatte nicht unbedingt erforderlich, würde aber eine flexible Justage der Position, insbesondere Verkippung, des Lichtblatts in Abhängigkeit des Brechungsindex der Probe direkt mitberücksichtigen können. Gemäß Fig. 2 ist an der oberen Position a) ein weiteres Ausführungsbeispiel einer Einrichtung zum Bereitstellen zweier Beleuchtungsstrahlen 3, 4 an zwei unterschiedlichen Positionen gezeigt. Dabei können ein oder mehrere planparallele Glasblöcke 34 in den Strahlengang 33 der Lichtquelle eingebracht werden, die den Strahl jeweils in den einen oder anderen Strahlengang umlenken um die zwei Beleuchtungsstrahlen 3, 4 zu erzeugen. Lediglich durch Drehen eines Glasblockes 34 kann der Umschaltvorgang realisiert werden.
Alternativ hierzu zeigt Fig. 2 bei b) eine Kombination aus einem schnellen polarisa- tionsdrehenden Element 35 wie beispielsweise einem EOM (Elektrooptischer Modulator) und einem polarisationsabhängigen Strahlteiler 36 in dem Strahlengang 33 der Lichtquelle. Je nach Polarisation des Lichtstrahls erfolgt eine Reflexion durch den polarisationsabhängigen Strahlteiler an der einen oder an der anderen Position. Um die so erzeugten zwei Beleuchtungsstrahlen 3, 4 zur besseren weiteren Verwendung parallel auszurichten, kann optional beispielsweise ein nachgeschalteter Spiegel 37 benutzt werden.
Alternativ hierzu könnten zwei Lichtleitfasern an geeigneter Position angeordnet werden, wobei das Licht zwischen den Fasern mit einem schnellen Schalter umgeschaltet werden kann.
Alternativ hierzu - beispielsweise wenn kein Strahlteiler zwischen dem zweiten Objektiv 9 und dem Galvanometer 7 eingebracht werden kann oder soll - können auch Dichroite in den Aufrichtungseinheiten 26 und 27 verwendet werden. Die Fig. 3a, b und c zeigen weitere Ausführungsbeispiele eines Strahlengangs in einenn Lichtblattmikroskop, wobei zwei unterschiedliche Detektionsstrahlengänge vereinigt werden, um sie auf einem einzigen Sensor 5 abbilden zu können. Für Elemente der Figuren, die mit derselben Bezugsziffer wie entsprechende Elemente in Fig. 1 bezeichnet sind, sei auf die Figurenbeschreibung zu Fig. 1 verwiesen. Die Tubuslinse 43 kann dabei auch doppelt ausgeführt jeweils in den beiden Strahlengängen angeordnet sein. Anstatt der hier gezeigten Spiegel 40, 41 , 42 können beispielsweise auch dichroitische Würfel mit Langpass- oder Kurzpassfiltern verwendet werden, wenn gleichzeitig mit zwei Farben detektiert wird.
Zur wechselnden Führung der Detektionsstrahlengänge auf den Sensor 5 werden im Ausführungsbeispiel in Fig. 3a unter anderem ein Kippspiegel 39 und weitere Spiegel 40, 41 sowie eine Tubuslinse 43 verwendet. Der Kippspiegel kann zwei Ausrichtungen (Spiegelstellungen) einnehmen, die dadurch definiert sind, dass bei der ersten Spiegelstellung (zu einem Zeitpunkt 1 ) das erste Detektionslicht 21 über einen ersten Detektionsstrahlengang und im Fall der zweiten Spiegelstellung (zu einem Zeitpunkt 2) das zweite Detektionslicht 22 über einen zweiten Detektionsstrahlengang zum Sensor 5 gelangt. Die Zeitpunkte müssen so gewählt sein, dass sie mit den Zeitpunkten der Beleuchtung mittels der Beleuchtungsstrahlen 3, 4 geeignet korrespondieren, also so festgelegt sind, dass Detektionslicht erzeugt durch den Beleuchtungsstrahl 3 bei einer der beiden Spiegelstellungen des Kippspiegels 39 zum Sensor 5 gelangt und Detektionslicht erzeugt durch den Beleuchtungsstrahl 4 bei der anderen Spiegelstellung. Im in Fig. 3b gezeigten Ausführungsbeispiel hingegen wird vereinfachend ein fixes Spiegelsystem (ausgebildet durch die Spiegel 40, 41 , 42) benutzt. Dieses hat im Vergleich zum Ausführungsbeispiel aus Fig. 3a den Nachteil, dass es hier potentiell zu störenden Artefakten bei der Detektion bzw. zu einer geringeren Bildqualität kommen kann, unter anderem wegen der nichtidealen Abbildung, da immer beide Detektionsstrahlengänge offen sind.
Die Abbildung (über die Spiegel 39, 40, 41 , 42 und die Linse 43) erfolgt im Fall der in Fig. 3a und 3b gezeigten Ausführungsbeispiele zu zwei Detektionszeitpunkten, beispielsweise abwechselnd, auf den gleichen Bereich des Sensors 5. Die Strahlengänge für die beiden Ansichten können aber auch so ausgeführt sein, dass die Bilder nebeneinander versetzt auf dem Sensor 5 liegen. Ein entsprechendes Ausführungsbeispiel ist in Fig. 3c gezeigt.
Die Darstellung des Detektionsstrahlengangs zwischen probenseitigem Objektiv 1 und Objektiv 9 ist in den Figuren 3a, 3b, 3c vereinfacht ohne Galvanometer 7 und Linse 31 dargestellt. Die Scan-Aktorik (Galvanometer-Spiegel) und/oder eine beliebige Zahl telezentrischer optischer Abbildungssysteme kann an der gekennzeichneten Stelle 45 eingefügt werden. Zur Abbildung von Volumina kann ein optisches System wie in Figur 1 gezeigt verwendet werden oder das Objektiv 9 kann mechanisch entlang seiner optischen Achse verschiebbar montiert sein.
Fig. 4 zeigt ein weiteres Ausführungsbeispiel eines Strahlengangs in einem Lichtblattmikroskop, wobei diese Ausführung auf die Vermeidung einer sterischen Kollision bei einer Realisierung mit dritten Objektiven 10, 1 1 mit hoher numerischer Apertur ausgerichtet ist. Die Darstellung ist analog zu den Figuren 3a, 3b, 3c vereinfacht ohne Galvanometer realisiert. Ähnlich wie in Fig. 3a wird hier ein schaltbarer Spiegel verwendet, allerdings wird dieser dazu benutzt, den Detektionspfad schon vor einem das Luftbild erzeugenden Objektiv (Objektiv 9 in den anderen Ausführungsbeispielen) aufzuspalten. Die Spiegel 50, 51 dienen bei diesem Ausführungsbeispiel nur der Kompaktheit des Aufbaus. Die Objektive 52 und 53 übernehmen die Funktion des Objektives 9 aus den vorherigen Ausführungsbeispielen. Wie auch in den vorherigen Beispielen kann die Scan-Aktorik (Galvanometer-Spiegel) und/oder eine beliebige Zahl telezentrischer optischer Abbildungssysteme beispielsweise an der gekennzeichneten Stelle 45 eingefügt werden. Auch in diesem Ausführungsbeispiel entsprechen Elemente, die mit denselben Bezugsziffern wie in Fig. 1 bezeichnet sind, den in Fig. 1 gezeigten Elementen.
Fig. 5 zeigt in einer schematischen Darstellung eine Scanbewegung, bei der unter- schiedliche Farbstoffe 1 und 2 mit unterschiedlichen Wellenlängen zur Emission von Detektionslicht mit ebenfalls unterschiedlichen Wellenlängen angeregt werden. Dabei werden zu aufeinanderfolgenden Zeitpunkten jeweils immer beide Beleuchtungsstrahlen 3, 4 gleichzeitig zur Probe geleitet, wodurch die in der Probe enthaltenen unterschiedlichen Farbstoffe 1 und 2 zum selben Zeitpunkt zur Emission von Detektionslicht 21 , 22 angeregt werden. Ein derart (beispielsweise mit einem Aufbau, wie er in Fig. 1 gezeigt ist) erzeugtes und aufgefangenes Detektionslicht 21 , 22 von beiden Farbstoffen kann nach und nach von Zeitpunkt 1 bis Zeitpunkt n zu einem Bilderstapel verarbeitet werden, wie dies im unteren Teil der Fig. 5 gezeigt ist. Auch hier entsprechen Elemente der Figur, die mit denselben Bezugsziffern wie in Fig. 1 bezeichnet sind, den in Fig. 1 gezeigten Elementen.
Die Fig. 6 bis 8 zeigen die Strahlgänge, Beleuchtungswinkel und Aperturen für Beleuchtungsobjektive mit einer numerischen Apertur NAw = 1 ,2 (Fig. 6), 1 , 1 (Fig. 7) und 1 ,0 (Fig. 8) in Wasser (Brechungsindex n = 1 ,33), wobei jeweils zwei beispielhafte Varianten für den Strahlverlauf, einmal bei Detektion senkrecht zum Lichtblatt, und einmal bei nichtsenkrechter Detektion, eingezeichnet sind. In den Zeichnungen sind die für die folgenden Betrachtungen relevanten Winkel eingetragen, wobei sich Variablennamen, die das Zeichen„a" beinhalten, auf halbe Öffnungswinkel beziehen, während Variablennamen mit dem Zeichen „ß" Winkel zur optischen Achse 2 kennzeichnen. Bei den Indizes werden mit„S" Winkel gekennzeichnet, die sich auf senkrechte Detektion beziehen, und mit „D" Winkel, die bei nichtsenkrechter Detektion auftreten.
Typischerweise wird das durch den Beleuchtungsstrahl 3 generierte Lichtblatt gegen die optische Achse 2 um einen Winkel ßi_s verkippt. Der Winkel ai_s entspricht dem halben Öffnungswinkel des Beleuchtungsstrahls 3 bei einer numerischen Apertur NA = n sin(ai_s). Wie oben geschrieben, werden jeweils zwei Strahlgänge 60, 61 für die senkrechte und 62, 63 und die nichtsenkrechte Detektion eingezeichnet, wobei die Hauptstrahlen 61 und 63 gestrichelt gezeichnet sind und jeweils ein Randstrahl 60, 62 eingezeichnet ist. Mit 60, 61 ist ein Strahlengang gezeigt, der eine Detektion senkrecht zur Beleuchtung garantiert und bei dem die Randstrahlen 60 symmetrisch um den Hauptstrahl 61 angeordnet verlaufen. Der Hauptstrahl 61 ist dann um den Winkel ßs = 90°- ßi_s gegen die optische Achse verkippt. Die symmetrische (sagittale) Apertur für den senkrechten Fall ergibt sich dann aus NAS = n sin(as) mit as = aobj - ßs, wobei aobj der halbe Öffnungswinkel des probenseitigen Objektives ist. Tabelle 1 :
Figure imgf000019_0001
Wie in Fig. 6 zu sehen ist kann bei einer hohen Apertur des Objektivs von NAw = 1 ,2 mit hoher numerischer Apertur von bis zu NAd.max = 0,75 detektiert werden. Allerdings kann in diesem Fall keine zwei Objektive 10, 1 1 auf der gegenüberliegenden Seite angebracht werden, da die beiden Objektive kollidieren würden. In Fig. 7 und 8, also bei Objektiven mit NAw = 1 , 1 und NAw = 1 ,0 bestehen keine Kollisionsprobleme, allerdings wird durch die symmetrische Nutzung des Objektivs und die senkrechte Ausrichtung auf dem Lichtblatt mögliche Apertur verschenkt. In Fig. 8 sieht man, dass eine praxisferne Detektionsapertur von 0,07 bleibt.
Daher ist in ein alternativer Strahlgang 62, 63 gezeigt, der einerseits die Detektionsapertur maximal nutzt und andererseits noch zusätzlich 5° Raumwinkel zur optischen Achse freihält, um zwei Objektive montieren zu können (also zur Vermeidung der weiter oben diskutierten sterischen Kollision). Daraus folgt ßD = CID - 5°. Die Werte sind in Tabelle 2 zusammengefasst. Die zur Vermeidung von Kollisionen der beiden zur Detektion der Luftbilder genutzten dritten und vierten Objektive 10, 1 1 maximal vorhaltbare numerische Apertur kann für NAw = 1 ,0 und NAw = 1 , 1 größer sein, als es zur Übertragung optischer Information notwendig wäre. In anderen Worten, die vom probenseitigen Objektiv 1 zur Detektion genutzte Teilapertur kann kleiner sein als die von den Objektiven 10, 1 1 , ohne dass es zur Kollision/Überschneidung der Objektive kommt. Zu beachten ist in diesem Fall, dass es durch die asymmetrische Nutzung der Pupille zu einer asymmetrischen numerischen Apertur bzw. Nutzung der Apertur kommt und daher auch die Auflösung asymmetrisch ist. Die dritten und vierten Objektive 10, 1 1 sind um den Winkel y = ßD + ßLS gegen die vom Lichtblatt beleuchtete Ebene verkippt. Während das dritte bzw. vierte Objektiv 10, 1 1 den Raumwinkel 2a3 bereit hält (in den Figuren entspricht dies dem Winkel zwischen dem Randstrahl 62 und der gestrichelten Linie 65), wird effektiv der Winkelbereich 2 o genutzt. Hierbei ist der halbe Öffnungswinkel 0:3 dieser Objektive gegeben durch den Verkippwinkel zwischen der optischen Achse 2 und dem Hauptstrahl 61 abzüglich des oben erwähnten Winkels zur Vermeidung der sterischen Kollision, also in diesem Beispiel 5°. Während für eine NA vom probenseitigen Objektiv 1 von 1 ,2 also das dritte und vierte Objektiv 10, 1 1 die effektive Detektionsapertur einschränken, ist diese für kleinere Werte der Apertur vom probenseitigen Objektiv 1 von 1 ,1 oder 1 ,0 nicht der Fall.
Tabelle 2:
Figure imgf000020_0001
Gemäß Fig. 6 sichert der Strahlverlauf 60, 61 die Detektion senkrecht zur Anregung. Der alternative Strahlverlauf 62, 63 ist dualview-kompatibel, d.h. es können zwei Objektive mit einem halben Öffnungswinkel CID um ßD verkippt gegen die optische Achse genutzt werden, um gegeneinander verkippte Luftbilder abzugreifen.
Hinsichtlich weiterer vorteilhafter Ausgestaltungen des erfindungsgemäßen Lichtblattmikroskops und des erfindungsgemäßen mikroskopischen Verfahrens mit einem Lichtblattmikroskop wird zur Vermeidung von Wiederholungen auf den allgemeinen Teil der Beschreibung sowie auf die beigefügten Ansprüche verwiesen.
Schließlich sei ausdrücklich darauf hingewiesen, dass die voranstehend beschriebenen Ausführungsbeispiele lediglich zur Erörterung der beanspruchten Lehre dienen, diese jedoch nicht auf die Ausführungsbeispiele einschränken.

Claims

A n s p r ü c h e
1. Lichtblattmikroskop mit einem probenseitigen Objektiv (1 ), mit einer Beleuch- tungseinrichtung zur Bereitstellung eines ersten Beleuchtungsstrahls (3), der zur
Bildung eines schräg zu einer optischen Achse (2) des Objektivs (1) geneigten und durch das Objektiv (1 ) geführten ersten Lichtblatts zur Beleuchtung einer Probe aus einer ersten Richtung fokussiert ist, und mit einer Detektionseinrichtung für durch das Objektiv (1) gelangendes Detektionslicht,
d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t, dass die Beleuchtungseinrichtung des Weiteren zur Bereitstellung mindestens eines zweiten Beleuchtungsstrahls (4) ausgebildet ist, der zur Bildung eines schräg zu der optischen Achse (2) des Objektivs (1) geneigten und durch das Objektiv (1 ) geführten mindestens einen zweiten Lichtblatts zur Beleuchtung der Probe aus einer sich von der ersten Richtung unterscheidenden mindestens einen zweiten Richtung fokussiert ist.
2. Lichtblattmikroskop nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die erste Richtung und die zweite Richtung mindestens zweier Beleuchtungsstrahlen (3, 4) senkrecht zueinander oder ungefähr senkrecht zueinander stehen oder die Be- leuchtungsstrahlen (3, 4) in den Randbereich der Pupille oder der hinteren Brennebene des probenseitigen Objektivs (1 ) gelenkt sind.
3. Lichtblattmikroskop nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Detektionseinrichtung einen ersten Sensor (5) für durch den ersten Beleuch- tungsstrahl (3) verursachtes und entlang einem ersten Detektionsstrahlengang im Objektiv (1) verlaufendes erstes Detektionslicht und mindestens einen zweiten Sensor (6) für durch den mindestens einen zweiten Beleuchtungsstrahl (4) verursachtes und entlang mindestens einem zweiten Detektionsstrahlengang im Objektiv (1) verlaufendes mindestens zweites Detektionslicht aufweist.
4. Lichtblattmikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Beleuchtungseinrichtung zur gleichzeitigen Bereitstellung des ersten Beleuchtungsstrahls (3) und des mindestens einen zweiten Beleuchtungsstrahls (4) oder zur Bereitstellung des ersten Beleuchtungsstrahls (3) und des mindestens einen zweiten Beleuchtungsstrahls (4) zu unterschiedlichen Zeitpunkten, vorzugsweise alternierend oder in einer vorgebbaren Abfolge, ausgebildet ist.
5. Lichtblattmikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekenn- zeichnet, dass die Detektionseinrichtung oder die Sensoren (5, 6) der Detektions- einrichtung zur gleichzeitigen Detektion des ersten Detektionslichts und des mindestens einen zweiten Detektionslichts oder zur Detektion des ersten Detektionslichts und des mindestens einen zweiten Detektionslichts zu unterschiedlichen Zeitpunkten, vorzugsweise alternierend oder in einer vorgebbaren Abfolge, ausgebildet ist oder sind.
6. Lichtblattmikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass im Strahlengang vor der Detektionseinrichtung oder vor mindestens einem Sensor (5, 6) ein Emissionsfilter, Bandpassfilter oder Filter für das erste und/oder das mindestens eine zweite Detektionslicht angeordnet ist.
7. Lichtblattmikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Beleuchtungseinrichtung einen Dichroiten (8), ein Galvanometer, planparallele Glasblöcke, Lichtleitfasern oder ein polarisationsdrehendes Element mit einem polarisationsabhängigen Strahlteiler zur Einkopplung der Beleuchtungsstrahlen (3, 4) in einen Beleuchtungsstrahlengang aufweist.
8. Lichtblattmikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Detektionseinrichtung Mittel zum Zusammenführen von durch den ersten Beleuchtungsstrahl (3) verursachtem und entlang einem ersten Detek- tionsstrahlengang im Objektiv (1) verlaufendem ersten Detektionslicht und von durch den mindestens einen zweiten Beleuchtungsstrahl (4) verursachtem und entlang mindestens einem zweiten Detektionsstrahlengang im Objektiv (1) verlaufendem mindestens zweitem Detektionslicht auf einen Sensor (5) aufweist.
9. Lichtblattmikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Beleuchtungseinrichtung Mittel zur Verschiebung des ersten Lichtblatts und/oder des mindestens einen zweiten Lichtblatts zur Erzeugung von Bilderstapeln aus vorzugsweise parallel zueinander liegenden Bildebenen aufweist und dass der Detektionseinrichtung eine Auswerteeinrichtung zur Verarbeitung der Bilderstapel zugeordnet ist.
10. Lichtblattmikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass der erste Beleuchtungsstrahl (3) und der nnindestens eine zweite Beleuchtungsstrahl (4) durch ein einziges gemeinsames optisches Element entlang einer zur optischen Achse (2) des Objektivs (1 ) senkrechten Richtung durch die Probe scanbar sind, wobei vorzugsweise dieses optische Element zum Entscan- nen von über dieses optische Element zurückgeführtem Detektionslicht einsetzbar ist.
1 1. Mikroskopisches Verfahren mit einem Lichtblattmikroskop, insbesondere mit einem Lichtblattmikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei ein erster Be- leuchtungsstrahl (3) mittels einer Beleuchtungseinrichtung bereitgestellt wird, der zur Bildung eines schräg zu einer optischen Achse (2) eines probenseitigen Objektivs (1 ) geneigten und durch das Objektiv (1 ) geführten ersten Lichtblatts zur Beleuchtung einer Probe aus einer ersten Richtung fokussiert wird, und wobei durch das Objektiv (1 ) gelangendes Detektionslicht mit einer Detektionseinrichtung detektiert wird, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t, dass des Weiteren mindestens ein zweiter Beleuchtungsstrahl (4) mittels der Beleuchtungseinrichtung bereitgestellt wird, der zur Bildung eines schräg zu der optischen Achse (2) des Objektivs (1) geneigten und durch das Objektiv (1) geführten mindestens einen zweiten Lichtblatts zur Beleuchtung der Probe aus einer sich von der ersten Richtung unterscheidenden min- destens einen zweiten Richtung fokussiert wird.
12. Mikroskopisches Verfahren mit einem Lichtblattmikroskop, insbesondere mit einem Lichtblattmikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 10, gekennzeichnet durch die Schritte:
- Aufnehmen von Bildern einer Probe, wobei der Winkel zwischen den Bildebenen und der optischen Achse idealerweise gleich ist und der Winkel zwischen den Bildebenen idealerweise 90° beträgt,
- Erzeugen von Bilderstapeln von Bildern idealerweise parallel zueinander liegender Ebenen und
- Fusion der Bilderstapel beispielsweise durch eine Multiview-Entfaltung.
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