WO2021215248A1 - 蛍光観察装置、蛍光観察システム及び蛍光観察方法 - Google Patents

蛍光観察装置、蛍光観察システム及び蛍光観察方法 Download PDF

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Definitions

  • Multicolored fluorescence images used for fluorescence observation, etc. are being promoted. In order to make it easier to distinguish each color in such a fluorescence image, it is necessary to improve the resolution of fluorescence detection.
  • An object of the present disclosure is to provide a fluorescence observation device, a fluorescence observation system, and a fluorescence observation method capable of improving the resolution of fluorescence detection.
  • a confocal fluorescence microscope that acquires an image or the like by staining a sample with a plurality of phosphors, but this is detected on the premise that a plurality of phosphors bind to a specific target at the same ratio. It is not used for the purpose, and the configuration in which the focal position of each excitation light is different is not used.
  • a point light source is formed by a composite phosphor composed of two or more types of fluorescent molecules with known allocations.
  • a molecule in which fluorescent molecules are chemically bonded at a specific composition ratio is used.
  • the biological sample 5 labeled with the composite phosphor has the excitation fluorescence characteristics of both the fluorescent molecule A and the fluorescent molecule B at the same position (point) on the biological sample 5.
  • the fluorescence observation device 1 includes an irradiation unit 10, a detection unit 20, and a control device 30.
  • the XYZ coordinate system is shown.
  • the Z-axis direction corresponds to the vertical direction
  • the X-axis direction and the Y-axis direction correspond to the horizontal direction.
  • the lens 14 is an optical element (for example, an objective lens) that concentrates the excitation light L11 and the excitation light L21 on the biological sample 5.
  • the condensing position of the excitation light L11 by the lens 14 is referred to as a condensing position F1 and is shown in the drawing.
  • the condensing position of the excitation light L21 by the lens 14 is referred to as a condensing position F2 and is shown in the drawing.
  • the condensing position F1 and the condensing position F2 may be focal positions.
  • the slit 21 has slit portions 21a and 21b.
  • the slit portion 21a is provided at a position where the fluorescence L12 is incident.
  • the slit portion 21b is provided at a position where the fluorescence L22 is incident.
  • the time from the scanning time t1 to the scanning time t2 is referred to as an offset time pt1 and is shown in the drawing.
  • the offset time pt1 is the time required to scan the offset distance pz (see FIGS. 1A and 1B).
  • the synthetic fluorescence signal S (FIG. 6) has a peak width (for example, a half width) narrower than that of each of the fluorescence signal S1 and the fluorescence signal S2 (FIG. 5).
  • the excitation light L11 and the excitation light L21 have an image spread (FIG. 1A).
  • Image spread also exists in fluorescence L12 and fluorescence L22 (FIG. 1B).
  • the fluorescence signal S1 obtained by using the two lights of the excitation light L11 and the fluorescence L12 has an image spread of 1 / ⁇ 2 more than that of the fluorescence signal obtained by simply observing the fluorescence L12 without irradiating the excitation light L11, for example. Is narrowed down to.
  • Identifying the distribution of the composite phosphor from the synthetic fluorescence signal S with a narrow peak width means improving the resolution of fluorescence detection. Further, in the synthetic fluorescence signal S, since the noise components of the fluorescence signal S1 and the fluorescence signal S2 are canceled by the multiplication, the influence of the noise level and the like are also reduced.
  • the fluorescence L12 and the fluorescence L22 are separated by the difference between the focusing position F1 and the focusing position F2, but also the detection positions (confocal position) of the fluorescence L12 and the fluorescence L22 in the detection unit 20 are different, so that each fluorescence It is possible to further enhance the spatial separation ability of.
  • the fluorescent molecule number calculation unit 33e calculates the number of photons.
  • the number of photons is obtained by dividing the number of electrons by the quantum absorption rate of an optical sensor element (CMOS or the like).
  • the number of photons calculated here is the number of photons based on the fluorescence detected through the lens 14 (for example, the objective lens) of the fluorescence emitted in all directions.
  • the fluorescent molecule number calculation unit 33e calculates the number of photons converted in all directions.
  • the omnidirectionally converted number of photons is obtained by dividing the above number of photons calculated based on the fluorescence detected through the lens 14 by the ratio of the range that can be detected through the lens 14 to the omnidirectional range. ..
  • the fluorescent molecule number calculation unit 33e calculates the number of fluorescent molecules.
  • the number of fluorescent molecules is obtained by dividing the number of photons converted in all directions by the number of emitted photons per molecule.
  • the number of emitted photons per molecule is a value obtained by multiplying the number of absorbed photons (Abs Photon) by the quantum yield of the fluorescent substance.
  • the number of absorbed photons is the value obtained by multiplying the excited photon density by the absorption cross section.
  • the excitation photon density is a value obtained by dividing the excitation power density by an energy of 1 [photon].
  • the control device 30 described above may be composed of, for example, a general-purpose computer (PC, tablet terminal, etc.) capable of executing the program 32a (software) described above.
  • the control device 30 may be provided separately from the fluorescence observation device 1.
  • a fluorescence observation system including software and a fluorescence observation device including an irradiation unit 10 and a detection unit 20 is provided.
  • Such a fluorescence observation system is also an aspect of the present disclosure.
  • An example of the hardware configuration of the control device 30 will be described later with reference to FIG.
  • step S102 the excitation light is irradiated.
  • the control device 30 controls the irradiation unit 10 to simultaneously irradiate the focusing position F1 and the focusing position F2 on the biological sample 5 with the excitation light L11 and the excitation light L21.
  • the excitation light L11 and the excitation light L21 are scanned in the Z-axis direction.
  • the excitation light L11 and the excitation light L21 may be scanned in the X-axis direction and the Y-axis direction.
  • irradiation units and detection units having various configurations may be used. Some examples will be described with reference to FIGS. 8A, 8B, 9A and 9B. An example of scanning in the X-axis direction will be described below.
  • FIGS. 10A and 10B are diagrams showing an example of a schematic configuration of the fluorescence observation device according to the second embodiment.
  • the fluorescence observation device 1C shown in FIGS. 10A and 10B includes an irradiation unit 10C and a control device 30C in place of the irradiation unit 10 and the control device 30 as compared with the fluorescence observation device 1 (FIGS. 1A and 1B). Is different.
  • the irradiation unit 10C includes a light source 11C, a mirror 12C, a mirror 13C, a lens 14C, and a stage 15.
  • the light source 11C, the mirror 12C, the mirror 13C, and the lens 14C are configured to irradiate the focusing position F1C and the focusing position F2C with the excitation light L11 and the excitation light L21 in a time-divided manner.
  • the condensing position F1C and the condensing position F2C are spatially the same position.
  • the light-collecting position F1C and the light-collecting position F2C are temporally different positions. That is, the time when the excitation light L11 is irradiated to the condensing position F1C is different from the time when the excitation light L21 is irradiated to the condensing position F2C.
  • the storage unit 32C stores the program 32aC.
  • the program 32aC is software that realizes control (processing) executed by the control device 30C.
  • the offset correction unit 33bC may or may not perform offset correction. Specifically, when the irradiation cycle of the excitation light L11 and the excitation light L21 is sufficiently shorter than the scanning cycle and the fluorescence signal S1 and the fluorescence signal S2 can be obtained in one scan, the offset correction unit 33bC may be used. No offset correction is performed. In this case, the fluorescence signal S1 and the fluorescence signal S2 having the same peak positions can be obtained from the beginning as described above with reference to FIG.
  • FIG. 13 is a block diagram showing a hardware configuration example of the control device.
  • the control device 30 (see FIGS. 1A, 1B, 3 and the like) will be described.
  • the same description can be made for the control device 30C (see FIGS. 10A, 10B, 11 and the like).
  • Various processes by the control device 30 are realized by the cooperation between the software (program 32a) and the hardware described below.
  • the control device 30 includes a CPU (Central Processing Unit) 901, a ROM (Read Only Memory) 902, a RAM (Random Access Memory) 903, and a host bus 904a. Further, the control device 30 includes a bridge 904, an external bus 904b, an interface 905, an input device 906, an output device 907, a storage device 908, a drive 909, a connection port 911, and a communication device 913.
  • the control device 30 may have a processing circuit such as a DSP or an ASIC in place of or in combination with the CPU 901.
  • the control device 30 may be provided separately from the fluorescence observation device 1.
  • the fluorescence observation device including the irradiation unit 10 and the detection unit 20 and software (program 32a) used for processing using the detection result of the detection unit 20. ) Is provided (the same applies to the control device 30C, the program 32aC, etc.).
  • Such a fluorescence observation system is also an aspect of the present disclosure.
  • the software is executed by the fluorescence observation device and realizes that the distribution of the composite phosphor is specified based on the fluorescence signal S1 and the fluorescence signal S2 obtained from the detection result of the detection unit 20.
  • the fluorescence observation system can also improve the resolution of fluorescence detection.

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Abstract

蛍光観察装置（１）は、２種類以上の蛍光分子（Ａ、Ｂ）を所定構成比で含む複合蛍光体によって標識された生体試料（５）における空間的又は時間的に異なる複数の位置に、互いに波長の異なる複数の励起光（Ｌ１１、Ｌ２１）を照射する照射部（１０）と、照射部（１０）の照射によって複数の位置のそれぞれで発生した蛍光（Ｌ１２、Ｌ２２）を検出する検出部（２０）と、検出部（２０）の検出結果から得られる蛍光（Ｌ１２、Ｌ２２）それぞれの生体試料（５）での位置に応じた蛍光強度を示す蛍光信号（Ｓ１、Ｓ２）に基づいて、複合蛍光体の分布を特定する演算部（３３）と、を備える。

Description

蛍光観察装置、蛍光観察システム及び蛍光観察方法
　本開示は、蛍光観察装置、蛍光観察システム及び蛍光観察方法に関する。
　例えばがん免疫治療等の分野において、ＰＤ－Ｌ１抗体等の各種抗体の位置を把握するために蛍光観察を行うことが知られている。
国際公開第２０１９／２３０８７８号
　蛍光観察等に供される蛍光画像の多色化が進められている。そのような蛍光画像において各色を見分けやすくするために、蛍光検出の解像度を向上させる必要がある。
　本開示は、蛍光検出の解像度を向上させることが可能な蛍光観察装置、蛍光観察システム及び蛍光観察方法を提供することを目的とする。
　本開示の一側面に係る蛍光観察装置は、２種類以上の蛍光分子を所定構成比で含む複合蛍光体によって標識された生体試料における空間的又は時間的に異なる複数の位置に、互いに波長の異なる複数の励起光を照射する照射部と、照射部の照射によって複数の位置のそれぞれで発生した蛍光を検出する検出部と、検出部の検出結果から得られる蛍光それぞれの生体試料での位置に応じた蛍光強度を示す蛍光信号に基づいて、複合蛍光体の分布を特定する演算部と、を備える。
　本開示の一側面に係る蛍光観察システムは、２種類以上の蛍光分子を所定構成比で含む複合蛍光体によって標識された生体試料における空間的又は時間的に異なる複数の位置に、互いに波長の異なる複数の励起光を照射する照射部、及び、照射部の照射によって複数の位置のそれぞれで発生した蛍光を検出する検出部を備える蛍光観察装置と、検出部の検出結果を用いる処理に使われるソフトウェアとを含んで構成される蛍光観察システムであって、ソフトウェアは、蛍光観察装置で実行され、検出部の検出結果から得られる蛍光それぞれの生体試料での位置に応じた蛍光強度を示す蛍光信号に基づいて、複合蛍光体の分布を特定すること、を実現する。
　本開示の一側面に係る蛍光観察方法は、２種類以上の蛍光分子を所定構成比で含む複合蛍光体によって標識された生体試料における空間的又は時間的に異なる複数の位置に、互いに波長の異なる複数の励起光を照射し、照射によって複数の位置のそれぞれで発生した蛍光を検出し、検出の結果から得られる蛍光それぞれの生体試料での位置に応じた蛍光強度を示す蛍光信号に基づいて、複合蛍光体の分布を特定する。
第１実施形態に係る蛍光観察装置の概略構成の例を示す図である。 第１実施形態に係る蛍光観察装置の概略構成の例を示す図である。 複合蛍光体の構成の例を示す図である。 制御装置の機能ブロックの例を示す図である。 蛍光信号の例を概念的に示す図である。 オフセット補正後の蛍光信号の例を概念的に示す図である。 合成蛍光信号の例を概念的に示す図である。 蛍光観察装置を用いて行われる蛍光観察方法の例を示すフローチャートである。 照射部の概略構成の別の例を示す図である。 照射部の概略構成の別の例を示す図である。 照射部及び検出部の概略構成の別の例を示す図である。 照射部及び検出部の概略構成の別の例を示す図である。 第２実施形態に係る蛍光観察装置の概略構成の例を示す図である。 第２実施形態に係る蛍光観察装置の概略構成の例を示す図である。 制御装置の機能ブロックの例を示す図である。 蛍光信号の例を概念的に示す図である。 制御装置のハードウェア構成例を示すブロック図である。
　以下に、本開示の実施形態について図面に基づいて詳細に説明する。なお、以下の各実施形態において、同一の部位には同一の符号を付することにより重複する説明を省略する。
　以下に示す項目順序に従って本開示を説明する。
　　１．　はじめに
　　２．　第１実施形態
　　３．　第２実施形態
　　４．　制御装置のハードウェア構成の例
　　５．　効果
１．　はじめに
　蛍光観察においては、例えば共焦点蛍光顕微鏡が用いられる。これまでの共焦点蛍光顕微鏡には、自家蛍光など観察蛍光体と同様のスペクトル成分を持つバックグラウンド信号と所望の蛍光との分離に限界があったり、共焦点光学系により通常顕微鏡と比べ解像度は向上してはいるが超解像顕微鏡に比べれば限定された解像度となったりする、といった課題がある。超解像顕微鏡を用いれば解像度は高くなるが、複雑な光学系に伴う煩雑な準備が必要である。通常の共焦点顕微鏡と同等の汎用性をもってより高解像な画像等が得られる方法が求められている。共焦点蛍光顕微鏡において焦点方向の解像度を上げるためには光源と共焦点位置にあるピンホールあるいはスリットを狭細化することが求められるが、これによりスリット・ピンホールにて光が遮られるため、検出効率が低下する。
　ここで、試料を複数の蛍光体を用いた染色等により画像等を取得する共焦点蛍光顕微鏡は存在するが、複数の蛍光体が特定標的に同一比率で結合することを前提としてこれを検出する目的で用いられておらず、あわせて各励起光の焦点位置が異なる構成は用いられていない。本開示の一側面において、２種類以上の蛍光分子が既知の割当で構成する複合蛍光体による点光源が形成される。その方法として、例えば、蛍光分子を特定構成比で化学的に結合させた分子が用いられる。２種の蛍光分子の結合方法として、元素を直接共有結合する、イオン結合により所定の割合で結合する、共通の骨格となる分子に共有結合する、イオン結合をもって結合する(例、プログラマブルダイ)、あるいは特定抗原に対して大凡既知の比率で結合することが想定される蛍光抗体を用い、これを用いて試料染色を行うなどの例が挙げられる。
２．　第１実施形態
　図１Ａ及び図１Ｂは、第１実施形態に係る蛍光観察装置の概略構成の例を示す図である。図１Ａ及び図１Ｂには、蛍光観察装置１の観察対象として、生体試料５が例示される。はじめに生体試料５について説明する。
　生体試料５は、複合蛍光体によって標識（試料染色）されている。複合蛍光体は、２種類以上の蛍光分子（蛍光体）を所定構成比で含む。複数の同種類の蛍光分子が複合蛍光体に含まれてもよい。異種類の蛍光分子は、互いに異なる励起蛍光特性を有する。複合蛍光体について、図２を参照してさらに説明する。
　図２は、複合蛍光体の構成の例を示す図である。複合蛍光体は、少なくとも蛍光分子Ａ及び蛍光分子Ｂの２種類の蛍光分子を含む。蛍光分子Ａは、第１の励起光が照射されると第１の蛍光を発生する励起蛍光特性を有する。第１の励起光は、第１の波長λ１の光で構成される。第１の蛍光は、第１のスペクトルを有する。蛍光分子Ｂは、第２の励起光が照射されると第２の蛍光を発生する励起蛍光特性を有する。第２の励起光は、第２の波長λ２（第１の波長λ１とは異なる波長）の光で構成される。第２の蛍光は、第２のスペクトル（第１のスペクトルとは異なるスペクトル）を有する。蛍光分子Ａ及び蛍光分子Ｂは、分子結合している。分子結合の例は、共有結合、イオン結合等である。蛍光分子Ａ及び蛍光分子Ｂは、互いに結合していてもよいし、骨格分子に結合していてもよい（例えばプログラマブルダイ）。あるいは、特定抗原に対して大凡既知の比率で結合する蛍光分子が、蛍光分子Ａ及び蛍光分子Ｂとして用いられてもよい。蛍光分子Ａ及び蛍光分子Ｂは、さまざまな構成比（例えば１：１、１：２等）で結合していてよい。図３に示される例では、蛍光分子Ａ及び蛍光分子Ｂの構成比は１：２である。以下、とくに説明がある場合を除き、複合蛍光体が蛍光分子Ａ及び蛍光分子Ｂの２種類の蛍光分子を１：２の構成比で含む場合について説明する。
　分子結合している蛍光分子Ａ及び蛍光分子Ｂの間隔は非常に狭いので、複合蛍光体中の蛍光分子Ａ及び蛍光分子Ｂの位置はほぼ同じであるとみなせる。したがって、複合蛍光体で標識された生体試料５は、生体試料５での同じ位置（点）に蛍光分子Ａ及び蛍光分子Ｂの両方の励起蛍光特性を併せ持つ。
　蛍光分子Ａ及び蛍光分子Ｂのような蛍光分子の例としては、ＦＩＴＣ（Fluorescein　Isothiocyanate）、Alexa　Fluor（登録商標）色素、ＰＥ（Phycoerythrin蛍光タンパク）等が挙げられる。次に、蛍光観察装置１の構成について説明する。
　図１Ａ及び図１Ｂに示されるように、蛍光観察装置１は、照射部１０と、検出部２０と、制御装置３０とを備える。図において、ＸＹＺ座標系が示される。例えば、Ｚ軸方向は鉛直方向に対応し、Ｘ軸方向及びＹ軸方向は水平方向に対応する。
　照射部１０は、励起光Ｌ１１及び励起光Ｌ２１を生体試料５に照射する。照射部１０は、光源１１と、ミラー１２と、ミラー１３と、レンズ１４と、ステージ１５とを含む。
　光源１１は、励起光Ｌ１１及び励起光Ｌ２１を発生する。励起光Ｌ１１の波長及び励起光Ｌ２１の波長は、先に図２を参照して説明した第１の波長λ１及び第２の波長λ２である。光源１１は、例えば水銀ランプ等の電球、ＬＥＤ（Light　Emitting　Diode）、レーザ光源等を含んで構成される。
　ミラー１２、ミラー１３及びレンズ１４は、励起光Ｌ１１及び励起光Ｌ２１をステージ１５上の生体試料５に導くように、光源１１とステージ１５との間の光軸上に配置される。
　ミラー１２及びミラー１３は、ある特定の波長の光を透過し、別の特定の波長の光を反射する光学素子（例えばダイクロイックミラー）である。ミラー１２及びミラー１３は、少なくとも励起光Ｌ１１及び励起光Ｌ２１を透過させる。また、ミラー１２は、後述の蛍光Ｌ１２を検出部２０に方向付けるように、蛍光Ｌ１２を反射する。ミラー１３は、後述の蛍光Ｌ２２を検出部２０に方向付けるように、蛍光Ｌ２２を反射する。
　レンズ１４は、励起光Ｌ１１及び励起光Ｌ２１を生体試料５へ集光する光学素子（例えば対物レンズ）である。レンズ１４による励起光Ｌ１１の集光位置を、集光位置Ｆ１と称し図示する。レンズ１４による励起光Ｌ２１の集光位置を、集光位置Ｆ２と称し図示する。集光位置Ｆ１及び集光位置Ｆ２は、焦点位置であってよい。
　ステージ１５には、生体試料５が載置される。この例では、載置面はＸＹ平面方向に延在する。生体試料５は、Ｘ軸方向、Ｙ軸方向及びＺ軸方向に長さ（面積及び厚さ）を有してよい。生体試料５の長さの例は、数μｍから数十μｍ程度である。生体試料５は、例えば、図示しないスライドガラス及びカバーガラスに挟まれ、ステージ１５上に固定されてよい。ステージ１５は、Ｘ軸方向、Ｙ軸方向及びＺ軸方向に移動可能に構成される。ステージ１５の移動は例えば制御装置３０によって制御される。ステージ１５とともに生体試料５が移動することで、生体試料５における集光位置Ｆ１及び集光位置Ｆ２が走査方向に移動する。したがって、励起光Ｌ１１及び励起光Ｌ２１の生体試料５への照射が走査される。
　なお、ミラー１２、ミラー１３、レンズ１４及びステージ１５は、励起光Ｌ１１及び励起光Ｌ２１を生体試料５に走査照射するための光学系の一例に過ぎない。例えば、ステージ１５を用いずに（生体試料５を移動させずに）走査が行われてもよい。他にも、励起光Ｌ１１及び励起光Ｌ２１を生体試料５に走査照射可能なさまざまな光学系が用いられてよい。
　集光位置Ｆ１及び集光位置Ｆ２について説明する。集光位置Ｆ１及び集光位置Ｆ２は、互いにずれた位置（空間的に異なる複数の位置）である。集光位置Ｆ１及び集光位置Ｆ２は、励起光Ｌ１１及び励起光Ｌ２１の走査方向において互いにずれていてよい。図１Ａ及び図１Ｂに示される例では、走査方向はＺ軸方向であり、したがって、集光位置Ｆ１及び集光位置Ｆ２はＺ軸方向に互いにずれている。Ｚ軸方向における集光位置Ｆ１と集光位置Ｆ２との間の距離（ずれ量）を、オフセット距離ｐｚと称し図示する。照射部１０は、集光位置Ｆ１及び集光位置Ｆ２に励起光Ｌ１１及び励起光Ｌ２１を同時に照射する。
　走査中、集光位置Ｆ１が複合蛍光体の位置に来て励起光Ｌ１１が複合蛍光体に照射されると、蛍光Ｌ１２が発生する。集光位置Ｆ２が複合蛍光体の位置に来て励起光Ｌ２１が複合蛍光体に照射されると、蛍光Ｌ２２が発生する。蛍光Ｌ１２及び蛍光Ｌ２２は、先に図２を参照して説明した第１のスペクトルを有する蛍光及び第２のスペクトルを有する蛍光である。蛍光Ｌ１２の少なくとも一部は、レンズ１４を通った後、ミラー１２で反射し、検出部２０に向かって進む。蛍光Ｌ２２の少なくとも一部は、レンズ１４を通った後、ミラー１３で反射し、検出部２０に向かって進む。
　検出部２０は、励起光Ｌ２１及び蛍光Ｌ２２を検出する。検出部２０は、スリット２１及び光センサ２２を含む。
　スリット２１は、スリット部２１ａ及び２１ｂを有する。スリット部２１ａは、蛍光Ｌ１２が入射する位置に設けられる。スリット部２１ｂは、蛍光Ｌ２２が入射する位置に設けられる。
　光センサ２２は、スリット２１を介して、蛍光Ｌ１２及び蛍光Ｌ２２を受光する。より具体的に、光センサ２２は、蛍光Ｌ１２をスリット部２１ａに対応する位置で受光し、蛍光Ｌ２２を光センサ２２ｂに対応する位置で受光することにより、蛍光Ｌ１２及び蛍光Ｌ２２を異なる位置で受光する。光センサ２２の受光面を、受光面２２ａと称し図示する。この例では、受光面２２ａは、ＸＺ平面方向に延在する。受光面２２ａは、アレイ状に設けられた複数の画素（光センサ画素）を含んでよく、これにより画素ごとに（受光面２２ａの各位置に）入射する蛍光の光量（受光レベル）が検出される。光センサ２２の例は、ＣＭＯＳ（Complementary　Metal　Oxide　Semiconductor）センサである。
　スリット２１と光センサ２２の受光面２２ａとの間には、図示しない回折格子等が設けられており、スリット２１を通過した蛍光Ｌ１２及び蛍光Ｌ２２（スリット２１を透過した１次元画像）は、回折格子等によって波長に応じた角度で回折された後、受光面２２ａ上に結像することにより、各波長での信号強度（スペクトル）として記録される。このように回折格子により１次元の波長の分光画像を取得し、これをスキャンすることにより試料面のスペクトル画像が取得される。光センサ２２の検出結果（蛍光Ｌ１２及び蛍光Ｌ２２のスペクトルを含む）は、制御装置３０に送られる。
　なお、スリット２１及び光センサ２２は、蛍光Ｌ１２及び蛍光Ｌ２２を（分離して）検出するための構成の一例に過ぎない。例えば、各光の焦点位置にピンホールを設ける、光路上にフィルタ（対応する蛍光のみを選択的に透過するフィルタ等）を設ける等により、光量を検出してもよい。なお、スリット２１の代わりにピンホールを設ける場合には、上述の１次元画像に代えて点画像が取得される。分光機能を備えた光学素子を追加し、事前に測られた分光スペクトルとの内積などを取ることにより該当する蛍光のみを検出してもよい。これら以外にも、さまざまな構成が用いられてよい。
　制御装置３０は、照射部１０を制御し、また、検出部２０の検出結果を処理する。制御装置３０について、さらに図３を参照して説明する。
　図３は、制御装置３０の機能ブロックの例を示す図である。制御装置３０は、照射制御部３１と、記憶部３２と、演算部３３と、表示部３４とを含む。
　照射制御部３１は、先に図１Ａ及び図１Ｂを参照して説明したように、集光位置Ｆ１及び集光位置Ｆ２に励起光Ｌ１１及び励起光Ｌ２１が同時に照射されるように、照射部１０を制御する。
　記憶部３２は、制御装置３０の処理に必要な種々の情報を記憶する。例えば、記憶部３２は、先に図２を参照して説明したような複合蛍光体情報（蛍光分子の種類、励起蛍光特性、構成比等）を記憶する。複合蛍光体情報には、蛍光分子の発する蛍光のスペクトル（所定スペクトル）も含まれる。他にも、後述の演算部３３の演算に必要なあらゆる情報が記憶部３２に記憶されていてよい。記憶部３２は、プログラム３２ａも記憶する。プログラム３２ａは、制御装置３０によって実行される制御（処理）を実現するソフトウェアであり、例えば検出部２０の検出結果を用いる処理に使われる。プログラム３２ａは、ネットワークを介して提供されてもよいし、任意の記憶媒体を介して提供されてもよい。プログラム３２ａは、適宜アップデートされてよい。この他にも、制御装置３０によって実行される処理に必要な種々の情報が記憶部３２に記憶されていてよい。
　演算部３３は、検出部２０の検出結果を用いたさまざまな処理を行う。いくつかの代表的な処理に対応する機能ブロックが、図３に例示される。この例では、演算部３３は、蛍光強度算出部３３ａと、オフセット補正部３３ｂと、合成蛍光信号生成部３３ｃと、画像生成部３３ｄと、蛍光分子数算出部３３ｅとを含む。
　蛍光強度算出部３３ａは、蛍光Ｌ１２及び蛍光Ｌ２２の蛍光強度を算出する。蛍光強度は、生体試料５での位置に応じた蛍光強度であり、より具体的には、生体試料５での走査位置に応じた蛍光強度である。蛍光Ｌ１２の蛍光強度の算出の例について説明すると、蛍光強度算出部３３ａは、検出部２０によって検出された蛍光Ｌ１２のスペクトルと、対応する所定スペクトル（記憶部３２に記憶されている）との内積をとる。内積は両スペクトルが類似しているほど大きくなるので、内積をとることにより、所定スペクトルを有する蛍光Ｌ１２の蛍光強度が算出される。蛍光Ｌ２２の蛍光強度も同様に算出される。以下、生体試料５での位置（より具体的には走査位置）に応じた蛍光Ｌ１２の蛍光強度を示す信号を、蛍光信号Ｓ１と称する。生体試料５での位置に応じた蛍光Ｌ２２の蛍光強度を示す信号を、蛍光信号Ｓ２と称する。
　図４は、蛍光信号の例を概念的に示す図である。グラフの横軸は走査時刻を示し、縦軸は蛍光強度を示す。実線グラフ線Ｓ１は、蛍光Ｌ１２の蛍光信号Ｓ１の強度を示す。破線グラフ線Ｓ２は、蛍光Ｌ２２の蛍光信号Ｓ２の強度を示す。蛍光信号Ｓ１がピークを示す走査時刻を、走査時刻ｔ１と称し図示する。蛍光信号Ｓ２がピークを示す走査時刻を、走査時刻ｔ２と称し図示する。走査時刻ｔ１から走査時刻ｔ２までの時間を、オフセット時間ｐｔ１と称し図示する。オフセット時間ｐｔ１は、オフセット距離ｐｚ（図１Ａ及び図１Ｂを参照）の走査に要する時間である。
　図３に戻り、オフセット補正部３３ｂは、オフセット（オフセット距離ｐｚ及びオフセット時間ｐｔ１）を補正する。例えば、蛍光信号Ｓ１及び蛍光信号Ｓ２を時間ｔの関数Ｓ１（ｔ）及びＳ２（ｔ）とした場合、オフセット補正部３３ｂは、Ｓ１（ｔ）＝Ｓ１（ｔ－ｐｔ１）に補正、あるいは、Ｓ２（ｔ）＝Ｓ２（ｔ＋ｐｔ１）に補正する。これらは、図４において蛍光信号Ｓ１あるいは蛍光信号Ｓ２をオフセット時間ｐｔ１だけ右側あるいは左側にシフトさせることに相当する。
　図５は、オフセット補正後の蛍光信号の例を概念的に示す図である。グラフの横軸は、走査時刻を示すとともに生体試料５での位置を示す。オフセット補正により、蛍光信号Ｓ１のピーク及び蛍光信号Ｓ２のピークが概ね一致する。
　図３に戻り、合成蛍光信号生成部３３ｃは、オフセット補正後の蛍光信号Ｓ１及び蛍光信号Ｓ２から、合成蛍光信号を生成する。例えば、合成蛍光信号生成部３３ｃは、蛍光信号Ｓ１及び蛍光信号Ｓ２を乗算することにより、合成蛍光信号Ｓを生成する。この場合、蛍光信号Ｓ１及び蛍光信号Ｓ２が所定構成比に応じた比で乗算されてよい。例えば、蛍光信号Ｓ１及び蛍光信号Ｓ２の各々が所定構成比に応じた比で累乗された後、乗算されてよい。ここでは蛍光信号Ｓ１を発生する蛍光分子Ａ及び蛍光信号Ｓ２を発生する蛍光分子Ｂの構成比が１：２であるので、Ｓ＝Ｓ１×（Ｓ２）２として合成蛍光信号Ｓが算出されてよい。所定構成比に応じた比で乗算することにより、例えば、特定の標的を自家蛍光などの影響を抑制して、より精度良く識別することが可能となる。蛍光信号Ｓ１及び蛍光信号Ｓ２の乗算結果は、乗算の数に応じた数でさらに累乗根されてよい。すなわち、Ｓ＝（Ｓ１×（Ｓ２）２）１／３として合成蛍光信号Ｓが算出されてよい。累乗根することで、合成蛍光信号Ｓの蛍光強度が、もともとの蛍光信号Ｓ１及び蛍光信号Ｓ２の蛍光強度、すなわち光センサ２２の受光面２２ａの画素ごとで検出された蛍光強度を示す。
　図６は、合成蛍光信号の例を概念的に示す図である。合成蛍光信号Ｓのピークの位置が複合蛍光体の位置（推定位置）に対応する。合成蛍光信号Ｓは、蛍光信号Ｓ１と蛍光信号Ｓ２とに基づいて算出されるので、蛍光信号Ｓ１及び蛍光信号Ｓ２と同様に、生体試料５での位置（より具体的には走査位置）に応じた蛍光強度を示す。なお、１次元走査の場合、位置は、Ｘ軸上の位置、Ｙ軸上の位置及びＺ軸上の位置のいずれか一つで表される。２次元走査の場合、位置は、Ｘ軸上の位置、Ｙ軸上の位置及びＺ軸上の位置のうちの２つの位置で表される。３次元走査の場合、位置は、Ｘ軸上の位置、Ｙ軸上の位置及びＺ軸上の位置の３つの位置で表される。このような合成蛍光信号Ｓを算出することにより、合成蛍光信号生成部３３ｃは、生体試料５を標識する複合蛍光体の分布を特定する。
　ここで、合成蛍光信号Ｓ（図６）は、蛍光信号Ｓ１及び蛍光信号Ｓ２（図５）の各々よりも、狭いピーク幅（例えば半値幅）を有する。理由について説明すると、励起光Ｌ１１及び励起光Ｌ２１には、像の広がりが存在する（図１Ａ）。蛍光Ｌ１２及び蛍光Ｌ２２にも、像の広がりが存在する（図１Ｂ）。励起光Ｌ１１及び蛍光Ｌ１２の２つの光を用いて得られる蛍光信号Ｓ１は、例えば励起光Ｌ１１を照射せず単に蛍光Ｌ１２を観察して得られる蛍光信号よりも、像の広がりが１／√２に絞られる。蛍光信号Ｓ２についても同様である。これら蛍光信号Ｓ１及び蛍光信号Ｓ２を乗算して得られる合成蛍光信号Ｓは、像の広がりが１／２（＝１／√２×１／√２）に絞られる分、より鋭いピークを示す。
　ピーク幅の狭い合成蛍光信号Ｓから複合蛍光体の分布を特定することは、蛍光検出の解像度の向上を意味する。さらに、合成蛍光信号Ｓでは、乗算によって蛍光信号Ｓ１及び蛍光信号Ｓ２のノイズ成分が打ち消されるので、ノイズレベルの影響等も低減される。
　先に説明したように、集光位置Ｆ１及び集光位置Ｆ２（図１Ａ及び図１Ｂ）は、焦点位置であってよい。この場合、照射部１０及び検出部２０は、励起光Ｌ１１及び励起光Ｌ２１を異なる焦点位置に集光し、発生した蛍光Ｌ１２及び蛍光Ｌ２２を検出する共焦点顕微鏡を構成するともいえる。集光位置Ｆ１にある複合蛍光体及び集光位置Ｆ２にある複合蛍光体の各々は、自身に励起光Ｌ１１又は励起光Ｌ２１の集光が及ぶときにのみ支配的に蛍光Ｌ１２又は蛍光Ｌ２２を発生するため、他の蛍光体からの信号の混ざり込みを抑制することができる。集光位置Ｆ１及び集光位置Ｆ２の違いによる蛍光Ｌ１２及び蛍光Ｌ２２の分離のみならず、検出部２０における蛍光Ｌ１２及び蛍光Ｌ２２の検出位置（共焦点位置）が異なる構成とすることにより、各蛍光の空間的分離能力をさらに高めることが可能である。
　図３に戻り、画像生成部３３ｄは、合成蛍光信号Ｓから、生体試料５の蛍光画像を生成する。蛍光画像は、生体試料５での位置ごとの複合蛍光体の蛍光強度を示す画像であってよい。画像の態様はとくに限定されず、さまざまな態様の画像が用いられてよい。画像は２次元画像であってもよし３次元画像であってもよい。蛍光画像において、セグメンテーションの結果、Ｓ／Ｎ値等が示されてもよい。
　蛍光分子数算出部３３ｅは、合成蛍光信号Ｓから、蛍光分子数を算出する。例えば次のようにして算出される。まず、蛍光分子数算出部３３ｅは、生体試料５での位置ごとの輝度を取得する。輝度として、合成蛍光信号生成部３３ｃによって生成された合成蛍光信号Ｓに示される蛍光輝度（生体試料５での位置ごとの蛍光強度）が取得される。
　次に、蛍光分子数算出部３３ｅは、エレクトロン数を算出する。エレクトロン数は、輝度に光センサ素子の飽和電荷量を乗算するとともに受光期間（露光時間）で除算することで求められる。
　次に、蛍光分子数算出部３３ｅは、フォトン数を算出する。フォトン数は、エレクトロン数を光センサ素子（ＣＭＯＳ等）の量子吸収率で除算することで求められる。なお、ここで算出されるフォトン数は、全方位に放出された蛍光のうちのレンズ１４（例えば対物レンズ）を通して検出された蛍光に基づくフォトン数である。
　次に、蛍光分子数算出部３３ｅは、全方位換算されたフォトン数を算出する。全方位換算されたフォトン数は、レンズ１４を通して検出された蛍光に基づいて算出された上記のフォトン数を、全方位の範囲に占めるレンズ１４を通して検出可能な範囲の割合で除算することで求められる。
　次に、蛍光分子数算出部３３ｅは、蛍光分子数を算出する。蛍光分子数は、全方位換算されたフォトン数を、１分子あたりの放出フォトン数で除算することによって求められる。１分子あたりの放出フォトン数は、吸収フォトン数（Abs　Photon）に蛍光物質の量子収率を乗算した値である。
　吸収フォトン数は、励起フォトン密度に吸収断面積を乗算した値である。励起フォトン密度は、励起パワー密度を１［photon］のエネルギーで除算した値である。
　１［photon］のエネルギーは、プランク定数ｈ(＝6.62607×10－34（Js）)、真空中の光速ｃ（=2.99792458×108（m/s））及び真空中の電磁波の波長λを用いて、ｈ×ｃ/λ≒3.66×10-19（J）として求められる。
　吸収断面積は、１分子あたりの吸収のし易さを示す。吸収断面積は、モル吸光係数ε（＝196000（L/mol/cm））を用いて、1960000（L/mol/cm）×1000（cm3）×2.3/6.02×1023（個）＝7.49×10-15（cm2/molecule）として求められる。1000（cm3）を乗算しているのは、励起フォトン密度の単位に合わせて（L）を（cm3）に変換するためである。6.02×1023（個）で除算しているのは、蛍光分子１分子あたりの値に変換するためである。2.3で乗算しているのは、吸光度をLogからLnに変換するためである。
　例えば以上のようにして、蛍光分子数算出部３３ｅは、生体試料５での位置ごとの蛍光分子数を算出する。さらに、蛍光分子数算出部３３ｅは、蛍光分子数を蛍光標識率で除算することによって、抗体数を算出してもよい。蛍光標識率は、Ｆ／Ｐ値：Fluorescein/Protein」などとも呼称され、抗体を標識する蛍光分子数を指す。
　なお、画像生成部３３ｄは、蛍光分子数算出部３３ｅによって算出された蛍光分子数又は蛍光分子に結合している抗体数が反映された画像を生成してもよい。この場合、画像生成部３３ｄは、生体試料５での各位置の輝度が、蛍光分子数の数が多いほど大きくなるような画像を生成してもよい。
　表示部３４は、演算部３３の演算結果を表示する。表示は、グラフ、数値、画像あるいはこれらの組み合わせ等、さまざまな態様で行われてよい。
　以上説明した制御装置３０は、例えば、先に説明したプログラム３２ａ（ソフトウェア）が実行可能な汎用のコンピュータ等（ＰＣ、タブレット端末等）で構成されてよい。制御装置３０は、蛍光観察装置１とは別に設けられてよい。この場合、照射部１０及び検出部２０を備える蛍光観察装置と、ソフトウェアとを含んで構成される蛍光観察システムが提供される。このような蛍光観察システムも、本開示の一態様である。なお、制御装置３０のハードウェア構成の例については、後に図１３を参照して説明する。
　図７は、蛍光観察装置を用いて行われる蛍光観察方法の例を示すフローチャートである。
　ステップＳ１０１において、生体試料を準備する。すなわち、生体試料５を複合蛍光体で標識し、ステージ１５上に載置する。この処理は、例えば蛍光観察装置１のユーザ等によって行われてよい。
　ステップＳ１０２において、励起光を照射する。具体的に、制御装置３０が、照射部１０を制御し、生体試料５上の集光位置Ｆ１及び集光位置Ｆ２に励起光Ｌ１１及び励起光Ｌ２１を同時に照射する。
　ステップＳ１０３において、蛍光を検出する。具体的に、検出部２０が、先のステップＳ１０２での励起光の照射に応じて発生した蛍光Ｌ１２及び蛍光Ｌ２２を検出する。
　ステップＳ１０４において、複合蛍光体の分布を特定する。具体的に、演算部３３の蛍光強度算出部３３ａが、先のステップＳ１０３で検出された蛍光Ｌ１２及び蛍光Ｌ２２の蛍光強度を算出し、蛍光信号Ｓ１及び蛍光信号Ｓ２を得る。オフセット補正部３３ｂが、蛍光信号Ｓ１及び蛍光信号Ｓ２のオフセットを補正する。合成蛍光信号生成部３３ｃが、オフセット補正後の蛍光信号Ｓ１及び蛍光信号Ｓ２を合成して合成蛍光信号Ｓを生成し、複合蛍光体の分布を特定する。この他に、例えば、画像生成部３３ｄによる蛍光画像の生成、蛍光分子数算出部３３ｅによる蛍光分子数の算出等が行われてもよい。表示部３４が、複合蛍光体の分布の特定結果を含め、各種の演算結果をさまざまな態様で表示してよい。
　ステップＳ１０４の処理が完了した後、フローチャートの処理は終了する。
　上記実施形態では、励起光Ｌ１１及び励起光Ｌ２１がＺ軸方向に走査される例について説明した。当然ながら、励起光Ｌ１１及び励起光Ｌ２１は、Ｘ軸方向及びＹ軸方向に走査されてもよい。また、図１Ａ及び図１Ｂを参照して説明した照射部１０及び検出部２０以外にも、さまざまな構成の照射部及び検出部が用いられてよい。いくつかの例について、図８Ａ、図８Ｂ、図９Ａ及び図９Ｂを参照して説明する。以下では、Ｘ軸方向の走査の例を説明する。
　図８Ａ及び図８Ｂ、照射部の概略構成の別の例を示す図である。図８Ａ及び図８Ｂに示される照射部１０Ａは、光源１１Ａ、ミラー１２Ａ、ミラー１３Ａ、レンズ１４Ａ及びステージ１５を含む。光源１１Ａ、ミラー１２Ａ、ミラー１３Ａ及びレンズ１４Ａは、集光位置Ｆ１Ａ及び集光位置Ｆ２Ａに励起光Ｌ１１及び励起光Ｌ２１を照射するように構成される。集光位置Ｆ１Ａ及び集光位置Ｆ２Ａは、Ｘ軸方向に互いにずれている。Ｘ軸方向における集光位置Ｆ１Ａ及び集光位置Ｆ２Ａとの間の距離を、オフセット距離ｐｘと称し図示する。励起光Ｌ１１の照射により集光位置Ｆ１Ａで蛍光Ｌ１２が発生し、励起光Ｌ２１の照射により集光位置Ｆ２Ａで蛍光Ｌ２２が発生する。蛍光Ｌ１２及び蛍光Ｌ２２は、検出部２０によって検出される。検出部２０の検出結果は、制御装置３０の演算部３３によって処理される。演算部３３による処理は、オフセット距離ｐｚ（図１Ａ及び図１Ｂ）に代えてオフセット距離ｐｘが用いられる点を除きこれまで説明したとおりであるので、説明は繰り返さない。
　図９Ａ及び図９Ｂは、照射部及び検出部の概略構成の別の例を示す図である。図９Ａ及び図９Ｂに示される照射部１０Ｂは、光源１１Ｂ１、光源１１Ｂ２、ミラー１２Ｂ、ミラー１３Ｂ、レンズ１４Ｂ１、レンズ１４Ｂ２及びステージ１５を備える。光源１１Ｂ１、ミラー１２Ｂ及びレンズ１４Ｂ１は、集光位置Ｆ１Ｂに励起光Ｌ１１を照射するように構成される。光源１１Ｂ２、ミラー１３Ｂ及びレンズ１４Ｂ２は、集光位置Ｆ２Ｂに励起光Ｌ２１を照射するように構成される。集光位置Ｆ１Ｂ及び集光位置Ｆ２Ｂは、Ｘ軸方向にオフセット距離ｐｘだけずれている。レンズ１４Ｂ１及びレンズ１４Ｂ２が集光位置Ｆ１Ｂ及び集光位置Ｆ２Ｂに対してそれぞれ設けられることにより、集光位置Ｆ１Ｂ及び集光位置Ｆ２Ｂに励起光Ｌ１１及び励起光Ｌ２１が異なる光軸で照射される。
　励起光Ｌ１１の照射により集光位置Ｆ１Ｂで蛍光Ｌ１２が発生し、励起光Ｌ２１の照射により集光位置Ｆ２Ｂで蛍光Ｌ２２が発生する。蛍光Ｌ１２は検出部２０Ｂ１によって検出され、蛍光Ｌ２２は検出部２０Ｂ２によって検出される。検出部２０Ｂ１は、スリット２１Ｂ１及び光センサ２２を含む。検出部２０Ｂ１の光センサ２２は、スリット２１Ｂ１のスリット部２１ａを介して蛍光Ｌ１２を受光（検出）する。検出部２０Ｂ２は、スリット２１Ｂ２及び光センサ２２を含む。検出部２０Ｂ２の光センサ２２は、スリット２１Ｂ２のスリット部２１ｂを介して蛍光Ｌ２２を受光する。検出部２０Ｂ１及び検出部２０Ｂ２の検出結果は、制御装置３０の演算部３３によって処理される。演算部３３による処理は、オフセット距離ｐｚ（図１Ａ及び図１Ｂ）に代えてオフセット距離ｐｘが用いられる点を除きこれまで説明したとおりであるので、説明は繰り返さない。
３．　第２実施形態
　以上説明した第１実施形態では、空間的に異なる集光位置Ｆ１及び集光位置Ｆ２に励起光Ｌ１１及び励起光Ｌ２１を同時に照射される例について説明した。次に説明する第２実施形態では、時間的に異なる複数の位置（空間的には同一の複数の位置）に励起光Ｌ１１及び励起光Ｌ２１が時分割で照射される。
　図１０Ａ及び図１０Ｂは、第２実施形態に係る蛍光観察装置の概略構成の例を示す図である。図１０Ａ及び図１０Ｂに示される蛍光観察装置１Ｃは、蛍光観察装置１（図１Ａ及び図１Ｂ）と比較して、照射部１０及び制御装置３０に代えて照射部１０Ｃ及び制御装置３０Ｃを備える点において相違する。
　照射部１０Ｃは、光源１１Ｃ、ミラー１２Ｃ、ミラー１３Ｃ、レンズ１４Ｃ及びステージ１５を含む。光源１１Ｃ、ミラー１２Ｃ、ミラー１３Ｃ及びレンズ１４Ｃは、集光位置Ｆ１Ｃ及び集光位置Ｆ２Ｃに励起光Ｌ１１及び励起光Ｌ２１を時分割で照射するように構成される。集光位置Ｆ１Ｃと集光位置Ｆ２Ｃとは空間的に同じ位置である。集光位置Ｆ１Ｃと集光位置Ｆ２Ｃとは、時間的に異なる位置である。すなわち、集光位置Ｆ１Ｃに励起光Ｌ１１が照射される時刻と、集光位置Ｆ２Ｃに励起光Ｌ２１が照射される時刻とは異なっている。
　励起光Ｌ１１及び励起光Ｌ２１の照射は、光源１１Ｃによる励起光Ｌ１１の出射及び励起光Ｌ２１の出射のタイミングを制御することによって行われる。この制御は、制御装置３０Ｃによって行われてよい。例えば、集光位置Ｆ１Ｃへの励起光Ｌ１１の照射と、集光位置Ｆ２Ｃへの励起光Ｌ２１の照射とが、時系列上で交互にかつ周期的に行われるように、励起光Ｌ１１及び励起光Ｌ２１の出射が制御される。励起光Ｌ１１及び励起光Ｌ２１を時系列上に交互に含むように変調された励起光が光源１１Ｃから出射されるともいえる。
　集光位置Ｆ１Ｃ及び集光位置Ｆ２Ｃへの励起光Ｌ１１及び励起光Ｌ２１の照射の周期は、例えば捜査範囲すべてを走査するのに要する期間（走査周期）に対して十分に短い周期に設定されてよい。この場合、ほぼ同じ走査位置に励起光Ｌ１１及び励起光Ｌ２１の照射が連続して行われるので、走査周期の間に、すべての走査位置に励起光Ｌ１１及び励起光Ｌ２１が時分割で照射される。
　同じ走査範囲が２回走査されてよく、その場合、励起光Ｌ１１及び励起光Ｌ２１の照射の周期は、走査周期と同じに設定されてよい。走査周期の２倍の期間で、すべての走査位置に励起光Ｌ１１及び励起光Ｌ２１が時分割で照射される。一つの走査周期中に励起光Ｌ１１及び励起光Ｌ２１を切替える必要がない分、各走査周期が短く設定されてよい。
　蛍光Ｌ１２及び蛍光Ｌ２２は、検出部２０によって検出される。検出部２０の検出結果は、制御装置３０Ｃによって処理される。制御装置３０Ｃについて、さらに図１１を参照して説明する。
　図１１は、制御装置３０Ｃの機能ブロックの例を示す図である。制御装置３０Ｃは、制御装置３０（図３）と比較して、照射制御部３１、記憶部３２及び演算部３３に代えて、照射制御部３１Ｃ、記憶部３２Ｃ及び演算部３３Ｃを備える点において相違する。
　照射制御部３１Ｃは、先に図１０Ａ及び図１０Ｂを参照して説明したように、集光位置Ｆ１Ｃ及び集光位置Ｆ２Ｃに励起光Ｌ１１及び励起光Ｌ２１が時分割で照射されるように、照射部１０Ｃを制御する。
　記憶部３２Ｃは、プログラム３２ａＣを記憶する。プログラム３２ａＣは、制御装置３０Ｃによって実行される制御（処理）を実現するソフトウェアである。
　演算部３３Ｃは、演算部３３（図３）と比較して、オフセット補正部３３ｂに代えて、オフセット補正部３３ｂＣを備える点において相違する。
　蛍光観察装置１Ｃでは、オフセット補正部３３ｂＣがオフセット補正を行う場合と行わない場合とがある。具体的に、励起光Ｌ１１及び励起光Ｌ２１の照射の周期が走査周期に対して十分に短く、１回の走査で蛍光信号Ｓ１及び蛍光信号Ｓ２が得られる場合には、オフセット補正部３３ｂＣは、オフセット補正を行わない。この場合には、先に図５を参照して説明したようにピーク位置が一致した蛍光信号Ｓ１及び蛍光信号Ｓ２が当初から得られるからである。一方で、励起光Ｌ１１及び励起光Ｌ２１の照射の周期が走査周期と同じであり、２回の走査で蛍光信号Ｓ１及び蛍光信号Ｓ２が得られる場合には、オフセット補正部３３ｂＣは、オフセット補正を行う。これについて、図１２を参照して説明する。
　図１２は、蛍光信号の例を概念的に示す図である。蛍光信号Ｓ１がピークを示す走査時刻を、走査時刻ｔ３と称し図示する。蛍光信号Ｓ２がピークを示す走査時刻を、走査時刻ｔ４と称し図示する。走査時刻ｔ３から走査時刻ｔ４までの時間を、オフセット時間ｐｔ２と称し図示する。オフセット時間ｐｔ２は、走査周期に相当する。オフセット時間ｐｔ２の補正は、例えば、蛍光信号Ｓ１及び蛍光信号Ｓ２を時間の関数とした場合、Ｓ１（ｔ）＝Ｓ１（ｔ－ｐｔ２）に補正、あるいは、Ｓ２（ｔ）＝Ｓ２（ｔ＋ｐｔ２）に補正することによって行われる。これらは、図１２において蛍光信号Ｓ１あるいは蛍光信号Ｓ２をオフセット時間ｐｔ２だけ右側あるいは左側にシフトさせることに相当する。
　オフセット補正後の蛍光信号Ｓ１及び蛍光信号Ｓ２に対する処理を行う合成蛍光信号生成部３３ｃ、画像生成部３３ｄ及び蛍光分子数算出部３３ｅ等についてはこれまで説明したとおりであるので、ここでは説明を繰り返さない。蛍光観察装置１Ｃのように励起光Ｌ１１及び励起光Ｌ２１を時分割で照射して特定時間断面において単一の蛍光体のみを励起することによっても複合蛍光体の分布が特定される。
４．　制御装置のハードウェア構成の例
　図１３は、制御装置のハードウェア構成例を示すブロック図である。以下では、制御装置３０（図１Ａ、図１Ｂ及び図３等を参照）について説明する。制御装置３０Ｃ（図１０Ａ、図１０Ｂ及び図１１等を参照）についても同様の説明が可能である。制御装置３０による各種処理は、ソフトウェア（プログラム３２ａ）と、以下に説明するハードウェアとの協働により実現される。
　図１３に示されるように、制御装置３０は、ＣＰＵ（Ｃｅｎｔｒａｌ　Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ　Ｕｎｉｔ）９０１、ＲＯＭ（Ｒｅａｄ　Ｏｎｌｙ　Ｍｅｍｏｒｙ）９０２、ＲＡＭ（Ｒａｎｄｏｍ　Ａｃｃｅｓｓ　Ｍｅｍｏｒｙ）９０３及びホストバス９０４ａを備える。また、制御装置３０は、ブリッジ９０４、外部バス９０４ｂ、インタフェース９０５、入力装置９０６、出力装置９０７、ストレージ装置９０８、ドライブ９０９、接続ポート９１１及び通信装置９１３を備える。制御装置３０は、ＣＰＵ９０１に代えて、又はこれとともに、ＤＳＰ若しくはＡＳＩＣなどの処理回路を有してもよい。
　ＣＰＵ９０１は、演算処理装置および制御装置として機能し、各種プログラムに従って情報処理装置１００内の動作全般を制御する。また、ＣＰＵ９０１は、マイクロプロセッサであってもよい。ＲＯＭ９０２は、ＣＰＵ９０１が使用するプログラムや演算パラメータ等を記憶する。ＲＡＭ９０３は、ＣＰＵ９０１の実行において使用するプログラムや、その実行において適宜変化するパラメータ等を一時記憶する。ＣＰＵ９０１は、例えば、制御装置３０の少なくとも演算部３３を具現し得る。
　ＣＰＵ９０１、ＲＯＭ９０２及びＲＡＭ９０３は、ＣＰＵバスなどを含むホストバス９０４ａにより相互に接続されている。ホストバス９０４ａは、ブリッジ９０４を介して、ＰＣＩ（Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ　Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ　Ｉｎｔｅｒｃｏｎｎｅｃｔ／Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ）バス等の外部バス９０４ｂに接続されている。なお、必ずしもホストバス９０４ａ、ブリッジ９０４および外部バス９０４ｂを分離構成する必要はなく、１つのバスにこれらの機能を実装してもよい。
　入力装置９０６は、例えば、マウス、キーボード、タッチパネル、ボタン、マイクロフォン、スイッチ及びレバー等、ユーザによって情報が入力される装置によって実現される。また、入力装置９０６は、例えば、赤外線やその他の電波を利用したリモートコントロール装置であってもよいし、制御装置３０の操作に対応した携帯端末やＰＤＡ等の外部接続機器であってもよい。さらに、入力装置９０６は、例えば、上記の入力手段を用いてユーザにより入力された情報に基づいて入力信号を生成し、ＣＰＵ９０１に出力する入力制御回路などを含んでいてもよい。ユーザは、この入力装置９０６を操作することにより、制御装置３０に対して各種のデータを入力したり処理動作を指示したりすることができる。
　出力装置９０７は、取得した情報をユーザに対して視覚的又は聴覚的に通知することが可能な装置で形成される。このような装置として、ＣＲＴディスプレイ装置、液晶ディスプレイ装置、プラズマディスプレイ装置、ＥＬディスプレイ装置及びランプ等の表示装置や、スピーカ及びヘッドホン等の音響出力装置や、プリンタ装置等がある。出力装置９０７は、例えば、制御装置３０の少なくとも表示部３４を具現し得る。
　ストレージ装置９０８は、データ格納用の装置である。ストレージ装置９０８は、例えば、ＨＤＤ等の磁気記憶部デバイス、半導体記憶デバイス、光記憶デバイス又は光磁気記憶デバイス等により実現される。ストレージ装置９０８は、記憶媒体、記憶媒体にデータを記録する記録装置、記憶媒体からデータを読み出す読出し装置および記憶媒体に記録されたデータを削除する削除装置などを含んでもよい。このストレージ装置９０８は、ＣＰＵ９０１が実行するプログラムや各種データ及び外部から取得した各種のデータ等を格納する。ストレージ装置９０８は、例えば制御装置３０の少なくとも記憶部３２を具現し得る。
　ドライブ９０９は、記憶媒体用リーダライタであり、情報処理装置１００に内蔵、あるいは外付けされる。ドライブ９０９は、装着されている磁気ディスク、光ディスク、光磁気ディスク、または半導体メモリ等のリムーバブル記憶媒体に記録されている情報を読み出して、ＲＡＭ９０３に出力する。また、ドライブ９０９は、リムーバブル記憶媒体に情報を書き込むこともできる。
　接続ポート９１１は、外部機器と接続されるインタフェースであって、例えばＵＳＢ（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ　Ｓｅｒｉａｌ　Ｂｕｓ）などによりデータ伝送可能な外部機器との接続口である。
　通信装置９１３は、例えば、ネットワーク９２０に接続するための通信デバイス等で形成された通信インタフェースである。通信装置９１３は、例えば、有線若しくは無線ＬＡＮ（Ｌｏｃａｌ　Ａｒｅａ　Ｎｅｔｗｏｒｋ）、ＬＴＥ（Ｌｏｎｇ　Ｔｅｒｍ　Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ）、Ｂｌｕｅｔｏｏｔｈ（登録商標）又はＷＵＳＢ（Ｗｉｒｅｌｅｓｓ　ＵＳＢ）用の通信カード等である。また、通信装置９１３は、光通信用のルータ、ＡＤＳＬ（Ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ　Ｄｉｇｉｔａｌ　Ｓｕｂｓｃｒｉｂｅｒ　Ｌｉｎｅ）用のルータ又は各種通信用のモデム等であってもよい。この通信装置９１３は、例えば、インターネットや他の通信機器との間で、例えばＴＣＰ／ＩＰ等の所定のプロトコルに則して信号等を送受信することができる。
　なお、ネットワーク９２０は、ネットワーク９２０に接続されている装置から送信される情報の有線、または無線の伝送路である。例えば、ネットワーク９２０は、インターネット、電話回線網、衛星通信網などの公衆回線網や、Ｅｔｈｅｒｎｅｔ（登録商標）を含む各種のＬＡＮ（Ｌｏｃａｌ　Ａｒｅａ　Ｎｅｔｗｏｒｋ）、ＷＡＮ（Ｗｉｄｅ　Ａｒｅａ　Ｎｅｔｗｏｒｋ）などを含んでもよい。また、ネットワーク９２０は、ＩＰ－ＶＰＮ（Ｉｎｔｅｒｎｅｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌ－Ｖｉｒｔｕａｌ　Ｐｒｉｖａｔｅ　Ｎｅｔｗｏｒｋ）などの専用回線網を含んでもよい。
　以上、制御装置３０の機能を実現可能なハードウェア構成例を示した。上記の各構成要素は、汎用的な部材を用いて実現されていてもよいし、各構成要素の機能に特化したハードウェアにより実現されていてもよい。従って、本開示を実施する時々の技術レベルに応じて、適宜、利用するハードウェア構成を変更することが可能である。
　なお、上記のような制御装置３０の各機能を実現するためのコンピュータプログラム（例えばプログラム３２ａ等）を作製し、ＰＣ等に実装することが可能である。また、このようなコンピュータプログラムが格納された、コンピュータで読み取り可能な記録媒体も提供することができる。記録媒体は、例えば、磁気ディスク、光ディスク、光磁気ディスク、フラッシュメモリ等を含む。また、上記のコンピュータプログラムは、記録媒体を用いずに、例えばネットワークを介して配信されてもよい。
５．　効果
　以上説明した蛍光観察装置は、例えば次のように特定される。図１Ａ、図１Ｂ及び図２～図７等を参照して説明したように、蛍光観察装置１は、照射部１０と、検出部２０と、演算部３３とを備える。照射部１０は、２種類以上の蛍光分子（例えば蛍光分子Ａ及び蛍光分子Ｂ）を所定構成比で含む複合蛍光体によって標識された生体試料５における空間的に異なる集光位置Ｆ１及び集光位置Ｆ２に、互いに波長の異なる励起光Ｌ１１及び励起光Ｌ２１を照射する。検出部２０は、照射部１０の照射によって集光位置Ｆ１及び集光位置Ｆ２それぞれで発生した蛍光Ｌ１２及び蛍光Ｌ２２を検出する。演算部３３は、検出部２０の検出結果から得られる蛍光Ｌ１２及び蛍光Ｌ２２それぞれの生体試料５での位置に応じた蛍光強度を示す蛍光信号Ｓ１及び蛍光信号Ｓ２に基づいて、複合蛍光体の分布を特定する。
　また、図１０Ａ、図１０Ｂ、図１１及び図１２等を参照して説明した蛍光観察装置１Ｃにおいては、照射部１０Ｃが、生体試料５における時間的に異なる集光位置Ｆ１Ｃ及び集光位置Ｆ２Ｃに、励起光Ｌ１１及び励起光Ｌ２１を照射する。演算部３３Ｃが、検出部２０の検出結果から得られる蛍光Ｌ１２及び蛍光Ｌ２２それぞれの生体試料５での位置に応じた蛍光強度を示す蛍光信号Ｓ１及び蛍光信号Ｓ２に基づいて、複合蛍光体の分布を特定する。
　上記の蛍光観察装置１又は蛍光観察装置１Ｃによれば、図４～図６等を参照して説明したように、複数の蛍光信号Ｓ１及び蛍光信号Ｓ２を用いることで、例えば単一の蛍光信号を用いる場合よりも、蛍光検出の解像度を向上させることができる。
　照射部１０は、励起光Ｌ１１及び励起光Ｌ２１で生体試料５を走査してよい。集光位置Ｆ１及び集光位置Ｆ２は、走査における空間的に異なる複数の位置であってよい。蛍光信号Ｓ１及び蛍光信号Ｓ２は、蛍光Ｌ１２及び蛍光Ｌ２２それぞれの生体試料５での走査位置に応じた蛍光強度を示してよい。演算部３３は、生体試料５での走査位置に応じた蛍光Ｌ１２及び蛍光Ｌ２２それぞれの蛍光信号Ｓ１及び蛍光信号Ｓ２に基づいて、複合蛍光体の分布を特定してよい。また、照射部１０Ｃによる集光位置Ｆ１Ｃ及び集光位置Ｆ２Ｃは、走査における時間的に異なる複数の位置であってよい。演算部３３Ｃは、生体試料５での走査位置に応じた蛍光Ｌ１２及び蛍光Ｌ２２それぞれの蛍光信号Ｓ１及び蛍光信号Ｓ２に基づいて、複合蛍光体の分布を特定してよい。これにより、生体試料５の走査範囲における複合蛍光体の分布を特定することができる。
　図２等を参照して説明したように、蛍光分子Ａ及び蛍光分子Ｂは、互いに異なる励起蛍光特性を有し、分子結合していてよい。蛍光分子Ａは、第１の波長λ１の励起光Ｌ１１が照射されると第１のスペクトルの蛍光Ｌ１２を発生してよい。蛍光分子Ｂは、第２の波長λ２の励起光Ｌ２１が照射されると第２のスペクトルの蛍光Ｌ２２を発生してよい。このように異なる励起蛍光特性を有する蛍光分子を分子結合させた複合蛍光体で生体試料５を試料染色することにより、生体試料５での同じ位置（点）に蛍光分子Ａ及び蛍光分子Ｂの両方の励起蛍光特性を備えさせることができる。
　図４～図６等を参照して説明したように、演算部３３及び演算部３３Ｃは、励起光Ｌ１１及び励起光Ｌ２１それぞれの蛍光信号Ｓ１及び蛍光信号Ｓ２を生体試料５での位置ごとに乗算することで、複合蛍光体の分布を特定してよい。この場合、演算部３３及び演算部３３Ｃは、蛍光分子Ａ及び蛍光分子Ｂそれぞれの蛍光信号Ｓ１及び蛍光信号Ｓ２を所定構成比に応じた比で乗算してよい。演算部３３及び演算部３３Ｃは、蛍光分子Ａ及び蛍光分子Ｂそれぞれの蛍光信号Ｓ１及び蛍光信号Ｓ２を所定構成比に応じた比で累乗してよい。このように蛍光信号Ｓ１及び蛍光信号Ｓ２を乗算することによって、ピーク幅の狭い合成蛍光信号Ｓが得られ、その結果、蛍光検出の解像度を向上させることができる。
　検出部２０は、蛍光Ｌ１２及び蛍光Ｌ２２のスペクトルを検出してよい。演算部３３及び演算部３３Ｃは、検出部２０によって検出されたスペクトルと所定スペクトルとの内積から蛍光強度を算出してよい。例えばこのようにして、生体試料５での位置に応じた蛍光Ｌ１２及び蛍光Ｌ２２の蛍光強度を算出することができる。
　照射部１０及び照射部１０Ｃは、生体試料５の深さ方向（Ｚ軸方向）に励起光Ｌ１１及び励起光Ｌ２１を走査してよい。これにより、生体試料５内部での複合蛍光体の分布を特定することができる。
　照射部１０及び照射部１０Ｃは、二次元方向（Ｘ軸方向、Ｙ軸方向及びＺ軸方向のうちの２つの軸方向）に励起光Ｌ１１及び励起光Ｌ２１を走査してよい。演算部３３及び演算部３３Ｃは、蛍光Ｌ１２及び蛍光Ｌ２２それぞれの生体試料５での位置に応じた蛍光信号Ｓ１及び蛍光信号Ｓ２から２次元蛍光画像を生成してよい。これにより、解像度が向上した２次元画像を得ることができる。
　演算部３３及び演算部３３Ｃは、励起光Ｌ１１及び励起光Ｌ２１それぞれの生体試料５での位置に応じた蛍光信号Ｓ１及び蛍光信号Ｓ２から生体試料５での位置ごとの蛍光分子数を算出してよい。各位置での蛍光分子数を高解像度で把握することができる。
　照射部１０のように、空間的に異なる集光位置Ｆ１及び集光位置Ｆ２に励起光Ｌ１１及び励起光Ｌ２１を同時に照射してもよい。照射部１０Ｃのように、空間的に同一の集光位置Ｆ１Ｃ及び集光位置Ｆ２Ｃに励起光Ｌ１１及び励起光Ｌ２１を時分割で照射してもよい。これにより、各集光位置にある複合蛍光体は、自身に蛍光Ｌ１２又は励起光Ｌ２１の集光が及ぶときにのみ支配的に蛍光Ｌ１２又は蛍光Ｌ２２を発生するため、他の蛍光体からの信号の混ざり込みを抑制することができる。すなわち、各蛍光の分離能力を高めることができる。
　図９Ａ及び図９Ｂを参照して説明した照射部１０Ｂのように、集光位置Ｆ１Ｂ及び集光位置Ｆ２Ｂそれぞれに対して設けられたレンズ１４Ｂ１及びレンズ１４Ｂ２を含んでもよい。これにより、励起光Ｌ１１及び励起光Ｌ２１を複数の光軸より生体試料５に入射させることができる。
　制御装置３０は、蛍光観察装置１とは別に設けられてよく、この場合、照射部１０及び検出部２０を備える蛍光観察装置と、検出部２０の検出結果を用いる処理に使われるソフトウェア（プログラム３２ａ）とを含んで構成される蛍光観察システムが提供される（制御装置３０Ｃ及びプログラム３２ａＣ等も同様）。このような蛍光観察システムも、本開示の一態様である。ソフトウェアは、蛍光観察装置で実行され、検出部２０の検出結果から得られる蛍光信号Ｓ１及び蛍光信号Ｓ２に基づいて、複合蛍光体の分布を特定することを実現する。蛍光観察システムによっても、蛍光検出の解像度を向上させることができる。
　図７等を参照して説明した蛍光観察方法も、本開示の一態様である。すなわち、蛍光観察方法は、集光位置Ｆ１及び集光位置Ｆ２（集光位置Ｆ１Ａ及び集光位置Ｆ２Ａ、集光位置Ｆ１Ｂ及び集光位置Ｆ２Ｂあるいは集光位置Ｆ１Ｃ及び集光位置Ｆ２Ｃでもよい）に、励起光Ｌ１１及び励起光Ｌ２１を照射し（ステップＳ１０２）、照射によって集光位置Ｆ１及び集光位置Ｆ２（集光位置Ｆ１Ａ及び集光位置Ｆ２Ａ、集光位置Ｆ１Ｂ及び集光位置Ｆ２Ｂあるいは集光位置Ｆ１Ｃ及び集光位置Ｆ２Ｃでもよい）で発生した蛍光Ｌ１２及び蛍光Ｌ２２を検出し（ステップＳ１０３）、検出の結果から得られる蛍光信号Ｓ１及び蛍光信号Ｓ２に基づいて、複合蛍光体の分布を特定する（ステップＳ１０４）。このような蛍光観察方法によっても、蛍光検出の解像度を向上させることができる。
　なお、本開示に記載された効果は、あくまで例示であって、開示された内容に限定されない。他の効果があってもよい。
　以上、本開示の実施形態について説明したが、本開示の技術的範囲は、上述の実施形態そのままに限定されるものではなく、本開示の要旨を逸脱しない範囲において種々の変更が可能である。また、異なる実施形態及び変形例にわたる構成要素を適宜組み合わせてもよい。
　また、本明細書に記載された各実施形態における効果はあくまで例示であって限定されるものでは無く、他の効果があってもよい。
　例えば、上記実施形態では、複合蛍光体が２種類の蛍光分子を含む例について説明した。ただし、複合蛍光体は３種類以上の蛍光分子を含んでもよい。この場合、それぞれの蛍光分子の励起蛍光特性に応じた数の励起光を照射し、対応する蛍光を検出するように、照射部及び検出部が適宜変更されてよい。
　なお、本技術は以下のような構成も取ることができる。
（１）
　２種類以上の蛍光分子を所定構成比で含む複合蛍光体によって標識された生体試料における空間的又は時間的に異なる複数の位置に、互いに波長の異なる複数の励起光を照射する照射部と、
　前記照射部の照射によって前記複数の位置のそれぞれで発生した蛍光を検出する検出部と、
　前記検出部の検出結果から得られる前記蛍光それぞれの前記生体試料での位置に応じた蛍光強度を示す蛍光信号に基づいて、前記複合蛍光体の分布を特定する演算部と、
　を備える、
　蛍光観察装置。
（２）
　前記照射部は、前記複数の励起光で前記生体試料を走査し、
　前記複数の位置は、走査における前記時間的又は空間的に異なる複数の位置であり、
　前記蛍光信号は、前記蛍光それぞれの前記生体試料での走査位置に応じた蛍光強度を示し、
　前記演算部は、前記生体試料での前記走査位置に応じた前記蛍光それぞれの前記蛍光信号に基づいて、前記複合蛍光体の分布を特定する、
　（１）に記載の蛍光観察装置。
（３）
　前記２種類以上の蛍光分子は、互いに異なる励起蛍光特性を有し、分子結合している、
　（１）又は（２）に記載の蛍光観察装置。
（４）
　前記２種類以上の蛍光分子は、第１の波長の励起光が照射されると第１のスペクトルの蛍光を発生する蛍光分子と、前記第１の波長とは異なる第２の波長の励起光が照射されると前記第１のスペクトルとは異なる第２のスペクトルの蛍光を発生する蛍光分子とを含む、
　（３）に記載の蛍光観察装置。
（５）
　前記演算部は、前記蛍光それぞれの前記蛍光信号を前記生体試料での位置ごとに乗算することで、前記複合蛍光体の分布を特定する、
　（１）～（４）のいずれかに記載の蛍光観察装置。
（６）
　前記演算部は、前記蛍光分子それぞれの前記蛍光信号を前記所定構成比に応じた比で乗算する、
　（５）に記載の蛍光観察装置。
（７）
　前記演算部は、前記蛍光分子それぞれの前記蛍光信号を前記所定構成比に応じた比で累乗する、
　（６）に記載の蛍光観察装置。
（８）
　前記検出部は、前記蛍光のスペクトルを検出し、
　前記演算部は、前記検出部によって検出されたスペクトルと所定スペクトルとの内積から前記蛍光強度を算出する、
　（１）～（７）のいずれかに記載の蛍光観察装置。
（９）
　前記照射部は、前記生体試料の深さ方向に前記複数の励起光を走査する、
　（１）～（８）のいずれかに記載の蛍光観察装置。
（１０）
　前記照射部は、二次元方向に前記複数の励起光を走査し、
　前記演算部は、前記蛍光それぞれの前記生体試料での位置に応じた前記蛍光信号から２次元蛍光画像を生成する、
　（１）～（９）のいずれかに記載の蛍光観察装置。
（１１）
　前記演算部は、前記蛍光それぞれの前記生体試料での位置に応じた前記蛍光信号から前記生体試料での位置ごとの蛍光分子数を算出する、
　（１）～（１０）のいずれかに記載の蛍光観察装置。
（１２）
　前記複数の位置は、前記空間的に異なる複数の位置であり、
　前記照射部は、前記複数の位置に前記互いに波長の異なる前記励起光を同時に照射する、
　（１）～（１１）のいずれかに記載の蛍光観察装置。
（１３）
　前記照射部は、前記複数の位置それぞれに対して設けられたレンズを含む、
　（１２）に記載の蛍光観察装置。
（１４）
　前記複数の位置は、前記時間的に異なる複数の位置であり、
　前記照射部は、前記生体試料での空間的に同一の位置に前記複数の励起光を時分割で照射する、
　（１）～（１１）のいずれかに記載の蛍光観察装置。
（１５）
　２種類以上の蛍光分子を所定構成比で含む複合蛍光体によって標識された生体試料における空間的又は時間的に異なる複数の位置に、互いに波長の異なる複数の励起光を照射する照射部、及び、前記照射部の照射によって前記複数の位置のそれぞれで発生した蛍光を検出する検出部を備える蛍光観察装置と、前記検出部の検出結果を用いる処理に使われるソフトウェアとを含んで構成される蛍光観察システムであって、
　前記ソフトウェアは、前記蛍光観察装置で実行され、
　前記検出部の検出結果から得られる前記蛍光それぞれの前記生体試料での位置に応じた蛍光強度を示す蛍光信号に基づいて、前記複合蛍光体の分布を特定すること、
　を実現する、
　蛍光観察システム。
（１６）
　２種類以上の蛍光分子を所定構成比で含む複合蛍光体によって標識された生体試料における空間的又は時間的に異なる複数の位置に、互いに波長の異なる複数の励起光を照射し、
　前記照射によって前記複数の位置のそれぞれで発生した蛍光を検出し、
　前記検出の結果から得られる前記蛍光それぞれの前記生体試料での位置に応じた蛍光強度を示す蛍光信号に基づいて、前記複合蛍光体の分布を特定する、
　蛍光観察方法。
　　１　蛍光観察装置
　　５　生体試料
　１０　照射部
　１１　光源
　１２　ミラー
　１３　ミラー
　１４　レンズ
　１５　ステージ
　２０　検出部
　２１　スリット
　２２　光センサ
　３０　制御装置
　３１　照射制御部
　３２　記憶部
　３３　演算部
３３ａ　蛍光強度算出部
３３ｂ　オフセット補正部
３３ｃ　合成蛍光信号生成部
３３ｄ　画像生成部
３３ｅ　蛍光分子数算出部
　３４　表示部

Claims (16)

  1. 　２種類以上の蛍光分子を所定構成比で含む複合蛍光体によって標識された生体試料における空間的又は時間的に異なる複数の位置に、互いに波長の異なる複数の励起光を照射する照射部と、
    　前記照射部の照射によって前記複数の位置のそれぞれで発生した蛍光を検出する検出部と、
    　前記検出部の検出結果から得られる前記蛍光それぞれの前記生体試料での位置に応じた蛍光強度を示す蛍光信号に基づいて、前記複合蛍光体の分布を特定する演算部と、
    　を備える、
    　蛍光観察装置。
  2. 　前記照射部は、前記複数の励起光で前記生体試料を走査し、
    　前記複数の位置は、走査における前記時間的又は空間的に異なる複数の位置であり、
    　前記蛍光信号は、前記蛍光それぞれの前記生体試料での走査位置に応じた蛍光強度を示し、
    　前記演算部は、前記生体試料での前記走査位置に応じた前記蛍光それぞれの前記蛍光信号に基づいて、前記複合蛍光体の分布を特定する、
    　請求項１に記載の蛍光観察装置。
  3. 　前記２種類以上の蛍光分子は、互いに異なる励起蛍光特性を有し、分子結合している、
    　請求項１に記載の蛍光観察装置。
  4. 　前記２種類以上の蛍光分子は、第１の波長の励起光が照射されると第１のスペクトルの蛍光を発生する蛍光分子と、前記第１の波長とは異なる第２の波長の励起光が照射されると前記第１のスペクトルとは異なる第２のスペクトルの蛍光を発生する蛍光分子とを含む、
    　請求項３に記載の蛍光観察装置。
  5. 　前記演算部は、前記蛍光それぞれの前記蛍光信号を前記生体試料での位置ごとに乗算することで、前記複合蛍光体の分布を特定する、
    　請求項１に記載の蛍光観察装置。
  6. 　前記演算部は、前記蛍光分子それぞれの前記蛍光信号を前記所定構成比に応じた比で乗算する、
    　請求項５に記載の蛍光観察装置。
  7. 　前記演算部は、前記蛍光分子それぞれの前記蛍光信号を前記所定構成比に応じた比で累乗する、
    　請求項６に記載の蛍光観察装置。
  8. 　前記検出部は、前記蛍光のスペクトルを検出し、
    　前記演算部は、前記検出部によって検出されたスペクトルと所定スペクトルとの内積から前記蛍光強度を算出する、
    　請求項１に記載の蛍光観察装置。
  9. 　前記照射部は、前記生体試料の深さ方向に前記複数の励起光を走査する、
    　請求項１に記載の蛍光観察装置。
  10. 　前記照射部は、二次元方向に前記複数の励起光を走査し、
    　前記演算部は、前記蛍光それぞれの前記生体試料での位置に応じた前記蛍光信号から２次元蛍光画像を生成する、
    　請求項１に記載の蛍光観察装置。
  11. 　前記演算部は、前記蛍光それぞれの前記生体試料での位置に応じた前記蛍光信号から前記生体試料での位置ごとの蛍光分子数を算出する、
    　請求項１に記載の蛍光観察装置。
  12. 　前記複数の位置は、前記空間的に異なる複数の位置であり、
    　前記照射部は、前記複数の位置に前記互いに波長の異なる前記励起光を同時に照射する、
    　請求項１に記載の蛍光観察装置。
  13. 　前記照射部は、前記複数の位置それぞれに対して設けられたレンズを含む、
    　請求項１２に記載の蛍光観察装置。
  14. 　前記複数の位置は、前記時間的に異なる複数の位置であり、
    　前記照射部は、前記生体試料での空間的に同一の位置に前記複数の励起光を時分割で照射する、
    　請求項１に記載の蛍光観察装置。
  15. 　２種類以上の蛍光分子を所定構成比で含む複合蛍光体によって標識された生体試料における空間的又は時間的に異なる複数の位置に、互いに波長の異なる複数の励起光を照射する照射部、及び、前記照射部の照射によって前記複数の位置のそれぞれで発生した蛍光を検出する検出部を備える蛍光観察装置と、前記検出部の検出結果を用いる処理に使われるソフトウェアとを含んで構成される蛍光観察システムであって、
    　前記ソフトウェアは、前記蛍光観察装置で実行され、
    　前記検出部の検出結果から得られる前記蛍光それぞれの前記生体試料での位置に応じた蛍光強度を示す蛍光信号に基づいて、前記複合蛍光体の分布を特定すること、
    　を実現する、
    　蛍光観察システム。
  16. 　２種類以上の蛍光分子を所定構成比で含む複合蛍光体によって標識された生体試料における空間的又は時間的に異なる複数の位置に、互いに波長の異なる複数の励起光を照射し、
    　前記照射によって前記複数の位置のそれぞれで発生した蛍光を検出し、
    　前記検出の結果から得られる前記蛍光それぞれの前記生体試料での位置に応じた蛍光強度を示す蛍光信号に基づいて、前記複合蛍光体の分布を特定する、
    　蛍光観察方法。
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