JP2004177662A

JP2004177662A - 顕微鏡の照明装置及びその照明装置を用いた画像処理装置

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Publication number: JP2004177662A
Application number: JP2002343807A
Authority: JP
Inventors: Atsushi Miyawaki; 敦史宮脇; Ten Fukano; 天深野; Yasushi Aono; 寧青野
Original assignee: Olympus Corp; RIKEN Institute of Physical and Chemical Research
Current assignee: Olympus Corp; RIKEN Institute of Physical and Chemical Research
Priority date: 2002-11-27
Filing date: 2002-11-27
Publication date: 2004-06-24
Anticipated expiration: 2022-11-27
Also published as: US20070008615A1; US7236298B2; US7126752B2; JP4521155B2; US20040120034A1; EP1424579A1

Abstract

【課題】標本に複数の波長の光を同時にかつ同一の照射強度分布で照射することができ、夫々の光の波長や強度を独立して設定することができる顕微鏡の照明装置及びその照明装置を用いた画像処理装置を提供する。
【解決手段】光源１１と、光源１１からの光束を第１及び第２の照射光の光束Ａ，Ｂに分岐する半透鏡２１と、第１及び第２の照射光の波長を選択する励起フィルタ２４Ａ，２４Ｂと、波長が選択された第１及び第２の照射光の光束Ａ，Ｂを単一の光束に合成する半透鏡２５と、半透鏡２５で合成された光束を試料４３に導くとともに、試料４３からの光を透過するダイクロイックミラー４１と、対物レンズ４２と、試料４３からの蛍光を第１及び第２の波長で励起された蛍光に分離して撮像するカメラ５３Ａ，５３Ｂと、撮像素子５３Ａ，５３Ｂで撮像された蛍光像を処理する画像処理部６１とを備えている。
【選択図】図１

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、複数の光の波長を自由に選択でき、かつ、その光強度を独立して調整でき、それらの光を同時に試料に照射しうる顕微鏡の照明装置及びその照明装置を用いた画像処理装置に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
一般に、蛍光顕微鏡は、医学や生物学をはじめ、その他の分野において生物組織や細胞の蛍光標識を施したタンパク質や遺伝子等を検出する目的で広く用いられている。特に近年では、複数の蛍光色素で染色した標本や複数の蛍光タンパク質を発現させた標本を時間的に一度に観察する多重蛍光検出が、遺伝子の解析や、細胞内構造の解明に威力を発揮している。多重蛍光検出では、多重蛍光標本を励起するために複数波長による照明光を標本に照射する手段が広く用いられているが、これに際しては、各々の波長を照射する時間的間隔が短いこと、また、標本面上での波長毎の照射光強度分布が時間的かつ空間的に変化しないことが、観察データの正確性を左右する重要な要素となる。
【０００３】
従来、多重蛍光標本を励起するための複数波長による照明光を標本に照射する手段としては、フィルタ切換手段を用いて励起光の波長を時分割するようにした装置（例えば、特許文献１参照）や、２つの独立した光源を用いた装置（例えば、特許文献２参照）が提案されている。また、従来、単一の光源からの光を分割して標本に照射するようにした装置（例えば、特許文献３）が提案されている。
【０００４】
【特許文献１】
特開平０９−００５２４３号公報
【特許文献２】
特開平０７−０５６０９２号公報
【特許文献３】
特開平１０−０９０６０８号公報
【０００５】
特許文献１に記載の装置は、図１１に示すように、測定対象の生体組織を複数の蛍光処理で予め処理し、複数の励起光選択用フィルタ１５１ａを１つの回転円板１５１ｂ内の所定箇所に設置したフィルタ切換手段１５１と、複数の蛍光選択用フィルタ１５２ａを回転円板１５２ｂ内の他の箇所に設置したフィルタ切換手段１５２とを用い、それらを同期して回転させることにより、第１の励起光と第２の励起光を時分割で該生体組織に照射するとともに、該生体組織から生ずる第１の蛍光と第２の蛍光を順次記録し、例えば、細胞内イオン濃度の変化と膜電位変化夫々を実質的に同時に測定するように構成されている。
【０００６】
また、特許文献２に記載の装置は、図１２に示すように、キセノンランプ等の白色光源１６１Ａ，１６１Ｂを２つ用い、夫々のランプからの光をコレクタレンズ１６２Ａ，１６２Ｂを介して集光した後、透過波長域の異なる励起フィルタ１６３Ａ，１６３Ｂを透過させて波長の選択を行い、選択された波長の光をダイクロイックミラー１６４で合成して、観察光学系１６５に導入するように構成されている。特許文献２に記載の装置によれば、励起フィルタ１６３Ａ，１６３Ｂを適宜交換することにより、所望の波長で照明することができる。
【０００７】
また、特許文献３に記載の装置は、図１３に示すように、照射用光源１７１から出射される照射光を分岐光学系１７２を介して分割し、各々の光Ａ，Ｂを試料１７３上の異なる部位に照射するように構成されている。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
しかし、特許文献１に記載の装置では、第１の励起光を選択するフィルタと第２の励起光を選択するフィルタまたは第１の蛍光を選択するフィルタと第２の蛍光を選択するフィルタを回転によって切り替えるためのわずかな時間のロスが生じ、この時間のロスは線虫のような動きの速い試料や心筋内のカルシウムイオン濃度の伝播等のような変化の速い現象を測定するには不適である。
また、このような回転円板を駆動するための手段としては、一般にモーター等が用いられるが、モーターによって発生する振動の影響で焦点がずれてしまう等の問題が生ずる。したがって、回転円板を駆動する際に生じる振動を低減するために顕微鏡一式を空気ばね等で構成される防振台の上に載せる等の措置が必要となる。
【０００９】
回転円板等の機械的駆動部を有しない手法としては、複数の特定の波長において透過率がピークを持つような干渉フィルタ（励起フィルタ）を用い、これにより試料に複数の波長の光を完全の同時に照射する手法が考えられる。この手法によれば、機械的駆動部を有しないため振動の発生等の問題も生じない。しかし、このような特性を持つように作製された励起フィルタは、製作後にその透過特性を改変することが困難である。したがって、例えば、２色の異なる色素で染色された試料を測定する場合、一方の色素に対応する蛍光が強く、他方の色素に対応する蛍光が弱い場合には、夫々の色素に対応する波長の励起光の強度の調整ができないといった問題がある。
【００１０】
また、特許文献１に記載の装置では、励起光を試料１５７に導くダイクロイックミラー１５８には、２つあるいは３つの特定の波長にのみ高い反射特性をもつダイクロイックミラーが用いられる。一般に、まず、このダイクロイックミラーを作成し、次いでダイクロイックミラーの反射特性に合わせて励起フィルタが設計・製作されるが、このダイクロイックミラーの反射ピーク波長と励起フィルタの透過ピーク波長とを完全に合致させることは難しく、結果として非常にコストが高価なものになってしまうという問題もある。
【００１１】
また、特許文献２に記載の装置では、光源の強度は２つの光源ごとにランダムに変動するため、夫々の光源からの光で励起された蛍光像のレシオを計算した場合、この変動によってレシオ値が不確かなものとなってしまうという問題がある。
【００１２】
また、特許文献３に記載の装置は、単一波長の光源からの光を分割して試料上の異なる複数の部位に照射することを目的として構成されたものであり、分割した光を再び同一の光束として合成する手段や波長を分離する手段を具備していないため、標本に複数の波長の光を同一の照射強度分布で照射することができない。
【００１３】
本発明は、上記問題点を解決するためになされたものであり、標本に複数の波長の光を同時にかつ同一の照射強度分布で照射することができ、夫々の光の波長や強度を独立して設定することができる顕微鏡の照明装置及びその照明装置を用いた画像処理装置を提供することを目的とする。
【００１４】
【課題を解決するための手段】
上記の目的を達成するため、本第１の発明による顕微鏡の照明装置は、白色光源と、前記光源から出射された光束を複数の照射光の光束に分岐する光束分割手段と、前記光束分割手段により分岐された夫々の照明光の光路上に夫々設けられた、各照明光の波長を選択する波長選択手段と、波長が選択された前記複数の照射光の光束を単一の光束に合成する光束合成手段と、を備えることを特徴としている。
【００１５】
また、本第２の発明による顕微鏡の照明装置は、白色光源と、前記光源から出射された光束を第１の照射光の光束と第２の照射光の光束とに分岐する光束分割手段と、前記第１の照射光の波長を選択する第１の波長選択手段と、前記第２の照射光の波長を選択する第２の波長選択手段と、波長が選択された前記第１の照射光の光束と波長が選択された前記第２の照射光の光束とを単一の光束に合成する光束合成手段と、を備えることを特徴としている。
【００１６】
また、本第３の発明による顕微鏡の照明装置及びその照明装置を用いた画像処理装置は、白色光源と、前記光源から出射された光束を複数の照射光の光束に分岐する光束分割手段と、前記光束分割手段により分岐された夫々の照明光の光路上に夫々設けられた、各照明光の波長を選択する波長選択手段と、波長が選択された前記複数の照射光の光束を単一の光束に合成する光束合成手段と、前記光束合成手段で合成された光束を試料に照射する方向に導くとともに、試料からの光を透過するミラーと、前記ミラーと試料との間に配置された対物レンズと、前記対物レンズ及び前記ミラーを通過した前記試料からの蛍光を夫々の波長で励起された蛍光に分離して撮像する撮像素子と、前記撮像素子で撮像された蛍光像を処理する画像処理手段と、を備えることを特徴としている。
【００１７】
また、本第４の発明による顕微鏡の照明装置及びその照明装置を用いた画像処理装置は、白色光源と、前記光源から出射された光束を第１の照射光の光束と第２の照射光の光束とに分岐する光束分割手段と、前記第１の照射光の波長を選択する第１の波長選択手段と、前記第２の照射光の波長を選択する第２の波長選択手段と、波長が選択された前記第１の照射光の光束と波長が選択された前記第２の照射光の光束とを単一の光束に合成する光束合成手段と、前記光束合成手段で合成された光束を試料に照射する方向に導くとともに、試料からの光を透過するミラーと、前記ミラーと試料との間に配置された対物レンズと、前記対物レンズ及び前記ミラーを通過した前記試料からの蛍光を第１の波長で励起された蛍光と第２の波長で励起された蛍光とに分離して撮像する撮像素子と、前記撮像素子で撮像された蛍光像を処理する画像処理手段と、を備えることを特徴としている。
【００１８】
また、本第５の発明による顕微鏡の照明装置及びその照明装置を用いた画像処理装置は、白色光源と、前記光源から出射された光束を複数の照射光の光束に分岐する光束分割手段と、前記光束分割手段により分岐された夫々の照明光の光路上に夫々設けられた、各照明光の波長を選択する波長選択手段と、波長が選択された前記複数の照射光の光束を単一の光束に合成する光束合成手段と、前記光束合成手段で合成された光束を試料に照射する方向に導く第１の対物レンズと、前記試料を挟んで前記第１の対物レンズに対向して配置された第２の対物レンズと、前記第２の対物レンズを通過した前記試料からの蛍光を夫々の波長で励起された蛍光に分離して撮像する撮像素子と、前記撮像素子で撮像された蛍光像を処理する画像処理手段と、を備えることを特徴としている。
【００１９】
また、本第６の発明による顕微鏡の照明装置及びその照明装置を用いた画像処理装置は、白色光源と、前記光源から出射された光束を第１の照射光の光束と第２の照射光の光束とに分岐する光束分割手段と、前記第１の照射光の波長を選択する第１の波長選択手段と、前記第２の照射光の波長を選択する第２の波長選択手段と、波長が選択された前記第１の照射光の光束と波長が選択された前記第２の照射光の光束とを単一の光束に合成する光束合成手段と、前記光束合成手段で合成された光束を試料に照射する方向に導く第１の対物レンズと、前記試料を挟んで前記第１の対物レンズに対向して配置された第２の対物レンズと、前記第２の対物レンズを通過した前記試料からの蛍光を第１の波長で励起された蛍光と第２の波長で励起された蛍光とに分離して撮像する撮像素子と、前記撮像素子で撮像された蛍光像を処理する画像処理手段と、を備えることを特徴としている。
【００２０】
【発明の実施の形態】
実施例の説明に先立ち、本発明の作用効果について説明する。
本第１又は第２の発明のように構成すると、１個の光源のみで、異なる複数又は２つの波長域の光で試料を照明することができるので、複数の光源を用いた場合のように、各光源の空間的な強度分布の違いの影響を受けることなく均一な照明が可能となる。
また、１個の光源のみで、異なる複数又は２つの波長域の光で試料を励起することができるので、複数の光源を用いた場合のように、各光源の時間的な変動の違いが生じない。
また、異なる複数又は２つの波長の光を時間的に完全に同時に試料を照明することができる。
【００２１】
また、本第３又は第４の発明のように構成すると、１個の光源のみで、異なる複数又は２つの波長域の光で試料を照明することができるので、複数の光源を用いた場合のように、各光源の空間的な強度分布の違いの影響を受けることなく均一な照明が可能となる。
また、１個の光源のみで、異なる複数又は２つの波長域光で試料を励起することができるので、複数の光源を用いた場合のように、各光源の時間的な変動の違いの影響を受けることなく、レシオ画像を確実に得ることができる。
また、異なる複数又は２つの波長の光で時間的に完全に同時に励起した蛍光像を取得できるので、変化の速い現象や、動きの速い試料を観察することができる。
また、ミラーの反射ピーク波長に合わせて最適な励起フィルタを選ぶことができるので、高価なデュアルピークの励起フィルターなど、ピーク波長が複数となる特性を有する励起フィルタを用いる必要がなく、結果としてコストを低減させることができる。
【００２２】
本第５又は第６の発明のように構成すると、励起光と蛍光が別の光路をとるため、ダイクロイックミラーや半透鏡を入れて励起光と蛍光を分離する必要がなくなる。このため、励起光及び蛍光を効率良く伝送することができ、特に暗い蛍光試料を観察する場合に有効となる。
また、高価なデュアルダイクロイックミラーを用いる必要がないため、コストを低減させることができる。
【００２３】
更に、本第１〜６の発明は、次のように構成すると好ましい。
本第７の発明として、本第３又は第５の発明による顕微鏡の照明装置及びその照明装置を用いた画像処理装置は、前記複数の照射光のうちの少なくともいずれかの照明光の強度を調整する光量調整手段を更に備えるのが好ましい。
また、本第８の発明として、本第４又は第６の発明による顕微鏡の照明装置及びその照明装置を用いた画像処理装置は、前記第１の照射光の強度を調整する第１の光量調整手段と前記第２の照射光の強度を調整する第２の光量調整手段の双方またはいずれか一方を更に備えるのが好ましい。
【００２４】
本第７又は第８の発明のように構成すると、複数又は２つの励起光強度のバランスを自由に変えることができ、一方の励起光に対応する蛍光の強度が、他方の励起光に対応する蛍光の強度よりも極端に強い場合でも、励起光強度のバランスを調整して、双方の励起光に対応する蛍光強度を同等にすることにより、カメラのダイナミックレンジを有効に活用することができる。
また、減光フィルタを時間的に切り替える必要がなく、不要な振動の発生を抑え、振動にともなう焦点位置がずれることもない。
【００２５】
また、本第９の発明として、本第３又は第５の発明による顕微鏡の照明装置及びその照明装置を用いた画像処理装置は、前記複数の照射光のうちの少なくともいずれかの照明光の偏光方向を選択する偏光方向選択手段を更に備えるのが好ましい。
また、本第１０の発明として、本第４又は第６の発明による顕微鏡の照明装置及びその照明装置を用いた画像処理装置は、前記第１の照射光の偏光方向を選択する第１の偏光方向選択手段と前記第２の照射光の偏光方向を選択する第２の偏光方向選択手段の双方またはいずれか一方を更に備えるのが好ましい。
【００２６】
本第９又は第１０の発明のように構成すると、励起スペクトルが双峰型でかつ、その励起スペクトルの形が、例えばカルシウムイオンの濃度に依存して変化するような蛍光物質を用いる場合、偏光方向が互いに直行する２つの波長の励起光で同時に試料を励起して蛍光を発生させる。その蛍光のうち、夫々の励起光の偏光方向と同一の偏光方向を有する成分を分離して画像化し、さらには、得られた２つの画像の比を計算してレシオ画像を測定することにより、例えば、カルシウムイオンの濃度の変化を時間のずれをまったく生じさせずに完全に同一の時間で測定することができ、変化が早い現象や動きの速い試料でも測定することが可能となる。
【００２７】
また、本第１１の発明として、本第３又は第５の発明による顕微鏡の照明装置及びその照明装置を用いた画像処理装置は、前記複数の照射光のうちの少なくともいずれかの照明光の波長分布を監視する波長分布監視手段を更に備えるのが好ましい。
また、本第１２の発明として、本第４又は第６の発明による顕微鏡の照明装置及びその照明装置を用いた画像処理装置は、前記第１及び前記第２の照射光の双方または一方の波長分布を監視する波長分布監視手段を更に備えるのが好ましい。
【００２８】
本第１１又は第１２の発明のように構成すると、試料に入射する光の波長分布を確実に監視することができる。
【００２９】
また、本第１３の発明として、本第３又は第４の発明による顕微鏡の照明装置及びその照明装置を用いた画像処理装置は、前記ミラーが半透鏡であるのが好ましい。
【００３０】
本第１３の発明のように構成すると、反射率及び透過率に波長依存性がほとんどない半透鏡を用いることで、ミラーの反射特性に制約されずに、用いる蛍光物質に合わせて励起フィルタ及び蛍光フィルタを最適に選択することができる。また、高価なデュアルダイクロイックミラーを用いる必要がないため、コストを低減させることができる。
【００３１】
また、本第１４の発明として、本第３〜第６のいずれかの発明による顕微鏡の照明装置及びその照明装置を用いた画像処理装置は、前記光束分割手段及び前記光束合成手段がダイクロイックミラーであるのが好ましい。
【００３２】
本第１４の発明のように構成すると、光束分割手段及び光束合成手段として半透鏡を用いた場合と比べて励起光のロスを最小限に抑え、試料を励起することができるので、特に暗い試料を観察する場合に有効である。
【００３３】
また、本第１５の発明として、本第３〜第６のいずれかの発明による顕微鏡の照明装置及びその照明装置を用いた画像処理装置は、前記光束分割手段及び前記光束合成手段が偏光ビームスプリッタであるのが好ましい。
【００３４】
本第１５の発明のように、光束分割手段及び光束合成手段として偏光ビームスプリッタを用いると、光学系を簡素化することができ、かつ、本第９又は第１０の発明と同等の効果を得ることができる。また、半透鏡を用いるのに比べて光源から出射した光のロスが少なく、効率良く試料に光を照明することができる。
【００３５】
なお、本第１６の発明として、本第３、第５、第７、第９、第１１のいずれかの発明による顕微鏡の照明装置及びその照明装置を用いた画像処理装置は、前記複数の波長選択手段のうちの少なくともいずれかが、前記光路分岐手段により分岐された光路上に挿脱可能に配置されるのが好ましい。
また、本第１７の発明として、本第４、第６、第８、第１０、第１２のいずれかの発明による顕微鏡の照明装置及びその照明装置を用いた画像処理装置は、前記第１の波長選択手段と前記第２の波長選択手段の少なくともいずれかが、前記光路分岐手段により分岐された光路上に挿脱可能に配置されるのが好ましい。
【００３６】
【実施例】
以下、本発明の実施例を図面を用いて説明する。
第１実施例
図１は本発明の第１実施例にかかる蛍光顕微鏡の照明装置及びその照明装置を用いた画像処理装置の概略構成図である。
本実施例の蛍光顕微鏡の照明装置及びその照明装置を用いた画像処理装置は、アークやフィラメントやＬＥＤ等により点灯される白色光源１１と、光源１１から出射された光束を第１の照射光の光束と第２の照射光の光束とに分岐する光束分割手段である半透鏡２１と、第１の照射光の波長を選択する第１の波長選択手段である励起フィルタ２４Ａと、第２の照射光の波長を選択する第２の波長選択手段である励起フィルタ２４Ｂと、波長が選択された第１の照射光の光束と波長が選択された第２の照射光の光束とを単一の光束に合成する光束合成手段である半透過鏡２５と、半透過鏡２５で合成された光束を試料４３に照射する方向に導くとともに、試料４３からの光を透過するミラーであるダイクロイックミラー４１と、ダイクロイックミラー４１と試料４３との間に配置された対物レンズ４２と、対物レンズ４２及びダイクロイックミラー４１を通過した試料４３からの蛍光を夫々の波長で励起された蛍光に分離して撮像する撮像素子であるカメラ５３Ａ，５３Ｂと、カメラ５３Ａ，５３Ｂで撮像された蛍光像を処理する画像処理手段である画像処理部６１を有して構成されている。
【００３７】
光源１１は、紫外波長域から可視波長域の光を発する水銀ランプやキセノンランプを用いた光源で構成されている。光源１１から発せられた光は、コレクタレンズ１２に入射するようになっている。コレクタレンズ１２は、光源１１からの光を平行光束に変換するように構成されている。コレクタレンズ１２を介して平行光束に変換された光は、光束分割手段である半透鏡２１に入射するようになっている。
【００３８】
半透鏡２１は、入射光束の一部を反射させ、残りを透過させる機能を有している。
半透鏡２１を透過した光束Ａの光路上には、反射鏡２２Ａと、減光フィルタ２３Ａと、励起フィルタ２４Ａが配置されている。また、半透鏡２１で反射した光束Ｂの光路上には、反射鏡２２Ｂと、減光フィルタ２３Ｂと、励起フィルタ２４Ｂが配置されている。
【００３９】
反射鏡２２Ａ及び反射鏡２２Ｂには、光束Ａ及び光束Ｂが半透鏡２５を経た後の進行方向及び光路上の位置を完全に一致させるための傾き調整機構（不図示）が備えられている。
減光フィルタ２３Ａ及び２３Ｂは、夫々光束Ａの光量及び光束Ｂの光量を個別に独立して調整することができるようになっている。
また、減光フィルタ２３Ａ及び２３Ｂは、夫々ターレット又はスライダーを介して光束Ａ及び光束Ｂの光路に容易に挿脱可能に設けられている。
励起フィルタ２４Ａ及び２４Ｂは、夫々光束Ａ及び光束Ｂにおける特定の波長域の光のみを透過させる性質を有しており、夫々ターレット又はスライダーを介して光束Ａ及び光束Ｂの光路に容易に挿脱可能に設けられている。
【００４０】
半透鏡２５は、光束Ａの一部を透過させ、光束Ｂの一部を反射させる特性を有している。半透鏡２５を経た後の光束Ａと光束Ｂは、上述の傾き調整機構を介して反射鏡２２Ａ及び反射鏡２２Ｂの傾き調整が施されることにより進行方向及び光路上の位置が完全に一致している。
【００４１】
図中、３１は半透鏡２５で合成された光束Ａ及び光束Ｂの光源像を対物レンズ４２の瞳面に導く投影レンズ、４４はダイクロイックミラー４１を透過した試料４３からの蛍光を反射鏡４５で反射させてカメラ５３Ａ及び５３Ｂの撮像面上に結像させる結像レンズである。
ダイクロイックミラー４１は、その反射ピーク波長が２つある反射特性を有するデュアルダイクロイックミラーを用いて構成されており、投影レンズ３１を透過した光を対物レンズ４２側に反射すると共に、試料４３から発した蛍光を透過するようになっている。
【００４２】
また、図中、５１は試料４３からの蛍光をその波長によって透過あるいは反射させるダイクロイックミラー、５２Ａ及び５２Ｂはダイクロイックミラー５１を介して分割された光束Ａ’及び光束Ｂ’の光において、夫々特定の波長域のみを透過させる蛍光フィルタである。
蛍光フィルタ５２Ａ及び５２Ｂは、夫々ターレット又はスライダーを介して光束Ａ’及び光束Ｂ’の光路に容易に挿脱可能に設けられている。
カメラ５３Ａ及び５３Ｂは、蛍光フィルタ５２Ａ及び５２Ｂを透過した光束Ａ’及び光束Ｂ’を撮像するように設けられている。
【００４３】
画像処理部６１は、カメラ５３Ａ及びカメラ５３Ｂから出力される電気信号をメモリーに蓄積し、さらに、得られた試料４３の蛍光画像の種々の演算を行うように構成されている。
図中、６２は画像表示部である。画像表示部６２は、画像処理部６１で処理された画像を表示する機能を有している。
【００４４】
また、本実施例では、半透過鏡２５と投影レンズ３１との間に半透過鏡７１が配置されており、半透鏡２５を反射及び透過した光束Ａ及び光束Ｂの光の一部を半透鏡７１を介して分光器７２に入射させるようにしてある。分光器７２は入射した光束Ａ及び光束Ｂの夫々の光の波長分布を測定する機能を有している。
【００４５】
このように構成された本実施例の蛍光顕微鏡の照明装置及びその照明装置を用いた画像処理装置によれば、光源１１を点灯すると、光源１１から発せられた光は、コレクタレンズ１２を介して平行光束に変換され、半透鏡２１を介して２つの光束Ａ，Ｂに分割される。
半透鏡２１を透過した光束Ａは、反射鏡２２Ａで反射した後、減光フィルタ２３Ａを所定の透過率で透過する。さらに、励起フィルタ２４Ａを所定の波長域の光が透過し、半透鏡２５に入射する。半透鏡２５を透過し、半透鏡７１を透過した光束Ａは、投影レンズ３１を通りダイクロイックミラー４１で反射し対物レンズ４２を経て、試料４３を照射する。試料４３は光束Ａの光を照射されることで励起され、蛍光を発する。
光束Ａを照射することにより試料４３で発した蛍光は、対物レンズ４２を逆進し、ダイクロイックミラー４１、結像レンズ４４を透過し、反射鏡４５で反射し、ダイクロイックミラー５１で反射する。次いで、蛍光フィルタ５２Ａを透過し、蛍光像としてカメラ５３Ａにより撮像される。
【００４６】
一方、半透鏡２１で反射した光束Ｂは、反射鏡２２Ｂで反射した後、減光フィルタ２３Ｂを所定の透過率で透過する。さらに、励起フィルタ２４Ｂを所定の波長域で透過し、半透鏡２５に入射する。半透鏡２５を反射し、半透鏡７１を透過した光束Ｂは、投影レンズ３１を通りダイクロイックミラー４１で反射し対物レンズ４２を経て、試料４３を照射する。試料４３は光束Ｂの光を照射されることで励起され、蛍光を発する。
光束Ｂを照射することにより試料４３で発した蛍光は、対物レンズ４２を逆進し、ダイクロイックミラー４１、結像レンズ４４を透過し、反射鏡４５で反射し、ダイクロイックミラー５１を透過する。次いで、蛍光フィルタ５２Ｂを透過し、蛍光像としてカメラ５３Ｂにより撮像される。
【００４７】
さらに、カメラ５３Ａ及び５３Ｂで撮像された試料４３の蛍光像は、画像処理部６１においてそれらの画像間の輝度比が演算され、画像表示部６２に原画像及びレシオ画像が表示される。
また、半透鏡２５を経た光束Ａ及び光束Ｂの夫々一部の光は、半透鏡７１を反射し、分光器７２に入射して、夫々の波長分布が監視される。
【００４８】
従って、本実施例の蛍光顕微鏡の照明装置及びその照明装置を用いた画像処理装置によれば、１個の光源１１のみで異なる２つの波長域で試料を照明することができるので、従来の複数の光源を用いた装置のように、各光源の視野ムラなどの空間的な強度分布の違いの影響を受けることなく均一な照明が可能となる。
また、１個の光源１１のみで異なる２つの波長域で試料を励起することができるので、従来の複数の光源を用いた装置のように、各光源の経時的な変化に伴う特性の変化やノイズなどの時間的な変動の違いの影響を受けることなく、レシオ画像を確実に得ることができる。
また、時間的に完全に同時に異なる２波長で励起した蛍光像を取得できるので、変化の速い現象や、動きの速い試料を多重蛍光観察することができる。
また、ダイクロイックミラー４１の反射ピーク波長に合わせて最適な励起フィルタを選択することができるので、高価なデュアルピークの励起フィルタを用いる必要がなく、結果としてコストを低減することができる。
さらに、２つの励起光強度のバランスを自由に変えることができるので、一方の励起光に対応する蛍光の強度が、他方の励起光に対応する蛍光の強度よりも極端に強い場合でも、励起光強度のバランスを調整して、双方の励起光に対応する蛍光強度を同等にすることにより、カメラのダイナミックレンジを有効に活用することができる。
また、減光フィルタを時間的に切り替える必要がなく、不要な振動の発生を抑えることができ、振動にともなう焦点位置がずれることがない。
また、分光器７２により顕微鏡に入射する光の波長分布を確実に監視することができる。
【００４９】
図２は本発明の第１実施例の変形例にかかる蛍光顕微鏡の照明部の変形例を示す概略構成図である。図１の実施例と同一の構成部分には同一符号を付してその詳しい説明は省略する。
図１に示した構成では、光束分割手段及び光束合成手段に夫々半透鏡２１及び２５を用いたが、それらの代わりに、図２に示すように、ダイクロイックミラー２８Ａ及び２８Ｂを用いてもよい。ダイクロイックミラー２８Ａ及び２８Ｂは、ある波長λより短波長の入射光を反射させ、波長λより長波長の入射光を透過させる特性を有している。
本変形例では、励起フィルタ２４Ａには、透過波長域が波長λより長波長の励起フィルタを用い、励起フィルタ２４Ｂには、透過波長域が波長λより短波長の励起フィルタを用いている。
【００５０】
このように構成された本変形例の照明部によれば、光源１１からの光のうち波長λより長波長の光は、ダイクロイックミラー２８Ａを透過し、反射鏡２２Ａで反射し、減光フィルタ２３Ａ及び励起フィルタ２４Ａを透過し、ダイクロイックミラー２８Ｂを透過して試料４３側に導かれる。一方、光源１１からの光のうち波長λより短波長の光は、ダイクロイックミラー２８Ａで反射し、反射鏡２２Ｂで反射し、光フィルタ２３Ｂ及び励起フィルタ２４Ｂを透過し、ダイクロイックミラー２８Ｂで反射して試料４３側に導かれる。
従って、本変形例の光源部によれば、光束分割手段及び光束合成手段として図１に示したような半透鏡２１，２５を用いた場合に比べて、励起光のロスを最小限に抑えて試料を励起することができるので、特に暗い試料を観察する場合に有効となる。
【００５１】
なお、第１実施例における半透鏡２１及び２５、あるいはダイクロイックミラー２８Ａ及び２８Ｂは、光束分割手段あるいは光束合成手段の一例を示したに過ぎず、これらに限定されるものではない。光束分割手段あるいは光束合成手段のその他の例としては、例えば、２分岐バンドルファイバー（図示省略）を用いても良い。
半透鏡２１の代わりに２分岐バンドルファイバーを用いる場合、バンドルファイバーの合成端をコレクタレンズ１２の直後に配置し、また、バンドルファイバーの分岐端を夫々反射鏡２２Ａ，２２Ｂの直前に配置すればよい。
このようにすれば、光源１１から発せられた光をコレクタレンズ１２により完全に平行光束にしなくても、バンドルファイバーに入射させることができれば、反射鏡２２Ａ，２２Ｂに入射させることができるので、光学系の調整が容易になる。
【００５２】
さらに、半透鏡２５にかえて２分岐バンドルファイバーを用いた場合、バンドルファイバーの分岐端を夫々励起フィルタ２４Ａ及び２４Ｂの直後に配置すればよい。
このようにすれば、励起フィルタ２４Ａ及び２４Ｂを透過した光がバンドルファイバーの分岐端の夫々に入射できるようにすれば合成できるので、減光フィルタ２３Ａ，２３Ｂ，励起フィルタ２４Ａ，２４Ｂの配置の自由度を大きくすることができる。
【００５３】
なお、第１実施例における励起フィルタ２４Ａ及び２４Ｂは、波長選択手段の一例を示したに過ぎず、これらに限定されるものではない。波長選択手段のその他の例としては、例えば、励起フィルタ２４Ａ及び２４Ｂの代わりにモノクロメータを用いても良い。このようにすれば、複数の励起フィルタを予め用意しておく必要がなくなる。
【００５４】
また、ダイクロイックミラー５１の代わりに半透鏡を用いてもよい。この場合、半透鏡はその反射率及び透過率の波長特性がほとんど一様であるので、ダイクロイックミラー５１を用いる場合のような、試料内の蛍光物質を変えるごとにその蛍光に応じて透過あるいは反射させる特性を持つダイクロイックミラー５１に交換しなければならないというような手間を省くことができる。
【００５５】
第２実施例
図３は本発明の第２実施例にかかる蛍光顕微鏡の照明装置及びその照明装置を用いた画像処理装置の概略構成図である。図１の実施例と同一の構成部分には同一符号を付してその詳しい説明は省略する。
第２実施例では、半透鏡２１を透過した光束Ａの光路上には、反射鏡２２Ａ、減光フィルタ２３Ａ、励起フィルタ２４Ａに加えて、偏光板２６Ａが配置されている。また、半透鏡２１で反射した光束Ｂの光路上には、反射鏡２２Ｂ、減光フィルタ２３Ｂ、励起フィルタ２４Ｂに加えて、偏光板２６Ｂが配置されている。偏光板２６Ａ及び２６Ｂは、光源１１からの入射光束の偏光方向を選択する特性を有している。
【００５６】
また、第２実施例では、反射鏡４５の反射側の光路上に蛍光フィルタ５２と、蛍光フィルタ５２を透過した光束を光束Ａ’と光束Ｂ’とに分割する半透鏡５６が配置され、半透鏡５６を介して分割された２つの光束Ａ’，Ｂ’の光路上に偏光板５４Ａ，偏光板５４Ｂが配置されており、偏光板５４Ａ及び５４Ｂを透過した蛍光が夫々カメラ５３Ａ，５３Ｂで撮像されるようになっている。
蛍光フィルタ５２は、試料４３からの光のうち特定の波長域のみの光を透過させる特性を有している。
偏光板５４Ａ及び５４Ｂは、半透鏡５６で分割された光束Ａ’及び光束Ｂ’の夫々を特定の偏光方向の成分の光のみを透過させる特性を有している。
【００５７】
ここで、偏光板２６Ａと偏光板２６Ｂ、偏光板５４Ａと偏光板５４Ｂの透過偏光軸の方向関係について述べる。
偏光板２６Ａと偏光板２６Ｂとは、透過偏光軸が互いに垂直になっており、偏光板５４Ａと偏光板５４Ｂとは、透過偏光軸が互いに垂直になっている。また、偏光板２６Ａと偏光板５４Ａとは、透過偏光軸が互いに平行になっており、偏光板２６Ｂと偏光板５４Ｂとは、透過偏光軸が互いに平行になっている。
このようにすると、偏光板２６Ａを透過した所定の偏光方向を有する光束Ａによって励起された試料４３の蛍光の偏光方向は、励起光（光束Ａ）の偏光方向と平行の成分が支配的であるので、その成分は偏光板５４Ａを透過することができるが、偏光板５４Ｂを透過することはできない。また逆に、試料４３の蛍光のうち、励起光（光束Ａ）の偏光方向と垂直な成分は、偏光板５４Ｂを透過することができるが、偏光板５４Ａを透過することはできない。他方、偏光板２６Ｂを透過した所定の偏光方向を有する光束Ｂによって励起された試料４３の蛍光の偏光方向は、励起光（光束Ｂ）の偏光方向と平行の成分が支配的であるので、その成分は、偏光板５４Ｂを透過することができるが、偏光板５４Ａを透過することはできない。また逆に、試料４３の蛍光のうち、励起光（光束Ｂ）の偏光方向と垂直な成分は、偏光板５４Ａを透過することができるが、偏光板５４Ｂを透過することはできない。
【００５８】
このように構成された本実施例の蛍光顕微鏡の照明装置及びその照明装置を用いた画像処理装置によれば、光源１１を点灯すると、光源１１から発せられた光は、コレクタレンズ１２を介して平行光束に変換され、半透鏡２１に入射し、２つの光束Ａ，Ｂに分割される。
半透鏡２１を透過した光束Ａは、反射鏡２２Ａで反射した後、減光フィルタ２３Ａを所定の透過率で透過する。また、励起フィルタ２４Ａを所定の波長域の光が透過し、さらに、偏光板２５Ａを介して所定の偏光方向の成分の光が選択され、半透鏡２５に入射する。半透鏡２５を透過し、半透鏡７１を透過した光束Ａは、投影レンズ３１を通りダイクロイックミラー４１で反射し対物レンズ４２を経て、試料４３を照射する。試料４３は光束Ａの光を照射されることで励起され、蛍光を発する。
なお、本実施例においては、試料４３内における蛍光物質として、ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）やＲＦＰ（赤色蛍光タンパク質）等のように分子量が大きな蛍光物質を用いる。分子量が大きいと、蛍光物質の回転運動が遅く、試料４３から発した蛍光の偏光方向は、試料に照射した励起光の偏光方向と平行な成分が支配的であり、また、その平行な成分と励起光の偏光方向と垂直な成分の比は、ほぼ一定となる。
光束Ａを照射することにより試料４３で発された蛍光は、対物レンズ４２を逆進し、ダイクロイックミラー４１、結像レンズ４４を透過し、反射鏡４５で反射し、蛍光フィルタ５２を透過し、半透鏡５６で透過及び反射する。次いで、蛍光のうち光束Ａの偏光方向と平行な成分は、偏光板５４Ａを透過し、蛍光像としてカメラ５３Ａにより撮像され、垂直な成分は、偏光板５４Ｂを透過し、蛍光像としてカメラ５３Ｂにより撮像される。
【００５９】
一方、半透鏡２１で反射した光束Ｂは、反射鏡２２Ｂで反射した後、減光フィルタ２３Ｂで所定の透過率で透過する。また、励起フィルタ２４Ｂを所定の波長域の光が透過し、さらに、偏光板２５Ｂを介して所定の偏光方向の成分の光が選択され、半透鏡２５に入射する。半透鏡２５で反射し、半透鏡７１を透過した光束Ｂは、投影レンズ３１を通りダイクロイックミラー４１で反射し対物レンズ４２を経て、試料４３を照射する。試料４３は光束Ｂの光を照射されることで励起され、蛍光を発する。
光束Ｂを照射することにより試料４３で発された蛍光は、対物レンズ４２を逆進し、ダイクロイックミラー４１、結像レンズ４４を透過し、反射鏡４５で反射し、蛍光フィルタ５２を透過し、半透鏡５６を透過及び反射する。次いで、蛍光のうち光束Ｂの偏光方向と平行な成分は、偏光板５４Ｂを透過し、蛍光像としてカメラ５３Ｂにより撮像され、垂直な成分は、偏光板５４Ａを透過し、蛍光像としてカメラ５３Ａにより撮像される。
【００６０】
次に、本実施例の構成、作用による効果について説明する。
ＧＦＰのように励起スペクトルが双峰型でかつ、その励起スペクトルの形が、例えばカルシウムイオンの濃度に依存して変化するような蛍光物質を用いる場合、従来では、当該双峰に対応する２つの波長の励起光を同時にあて、発する蛍光からカルシウムイオンの濃度の変化を抽出することは、困難であった。
しかし、本実施例の蛍光顕微鏡の照明装置及びその照明装置を用いた画像処理装置によれば、上述したように偏光方向が互いに直行する２つの波長の励起光で同時に試料を励起して蛍光を発生させ、その蛍光のうち、偏光方向が互いに直交する２成分を２つのカメラで同時に撮像した後、得られた２つの画像をもとに演算すると、それぞれの波長の励起光で単独に励起した場合に得られる蛍光像と同等な蛍光像を分離して求めることができる。さらには、得られた２つの画像の比を計算してレシオ画像を測定することにより、例えば、カルシウムイオンの濃度の変化を時間のずれをまったく生じずに完全に同一の時間で測定することができ、変化が早い現象や動きの速い試料でも測定することが可能となる。
【００６１】
なお、第２の実施例においては、偏光方向選択手段として偏光板２６Ａ及び２６Ｂを用いたが、これらの代わりに偏光ビームスプリッタを用いても良い。
図４は本発明の第２実施例の変形例にかかる蛍光顕微鏡の照明装置及びその照明装置を用いた画像処理装置の概略構成図である。図１及び図３と同一部分には同一符号を付してその詳しい説明は省略する。
本変形例では、図１に示した半透鏡２１及び２５の代わりに、図４に示すように、偏光ビームスプリッタ２７Ａ，２７Ｂを用いている。
偏光ビームスプリッタ２７Ａは、コレクタレンズ１２を経た平行光束が入射する位置に配置されている。偏光ビームスプリッタ２７Ａは、入射光束のうち紙面に対して平行な偏光方向の成分の光を透過し、紙面に対して垂直な偏光方向の成分の光を反射する特性を有し、入射光束をその偏光方向に応じて光束Ａ，Ｂに分割するように構成されている。
そして、偏光ビームスプリッタ２７Ａを透過した光束Ａの光路上には、反射鏡２２Ａと、減光フィルタ２３Ａと、励起フィルタ２４Ａが配置されている。また、偏光ビームスプリッタ２７Ａで反射した光束Ｂの光路上には、反射鏡２２Ｂと、減光フィルタ２３Ｂと、励起フィルタ２４Ｂが配置されている。
【００６２】
偏光ビームスプリッタ２７Ｂは、励起フィルタ２４Ａを経た光束Ａ及び励起フィルタ２４Ｂを経た光束Ｂが入射する位置に配置されている。そして、偏光ビームスプリッタ２７Ｂは、偏光ビームスプリッタ２７Ａと同様な機能を有し、紙面に対して平行な偏光成分を有する光束Ａを透過し、紙面に対して垂直な偏光方向の成分を有する光束Ｂを反射することにより、光束Ａ及び光束Ｂを合成する。
また、本変形例では、反射鏡４５の反射側の光路上に蛍光フィルタ５２と、蛍光フィルタを透過した光束を偏光方向の違いによって光束Ａ’と光束Ｂ’とに分割する偏光ビームスプリッタ５５が配置され、偏光ビームスプリッタ５５で分割された蛍光が夫々カメラ５３Ａ，５３Ｂで撮像されるようになっている。
偏光ビームスプリッタ５５は、入射光束のうち紙面に対して平行な偏光方向の成分の光を透過し、紙面に対して垂直な偏光方向の成分の光を反射する特性を有し、入射光束をその偏光方向に応じて光束Ａ’，Ｂ’に分割するように構成されている。
【００６３】
このように構成された本変形例の蛍光顕微鏡の照明装置及びその照明装置を用いた画像処理装置によれば、偏光ビームスプリッタ２７Ａ及び２７Ｂが、偏光方向選択手段の機能に加えて、光束分割手段及び光束合成手段の機能をも兼ね備えるので、半透鏡２１及び半透鏡２５を省略することができ、光学系の簡素化が可能となる。また、本変形例では、偏光ビームスプリッタ２７Ａ，２７Ｂを用いると、半透鏡２１，２５を用いるのに比べて、光源１１からの光のロスが少なくなるので、効率良く試料に光を照射することができる。また、偏光ビームスプリッタ５５が、図３における半透鏡５１及び偏光板５４Ａ及び５４Ｂの役割を果たすので、光学系の簡素化が図れるのみならずシステムの安定性の向上が図れる。また、偏光ビームスプリッタ５５を用いると、半透鏡５６を用いるのに比べて、試料から発した光のロスが少なくなるので、効率よく蛍光を検出することができる。
また、本変形例によれば、１個の光源１１のみで異なる２つの波長域で試料を励起することができるので、図１，２に示した第１実施例と同様な効果を奏する。また、図３に示した構成と同様の効果を有する。
【００６４】
第３実施例
図５は本発明の第３実施例にかかる蛍光顕微鏡の照明装置及びその照明装置を用いた画像処理装置の概略構成図である。図１の実施例と同一の構成部分には同一符号を付してその詳しい説明は省略する。
第３実施例では、図１に示した第１実施例の装置におけるダイクロイックミラー４１に代えて半透鏡４６が配置されている。半透鏡４６は、入射した光の一部を反射し、一部を透過する機能を有し、その反射率及び透過率の波長依存性がほとんどないという特性を有している。そして、半透鏡２５で合成された光束Ａ及び光束Ｂの一部を対物レンズ４２側に反射させるとともに、試料４３から発した蛍光の一部を透過させている。
【００６５】
このように構成された本実施例の蛍光顕微鏡の照明装置及びその照明装置を用いた画像処理装置によれば、反射率及び透過率に波長依存性がほとんどない半透鏡４６を用いたので、ダイクロイックミラー４１を用いた実施例のように反射特性に制約されることがなく、試料４３に用いる蛍光物質に合わせて励起フィルタ及び蛍光フィルタを最適に選択することができる。また、高価なデュアルダイクロイックミラーを用いる必要がないため、コストを低減させることができる。
また、１個の光源１１のみで異なる２つの波長域で試料を励起することができるので、第１の実施の形態と同様な効果を奏する。
【００６６】
第４実施例
図６は本発明の第４実施例にかかる蛍光顕微鏡の照明装置及びその照明装置を用いた画像処理装置の概略構成図である。図１の実施例と同一の構成部分には同一符号を付してその詳しい説明は省略する。
第４実施例は、半透鏡７１から反射鏡４５に至るまでの光路上の構成が図１に示した第１実施例と異なっており、この間の光路上には、投影レンズ３１と、反射鏡４７と、第１の対物レンズである対物レンズ４２Ａと、第２の対物レンズである対物レンズ４２Ｂと、結像レンズ４４が配置されており、透過型の蛍光観察を行なうように構成されている。
投影レンズ３１は、半透鏡２５で合成された光束Ａ及び光束Ｂの光源像を第１の対物レンズ４２Ａの瞳面に導いている。反射鏡４７は、投影レンズ３１を透過した光を反射させて対物レンズ４２Ａに導いている。対物レンズ４２Ａは、半透鏡２５で合成された光束を試料４３に照射するように配置されている。対物レンズ４２Ｂは、試料４３を挟んで対物レンズ４２Ａに対向して配置されており、試料４３から発した蛍光を透過し、結像レンズ４４を介して反射鏡４５で反射させることによってカメラ５３Ａ及び５３Ｂの撮像面上に結像させるようになっている。また、第１の対物レンズ４２Ａは光軸方向に沿って上下動して試料４３に照射する光の径を調整することができるようになっている。
【００６７】
このように構成された本実施例の蛍光顕微鏡の照明装置及びその照明装置を用いた画像処理装置によれば、励起光と蛍光とが別の光路を辿るため、図１に示したダイクロイックミラー４１あるいは図５に示した半透鏡４６を用いて励起光と蛍光とを分離する必要がない。このため、励起光及び蛍光を効率良く伝送することができるので、特に暗い蛍光試料を観察する場合に有効である。また、高価なデュアルダイクロイックミラーを用いる必要がないため、コストを低減させることができる。
また、１個の光源１１のみで異なる２つの波長域で試料を励起することができるので、第１の実施の形態と同様な効果が得られる。
なお、第４実施例においても、顕微鏡の照明部を図２に示したような構成にすることはもちろん可能であり、その場合には同様の効果が得られる。
【００６８】
第５実施例
図７は本発明の第５実施例にかかる蛍光顕微鏡の照明装置及びその照明装置を用いた画像処理装置の概略構成図である。図３の実施例と同一の構成部分には同一符号を付してその詳しい説明は省略する。
第５実施例は、半透鏡２５、半透鏡７１から反射鏡４５に至るまでの光路上の構成が図３に示した第２実施例と異なり、この間の光路上には、第４実施例と同様に、投影レンズ３１と、反射鏡４７と、第１の対物レンズである対物レンズ４２Ａと、第２の対物レンズである対物レンズ４２Ｂと、結像レンズ４４が配置されている。
【００６９】
このように構成された本実施例の蛍光顕微鏡の照明装置及びその照明装置を用いた画像処理装置によれば、第４実施例と同様に、励起光と蛍光とが別の光路を辿るため、図３に示したダイクロイックミラー４１あるいは半透鏡を用いて励起光と蛍光とを分離する必要がなくなる。このため、励起光及び蛍光を効率良く伝送することができ、特に暗い蛍光試料を観察する場合に有効である。また、高価なデュアルダイクロイックミラーを用いる必要がないため、コストを低減させることができる。
その他の効果は、図３に示した第２実施例とほぼ同じである。
【００７０】
第６実施例
図８は本発明の第６実施例にかかる蛍光顕微鏡の照明装置及びその照明装置を用いた画像処理装置の概略構成図である。図４の実施例と同一の構成部分には同一符号を付してその詳しい説明は省略する。
第６実施例は、偏光ビームスプリッタ２７Ｂ、半透鏡７１から反射鏡４５に至るまでの光路上の構成が図４に示した第２実施例の変形例と異なり、この間の光路上には、投影レンズ３１と、反射鏡４７と、第１の対物レンズである対物レンズ４２Ａと、第２の対物レンズである対物レンズ４２Ｂと、結像レンズ４４が配置されている。
【００７１】
このように構成された本実施例の蛍光顕微鏡の照明装置及びその照明装置を用いた画像処理装置によれば、第４実施例と同様に、励起光と蛍光とが別の光路を辿るため、図４に示したダイクロイックミラー４１あるいは半透鏡を用いて励起光と蛍光とを分離する必要がなくなる。このため、励起光及び蛍光を効率良く伝送することができるので、特に暗い蛍光試料を観察する場合に有効となる。また、高価なデュアルダイクロイックミラーを用いる必要がないため、コストを低減させることができる。
その他の効果は、図４に示した第２実施例の変形例とほぼ同じである。
【００７２】
第７実施例
図９は本発明の第７実施例にかかる蛍光顕微鏡の照明装置及びその照明装置を用いた画像処理装置の概略構成図である。図１の実施例と同一の構成部分には同一符号を付してその詳しい説明は省略する。
第７実施例では、半透鏡２１及び半透鏡８１を介して、光源１１から出射された光束を３つの照射光の光束に分岐し、励起フィルタ２４Ａ〜２４Ｃを介してこれらの光束分割手段により分岐された夫々の照明光の波長を選択するとともに、半透鏡８２及び半透鏡２５を介して、波長が選択された複数の照射光の光束を単一の光束に合成するように構成されている。
【００７３】
コレクタレンズ１２を介して平行光束に変換された光は、光束分割手段である半透鏡２１に入射する。半透鏡２１は、入射光束の一部を反射させ、残りを透過させる特性を有している。
半透鏡２１を透過した光束Ａの光路上には、光束分割手段としての半透鏡８１が配置されている。半透鏡８１は、入射光束の一部を反射させ、残りを透過させる特性を有している。
半透鏡８１を透過した光束Ａの光路上には、反射鏡２２Ａと、減光フィルタ２３Ａと、励起フィルタ２４Ａが配置されている。
また、半透鏡８１で反射した光束Ｃの光路上には、減光フィルタ２３Ｃ、励起フィルタ２４Ｃと、半透鏡８２が配置されている。
一方、半透鏡２１で反射した光束Ｂの光路上には、減光フィルタ２３Ｂと、励起フィルタ２４Ｂと、反射鏡２２Ｂが配置されている。
【００７４】
反射鏡２２Ａ，２２Ｂ、半透鏡８１，８２には、光束Ａ、光束Ｂ、光束Ｃが半透鏡２５を経た後の進行方向及び光路上の位置を完全に一致させるための傾き調整機構（不図示）が備えられている。
減光フィルタ２３Ａ，２３Ｂ，２３Ｃは、夫々光束Ａの光量，光束Ｂの光量，及び光束Ｃの光量を独立して調整することができるようになっている。
また、減光フィルタ２３Ａ，２３Ｂ，及び２３Ｃは、夫々ターレット又はスライダーを介して光束Ａ，光束Ｂ，及び光束Ｃの光路に容易に挿脱可能に設けられている。
励起フィルタ２４Ａ，２４Ｂ，及び２４Ｃは、夫々光束Ａ，光束Ｂ，及び光束Ｃにおける特定の波長域の光のみを透過させる特性を有しており、夫々ターレット又はスライダーを介して光束Ａ，光束Ｂ，及び光束Ｂの光路に容易に挿脱可能に設けられている。
【００７５】
半透鏡８２は、入射光の一部を透過させ一部を反射させる特性を有しており、半透鏡８２を透過した平行光束Ｂと、半透鏡を反射した平行光束Ｃが合成されて半透鏡２５に入射するように構成されている。更に、半透鏡２５は、入射光の一部を透過させ一部を反射させる特性を有しており、半透鏡２５を透過した平行光束Ａと半透鏡２５を反射した平行光束Ｂ及びＣは合成されるようになっている。その際、上述の傾き調整機構を介して反射鏡２２Ａ、反射鏡２２Ｂ、半透鏡８１及び８２の傾き調整が施されることにより、半透鏡２５を通った平行光束Ａ、Ｂ及びＣは進行方向及び光路上の位置が完全に一致している。
【００７６】
また、本実施例では、ダイクロイックミラー４１には、反射ピークが３つ以上ある反射特性を有するマルチクロイックミラーが用いられている。そして、励起フィルタ２４Ａ、２４Ｂ及び２４Ｃは、ダイクロイックミラー４１の反射ピークに合わせて選択されている。
また、本実施例では、カメラ９１として、試料４３からの蛍光を３つの波長成分に分割して撮像する３板式のカラーＣＣＤカメラが用られており、図１の実施例に示したようなダイクロイックミラー５１や蛍光フィルタ５２Ａ，５２Ｂに相当する光学部材は省かれている。
【００７７】
このように構成された本実施例の蛍光顕微鏡の照明装置及びその照明装置を用いた画像処理装置によれば、１個の光源１１のみで異なる３つの波長域で試料を励起することができるので、上記第１実施例と同様な効果を奏する。さらに、３つ以上の波長域で試料を同時に励起し、３つ以上の蛍光を同時に観察することができるので、例えば、カルシウムイオン濃度の変化に加えて、クロライドイオン濃度の変化も同時に観察することができるといった効果が得られる。
なお、本実施例では照明光束を３つに分割する例を示したが、４つ以上の分割も可能である。また、ダイクロイックミラー４１の代わりに半透鏡を用いれば、第３実施例と同様の効果が得られる。
【００７８】
なお、図９の例では、カメラ９１として、試料４３からの蛍光を３つの波長成分に分割して撮像する３板式のカラーＣＣＤカメラを用いたが、図１の実施例に示したようなダイクロイックミラー５１を用いて３つの光路に分割し、夫々の光路に蛍光フィルタと、単板式のＣＣＤカメラを配置してもよい。
図１０は第７実施例の変形例にかかる蛍光顕微鏡の照明装置及びその照明装置を用いた画像処理装置の概略構成図である。図９の実施例と同一の構成部分には同一符号を付してその詳しい説明は省略する。
本変形例では、反射鏡４５の反射側の光路上にダイクロイックミラー５１が配置されて、反射鏡４５で反射された光束を光束Ｂ’とそれ以外の光束に分割するとともに、さらに、ダイクロイックミラー５１を透過した光束の光路上にダイクロイックミラー５１’が配置されており、ダイクロイックミラー５１を透過した光束を光束Ａ’、光束Ｃ’に分割している。
そして、分割された夫々の光束Ａ’，Ｂ’，Ｃ’の光路上には、夫々特定の波長域のみを透過させる蛍光フィルタ５２Ａ，５２Ｂ，５２Ｃと、カメラ５３Ａ，５３Ｂ，５３Ｃが設けられている。カメラ５３Ａ，５３Ｂ，５３Ｃには、それぞれ単板式のＣＣＤカメラが用いられている。
本変形例のように構成すれば、図９に示した３板式のＣＤＤカメラを用いた場合と比べて単板式のＣＣＤカメラが安価であるため、装置全体の製造コストを低減することができる。
また、３つに分割された光束Ａ’，Ｂ’，Ｃ’の光路に夫々蛍光フィルタを配置する構成であるため、試料内の蛍光物質を変えても、その蛍光に応じた特性を備えた蛍光フィルタを光束Ａ’，Ｂ’，Ｃ’の光路に挿脱することができ、３板式ＣＣＤカメラを用いる場合のようにＣＣＤカメラを取りかえることなく蛍光撮影ができる。
その他の効果は図９に示した実施例と同様である。
【００７９】
なお、図９及び図１０に示した第１０実施例の構成は、半透鏡２５、半透鏡７１から反射鏡４５に至るまでの光路上の構成に関し、図６の実施例に示したように、投影レンズ３１と、反射鏡４７と、第１の対物レンズである対物レンズ４２Ａと、第２の対物レンズである対物レンズ４２Ｂと、結像レンズ４４が配置された構成の装置においても適用可能である。
【００８０】
以上説明したように、本発明の顕微鏡の照明装置及びその照明装置を用いた画像処理装置は、特許請求の範囲に記載された発明の他に、次に示すような特徴も備えている。
【００８１】
（１）前記複数の照射光のうちの少なくともいずれかの照明光の強度を調整する光量調整手段を更に備えることを特徴とする請求項３又は５に記載の顕微鏡の照明装置及びその照明装置を用いた画像処理装置。
【００８２】
（２）前記第１の照射光の強度を調整する第１の光量調整手段と前記第２の照射光の強度を調整する第２の光量調整手段の双方またはいずれか一方を更に備えることを特徴とする請求項４又は６に記載の顕微鏡の照明装置及びその照明装置を用いた画像処理装置。
【００８３】
（３）前記複数の照射光のうちの少なくともいずれかの照明光の偏光方向を選択する偏光方向選択手段を更に備えることを特徴とする請求項３又は５に記載の顕微鏡の照明装置及びその照明装置を用いた画像処理装置。
【００８４】
（４）前記第１の照射光の偏光方向を選択する第１の偏光方向選択手段と前記第２の照射光の偏光方向を選択する第２の偏光方向選択手段の双方またはいずれか一方を更に備えることを特徴とする請求項４又は６に記載の顕微鏡の照明装置及びその照明装置を用いた画像処理装置。
【００８５】
（５）前記複数の照射光のうちの少なくともいずれかの照明光の波長分布を監視する波長分布監視手段を更に備えることを特徴とする請求項３又は５に記載の顕微鏡の照明装置及びその照明装置を用いた画像処理装置。
【００８６】
（６）前記第１及び前記第２の照射光の双方または一方の波長分布を監視する波長分布監視手段を更に備えることを特徴とする請求項４又は６に記載の顕微鏡の照明装置及びその照明装置を用いた画像処理装置。
【００８７】
（７）前記ミラーが半透鏡であることを特徴とする請求項３又は４に記載の顕微鏡の照明装置及びその照明装置を用いた画像処理装置。
【００８８】
（８）前記光束分割手段及び前記光束合成手段がダイクロイックミラーであることを特徴とする請求項３〜６のいずれかに記載の顕微鏡の照明装置及びその照明装置を用いた画像処理装置。
【００８９】
（９）前記光束分割手段及び前記光束合成手段が偏光ビームスプリッタであることを特徴とする請求項３〜６のいずれかに記載の顕微鏡の照明装置及びその照明装置を用いた画像処理装置。
【００９０】
（１０）前記複数の波長選択手段のうちの少なくともいずれかが、前記光路分岐手段により分岐された光路上に挿脱可能に配置されることを特徴とする請求項３、５、上記（１）、（３）、（５）のいずれかに記載の顕微鏡の照明装置及びその照明装置を用いた画像処理装置。
【００９１】
（１１）前記第１の波長選択手段と前記第２の波長選択手段の少なくともいずれかが、前記光路分岐手段により分岐された光路上に挿脱可能に配置されることを特徴とする請求項４、６、上記（２）、（４）、（６）のいずれかに記載の顕微鏡の照明装置及びその照明装置を用いた画像処理装置。
【００９２】
【発明の効果】
本発明によれば、標本に複数の波長の光を同時にかつ同一の照射強度分布で照射することができ、夫々の光の波長や強度を独立して設定することができる顕微鏡の照明装置及びその照明装置を用いた画像処理装置を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の第１実施例にかかる蛍光顕微鏡の照明装置及びその照明装置を用いた画像処理装置の概略構成図である。
【図２】本発明の第１実施例の変形例にかかる蛍光顕微鏡の照明部の変形例を示す概略構成図である。
【図３】本発明の第２実施例にかかる蛍光顕微鏡の照明装置及びその照明装置を用いた画像処理装置の概略構成図である。
【図４】本発明の第２実施例の変形例にかかる蛍光顕微鏡の照明装置及びその照明装置を用いた画像処理装置の概略構成図である。
【図５】第３実施例にかかる蛍光顕微鏡の照明装置及びその照明装置を用いた画像処理装置の概略構成図である。
【図６】本発明の第４実施例にかかる蛍光顕微鏡の照明装置及びその照明装置を用いた画像処理装置の概略構成図である。
【図７】本発明の第５実施例にかかる蛍光顕微鏡の照明装置及びその照明装置を用いた画像処理装置の概略構成図である。
【図８】本発明の第６実施例にかかる蛍光顕微鏡の照明装置及びその照明装置を用いた画像処理装置の概略構成図である。
【図９】本発明の第７実施例にかかる蛍光顕微鏡の照明装置及びその照明装置を用いた画像処理装置の概略構成図である。
【図１０】第７実施例の変形例にかかる蛍光顕微鏡の照明装置及びその照明装置を用いた画像処理装置の概略構成図である。
【図１１】従来の多重蛍光標本を励起するための複数波長による照明光を標本に照射する一手段を示す概略構成図である。
【図１２】従来の多重蛍光標本を励起するための複数波長による照明光を標本に照射する他の手段を示す概略構成図である。
【図１３】単一の光源からの光を分割して標本に照射するようにした装置の従来例を支援す概略構成図である。
【符号の説明】
１１光源
１２コレクタレンズ
２１，２５，５６，４６，７１，８１，８２半透鏡
２２Ａ，２２Ｂ，４５，４７反射鏡
２３Ａ，２３Ｂ，２３Ｃ減光フィルタ
２４Ａ，２４Ｂ，２４Ｃ励起フィルタ
２６Ａ，２６Ｂ，５４Ａ，５４Ｂ偏光板
２７Ａ，２７Ｂ，５５偏光ビームスプリッタ
３１投影レンズ
２８Ａ，２８Ｂ，４１，５１，５１’ ダイクロイックミラー
４２，４２Ａ，４２Ｂ対物レンズ
４３試料
４４結像レンズ
５２，５２Ａ，５２Ｂ，５２Ｃ蛍光フィルタ
５３Ａ，５３Ｂ，５３Ｃカメラ
９１３板式ＣＣＤカメラ
６１画像処理部
６２画像表示部
７２分光器
１５１フィルタ切換手段
１５１ａ励起光選択用フィルタ
１５１ｂ回転円板
１５２ａ蛍光選択用フィルタ
１５８，１６４ダイクロイックミラー
１６１Ａ，１６１Ｂ白色光源
１６２Ａ，１６２Ｂコレクタレンズ
１６３Ａ，１６３Ｂ励起フィルタ
１６５観察光学系
１７１照射用光源
１７２分岐光学系
１７３試料

Claims

白色光源と、
前記光源から出射された光束を複数の照射光の光束に分岐する光束分割手段と、
前記光束分割手段により分岐された夫々の照明光の光路上に夫々設けられた、各照明光の波長を選択する波長選択手段と、
波長が選択された前記複数の照射光の光束を単一の光束に合成する光束合成手段と、
を備えることを特徴とする顕微鏡の照明装置。
白色光源と、
前記光源から出射された光束を第１の照射光の光束と第２の照射光の光束とに分岐する光束分割手段と、
前記第１の照射光の波長を選択する第１の波長選択手段と、
前記第２の照射光の波長を選択する第２の波長選択手段と、
波長が選択された前記第１の照射光の光束と波長が選択された前記第２の照射光の光束とを単一の光束に合成する光束合成手段と、
を備えることを特徴とする顕微鏡の照明装置。
白色光源と、
前記光源から出射された光束を複数の照射光の光束に分岐する光束分割手段と、
前記光束分割手段により分岐された夫々の照明光の光路上に夫々設けられた、各照明光の波長を選択する波長選択手段と、
波長が選択された前記複数の照射光の光束を単一の光束に合成する光束合成手段と、
前記光束合成手段で合成された光束を試料に照射する方向に導くとともに、試料からの光を透過するミラーと、
前記ミラーと試料との間に配置された対物レンズと、
前記対物レンズ及び前記ミラーを通過した前記試料からの蛍光を夫々の波長で励起された蛍光に分離して撮像する撮像素子と、
前記撮像素子で撮像された蛍光像を処理する画像処理手段と、
を備えることを特徴とする顕微鏡の照明装置及びその照明装置を用いた画像処理装置。
白色光源と、
前記光源から出射された光束を第１の照射光の光束と第２の照射光の光束とに分岐する光束分割手段と、
前記第１の照射光の波長を選択する第１の波長選択手段と、
前記第２の照射光の波長を選択する第２の波長選択手段と、
波長が選択された前記第１の照射光の光束と波長が選択された前記第２の照射光の光束とを単一の光束に合成する光束合成手段と、
前記光束合成手段で合成された光束を試料に照射する方向に導くとともに、試料からの光を透過するミラーと、
前記ミラーと試料との間に配置された対物レンズと、
前記対物レンズ及び前記ミラーを通過した前記試料からの蛍光を第１の波長で励起された蛍光と第２の波長で励起された蛍光とに分離して撮像する撮像素子と、
前記撮像素子で撮像した蛍光像を処理する画像処理手段と、
を備えることを特徴とする顕微鏡の照明装置及びその照明装置を用いた画像処理装置。
白色光源と、
前記光源から出射された光束を複数の照射光の光束に分岐する光束分割手段と、
前記光束分割手段により分岐された夫々の照明光の光路上に夫々設けられた、各照明光の波長を選択する波長選択手段と、
波長が選択された前記複数の照射光の光束を単一の光束に合成する光束合成手段と、
前記光束合成手段で合成された光束を試料に照射する方向に導く第１の対物レンズと、
前記試料を挟んで前記第１の対物レンズに対向して配置された第２の対物レンズと、
前記第２の対物レンズを通過した前記試料からの蛍光を夫々の波長で励起された蛍光に分離して撮像する撮像素子と、
前記撮像素子で撮像された蛍光像を処理する画像処理手段と、
を備えることを特徴とする顕微鏡の照明装置及びその照明装置を用いた画像処理装置。
白色光源と、
前記光源から出射された光束を第１の照射光の光束と第２の照射光の光束とに分岐する光束分割手段と、
前記第１の照射光の波長を選択する第１の波長選択手段と、
前記第２の照射光の波長を選択する第２の波長選択手段と、
波長が選択された前記第１の照射光の光束と波長が選択された前記第２の照射光の光束とを単一の光束に合成する光束合成手段と、
前記光束合成手段で合成された光束を試料に照射する方向に導く第１の対物レンズと、
前記試料を挟んで前記第１の対物レンズに対向して配置された第２の対物レンズと、
前記第２の対物レンズを通過した前記試料からの蛍光を第１の波長で励起された蛍光と第２の波長で励起された蛍光とに分離して撮像する撮像素子と、
前記撮像素子で撮像された蛍光像を処理する画像処理手段と、
を備えることを特徴とする顕微鏡の照明装置及びその照明装置を用いた画像処理装置。