JPH05126725A - 走査型分析顕微鏡 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 対物レンズを含む光学系により絞った光ビー
ムで試料を走査し、この光ビームと試料との相互作用に
よる光、熱あるいは音を検出して、上記光ビームが照射
された試料の部分を分析する走査型分析顕微鏡におい
て、顕微鏡倍率に応じて分析値が変動することを防止す
る。 【構成】 光ビーム11を走査させる機構として、対物レ
ンズ17を含むプローブ15を全体的に試料23に対して相対
移動させる機構を用い、そしてこの相対移動の幅を変え
て顕微鏡倍率を変更させる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、透過あるいは反射型の
分光測光顕微鏡、ラマン分光測光顕微鏡、光音響顕微鏡
等の分析顕微鏡に関し、特に詳細には走査型の分析顕微
鏡に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】従来より、対物レンズを含む光学系によ
り細く絞った落射照明光を試料に照射し、その際試料で
反射した光やあるいは試料を透過した光を分光測光する
ことにより、試料中の含有物の同定、結晶の解析、膜厚
の測定等を行なう分光測光顕微鏡が知られている。この
種の分析顕微鏡においては、試料を透過した光を定量測
光することにより、試料中の吸光物質の定量測定を行な
うことも可能である。

【０００３】また、上記の反射光や透過光の代りに、光
照射により試料が発した蛍光を分光測光、定量測光する
蛍光顕微鏡や、上記蛍光の強度を時間分解して測定する
時間分解蛍光顕微鏡も公知となっている。さらに、試料
への光照射により生じるラマン散乱光を分光測光するラ
マン分光測光顕微鏡や、光ビームが試料に照射された際
の光熱変換過程で生じる熱や音を何らかの方法で測定し
て試料を分析する光音響顕微鏡も知られている。

【０００４】以上述べたように、細く絞った光ビームを
試料に照射し、そのときの光と試料との相互作用による
光、熱あるいは音を検出する分析顕微鏡としてはその
他、波長分散蛍光顕微鏡、時間分解ラマン顕微鏡、波長
分散ラマン顕微鏡、時間分解光音響顕微鏡等が公知とな
っている。

【０００５】そしてこの種の分析顕微鏡の１つとして、
光ビームを試料上で走査させて、試料を２次元的に分析
可能とした走査型分析顕微鏡も提供されている。従来、
この走査型分析顕微鏡においては、光ビームによって試
料を走査するために、顕微鏡対物レンズに通す前の段階
で光ビームを偏向させるようにしていた。そして顕微鏡
倍率の変更は、上記対物レンズとしてＮＡ（開口数）の
異なるものを複数用意しておき、それらを交換すること
によって実現していた。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】しかし、上記のように
して顕微鏡倍率を変更すると、試料上における光ビーム
のスポット径が、対物レンズのＮＡに応じて変わること
になる。つまり、ＮＡが大きいほどスポット径はより小
さくなる。このように光ビームのスポット径が変化する
と、分析値が変わってしまうことが確認されている。そ
うであると、当然のこととして顕微鏡使用者は、どの分
析値を正しいものとして採用すればよいのか分からなく
なってしまう。

【０００７】本発明は上記のような事情に鑑みてなされ
たものであり、光ビームのスポット径変化により分析値
が変動することのない走査型分析顕微鏡を提供すること
を目的とするものである。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明による走査型分析
顕微鏡は、前述したように対物レンズを含む光学系によ
り絞った光ビームで試料を走査し、この光ビームと試料
との相互作用による光、熱あるいは音を検出して、上記
光ビームが照射された試料の部分を定量的または定性的
に分析する走査型分析顕微鏡において、光ビームを走査
させる機構として、上記対物レンズを含む光学系を全体
的に試料に対して相対移動させ、そしてこの相対移動の
幅が変更可能とされた機構が用いられたことを特徴とす
るものである。

【０００９】

【作用および発明の効果】上記の走査機構を用いれば、
光学系の試料に対する相対移動幅を変更させることによ
り、顕微鏡倍率を変えることができる。したがってこの
走査型分析顕微鏡においては、顕微鏡倍率を変えるため
に対物レンズを交換する必要がなく、常に同一の対物レ
ンズを使用することができる。そうであれば、対物レン
ズのＮＡに応じて光ビームのスポット径が変わることが
なくなり、よって、このスポット径の変化により分析値
が変動してしまうことを防止可能となる。

【００１０】

【実施例】以下、図面に示す実施例に基づいて本発明を
詳細に説明する。

【００１１】図２は、本発明の第１実施例による共焦点
走査型蛍光顕微鏡を示すものであり、また図１は、その
走査機構の平面形状を詳しく示している。なおこの蛍光
顕微鏡は、時間分解蛍光顕微鏡としても、また試料の反
射拡大像を撮像する一般的な光学式走査型顕微鏡として
も使用できるものである。

【００１２】まず、この顕微鏡が一般的な走査型顕微鏡
として使用される場合について説明する。図２に示され
るように単色光レーザ10からは、単一波長の照明光11が
連続的に射出される。直線偏光したこの照明光11は、Ｐ
偏光状態で偏光ビームスプリッタ25の膜面25ａに入射
し、そこを透過する。偏光ビームスプリッタ25を通過し
た照明光11は、偏波面調整用のλ／２板12を通過し、入
射用レンズ13で集光されて、偏波面保存光ファイバー14
内に入射せしめられる。

【００１３】この偏波面保存光ファイバー14としては、
図３に断面形状を示すように、クラッド14ａ内にコア14
ｂが配され、このコア14ｂの両側に応力付与部14ｃ、14
ｃが形成されてなる、いわゆるＰＡＮＤＡ型のものが用
いられている。そして直線偏光した照明光11は、λ／２
板12を適宜回転させることにより、偏波面の向きが応力
付与部14ｃ、14ｃの並び方向、あるいはそれに直交する
方向と揃う状態にして（本実施例では後者の方向、すな
わち図３の矢印Ｕ方向）、該光ファイバー14内に入射せ
しめられる。

【００１４】この光ファイバー14の一端はプローブ15に
固定されており、該光ファイバー14内を伝搬した照明光
11はこの一端から出射する。この際光ファイバー14の一
端は、点光源状に照明光11を発することになる。プロー
ブ15には、コリメーターレンズ16および対物レンズ17か
らなる送光光学系（受光光学系を兼ねる）18が固定され
ている。なお、コリメーターレンズ16と対物レンズ17と
の間には、λ／４板19が配設されている。

【００１５】上記の照明光11はコリメーターレンズ16に
よって平行光とされ、λ／４板19を通過して円偏光とさ
れ、次に対物レンズ17によって集光されて、試料台22に
載置された試料23上で（表面あるいはその内部で）微小
な光点Ｐに結像する。試料23で反射した反射光11”は旋
回方向が逆向きの円偏光となり、λ／４板19を通過し
て、偏波面の向きが照明光11のそれと直交する直線偏光
とされる。この反射光11”の光束は、コリメーターレン
ズ16によって集光されて、偏波面保存光ファイバー14内
に入射せしめられる。このときの反射光11”の偏波面の
向きは、図３の矢印Ｖ方向となる。光ファイバー14を伝
搬した反射光11”はその一端から出射し、レンズ13によ
って平行光とされる。

【００１６】この反射光11”はλ／２板12を通過後、Ｓ
偏光状態で偏光ビームスプリッタ25の膜面25ａに入射
し、そこで反射する。この反射光11”は、集光レンズ26
で集光され、アパーチャピンホール27を通して光検出器
28によって検出される。この光検出器28は例えばフォト
マルチプライヤ（光電子増倍管）等からなり、そこから
は、試料23の照明光照射部の明るさを示す信号Ｓが出力
される。

【００１７】上述のように、λ／４板19と偏光ビームス
プリッタ25とから構成される光アイソレータを設けたこ
とにより、反射光11”がレーザ10側に戻ることがなくな
り、より大光量の反射光11”が光検出器28に導かれるよ
うになる。また、入射用レンズ13や光ファイバー14の端
面等で反射した照明光11が、光検出器28に入射すること
も防止され、Ｓ／Ｎの高い信号Ｓが得られるようにな
る。

【００１８】次に、照明光11の光点Ｐの２次元走査につ
いて、図１を参照して説明する。プローブ15は、水平に
配された鉄製の音叉30の一先端部に、光学系18の光軸が
垂直となる状態で固定されている。この音叉30は、その
基部30ａが架台32に固定されて、所定の固有振動数で振
動可能となっている。そして音叉30の内側には、その両
先端部とそれぞれ若干の間隔をおいて、電磁石31が配設
されている。この電磁石31は、取付部材34を介して架台
32に固定されている。

【００１９】上記電磁石31には、駆動回路33から、音叉
30の固有振動数と等しい周波数の矩形パルス電流Ｅが印
加される。こうして音叉30の両端部に断続的に磁界が作
用することにより、音叉30はその固有振動数で振動す
る。そこで、この音叉30に固定されているプローブ15
は、図１、図２中のＸ方向（水平方向）に高速で往復移
動し、光点Ｐの主走査がなされる。

【００２０】また試料台22は架台32に対して、Ｚ方向
（光学系18の光軸方向）に往復移動可能なＺ移動ステー
ジ24Ｚ、およびＸ、Ｚ両方向に対して直角なＹ方向に往
復移動可能なＹ移動ステージ24Ｙを介して取り付けられ
ている。そこで、上記のようにして光点Ｐの主走査を行
なうとき、同時にＹ移動ステージ24Ｙを往復駆動させる
と、光点Ｐの副走査がなされる。

【００２１】そして、光点Ｐの２次元走査を行なう毎
に、Ｚ移動ステージ24Ｚを移動させることにより、たと
え試料23の表面に微細な凹凸が有ったとしても、試料23
をＺ方向に移動させた範囲内で、全ての面に焦点が合っ
た画像を担う信号Ｓを得ることが可能となる。

【００２２】以上説明した通り本装置においては、音叉
30を共振させ、振幅の大きなこの振動を利用して照明光
光点Ｐを主走査させるようにしているので、主走査幅を
大きく確保して、試料23の広い領域を撮像可能となる。
なお本実施例では図１に示す通り、音叉30の他端部に、
プローブ15と同じ構成のダミープローブ15’が取り付け
られている。それにより、音叉30の一端部、他端部の機
械的バランスを良好に保ち、理想に近い共振系を構成で
きるようになる。

【００２３】また本実施例では、音叉30の内側に電磁石
31を配して、音叉30の両端部にそれぞれ磁界を作用させ
るようにしているので、電磁石を音叉30の１つの端部の
外側にのみ配する場合に比べれば、音叉30に作用する磁
束密度、つまりは作用する力を、より大きくすることが
できる。

【００２４】次に図４を参照して、電気的な構成につい
て説明する。前述した光検出器28が出力する信号Ｓは、
アンプ40で増幅されてからＡ／Ｄ変換器41に入力され、
そこでデジタルの画像信号Ｓｄに変換される。この画像
信号Ｓｄは、画像処理装置42において例えば階調処理等
の画像処理を受けた後、ＣＲＴ表示装置等の画像再生装
置43に入力される。この画像再生装置43においては、画
像信号Ｓｄが担持する画像、すなわち試料23の顕微鏡像
が再生される。

【００２５】上記画像再生装置43には、上記画像処理装
置42および制御回路60を介して、例えばパーソナルコン
ピュータ等のコンピュータ44が接続されている。画像処
理の指令や、走査型顕微鏡の基本的操作指令すなわち観
察用画像の撮像指令等は、すべてこのコンピュータ44の
キーボード等の入力操作部を用いて与えられる。またこ
の場合、Ａ／Ｄ変換器41における画像信号Ｓのサンプリ
ング周期は、サンプリングクロック発生器61から入力さ
れるサンプリングクロックＣＬＫに基づいて規定され
る。

【００２６】前述したＹ移動ステージ24Ｙは、発振器45
から所定周波数の信号を受けるドライバ46により、該周
波数で往復移動するように駆動される。またＺ移動ステ
ージ24Ｚは、画像処理装置42から出力されてＤ／Ａ変換
器47によりアナログ化されたＺ軸コントロール信号Ｆｓ
に基づいて、所定のＺ位置上に来るようにドライバ48に
より駆動される。そして発振器45、Ｄ／Ａ変換器47は各
々、画像処理装置42から発せられる垂直同期信号Ｖｓ、
フォーカス方向信号Ｆｓに基づいて作動制御され、ステ
ージ24Ｙ、24Ｚの移動の同期が取られる。

【００２７】一方電磁石用駆動回路33は、パルス発生器
49と、その後段のドライバ50とから構成されている。ド
ライバ50は、オープンコレクタバッファ51、フォトカプ
ラ52、パワーＭＯＳ−ＦＥＴ53、ダイオード54、コンデ
ンサ55等からなり、上記パルス発生器49から入力される
周波数信号Ｓｆと同じ周波数の矩形パルス電流Ｅを電磁
石31に印加する。またパルス発生器49は、画像処理装置
42から発せられる水平同期信号Ｈｓに基づいて作動制御
され、ステージ24Ｙ、24Ｚの移動と、プローブ15の往復
移動との同期が取られる。

【００２８】ここで、上記パルス発生器49が出力する信
号Ｓｆの周波数は、周波数切換信号Ｃｆに応じて、何通
りかのうちの１つに択一的に切り換えられる。この信号
Ｓｆの周波数が高いほど、プローブ15の振幅すなわち主
走査幅は狭くなる。このようにして照明光主走査幅が変
化しても、例えば上記周波数切換信号Ｃｆに応じてＡ／
Ｄ変換器41におけるサンプリング周期を変化させる等の
処置を取れば、常に１主走査ライン当り一定の画素数か
らなるデジタル画像信号Ｓｄが得られる。このような画
像信号Ｓｄに基づいて画像再生装置43において再生され
る顕微鏡像は、常に一定サイズのものとなる。したがっ
てこの顕微鏡像の倍率は、上記主走査幅に反比例するこ
とになる。このように本装置においては、プローブ15の
試料23に対する相対移動幅（主走査幅）を変化させるこ
とにより、顕微鏡倍率が変えられるようになっている。

【００２９】次に、この走査型顕微鏡が蛍光顕微鏡とし
て使用される場合について説明する。この場合、前述し
た照明光11は、試料23中の蛍光物質を励起する励起光と
して作用することになる。すなわち、励起光（照明光）
光点Ｐの照射を受けた試料23の部分からは、蛍光Ｆが発
せられる。この蛍光Ｆは、先に説明した反射光11”と同
様の光路を辿って、光検出器28により光電的に検出され
る。なおこの場合は、偏光ビームスプリッタ25と光検出
器28との間に、励起光（照明光）11をカットして蛍光Ｆ
のみを透過させるフィルター29が挿入される（図２参
照）。

【００３０】上記蛍光Ｆの光量を検出した光検出器28の
出力Ｓは、図４に示した電気回路において反射光11”を
検出した場合と同様に処理され、試料23の蛍光像が画像
再生装置43において再生される。また、このように蛍光
像を再生する他、コンピュータ44において所定のプログ
ラムに基づき、デジタル画像信号Ｓｄから蛍光の定量測
定を行なうことも可能である。

【００３１】次に、時間分解蛍光測定について説明す
る。この際、図４に示される制御回路60は、コンピュー
タ44からの指令に基づいて、所定時間間隔（例えばナノ
秒〜ピコ秒程度の範囲）でトリガ信号Ｔを発する。励起
光源としての単色光レーザ10は、このトリガ信号Ｔが入
力される毎にパルス状に励起光11を発する。またこのト
リガ信号Ｔは、遅延回路62において所定時間ｔの遅延が
与えられた上で、サンプリングクロックＴ’としてＡ／
Ｄ変換器41に入力される。Ａ／Ｄ変換器41は、このクロ
ックＴ’が入力される毎に画像信号Ｓをサンプルホール
ドして、デジタル画像信号Ｓｄを作成する。上記遅延時
間ｔを一定にしておいて、励起光11のＸ−Ｙ走査を１回
（１画面分）行なえば、この遅延時間ｔに対応した情報
を担う信号Ｓｄを得ることができる。また遅延時間ｔの
設定を変える毎にＸ−Ｙ走査を１回ずつ行なえば、遅延
時間ｔに応じて情報の異なる複数組の信号Ｓｄを得るこ
とができる。遅延時間ｔと信号Ｓｄの値（つまり蛍光Ｆ
の強度）との関係は、試料23中の蛍光物質に応じた特有
のものとなる。そこで、コンピュータ44において所定の
プログラムに基づいて上記複数組の信号Ｓｄを処理すれ
ば、試料23中の物質の同定等の分析をすることができ
る。

【００３２】そして、先に述べた通り本装置において
は、顕微鏡倍率の変更はプローブ15の移動幅を変えるこ
とによってなされ、この倍率変更のために対物レンズ17
を交換する必要がない。つまり対物レンズ17として常に
同じものが使用されるから、絞られた励起光11の光点Ｐ
の径は常に一定となる。したがって、この光点Ｐの径が
変化するために、上記のようにして求められる分析値が
変わってしまうということがない。

【００３３】次に図５を参照して、本発明の第２実施例
について説明する。この図５は、本発明の第２実施例に
よる走査型の波長分散蛍光顕微鏡の概略構成を示してい
る。なおこの図５において、既に説明したものと同等の
要素については同番号を付してあり、それらについての
重複した説明は省略する（以下、同様）。

【００３４】この図５において70は顕微鏡本体、すなわ
ち、図１および図２に示した機構から基本的に単色光レ
ーザ10および光検出器28を除いた部分である。したがっ
て本装置においても、照明光（励起光）11の２次元走査
および倍率変更等の基本操作は、第１実施例の装置にお
けるのと同様になされる。この点は、以下に説明する実
施例においても同様である。

【００３５】本装置において、試料から発せられて励起
光11と分離された蛍光Ｆは分光器（モノクロメータ）71
に送られ、そこで分散せしめられる。分散した蛍光Ｆは
その波長順に一線に並ぶように導かれ、この並び方向に
延びるように配置されたラインセンサ72によって各波長
毎に検出される。これらの蛍光Ｆを検出したラインセン
サ72の各受光素子毎の出力信号Ｓν１、Ｓν２、Ｓν３
……Ｓνｎは、画像処理装置42に送られて必要な画像処
理を受けた後、画像再生装置43に送られる。画像再生装
置43においては、これらの信号Ｓν１、Ｓν２、Ｓν３
……Ｓνｎが各々担う合計ｎ枚の蛍光像が再生され得
る。

【００３６】なお本例では、信号Ｓν１、Ｓν２、Ｓν
３……ＳνｎのＡ／Ｄ変換も画像処理装置42内で行なわ
れる。また、顕微鏡本体70、分光器71および画像処理装
置42の作動は、制御回路60を介してコンピュータ44によ
って制御される。

【００３７】この実施例においても、コンピュータ44に
おいて所定のプログラムに基づいて上記信号Ｓν１〜Ｓ
νｎを処理することにより、試料23中の物質の同定等の
分析をすることができる。

【００３８】次に図６を参照して、本発明の第３実施例
について説明する。図６は、本発明の第３実施例による
走査型の波長分散ラマン顕微鏡の概略構成を示してい
る。本装置において励起光11の照射により試料から生じ
たラマン散乱光Ｒは、分光器（ダブルモノクロメータ）
73に送られ、そこで分散せしめられる。分散したラマン
散乱光Ｒは、ラインセンサ72によって波長毎に検出され
る。

【００３９】この場合も第２実施例におけるのと同様
に、ラインセンサ72の出力信号Ｓν１〜Ｓνｎに基づい
て、画像再生装置43においてラマン像を再生したり、あ
るいは試料の分析を行なうことができる。

【００４０】なおラインセンサ72に代えて、例えば光電
子増倍管等、１つの受光部を有する光検出器を用いて、
ある特定波長のラマン散乱光Ｒのみを検出するように構
成することも勿論可能である。

【００４１】次に図７を参照して、本発明の第４実施例
について説明する。図７は、本発明の第４実施例による
走査型の時間分解光音響顕微鏡の概略構成を示してい
る。本装置においては、顕微鏡本体70の試料台22（図２
参照）に、マイクロフォン74が組み込まれている。試料
にパルス状励起光11が照射された際の無放射遷移過程
（非発光の光熱変換過程）で生じた音は、上記マイクロ
フォン74によって集音される。このマイクロフォン74の
出力信号ＳＡはアンプ75によって増幅された後、Ａ／Ｄ
変換器41によってデジタル音声信号ＳＡｄに変換され
る。

【００４２】本装置においても第１実施例装置における
のと同様に、単色光レーザ10をパルス駆動させるトリガ
信号Ｔは、遅延回路62において所定時間ｔの遅延が与え
られた上で、サンプリングクロックＴ’としてＡ／Ｄ変
換器41に入力される。Ａ／Ｄ変換器41は、このクロック
Ｔ’が入力される毎に信号ＳＡをサンプルホールドし
て、デジタル音声信号ＳＡｄを作成する。上記遅延時間
ｔを一定にしておいて、励起光11のＸ−Ｙ走査を１回
（１画面分）行なえば、この遅延時間ｔに対応した情報
を担う信号ＳＡｄを得ることができる。また遅延時間ｔ
の設定を変える毎にＸ−Ｙ走査を１回ずつ行なえば、遅
延時間ｔに応じて情報の異なる複数組の信号ＳＡｄを得
ることができる。遅延時間ｔと信号ＳＡｄの値（つまり
上記音の大きさ）との関係は、試料の物性に応じた特有
のものとなる。そこで、コンピュータ44において所定の
プログラムに基づいて上記複数組の信号ＳＡｄを処理す
れば、試料23中の物質の同定等の分析をすることができ
る。

【００４３】なお上記マイクロフォン74の代りに圧電素
子を用いて、試料中に発生した弾性波を測定するように
してもよいし、あるいは赤外検出器を用いて、上記光熱
変換過程で生じた熱を測定するようにしてもよい。

【００４４】以上説明した第２、３および４実施例にお
いても、顕微鏡倍率はプローブ15（図２参照）の移動幅
を変更することによって変えられるので、倍率変更のた
めに分析値が変わってしまうことがない。

【００４５】なお本発明は、以上説明した４つのタイプ
の分析顕微鏡に限らず、細く絞った光ビームを試料上に
おいて走査させるあらゆる走査型分析顕微鏡に対して適
用可能であり、そしていずれの場合も上記と同様の効果
を奏するものである。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の第１実施例の走査型分析顕微鏡に用い
られた照明光走査機構の平面図

【図２】第１実施例の走査型分析顕微鏡を示す一部破断
正面図

【図３】第１実施例の走査型分析顕微鏡に用いられた偏
波面保存光ファイバーの断面図

【図４】第１実施例の走査型分析顕微鏡の電気回路図

【図５】本発明の第２実施例の走査型分析顕微鏡の概略
構成図

【図６】本発明の第３実施例の走査型分析顕微鏡の概略
構成図

【図７】本発明の第４実施例の走査型分析顕微鏡の概略
構成図

【符号の説明】 10 単色光レーザ 11 照明光（励起光） 11” 反射光 14 偏波面保存光ファイバー 15 プローブ 16 コリメーターレンズ 17 対物レンズ 18 送光光学系 22 試料台 23 試料 26 集光レンズ 27 アパーチャピンホール 28 光検出器 29 励起光カットフィルター 30 音叉 31 電磁石 32 架台 33 電磁石駆動回路 41 Ａ／Ｄ変換器 42 画像処理装置 43 画像再生装置 44 コンピュータ 46、48、50 ドライバ 49 パルス発生器 60 制御回路 61 サンプリングクロック発生器 62 遅延回路 71、73 分光器 72 ラインセンサ 74 マイクロフォン Ｆ 蛍光 Ｒ ラマン分散光

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 対物レンズを含む光学系により絞った光
   ビームで試料を走査し、この光ビームと試料との相互作
   用による光、熱あるいは音を検出して、前記光ビームが
   照射された試料の部分を定量的または定性的に分析する
   走査型分析顕微鏡において、 前記光ビームを走査させる機構として、前記対物レンズ
   を含む光学系を全体的に試料に対して相対移動させ、こ
   の相対移動の幅が変更可能とされた機構が用いられたこ
   とを特徴とする走査型分析顕微鏡。