JPH0815155A - 光学的検査方法および光学的検査装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 励起レーザー光の強度揺らぎのある状況下で
も、正確に蓄積光エコーを蛍光から検出できる光学的検
査装置を提供する。 【構成】 光源１００からの光を、光変調光学系２００
において、互い直交する直線偏光成分に分け、その一方
の成分について、光遅延器２３０により光路長を順次変
化させ、かつ、他方の成分について位相変調器２２０に
より位相変調を行なった後、これらを合成して、試料Ｍ
に照射する。試料Ｍからの蛍光を偏光ビームスプリッタ
で互い直交する直線偏光成分に分け、それぞれについて
検出器３４１，３４２により強度を測定し、得られたデ
ータについて作動アンプ３４３での差分を求める。そし
て、得られた差分データについて、ロックインアンプ３
４４で変調周波数の２倍の周波数成分のみ増幅する。得
られた結果と遅延時間τとの関係から、位相緩和時間を
求める。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、物質の物理化学的な性
質の差を、光学的に観察できる光学的検査方法および光
学的検査装置に関する。

【０００２】

【従来技術】一般の光学顕微鏡に対して、レーザー光源
を用いたレーザー走査顕微鏡が知られており、種々の顕
微鏡に利用されている。このうち、共焦点型レーザー走
査顕微鏡は、照明系の焦点位置に被検物体を配置して、
ここに、光スポットを形成し、被検物体からの光をピン
ホール上に集光して光検出をするものである。共焦点型
レーザー走査顕微鏡で得られる画像は、非常に浅い焦点
深度を有していることから、光軸方向の走査を行うこと
によって、所謂セクショニング効果による無限に深い焦
点深度が得られるという利点を有している。

【０００３】しかし、共焦点型レーザー走査顕微鏡によ
って得られる被検物体の情報は、通常の光学顕微鏡の画
像から得られる情報と比較すると、質的に大差ないもの
であった。

【０００４】そこで、試料をただ観察するという従来の
顕微鏡の機能の他に、試料の物理化学的な性質の差異に
関する情報を得ることのできる光学的検査装置が提案さ
れている。すなわち、本出願人によって提案された特開
平４−２６９６４４号公報に開示される光エコー顕微鏡
がそれである。この光エコー顕微鏡は、光学的位相緩和
時間（一般にＴ２緩和時間、或いは横緩和時間と呼んで
いる）を、走査手段との組合せにより、２次元的に、さ
らには、３次元的にマッピングすることにより、対象物
の構造等を明らかにするという新たな機能を有してい
る。すなわち、通常のレーザ顕微鏡としての走査像の他
に、そのレーザー光と共鳴しうる光吸収体が試料中にあ
る場合は、光エコーによる光位相緩和時間を測定するこ
とにより、試料の物理学的な性質をも明らかにできる。
例えば、レーザー光と共鳴し得る色素を、結晶質と非晶
質とが混在するポリマー中に分散した場合、結晶質中と
非晶質中では光位相緩和時間が異なることを利用すれ
ば、非晶質相と結晶質相とがどのような形で混在するの
かを観察することができる。

【０００５】ところで、固体の位相緩和時間は、蓄積フ
ォトンエコーの検出により測定することが可能である。
しかし、生物試料のような光散乱体に対しては測定が困
難であった。上記光エコー顕微鏡で用いられる、蓄積光
エコーの蛍光検出法は、光散乱体に対しても有効な方法
として、筆者らにより提案された検出法である。また、
この検出法は、特に、共焦点型レーザー走査顕微鏡の形
態を有することができることから、その照明系の焦点に
おける光エコーを簡便に測定する方法としても知られて
いる。

【０００６】なお、光エコーの光位相変調による蛍光検
出法については、本出願人により出願された特開平４−
１３２０２０号公報に開示されている。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】ところで、蓄積光エコ
ーの蛍光検出法において検出される蛍光の強度変調は、
一般には、４次の非線形光学現象により説明される現象
であり、その変調深度は極めて小さいことが通常であ
る。従って、励起レーザー光の出力強度揺らぎがある場
合は、それに誘起される蛍光の強度揺らぎにより、蓄積
光エコーを正確に測定できないことがあり得る。そこ
で、励起レーザー光の強度揺らぎのある状況下でも、正
確に蓄積光エコーを蛍光から検出できるようにすれば、
より好ましい。

【０００８】本発明の目的は、励起レーザー光の強度揺
らぎのある状況下でも、正確に蓄積光エコーを蛍光から
検出できる、光学的検査方法および光学的検査装置を提
供することにある。

【０００９】

【課題を解決するための手段】上記目的を達成するた
め、本発明の一態様によれば、像面上で点光源とみなせ
る空間コヒーレンスと所定の時間コヒーレンスとを有す
る光を、互いに直交する直線偏光よりなる２光束に分割
して、それぞれの光路を進行させ、いずれかの光路の光
路長を変化させ、かつ、いずれかの光路において、光を
位相変調した後、２光束を合成して、試料に照射し、試
料から放射される蛍光を、互いに直交する直線偏光より
なる２光束に分割し、それぞれの強度を検出し、かつ、
それぞれの検出信号の差分を求め、この差分データにつ
いて上記位相変調の周波数の偶数倍のいずれかの変調強
度を選択的に増幅して蓄積エコー強度を求め、さらに、
光路長を異なる長さに変化させて、上記手順を繰返し、
光路長の変化による遅延時間と、その時の蓄積エコー強
度とを得ることを特徴とする光学的検査方法が提供され
る。

【００１０】上記態様において、位相変調を周波数ｆで
行ない、周波数２ｆの変調強度を選択的に増幅して蓄積
エコー強度を求めることができる。

【００１１】また、本発明の他の態様によれば、 像面
上で点光源とみなせる空間コヒーレンスと所定の時間コ
ヒーレンスとを有する光を放射する光源と、光源からの
光を、互いに直交する直線偏波成分に分割して、いずれ
か一方について、光路長を変化させ、かつ、いずれか一
方を位相変調した後、合成して射出する光変調光学系
と、光変調光学系から出射される光束を、試料に照射し
て、試料から放射される蛍光を互いに直交する直線偏光
よりなる２光束に分割して、それぞれの強度を検出し、
かつ、それぞれの検出信号の差分を求め、この差分デー
タについて上記位相変調の周波数の偶数倍のいずれかの
倍数の変調強度を選択的に増幅して蓄積エコー強度を求
める検出系とを備えることを特徴とする光学的検査装置
が提供される。

【００１２】上記光変調光学系は、例えば、光源からの
光を互いに直交する直線偏光よりなる２光束に分割する
光分割器と、該光分割器により分岐された２光束の一方
の光路中に配置配置され、光路長を任意に変化させるこ
とができる光遅延器と、該２光束に分割された２光束の
一方の光を所定の周波数で位相変調するための位相変調
器と、該２光束を合波する光合成器とを備える構成とす
ることができる。

【００１３】また、上記検出系は、例えば、合成されて
出射された光を試料のある位置まで導いて、試料に照射
するための照射光学系と、試料を保持するための試料保
持部と、試料から放射される蛍光を集光すると共に、互
いに直交する直線偏光よりなる２光束に分割する検出光
学系と、蛍光を電気的に検出して、その電気信号を処理
する信号処理部と、上記光遅延器の制御および上記処理
された信号に基づいて、情報処理を行うコンピュータと
を有する構成とすることができる。

【００１４】ここで、上記信号処理部は、分離された該
偏光成分の強度を独立に検出するための２つの光センサ
と、光センサのそれぞれの出力の差分を求める差動アン
プと、該差動検出器からの出力から、前記位相変調器の
変調周波数の偶数倍の変調成分を抽出し増幅するロック
インアンプとを備える構成とすることができる。

【００１５】上記コンピュータは、光遅延器を目的の遅
延時間とするための制御と、ロックインアンプから出力
される測定データを、遅延時間と対応させて記憶する処
理を行なうものとすることができる。

【００１６】上記検出光学系は、試料から放射された蛍
光のうち、目的の蛍光を透過させるフィルタをさらに備
える構成とすることができる。また、検出光学系は、試
料に照射される光スポットを２次元に走査する走査機構
をさらに備えることができる。さらに、検出光学系は、
試料に照射される光スポットを２次元に走査する走査機
構と、該光スポットを試料の深さ方向に変位させると駆
動装置とをさらに備えることができる。

【００１７】また、レーザー光源は被検物体に対して注
目する光吸収帯を光励起でき、また該光吸収帯の光学的
位相緩和時間よりも短い時間コヒーレンスを有すること
が望ましい。

【００１８】

【作用】被検物体が、蓄積光エコーおよび蛍光を生じ得
る物理化学的特性を有している場合には、光エコーの振
幅は、位相変調周波数の２倍乃至は偶数倍の蛍光強度変
調として現れる。この過程について、以下に簡単に説明
する。なお、光エコー現象は、３次の非線形光学効果の
一種であり、その生成過程については、例えば、「実験
化学講座、第１２巻」（第４版、日本化学会編、丸善
（株））等に詳しく述べられている。

【００１９】蛍光から蓄積光エコーを観察するために
は、少なくとも４つの光パルス、あるいはパルス列が必
要である。第１の光パルスと第２の光パルスの時間間隔
（遅延時間）をτとし、第３の光パルスと第４の光パル
スの時間間隔もτとなるように設定する。モード同期レ
ーザーのように規則正しいパルス列を放射する光源で
は、このようなパルス列の生成は単純な２光束干渉計を
用いれば容易に達成される。また、インコヒーレント光
を微小なパルス列と解釈すれば、インコヒーレント光を
励起光として用いた場合も同様な光学系を用いて、上述
の光パルス列を生成できる。

【００２０】次に、第２および第４の光パルスを、それ
ぞれ第１および第３パルスに対して位相変調する。位相
変調器としては、従来考案されているすべての装置を用
いることができるが、できるだけ残存する強度ノイズが
少ないものが望ましい。ここでは、ドップラー変調器を
位相変調器に用いた場合について説明する。この場合に
は、前述のパルスの時間間隔（遅延時間）τを、τを中
心として適当な時間幅Δτで、周波数ｆで変調すること
になる。このような光変調を実現するためには、前述の
２光束干渉計の一方の光路中に周波数ｆで振動する移動
鏡を配置すれば良い。

【００２１】このような方法で、時間遅延および位相変
調を施されたパルス列が試料に入射した場合の４次の非
線形光学応答を考える。回転波近似のもとでは、４次の
光学応答は、試料中の励起状態の占有数（population）
の変化となって現れる。この変化は、蛍光強度の変化と
して観測することが可能である。前述したように、光エ
コーは３次の非線形光学応答であるが、回転波近似のも
とでは、この応答は物質中に励起された分極波となる。
３次の非線形分極波と４次の非線形応答である蛍光とは
密接な関係にあり、蛍光緩和時間が位相変調の周期より
も充分短い場合には、蓄積光エコーの振幅、つまり物質
中で位相整合された分極波の大きさは、蛍光の２ｆ、あ
るいは、偶数倍の変調強度に比例することがわかる。蓄
積光エコーの強度を異なる遅延時間τのもとで順次測定
を行い、蓄積光エコー強度の遅延時間τ依存性から、測
定物の光学的位相緩和時間を間接的に知ることができ
る。光学的位相緩和時間は、測定物の微視的なダイナミ
クスの差を敏感に反映することから、光エコー測定によ
り物性についての多くの情報が得られるのである。

【００２２】蓄積光エコーの蛍光検出法において、試料
の位相緩和時間は、上記光遅延器により２つの光ビーム
の光路長差を順次変化させながら、蛍光の強度変調深度
を記録することにより得られる。しかし、光エコー現象
による蛍光の強度変調の変調振幅は非常に小さく、レー
ザー光の強度揺らぎに誘起される蛍光強度揺らぎによ
り、光エコー信号が消されることがある。このような欠
点を改善するためには、独立の２つの光検出器で、 信号Ａ＝光エコー信号＋蛍光の背景ノイズ（バックグラ
ンドノイズ） 信号Ｂ＝蛍光の背景ノイズ の２つの信号を検出し、後で両者の差を取れば、光エコ
ー信号のみを検出することが可能である。すなわち、 信号Ａ−信号Ｂ＝光エコー信号 一般には、このようなノイズ除去の方法として、励起レ
ーザー光の強度をモニターして、信号Ｂを得る方法が採
用されている。しかしながら、光エコー計測では、単
に、励起レーザーの強度ノイズのみならず、位相ノイズ
も蛍光強度に影響を与える。従って、２光束に分波さ
れ、および、合波された後の合成波の強度をモニターす
る必要がある。さらに、生物試料のような光散乱の多い
サンプルを測定する場合は、試料面における、光スポッ
トの微小な移動や振動等も、観測される蛍光強度を変化
させる。結局、蛍光の背景ノイズは、試料面から放射さ
れる蛍光を直接モニターすることが望ましい。

【００２３】図２は、蓄積光エコーの原理を説明するた
めの概略の光路図である。光源１００からの入射レーザ
ーは、偏光ビームスプリッタ２１２で２光束に分波され
る。分波された一方（Ｒ）は、コーナーキューブプリズ
ム２２１と圧電素子２２２とを有する光位相変調器２２
０で変調され、他方（Ｌ）は、コーナーキューブプリズ
ム２３１と水平移動ステージ２３２で構成される光遅延
器２３０により、サンプルＭへの到達時間が制御され
る。分割された２光束が偏光ビームスプリッタ２１２で
合成され、照射光学系３１０を介してサンプルＭに投射
して、光スポットを形成する。この照射によって、試料
Ｍから発生した蛍光は、レンズ３３１集光され、色ガラ
スフィルタ３３４で長波長側の蛍光のみが選択された
後、光検出器３４１に入射する。

【００２４】光エコー現象を詳しく解析すると、光束
（Ｒ）の光路長が光束（Ｌ）の光路長よりも長い場合
は、光エコー信号を含む蛍光の偏光特性は光束（Ｒ）と
同様になることがわかる。逆の場合は、光束（Ｌ）と同
様になる傾向がある。このとき、光エコー信号を含まな
い蛍光の偏光成分は、蛍光の背景光ノイズに対しては、
光エコー信号を含む蛍光と同条件になっている。

【００２５】蓄積光エコーの蛍光検出法に関する上記の
特性を利用すると、蛍光の背景ノイズを消して、光エコ
ー信号のみを検出することが可能となる。すなわち、サ
ンプルから発生する蛍光を、所定の互いに直交する偏光
成分に分離して各々の強度を光検出器で検出し、得られ
た信号どうしの差を測定すれば良い。

【００２６】

【実施例】以下、本発明の実施例について、図面を参照
して説明する。

【００２７】図１は、本発明の光学的検査方法を実施す
るための光学的検査装置の第１実施例の構成を示す概略
光路図である。

【００２８】本実施例の光学的検査装置は、光源１００
と、光変調光学系２００と、検出系３００とを備える。

【００２９】光源１００は、像面上で点光源とみなせる
空間コヒーレンスを有し、かつ、一定の時間コヒーレン
スを有するものが用いられる。好ましくは、被測定物の
注目する光吸収帯の光学的位相緩和時間より短い時間コ
ヒーレンスを有するものが用いられる。例えば、レーザ
ー光源としては、モード同期アルゴンレーザー励起色素
レーザー、マルチモード半導体レーザー、モード同期半
導体レーザー、固体レーザー、ガスレーザー等を用いる
ことができる。レーザー以外の光源としては、ＬＥＤ、
希ガスランプ、ハロゲンランプ、水銀ランプ等、また
は、粒子加速器等からの放射光を用いることができる。
本実施例の場合、具体的には、レーザー光源としてモー
ド同期アルゴンレーザー励起色素レーザーを用いてい
る。

【００３０】光変調光学系２００は、上記光源１００か
らの光を、互いに直交する直線偏光よりなる２光束に分
割し、それぞれの光路を進行させた後、合成する２光路
干渉光学系２１０と、この干渉光学系２１０の分割され
た一方の光路中に配置される光遅延器２３０と、分割さ
れた他方の光路中に配置される干渉光学系の位相変調器
２２０とを有する。

【００３１】２光路干渉光学系２１０は、半波長位相板
２１１と、入射光を互いに直交する直線偏光よりなる２
光束に分割する偏光分割器として機能する偏光ビームス
プリッタ２１２と、分割された一方の光束を反射する反
射鏡２１５と、この光束を光遅延器２３０に入射させる
と共に、光遅延器２３０からの出射光を元の光路の延長
上に戻すための、互いに直交する反射鏡２１６ａ，２１
６ｂと、分割された他方の光束を位相変調器２２０に入
射させると共に、位相変調器２２０からの出射光を元の
光路の延長上に戻すための、互いに直交する反射鏡２１
４ａ，２１４ｂと、分割された２光束を合成する合成器
として機能する偏光ビームスプリッタ２１７とを有す
る。反射鏡２１６ａ，２１６ｂは、反射鏡２１５と偏光
ビームスプリッタ２１７との間、および、反射鏡２１４
ａ，２１４ｂは、反射鏡２１３と偏光ビームスプリッタ
２１７との間に、それぞれ配置される。

【００３２】光遅延器２３０は、可動ステージ２３２
と、この可動ステージ２３２上に配置されたコーナーキ
ューブプリズム２３１とで構成される。可動ステージ２
３２は、光路の長さを変更する方向に移動する機能を有
する。すなわち、コーナーキューブプリズム２３１を載
置するための盤２３３と、この盤を移動させるための図
示しない駆動機構とを有する。この駆動機構は、後述す
る制御装置（コンピュータ３５０）により変位量が制御
される。コーナーキューブプリズム２３１は、反射鏡２
１６ａ，２１６ｂとの間で、光束を折り返し反射するた
めのものである。この光遅延器２３０は、可動ステージ
２３２を変位させることにより、コーナーキューブプリ
ズム２３１の、反射鏡２１６ａ，２１６ｂとの距離を変
更させて、光路長を変化させる。

【００３３】位相変調器２２０は、光を折り返し反射さ
せるコーナーキューブプリズム２２１と、このコーナー
キューブプリズム２２１が一端に連結され、このプリズ
ム２２１を周期的に変位させるための圧電素子２２２
と、この圧電素子２２２を一定の周波数ｆの交流電圧で
駆動する駆動装置２２３とを有する。すなわち、この位
相変調器２２０は、コーナーキューブプリズム２２１で
反射される光を、周波数ｆで位相変調する。位相変調器
２２０としては、本実施例のものに限らず、電気光学結
晶を用いたものも使うことができる。

【００３４】なお、本実施例では、光遅延器２３０およ
び位相変調器２２０を、それぞれ分割された光路の一方
および他方に分けて配置しているが、これに限定されも
のではない。光遅延器２３０および位相変調器２２０の
配置は、互いに、図１での光路とは異なる光路に八する
ことができる。また、同一の光路に配置することもでき
る。また、位相変調器２２０を可動ステージ２３２に載
せる構成としてもよい。

【００３５】検出系３００は、上記偏光ビームスプリッ
タ２１７で合成されて出射された光を試料のある位置ま
で導いて、試料に照射するための照射光学系３１０と、
試料Ｍを保持するための試料保持部３２０と、試料Ｍか
ら放射される蛍光を集光すると共に、互いに直交する直
線偏光に分離する検出光学系３３０と、蛍光を電気的に
検出して、その電気信号を処理する信号処理部３４０
と、光遅延器２３０の制御および上記処理された信号に
基づいて、情報処理を行うコンピュータ３５０とを有す
る。

【００３６】照射光学系３１０は、上記偏光ビームスプ
リッタ２１７で合成されて出射された光の向きを代える
ための反射鏡３１１と、この出射光を集光して、試料Ｍ
に照射させるための集光レンズ３１２とを有する。ま
た、試料保持部３２０は、本実施例の場合ヘリウムクラ
イオスタットで構成される。

【００３７】検出光学系３３０は、試料Ｍから放射され
る蛍光（光エコー）を集光するレンズ３３１と、該レン
ズ３３１の焦点位置に置かれた絞り３３２と、絞り３３
２を通過した光を平行光に変換するレンズ３３３と、必
要な蛍光のみを選択するための色ガラスフィルタ３３４
と、任意の角度方向に偏光した直交蛍光偏光成分を分離
する偏光ビームスプリッタ３３５とを備える。絞り３３
２は、試料Ｍ表面の光スポットと共役な位置に配された
ピンホールである。また、色ガラスフィルタ３３４は、
これに代えて、各種分光器を使うことができる。

【００３８】信号処理部３４０は、偏光ビームスプリッ
タ３３５で分離された各偏光成分を検出するための光セ
ンサである光電子増倍管３４１，３４２と、それぞれの
光電子増倍管３４１，３４２の出力を差動増幅する差動
アンプ３４３と、差動アンプ３４３の出力から、周波数
２ｆの信号成分のみ増幅して、光エコー信号として出力
するロックインアンプ３４４とを備える。なお、本実施
例では、光センサとして、光電子増倍管を用いている
が、これに限定されない。

【００３９】コンピュータ３５０は、光遅延装置２３０
の可動ステージ２３２の位置の制御と、測定データの処
理とを少なくとも行う中央処理ユニット（ＣＰＵ）３５
１と、ＣＰＵ３５１のプログラム、測定データ等を記憶
するメモリ３５２と、データの変換等の処理を行うイン
タフェース３５３とを備える。また、出力装置３５４が
接続される。

【００４０】ＣＰＵ３５１は、目的の遅延時間τとなる
ように、光遅延装置２３０の可動ステージ２３２の位置
を制御するための信号を生成して、出力すると共に、遅
延時間τと光エコー信号とに基づいて、光学的位相緩和
時間を求める処理を行う。また、メモリ３５２には、測
定データとして、遅延時間τと光エコー信号が対となっ
て記録される。出力装置３５４は、例えば、表示装置、
プリンタ等が含まれる。本実施例では、表示装置および
プリンタが接続されている。なお、これに加えて、入力
装置（図示せず）を備える。また、ＣＰＵ３５１は、本
実施例では、遅延時間τと光エコー信号が対となった測
定データを、例えば、後述する図４に示すようなグラフ
にして、表示または印刷する機能を有する。

【００４１】次に、本実施例の作用について、図面を参
照して説明する。

【００４２】まず、試料Ｍを、試料保持部３２０に設置
する。また、コンピュータ３５０は、光遅延装置２３０
の可動ステージ２３２の位置を、指定された遅延時間τ
となるように制御するための操作信号を生成して、イン
タフェース３５３を介して、光遅延器２３０の図示して
ないない駆動装置に送る。この駆動装置は、送られた操
作信号に応じて、ステージ２３２を変位させる。それに
よって、コーナーキューブプリズム２３１と、反射鏡２
１６ａ，２１６ｂとの間の距離が変化し、遅延時間が変
化する。さらに、駆動装置２２３を起動して、予め定め
た周波数ｆの交流電圧を圧電素子２２２に印加して、圧
電素子２２２を周波数ｆで振動させる。それによって、
周波数ｆによってコーナーキューブプリズム２２１が周
期的に変位し、粗の変位に応じて光路長が変化する。

【００４３】次に、光源１００を起動して、光束を放射
させる。放射された光は、干渉光学系２００に、入射す
る。すなわち、半波長位相板２１１を経て、偏光ビーム
スプリッタ２１２に入射して、互いに直交する直線偏光
よりなる２光束に分割される。

【００４４】分割された一方の光束は、反射鏡２１５、
反射鏡２１６ａを経て、光遅延器２３０のコーナーキュ
ーブプリズム２３１に入射して、折り返し反射されて、
反射鏡２１６ｂを経て偏光ビームスプリッタ２１７に向
かう。ここで、光束は、コーナーキューブプリズム２３
１の変位に応じた遅延時間が加わって、この光路を進行
する。

【００４５】分割された他方の光束は、反射鏡２１３、
反射鏡２１４ａを経て、位相変調器２２０のコーナーキ
ューブプリズム２２１に入射して、折り返し反射され
て、反射鏡２１４ｂを経て偏光ビームスプリッタ２１７
に向かう。ここで、光束は、コーナーキューブプリズム
２２１の周期的変位に応じて位相変調される。

【００４６】分割された二つの光束は、偏光ビームスプ
リッタ２１７において合成され、この干渉光学系２００
から出射され、検出系３００に入射する。

【００４７】検出系３００では、光束は、照射光学系
の、反射鏡３１１およびレンズ３１２を経て、試料Ｍ
に、光スポットの形で照射される。そして、試料Ｍから
放射される光が、レンズ３３１で、絞り３３２の開口３
３２ａに集光される。これにより、照射光学系そして、
レンズ３３３により平行光に変換される。この平行光
は、色ガラスフィルタ３３４を通過して、必要な蛍光の
みを選択される。そして、偏光ビームスプリッタ３３５
を経て、互いに直交する偏光成分に分離されて、それぞ
れ、光電子増倍管３４１，３４２に入射する。この時、
光エコー信号を含む蛍光の偏波成分と、光エコー信号を
含まない蛍光の偏波成分とに分離されて、対応する光電
子増倍管３４１，３４２に入力される。

【００４８】光電子増倍管３４１，３４２は、それぞ
れ、光電変換作用により、入射光をその光量に応じた電
気信号に変換して出力する。これらの電気信号は、差動
アンプ３４３により、同相成分が除去され、差分が増幅
されて出力される。すなわち、上述した蛍光の背景ノイ
ズが除去される。この後、差動アンプ３４３の出力は、
ロックインアンプ３４４に入力される。ロックインアン
プ３４４は、周波数２ｆの信号成分のみ増幅し、光エコ
ー信号として出力する。

【００４９】ロックインアンプ３４４から出力された信
号は、インタフェースにおいてアナログ信号からディジ
タル信号に変換され、ＣＰＵ３５１に取り込まれる。そ
して、ＣＰＵ３５１は、その時の遅延時間τと光エコー
信号とを、測定データとして対でメモリ３５２に格納す
る。

【００５０】また、ＣＰＵ３５１は、次の遅延時間τを
示す操作信号を光遅延器２３０に送って、上記と同様に
して、光エコー信号を検出する。以下、この動作を種々
の遅延時間について繰返し、それぞれにおける測定デー
タをメモリ３５２に蓄積する。このようにして、遅延時
間τと光エコー信号との対のデータが蓄積されたところ
で、ＣＰＵ３５１は、遅延時間τと光エコー信号とに基
づいて光学的位相緩和時間を求める処理を行う。そし
て、結果が、出力装置３５４により表示される。

【００５１】次に、上記のように構成される第１実施例
の光学検査装置を用いた実験例について説明する。

【００５２】（実験例）例えば、ローダミン系の色素
（ＸＲＩＴＣ）を用いて、人体の胃の切片組織（厚さ約
５ミクロン）を光学濃度約０．０１で染色したものを試
料Ｍとして、これにレーザー光を照射して、測定を行っ
た。この時、光源１００のレーザー波長は６００ｎｍ付
近に選択し、位相変調器２２０の周波数ｆは、２０ＫＨ
ｚとした。試料Ｍは、試料保持部３２０のクライオスタ
ットで、７ケルビンまで冷却した。照射光学系３１０に
より、試料Ｍ上の一点にレーザービームを固定し、光遅
延器２３０のステージ２３２の位置を走査しながら、各
遅延時間τについて、検出光学系３３０を介して試料の
蛍光を取り込み、光電子増倍管３４１，３４２で電気信
号に変換した。得られた電気信号を差動アンプ３４３で
差動増幅器において、背景ノイズを除去した。そして、
４０ＫＨｚの電気信号のみをロックインアンプ１４によ
り増幅して、コンピュータ３５０のメモリ３５２に、遅
延時間τと共に記録した。その後、コンピュータ３５０
により、図４に示すグラフを作成した。

【００５３】本実施例の光学検査装置で測定した結果
を、図４に示す。図４（ａ）は本実施例の装置で測定し
た結果であり、図４（ｂ）は蛍光の偏光分割を行わずに
測定した結果である。明らかに、本実施例の装置で測定
した方がＳＮ比が改善されていることがわかる。この場
合、光学的位相緩和時間は、信号強度の対数の遅延時間
に対する傾きから求めた。

【００５４】次に、本発明の第２実施例について、図３
を参照して説明する。

【００５５】図３に示す本発明の第２実施例は、光源１
００と、光変調光学系２００と、検出系３００とを有す
る。ここで、光源１００および光変調光学系２００は、
第１実施例のものと同じである。本実施例は、検出系３
００の構成において、第１実施例と相違する点がある。
すなわち、本実施例を構成する検出系３００は、試料Ｍ
において生じる光スポットを３次元走査できるようにし
た点、および、試料Ｍに対して落射照明を行なっている
点において、第１実施例と相違する。そこで、ここで
は、相違点を中心に説明する。

【００５６】本実施例で用いられる検出系３００は、光
変調光学系２００から出射される光束を受ける反射鏡３
１１と、反射鏡３１１からの光を２次元走査する走査機
構３７０と、走査された光を試料Ｍに投射すると共に、
蛍光を集光するための対物レンズ系を構成するレンズ３
６２および３６３と、レンズ３６３の焦点位置を試料Ｍ
の深さ方向に走査するための駆動装置３６４と、試料Ｍ
を保持する試料保持部３２０と、照射光と試料からの蛍
光とを分離する半透鏡３６１とを有する。また、検出系
３００は、半透鏡３６１で分離された蛍光を集光するレ
ンズ３３６と、該レンズの焦点位置にその開口（ピンホ
ール）３３２ａが配置された絞り３３２と、絞り３３２
を通過した光を平衡項に変換するレンズ３３７と、色ガ
ラスフィルタ３３４と、偏光ビームスプリッタ３３５
と、分離された各偏波成分を検出する光電子増倍管３４
１，３４２とを備える。さらに、検出系３００は、図３
には示していないが、第１実施例において用意されてい
る信号処理部およびコンピュータを備えている。

【００５７】走査機構３７０は、回転軸が互いに超っ抗
する位置関係となるように配置された回転ミラー３７
１，３７２と、それらの駆動を制御する制御装置とで構
成される。回転ミラー３７１，３７２としては、例え
ば、ガルバノミラーを用いることができる。具体的に
は、ミラーと、これを回転させるモータ、例えば、ステ
ッピングモータとで構成される。また、制御装置３７３
は、本実施例では図示していないが、コンピュータとの
間で、起動／停止信号、走査位置を示すアドレス信号等
の授受を行なっている。

【００５８】このような構成において、本実施例では、
先ず、駆動装置３６４で、試料Ｍの深さ方向の特定位置
にレンズ３６３の焦点を合わせるようにする。ついで、
光変調光学系２００から出射される光束を、走査機構３
７０において、回転ミラー３７１，３７２を回転させ
て、予め定めた順序で走査する。具体的には、一方のミ
ラー水平方向の走査に用い、他方のミラーを垂直方向の
走査に用いる。このようにして、照射光を、走査しつ
つ、対物レンズ系３６２，３６３を介して試料Ｍに投射
させる。

【００５９】一方、試料Ｍから放射される光は、対物レ
ンズ系３６３，３６２により集光して、照射時とは逆方
向に進行させる。そして、半透鏡３６１で分離して、レ
ンズ３３６で、絞り３３２の開口３３２ａに集光させ
る。この絞り３３２で、散乱光等の迷光を除去して、レ
ンズ３３７で再び平行光に変換する。そして、色ガラス
フィルタ３３４を通過して、必要な蛍光のみを選択し、
偏光ビームスプリッタ３３５を経て、互いに直交する偏
光成分に分離して、それぞれ、光電子増倍管３４１，３
４２に入射する。この時、光エコー信号を含む蛍光の偏
波成分と、光エコー信号を含まない蛍光の偏波成分とに
分離されて、対応する光電子増倍管３４１，３４２に入
力される。光電子増倍管３４１，３４２は、それぞれ、
光電変換作用により、入射光をその光量に応じた電気信
号に変換して出力する。

【００６０】これらの電気信号は、図示していない信号
処理部およびコンピュータによって、第１実施例と同様
に、測定データとして処理される。ただし、本実施例で
は、各遅延時間τについて、３次元走査アドレスと対応
させて測定データを記憶する。従って、試料Ｍについ
て、立体的に位相緩和時間を知ることができる。

【００６１】上記第１実施例では、試料の一点につい
て、位相緩和時間を求める実験を行なっているが、本実
施例では、試料を三次元的に走査して、それぞれの点
で、第１実施例の実験例と同様のデータを取得した。こ
のデータをもとに、試料の位相緩和時間について、立体
的な分布が得られた。

【００６２】また、上記各実施例では、位相変調器２２
０および光遅延器２３０において、コーナーキューブプ
リズムを用いているが、同のように機能するものであれ
ば、他のものを用いてもよい。例えば、直角に配置した
ミラーを用いることができる。

【００６３】

【発明の効果】本発明によれば、被観察物体の微細な形
状のみならず、微細部分の光位相緩和時間を測定するこ
とにより、その物性の差を明らかにすることができた。
また、励起レーザー強度が揺らいでいたり、測定装置が
振動していても、蛍光から蓄積エコーを正確に測定する
ことができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明による第１実施例の光学的検査装置の構
成を示す光路図。

【図２】蓄積光エコーの蛍光検出法の原理を示す概略光
路図。

【図３】本発明による第２実施例の光学的検査装置の構
成を示す光路図。

【図４】本発明による第１実施例の光学的検査装置によ
って測定した結果を示すグラフ。

【符号の説明】

１００…光源、２００…光変調光学系、２１１…位相
板、２１２、２１７、３３５…偏光ビームスプリッタ、
２１３、２１５…反射鏡、２１４ａ、２１４ｂ、２１６
ａ、２１６ｂ…反射鏡、２２０…位相変調器、２３０…
光遅延器、２２１、２３１…コーナーキューブプリズ
ム、２２２…圧電素子、２３２…移動ステージ、３００
…検出系、３１０…照射光学系、３１２、３３１、３３
３、３３６、３３７、３６２、３６３…レンズ、３２０
…試料保持部、３３０…検出光学系、３３４…色ガラス
フィルタ、３３２…絞り、３４０…信号処理部、３４
１，３４２…光電子増倍管、３４３…作動アンプ、３４
４…ロックインアンプ、３５０…コンピュータ、３７０
…走査機構、３７１，３７２…ガルバノミラー、Ｍ…試
料。

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】像面上で点光源とみなせる空間コヒーレン
   スと所定の時間コヒーレンスとを有する光を、互いに直
   交する直線偏光よりなる２光束に分割して、それぞれの
   光路を進行させ、いずれかの光路の光路長を変化させ、
   かつ、いずれかの光路において、光を位相変調した後、
   ２光束を合成して、試料に照射し、試料から放射される
   蛍光を、互いに直交する直線偏光よりなる２光束に分割
   し、それぞれの強度を検出し、かつ、それぞれの検出信
   号の差分を求め、この差分データについて上記位相変調
   の周波数の偶数倍のいずれかの変調強度を選択的に増幅
   して蓄積エコー強度を求め、さらに、光路長を異なる長
   さに変化させて、上記手順を繰返し、光路長の変化によ
   る遅延時間と、その時の蓄積エコー強度とを得ることを
   特徴とする光学的検査方法。
2. 【請求項２】請求項１において、位相変調を周波数ｆで
   行ない、周波数２ｆの変調強度を選択的に増幅して蓄積
   エコー強度を求める、光学的検査方法。
3. 【請求項３】像面上で点光源とみなせる空間コヒーレン
   スと所定の時間コヒーレンスとを有する光を放射する光
   源と、 光源からの光を、互いに直交する直線偏波成分に分割し
   て、いずれか一方について、光路長を変化させ、かつ、
   いずれか一方を位相変調した後、合成して射出する光変
   調光学系と、 光変調光学系から出射される光束を、試料に照射して、
   試料から放射される蛍光を互いに直交する直線偏光より
   なる２光束に分割して、それぞれの強度を検出し、か
   つ、それぞれの検出信号の差分を求め、この差分データ
   について上記位相変調の周波数の偶数倍のいずれかの倍
   数の変調強度を選択的に増幅して蓄積エコー強度を求め
   る検出系とを備えることを特徴とする光学的検査装置。
4. 【請求項４】請求項３において、光変調光学系は、 光源からの光を互いに直交する直線偏光よりなる２光束
   に分割する光分割器と、 該光分割器により分岐された２光束の一方の光路中に配
   置配置され、光路長を任意に変化させることができる光
   遅延器と、 該２光束に分割された２光束の一方の光を所定の周波数
   で位相変調するための位相変調器と、 該２光束を合波する光合成器とを備える光学的検査装
   置。
5. 【請求項５】請求項４において、検出系は、 合成されて出射された光を試料のある位置まで導いて、
   試料に照射するための照射光学系と、 試料を保持するための試料保持部と、 試料から放射される蛍光を集光すると共に、互いに直交
   する直線偏光よりなる２光束に分割する検出光学系と、 蛍光を電気的に検出して、その電気信号を処理する信号
   処理部と、 上記光遅延器の制御および上記処理された信号に基づい
   て、情報処理を行うコンピュータとを有する光学的検査
   装置。
6. 【請求項６】請求項５において、信号処理部は、 分離された該偏光成分の強度を独立に検出するための２
   つの光センサと、 光センサのそれぞれの出力の差分を求める差動アンプ
   と、 該差動検出器からの出力から、前記位相変調器の変調周
   波数の偶数倍の変調成分を抽出し増幅するロックインア
   ンプとを備える光学的検査装置。
7. 【請求項７】請求項６において、コンピュータは、 光遅延器を目的の遅延時間とするための制御と、ロック
   インアンプから出力される測定データを、遅延時間と対
   応させて記憶する処理を行なうものである光学的検査装
   置。
8. 【請求項８】請求項５、６または７において、検出光学
   系は、 試料から放射された蛍光のうち、目的の蛍光を透過させ
   るフィルタをさらに備える光学検査装置。
9. 【請求項９】請求項５、６または７において、検出光学
   系は、試料に照射される光スポットを２次元に走査する
   走査機構をさらに備える光学的検査装置。
10. 【請求項１０】請求項５、６または７において、検出光
    学系は、試料に照射される光スポットを２次元に走査す
    る走査機構と、該光スポットを試料の深さ方向に変位さ
    せると駆動装置とをさらに備える光学的検査装置。