CN114574632A

CN114574632A - 用于同时检测pev和ptv的直接扩增荧光rt-pcr引物探针组和试剂盒及方法

Info

Publication number: CN114574632A
Application number: CN202210237973.1A
Authority: CN
Inventors: 于新友; 王文秀; 李天芝; 唐娜; 刘博�; 谢金文; 谷英华
Original assignee: Shandong Binzhou Animal Science & Veterinary Medicine Academy
Current assignee: Shandong Binzhou Animal Science & Veterinary Medicine Academy
Priority date: 2022-03-10
Filing date: 2022-03-10
Publication date: 2022-06-03

Abstract

本发明公开了一种用于同时检测PEV和PTV的直接扩增荧光RT‑PCR引物探针组和试剂盒及方法，所述引物探针组包括4条不同的引物和2条不同的探针，其中，2条扩增PEV的引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1～2所示；1条扩增PEV的探针序列，其核酸序列如SEQ ID NO.5所示；2条扩增PTV的引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3～4所示；1条扩增PTV的探针序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，可用于直接扩增荧光RT‑PCR同时检测PEV和PTV，具有操作简单、灵敏度高、特异性好、检测速度快，成本低等显著优势，适宜临床大规模推广应用，具有良好的推广价值和应用前景。

Description

用于同时检测PEV和PTV的直接扩增荧光RT-PCR引物探针组和试剂盒及方法

技术领域

本发明涉及分子生物学检测技术领域，具体涉及一种用于同时检测PEV和PTV的直接扩增荧光RT-PCR引物探针组和试剂盒及方法。

背景技术

猪肠道病毒(porcine enteroviruse，PEV)是小RNA病毒科、肠道病毒属，病毒粒子呈圆形，无囊膜，基因组为单股正链RNA。PEV仅能感染猪，各品种和日龄猪均可感染发病，多呈散发。PEV引起的肠道病毒病临床症状可表现为腹泻、呼吸道疾病、神经症状及繁殖障碍等。能垂直传播也能水平传播，给养猪业造成严重的经济损失。

猪捷申病毒(porcine teschovirus，PTV)是小RNA病毒科、捷申病毒属，病毒粒子呈球形，无囊膜，基因组为单股正链RNA。PTV唯一宿主是猪，引起的猪捷申病毒病长期以来一直被忽视，呈地方流行性。各品种和日龄猪均可感染发病，主要临床表现为脑脊髓灰质炎、繁殖障碍、肺炎、下痢、心包炎和心肌炎、皮肤损伤等等。PTV还具有持续感染的特性，猪群感染康复后可长期带毒，排毒期长达3个月，给养猪业造成了严重的经济损失。

荧光PCR技术以其无可比拟的优势广泛应用于猪病检测中，传统荧光PCR检测需要病原核酸提取步骤，操作繁琐，增加了实验室气溶胶污染的概率，且可能因提取操作不慎导致检测假阴性或假阳性结果，对实验室条件要求较高。随着分子生物技术的不断发展，一些生物试剂公司已经开发出了直接扩增荧光PCR扩增试剂，试剂有耐高温的酶制剂和促使病毒高温裂解的试剂组分，已经应用新型冠状病毒检测中，但在兽医领域相关报道较少。一种病原核酸检测方法建立除试剂外，引物和探针是最关键的部分，尤其多重荧光PCR检测病原的方法尚未成熟，对多种荧光PCR检测引物和探针的设计并不容易，需要考虑不同引物和探针间的干扰和匹配性，各引物和探针的比例需要不断优化，并不是简单随意的配比，为达到最佳扩增效果，还需要对扩增反应的退火温度和反应条件不断优化，确定最佳的引物探针配比和反应条件。因此，在荧光PCR方法在建立过程中需要优化各种条件。选择不同厂家试剂进行比对分析，选择性价比高，检测效果好的试剂，一种优质检测方法的研制并非想的那么简单，需要大量的时间和精力付出，不断调试验证。

猪病毒性腹泻是猪最重要的一类疾病，可造成仔猪大批量死亡，猪场损失严重，PEV和PTV均是导致猪腹泻的重要病原，均能通过粪口途径传播。此外，PEV和PTV还均能引起猪神经症状、繁殖障碍等，临床上症状表现类似，很难区分，需要通过实验室方法进行鉴别。当前存在分别针对PEV或PTV单项荧光PCR方法，但没有同时检测PEV和PTV荧双重光PCR方法，且操作繁琐，对实验室条件要求高，存在气溶胶污染风险。对PEV和PTV同时快速检测是猪场亟需的技术，需要研制适合现场快速检测、高效、灵敏、简便的试剂盒。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种用于同时检测PEV和PTV的直接扩增荧光RT-PCR引物探针组；本发明的目的之二在于提供一种含有所述的引物探针组的试剂盒，该试剂盒操作简单、灵敏度高、特异性好、检测速度快，成本低，能同时检测PEV和PTV，可以有效满足猪场临床PEV和PTV疑似病例的快速确诊、疫情的流行病学调查；本发明的目的之三在于提供一种使用所述的试剂盒同时检测PEV和PTV的方法。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

1、一种用于同时检测PEV和PTV的直接扩增荧光RT-PCR引物探针组

包括4条不同的引物和2条不同的探针，其中，2条扩增PEV的引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1～2所示；1条扩增PEV的探针序列，其核酸序列如SEQ ID NO.5所示；2条扩增PTV的引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3～4所示；1条扩增PTV的探针序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。

本发明优选的，SEQ ID NO.5序列所示探针的5′端标记荧光基团FAM，3′端标记淬灭基团BHQ1。

本发明优选的，SEQ ID NO.6序列所示探针的5′端标记荧光基团HEX，3′端标记淬灭基团BHQ1。

2、一种含有所述的引物探针组的试剂盒，包括如下试剂：

(1)RT-PCR反应液：PrimeDirect Probe RT-qPCR Mix；

(2)引物、探针预混合液：SEQ ID NO.1～4所示引物，SEQ ID NO.5～6所示探针的混合液；

(3)阳性对照：阳性对照为灭活的PEV和PTV病毒液等体积混合液；

(4)阴性对照：纯化水。

本发明优选的，所述引物探针预混合液中，SEQ ID NO.1～4所示引物分别按8∶13∶12∶14的体积混合，SEQ ID NO.5～6所示探针按6∶7的体积混合，SEQ ID NO.1～4所示引物的配制浓度均为15μmol/L，SEQ ID NO.5～6所示探针的配制浓度均为10μmol/L。

本发明优选的，所述阳性对照中，灭活前PEV病毒液病毒含量为10^2.71TCID₅₀/100μL，PTV病毒液病毒含量为10^2.54TCID₅₀/100μL。

3、使用所述的试剂盒同时检测PEV和PTV的方法，包含如下步骤：

取待测猪的肠道内容物或粪便作为样本，按1∶5加入生理盐水，搅拌混匀，12000r/min离心2min，取上清作为模板，加入权利要求4～6任一项所述的试剂盒中的RT-PCR反应液和引物、探针预混合液进行进行直接扩增荧光RT-PCR。

本发明优选的，所述直接扩增荧光RT-PCR的反应程序为：90℃裂解3min；60℃反转录5min；95℃变性5s，52℃退火20s，此处收集荧光，共计40个循环。

本发明的有益效果在于：针对PEV和PTV保守基因序列，设计多组引物探针，筛选出最佳组合，优化各引物和探针比例，配以直接扩增法荧光RT-PCR反应液，在荧光定量PCR仪扩增检测，通过荧光信号的变化实现对PEV和PTV两种病毒的同时检测。不需要提取病原核酸，而是直接以含有病毒的样品为模板，操作简单，减少了实验室气溶胶污染风险，稳定性好，易操作，实现快速、简便、高通量的检测PEV和PTV，具有灵敏度高、特异性强、结果准确、高通量等优势，非常适宜大规模推广应用，具有良好的应用前景。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：

图1为双重荧光PCR方法对PEV检测的敏感性试验；

图2为双重荧光PCR方法对PTV检测的敏感性试验；

图3为双重荧光PCR方法对PEV检测的特异性试验；

图4为双重荧光PCR方法对PTV检测的特异性试验。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

实施例1

同时检测PEV和PTV的直接扩增荧光RT-PCR检测方法的建立

一、引物探针的设计和制备

查询并下载GenBank收录的PEV VP1基因和PTV VP1基因序列，经DNAMAN软件比对分析，设计多组引物和探针，筛选后获得的最佳引物和探针组序列如下：

用于PEV扩增的引物为：

正向引物SEQ ID NO.1：AAATAGCCGATAACAAGC；

反向引物SEQ ID NO.2：AGGTGGCAACAAGAGTAA；

用于PTV扩增的引物为：

正向引物SEQ ID NO.3：AGATTCCGCAGGACTTTG；

反向引物SEQ ID NO.4：GATTCGGGTGGACTCATT；

用于PEV扩增的探针为：

SEQ ID NO.5：TGTACAGCTAAGGGCCAAGATTGAGC；

用于PTV扩增的探针为：

SEQ ID NO.6：CCTCAATGTCCCCAGCCAACAAGATAGT；

SEQ ID NO.5序列所示探针的5′端标记荧光基团FAM，3′端标记淬灭基团BHQ1。SEQID NO.6序列所示探针的5′端标记荧光基团HEX，3′端标记淬灭基团BHQ1。

上述引物和探针由生工生物工程(上海)有限公司合成。

二、阳性对照制备

本实施例中阳性对照为灭活的PEV和PTV等体积混合液，灭活前PEV病毒液含毒量为10^2.71TCID₅₀/100μL，PTV病毒液含毒量为10^2.54TCID₅₀/100μL，PEV和PTV病毒为本单位分离、保存。

三、反应体系的配制

PrimeDirect Probe RT-qPCR Mix 10μL，引物探针混合液6μL，纯化水2μL，模板2μL进行混匀，共20μL。其中，引物探针混合液中含0.8μL SEQ ID NO.1(15μmol/L)，1.3μL SEQID NO.2(15μmol/L)，0.6μL SEQ ID NO.5(10μmol/L)，1.2μL SEQ ID NO.3(15μmol/L)，1.4μL SEQ ID NO.4(15μmol/L)，0.7μL SEQ ID NO.6(10μmol/L)。配制好反应体系后即可进行荧光RT-PCR检测。

四、扩增反应程序

优化后直接扩增荧光RT-PCR的最佳退火温度为52℃，扩增的反应程序为：90℃裂解3min；60℃反转录5min；95℃变性5s，52℃退火20s(此处收集荧光)，共计40个循环。

五、结果的判定

荧光PCR反应结束后，利用实时荧光PCR仪分析软件，根据实时荧光PCR的扩增曲线分析待测样品。所述分析待测样品结果判定标准如下：

质控标准：

阴性对照：FAM通道无Ct值，且无典型扩增曲线。HEX通道无Ct值，且无典型扩增曲线。阳性对照：FAM通道Ct值＜30.0，并出现典型的扩增曲线。HEX通道Ct值＜30.0，并出现典型的扩增曲线。

若阴、阳性对照组结果不成立，则视为无效检验。

结果描述及判定：

若检测样品FAM通道无Ct值或Ct值＞38，则判为PEV核酸阴性。若检测样品HEX通道无Ct值或Ct值＞38，则判为PTV核酸阴性。

若检测样品FAM通道Ct值≤35.0，出现典型的扩增曲线，则判为PEV核酸阳性。若检测HEX通道样品Ct值≤35.0，出现典型的扩增曲线，则判为PTV核酸阳性。

若检测样品FAM通道35.0＜Ct值≤38.0，则应重新提取样本核酸，重复检验一次，若Ct值≤38.0，扩增曲线有明显起峰，则样本判为PEV核酸阳性，否则为阴性。若检测样品HEX通道35.0＜Ct值≤38.0，则应重新提取样本核酸，重复检验一次，若Ct值≤38.0，扩增曲线有明显起峰，则样本判为PTV核酸阳性，否则为阴性。

实施例2

直接扩增荧光RT-PCR引物对的筛选及对比验证

设计针对PEV VP1基因和PTV VP1基因序列各4组引物，并与PEV和PTV特异性探针进行组合(SEQ ID NO.5，SEQ ID NO.6，4组引物对应的PEV与PTV的探针相同)，其中，4组引物分别为A组、B组、C组和D组，其中C组为本发明筛选的最佳引物组(实施例1中SEQ ID NO.1～4)，A组、B组和D组的引物组如下，结果发现A组引物FAM荧光通道无扩增，C引物扩增效果较好，B组引物FAM荧光通道无扩增，D组引物敏感性不够，存在漏检情况。

A组引物具体核苷酸如下：

PEV-F：GTTGTGGTCTCGTATCCAT(SEQ ID NO.7)；

PEV-R：TTTCCTTTGGTAAAGGTGG(SEQ ID NO.8)；

PTV-F：TTTGATCCCCAAAAGGAAC(SEQ ID NO.9)；

PTV-R：TATTCCAGGGCGTGGACA(SEQ ID NO.10)；

B组引物具体核苷酸如下：

PEV-F：ATCCATCAAAGAAATAGCCG(SEQ ID NO.11)；

PEV-R：TGGATGTTGTGATGCAGA(SEQ ID NO.12)；

PTV-F：AAGGAACAACCAGATTCCGCAGG(SEQ ID NO.13)；

PTV-R：TCATTTGAATACGAATCTT(SEQ ID NO.14)；

D组引物具体核苷酸如下：

PEV-F：GTTGAGAAATGGTTGGTTA(SEQ ID NO.15)；

PEV-R：ATACATAACCTGTACTTGGA(SEQ ID NO.16)；

PTV-F：GGTTTTGGGATGCTTGTACTGC(SEQ ID NO.17)；

PTV-R：GAAAGCCGGCCTGTCACTGCT(SEQ ID NO.18)；

实施例3

同时检测PEV和PTV的直接扩增荧光RT-PCR试剂盒灵敏度试验

取病毒含量为10^4.71TCID₅₀/100μL的PEV病毒培养液，10倍比系列稀释，当PEV倍比稀释到10⁴，即病毒含量为5.13TCID₅₀/100μL时检测结果仍为阳性，即该法对PEV最低检测限度为5.13TCID₅₀/100μL。

取病毒含量为10^4.54TCID₅₀/100μL的PTV病毒培养液，10倍比系列稀释，当PTV倍比稀释到10⁴，即病毒含量为3.47TCID₅₀/100μL时检测结果仍为阳性，即该法对PTV最低检测限度为3.47TCID₅₀/100μL。

结果如图1(FAM荧光通道)和图2(HEX荧光通道)所示，图1中1表示10^4.71TCID₅₀/100μL的PEV病毒液，2表示10^3.71TCID₅₀/100μL的PEV病毒液，3表示10^2.71TCID₅₀/100μL的PEV病毒液，4表示10^1.71TCID₅₀/100μL的PEV病毒液，5表示10^0.71TCID₅₀/100μL的PEV病毒液，6表示10^-0.29TCID₅₀/100μL的PEV病毒液，7表示10^-1.29TCID₅₀/100μL的PEV病毒液。从图1中可以看出，1～5扩增结果为阳性。因此，可以确定该法对PEV的最低检测限度为5.13TCID₅₀/100μL。

图2中1表示10^4.54TCID₅₀/100μL的PTV病毒液，2表示10^3.54TCID₅₀/100μL的PTV病毒液，3表示10^2.54TCID₅₀/100μL的PTV病毒液，4表示10^1.54TCID₅₀/100μL的PTV病毒液，5表示10^0.54TCID₅₀/100μL的PTV病毒液，6表示10^-0.46TCID₅₀/100μL的PTV病毒液，7表示10^- ^1.46TCID₅₀/100μL的PTV病毒液。从图2中可以看出，1～5扩增结果为阳性。因此，可以确定该法对PTV的最低检测限度为3.47TCID₅₀/100μL。

这表明本方法对PEV和PTV检测均具有较高的敏感性。

实施例4

同时检测PEV和PTV的直接扩增荧光RT-PCR试剂盒的特异性试验

取猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒2型、猪伪狂犬病毒、猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪轮状病毒、猪德尔塔冠状病毒8种病毒液作为模板，用研制的直接扩增荧光RT-PCR试剂盒进行扩增检测，同时设置PEV和PTV混合病毒液为阳性对照，纯化水为阴性对照。

结果如图3和图4所示。在图3中1表示PEV和PTV混合病毒液；2表示猪瘟病毒；3表示猪繁殖与呼吸综合征病毒；4表示猪圆环病毒2型；5表示猪伪狂犬病毒；6表示猪流行性腹泻病毒；7表示猪传染性胃肠炎病毒；8表示猪轮状病毒；9表示猪德尔塔冠状病毒；10表示纯化水。

在图4中1表示PEV和PTV混合病毒液；2表示猪瘟病毒；3表示猪繁殖与呼吸综合征病毒；4表示猪圆环病毒2型；5表示猪伪狂犬病毒；6表示猪流行性腹泻病毒；7表示猪传染性胃肠炎病毒；8表示猪轮状病毒；9表示猪德尔塔冠状病毒；10表示纯化水。

PEV和PTV混合病毒液无论是在FAM荧光通道还是HEX荧光通道均有典型的S型扩增的曲线，且两者CT≤30.0，其余样品和阴性对照均无扩增曲线，表明本发明方法特异性良好。

实施例5

同时检测PEV和PTV的直接扩增荧光RT-PCR试剂盒的重复性试验

取病毒含量为10^4.71TCID₅₀/100μL的PEV病毒培养液，10倍比系列稀释，

稀释后的PEV病毒液取10^4.71TCID₅₀/100μL、10^3.71TCID₅₀/100μL、10^2.71TCID₅₀/100μL三种不同稀释度，进行批内和批间重复性试验。取病毒含量为10^4.54TCID₅₀/100μL的PTV病毒培养液，10倍比系列稀释，稀释后的PTV病毒液取10^4.54TCID₅₀/100μL、10^3.54TCID₅₀/100μL、10^2.54TCID₅₀/100μL三种不同稀释度，进行批内和批间重复性试验。

批内重复性试验：每个样品设3个重复，在同一试验下，用研制的直接扩增荧光RT-PCR方法进行检测。批间重复性试验：在不同时间段，相同试验条件下，用研制的直接扩增荧光RT-PCR方法检测进行3次独立检测，根据Ct值计算标准偏差和变异系数，验证方法的重复性。结果如表1所示，PEV和PTV毒株批内和批间变异系数均不高于2％，表明方法具有良好的重复性。

表1直接扩增荧光定量RT-PCR检测试剂盒重复性试验结果

实施例6

应用本发明试剂盒进行临床样本检测

采集135份疑似PEV或PTV感染猪肠道内容物和粪便样本，按常规方法处理，按1∶5加入生理盐水，搅拌混匀，12 000r/min离心2min，取上清作为模板。用本发明同时检测PEV和PTV直接扩增荧光RT-PCR试剂盒进行检测，同时参照相关文献用传统核酸提取后，再进行荧光RT-PCR方法检测验证结果。结果本发明试剂盒检测出PEV阳性样品24份，PTV阳性样品13份，而传统核酸提取后的荧光RT-PCR方法检出PEV阳性样品24份，PTV阳性样品13份，由此可看出本发明试剂盒检测结果与传统核酸提取后，再进行荧光RT-PCR方法检测的结果一致，具有良好的商业应用前景。

实施例7

不同病毒基因组RNA提取和直接扩增对PEV和PTV检测的影响

目前市场上RNA提取试剂盒的种类较多，主要可分为两类即柱式提取法和磁珠法。本实施例以3份PEV阳性组织样本匀浆液和2份PTV阳性组织样本匀浆液作为待检测样品。选择以下3种方法处理样品：①直接离心取上清液为模板②选择柱式提取法(杭州博日科技有限公司产品)提取RNA为模板③选择磁珠法(杭州博日科技有限公司产品)提取RNA为模板。后采用本发明同时检测PEV和PTV的直接扩增荧光RT-PCR试剂盒进行扩增，探讨是否提取核酸方法对PEV和PTV检测的影响。结果如表2所示。

表2 2种病毒RNA提取方法和不提取直接扩增方法检测结果

从上表2可以明显看出，3种方法检测都有明确的Ct值，且相差不大，表明这3种方法都可以从组织样品中检测出PEV和PTV，且这3种方法的敏感性没有明显差异。但比较这3种方法的检测时间可以看出，方法1仅用时38分钟左右，方法2用时85分钟左右，而方法3用时52分钟左右，显然，方法1更适合临床PEV和PTV的快速检测。这一结果也看出本发明研制的试剂盒的便捷性所在。

由以上实施例可知，本发明提供了一种引物探针组，并以引物探针组为基础研制了一种同时检测PEV和PTV直接扩增荧光RT-PCR试剂盒，该试剂盒不同于当前市面上的试剂盒，不需要核酸提取或快速预处理，而是直接以样品为模板，试剂盒抗干扰能力强，操作简便，敏感性高，特异性好，不需要专业PCR实验室，配合便携式荧光检测设备，可实现病原现场快速检测，具有良好的应用前景。

以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。

序列表

<110> 山东省滨州畜牧兽医研究院

<120> 用于同时检测PEV和PTV的直接扩增荧光RT-PCR引物探针组和试剂盒及方法

<160> 18

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

aaatagccga taacaagc 18

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

aggtggcaac aagagtaa 18

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

agattccgca ggactttg 18

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gattcgggtg gactcatt 18

<210> 5

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tgtacagcta agggccaaga ttgagc 26

<210> 6

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

cctcaatgtc cccagccaac aagatagt 28

<210> 7

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gttgtggtct cgtatccat 19

<210> 8

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

tttcctttgg taaaggtgg 19

<210> 9

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

tttgatcccc aaaaggaac 19

<210> 10

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

tattccaggg cgtggaca 18

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

atccatcaaa gaaatagccg 20

<210> 12

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

tggatgttgt gatgcaga 18

<210> 13

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

aaggaacaac cagattccgc agg 23

<210> 14

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

tcatttgaat acgaatctt 19

<210> 15

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

gttgagaaat ggttggtta 19

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

atacataacc tgtacttgga 20

<210> 17

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

ggttttggga tgcttgtact gc 22

<210> 18

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

gaaagccggc ctgtcactgc t 21

Claims

1.一种用于同时检测PEV和PTV的直接扩增荧光RT-PCR引物探针组，其特征在于，包括4条不同的引物和2条不同的探针，其中，2条扩增PEV的引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1～2所示；1条扩增PEV的探针序列，其核酸序列如SEQ ID NO.5所示；2条扩增PTV的引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3～4所示；1条扩增PTV的探针序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。

2.根据权利要求1所示的引物探针组，其特征在于，SEQ ID NO.5序列所示探针的5′端标记荧光基团FAM，3′端标记淬灭基团BHQ1。

3.根据权利要求1所示的引物探针组，其特征在于，SEQ ID NO.6序列所示探针的5′端标记荧光基团HEX，3′端标记淬灭基团BHQ1。

4.一种含有权利要求1所述的引物探针组的试剂盒，其特征在于，包括如下试剂：

(1)RT-PCR反应液：PrimeDirect Probe RT-qPCR Mix；

(4)阴性对照：纯化水。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述引物探针预混合液中，SEQ ID NO.1～4所示引物分别按8：13：12：14的体积混合，SEQ ID NO.5～6所示探针按6：7的体积混合，SEQ ID NO.1～4所示引物的配制浓度均为15μmol/L，SEQ ID NO.5～6所示探针的配制浓度均为10μmol/L。

6.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述阳性对照中，灭活前PEV病毒液病毒含量为10^2.71TCID₅₀/100μL，PTV病毒液病毒含量为10^2.54TCID₅₀/100μL。

7.使用权利要求4～6任一项所述的试剂盒同时检测PEV和PTV的方法，其特征在于，包含如下步骤：取待测猪的肠道内容物或粪便作为样本，按1：5加入生理盐水，搅拌混匀，12000r/min离心2min，取上清作为模板，加入权利要求4～6任一项所述的试剂盒中的RT-PCR反应液和引物、探针预混合液进行直接扩增荧光RT-PCR。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述直接扩增荧光RT-PCR的反应程序为：90℃裂解3min；60℃反转录5min；95℃变性5s，52℃退火20s，此处收集荧光，共计40个循环。