CN104745726A - 猪蓝耳病病毒、高致病性猪蓝耳病病毒和猪瘟病毒三重荧光定量检测试剂盒 - Google Patents

猪蓝耳病病毒、高致病性猪蓝耳病病毒和猪瘟病毒三重荧光定量检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种猪蓝耳病病毒、高致病性猪蓝耳病病毒和猪瘟病毒三重荧光定量检测试剂盒，其包括序列表SEQ ID No.1～9所示序列的引物和探针，以及病毒总RNA萃取试剂、RT-QPCR混合酶液、RNase Free dH2O、阳性对照和阴性对照中的一种或多种。本试剂盒基于三重RT荧光定量PCR技术，同时检测猪蓝耳病病毒分子，高致病猪蓝耳病病毒分子和猪瘟病毒分子，用于动物肺、淋巴结、脾脏、肾、心、肝、血液及肉品等低微含量样品的检测，诊断样品供体是否染毒，适用于活畜和肉品检疫。其具有特异性好、灵敏度高的优点，联合检测大大降低了检测成本，节省了检测时间，能在疫情爆发时便于在短时间内确定疫病的种类。

Description

猪蓝耳病病毒、高致病性猪蓝耳病病毒和猪瘟病毒三重荧光定量检测试剂盒
技术领域
本发明涉及病毒的诊断领域，具体涉及一种能同时检测猪蓝耳病病毒、高致病性猪蓝耳病病毒和猪瘟病毒的三重荧光定量RT-PCR检测试剂盒。
背景技术
猪瘟是由猪瘟病毒(Classical Swine Fever Virus，CSFV)引起的一种高度接触性热性传染病，该传染性高，致病性强，猪是本病唯一的自然宿主，感染的病猪主要表现为特征性病理变化，内脏出血，梗塞和坏死，死亡率很高，给养猪业造成重大的经济损失。病猪是最主要的传染源，易感猪与病猪的直接接触是病毒传播的主要方式。在我国，猪瘟流行呈现典型猪瘟和非典型猪瘟共存、持续感染与隐性感染共存、免疫耐受和带毒综合征共存等形式；在国外，比利时、德国、荷兰最近爆发猪瘟也说明猪瘟流行形式发生了改变。猪瘟新的流行形式给全世界养猪业提出了新的挑战。CSFV与牛病毒性腹泻病毒(bovine viraldiarrhea virus，BVDV)和羊边界病毒(Border Disease Virus，BDV)同属黄病毒科(Flaviviridae)瘟病毒属(pestivirus)。猪瘟病毒基因组为单股正链RNA长约12.3KB，含有一个大的开放阅读框架。病毒粒子呈球形，直径40-50nm，二十面体对称，其芯髓直径29-30nm，有囊膜。
猪蓝耳病与呼吸综合征，是由猪蓝耳病病毒(Porcine reproductiveand respiratory syndrome virus，PRRSV)引起的一种高度接触性传染病，在大多数国家中呈流行性感染。猪发病后临床表现差异极大，是该病的显著特征之一。临床症状主要是繁殖障碍，包括怀孕后期流产、早产和死胎，育成猪的呼吸道症状。发病母猪体温升高，厌食，部分患猪的背侧、双耳的耳尖及边缘呈红蓝色。发病公猪性欲减退，生产性能下降。发病仔猪出生时死亡或产出后个体小。患猪死亡后的主要病理变化是:眼球肿胀突出，头、臀部皮下水肿，胸腔、心包积水，心室扩张，心肌变化萎缩，肾脏皮质部点状出血，肺脏间质性肺炎病变。1991年病原首次鉴定，病毒是单链RNA病毒，属于动脉炎病毒科动脉炎病毒属，但是病毒的来源并未确定。1985年美国猪群猪繁殖与呼吸综合征病毒血清抗体的存在说明该病毒在发病之前就已经存在。
2006年我国南方部分省份出现养猪场(户)暴发猪“高热病”疫情，发病猪以“高热”、“高发病率”和“高死亡率”为主要特征，给我国的养猪业造成了较大的经济损失。中国动物疫病预防控制中心田克恭等研究发现，猪“高热病”的主要致病病原为Nsp2缺失30个氨基酸的猪繁殖与呼吸综合征病毒变异引起，后将其命名为“高致病性猪蓝耳病”(Highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndromevirus，HP-PRRSV)，其致病性大大增加，仔猪发病率可达100％、死亡率可达50％以上，母猪流产率可达30％以上，育肥猪也可发病死亡。依据PRRSV结构基因序列的不同可以将其分为欧洲型和美洲型两种基因型，而依据其致病力的不同，又可将其中的美洲型PRRSV分为经典株和高致病性株两种亚型。
常规的猪瘟病毒和猪蓝耳病病毒的实验室检验方法是根据免疫反应原理，利用ELISA及双夹心ELISA法进行检测。目前，国内外已对猪瘟的结构蛋白基因进行了详尽的研究，国外有学者分别对CSFVAlfort株和BreSCia株基因进行了全序列测定，并通过免疫学方法证明囊膜糖蛋白El是CSFV诱导保护性中和抗体的重要抗原，而国内则对于石门株(Shimen)的基因序列进行了测定。通过RT-PCR技术将编码相应结构蛋白的mRNA反转录成cDNA，转入载体进行表达，并将表达产物进行纯化、定量以及作为抗原包板做ELISA进行感染检测。另外猪瘟兔化弱毒EZ蛋白A/D区的高效表达和蛋白纯化后亦可以作为包被抗原进行ELISA测定，但是由于不能区分自然感染的和免疫接种。PRRSV可以从各种临床样品中分离到，包括血清、血浆、外周血单核细胞、骨髓、扁桃体、肺脏、淋巴结、胸腺、脾脏、心、脑、肝、翠丸、附翠、输精管、尿道球腺、阴茎组织、口咽拭子、鼻甲、鼻拭子、胎盘、唾液、尿液、粪便以及精液中。一般来说，肺脏深处积液以及血清都是病毒分离最理想的材料。送检材料通常应包括新鲜采集的肺、扁桃体以及淋巴结。但是只有当特定滴度的标准病毒在新巨噬细胞生长良好，方可使用。冰冻切片免疫荧光抗体试验(IFA)以及免疫组化试验(IHC)可以检测组织中的PRRSV抗原。冰冻切片直接FA试验成本较低并且快速，这两种方法的特异性很高，但相对来说敏感性不够。样品的质量对FA结果影响非常大，要求组织应该新鲜。IHC可以检测甲醛固定的组织，比FA的敏感性要高，但更费时而且成本更高。通过组织病理学切片，结合IHC以及FA试验的结果可以对PRRSV感染做出准确的诊断。另外，针对上述两种病毒可以用RT-PCR技术进行检测。通常是用异硫氰酸肌一酚一仿一步抽提法提取病料细胞总RNA并进行反转录，再以此产物为模板对可疑的猪瘟或者猪蓝耳病病料进行了PCR扩增。如果扩增出相应的片段则说明病毒的存在，敏感性要高于荧光抗体染色法、酶标单克隆抗体染色法和电镜负染法，可以作为一种有效的诊断方法。概括来说猪瘟病毒和猪蓝耳病病毒的检测方法主要包括免疫学检测方法和核酸检测方法两大类。免疫学方法主要是检测血清中是否存猪瘟和猪蓝耳病病毒的特异性抗体，具体是用ELISA的方法进行检测，然而这种方法必须是建立在已经发生病毒感染并产生抗体的基础上，而且鉴于上述病毒的高度变异性以及与其他病毒血清学的交叉性，其特异性难以保证，容易出现假阳性和假阴性。病毒分离和培养法比较敏感，但是这种方法操作繁琐，不宜在所有检测实验特别是一些基层实验室推广。用普通PCR的方法进行猪瘟或者猪蓝耳病病毒核酸，虽然灵敏度有所提高，但是容易产生非特异性扩增，甚至会因为操作的原因出现假阳性，而且普通PCR扩增法其结果的判断需要对产物进行凝胶电泳分析，操作方法不够简化。
荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法，该方法操作方便快捷。CN101058830A公开了“猪瘟病毒荧光定量RT-PCR诊断试剂盒”，CN101328506A公开了“一种特异检测猪瘟病毒野毒感染的荧光定量PCR快速诊断试剂盒及其应用方法”。两篇文献均只对猪瘟病毒进行了单独检测。猪瘟和猪蓝耳病是严重危害猪的病毒性疾病，常以单独或混合感染的方式感染猪，发病率和死亡率都较高。目前针对猪瘟病毒和猪蓝耳病病毒感染的联合检测方法还未完善，而对高致病性猪蓝耳病毒的检测也仍然在探索阶段。目前还没有能够同时对猪蓝耳病病毒、高致病性猪蓝耳病病毒和猪瘟病毒进行同时检测的相关试剂。
发明内容
本发明的目的在于针对上述不足提供一种具可同时用于猪蓝耳病病毒美洲型经典株、高致病株和猪瘟病毒三种病毒的联合荧光定量检测。
为实现上述目的，本发明的技术方案如下：
猪蓝耳病病毒、高致病性猪蓝耳病病毒和猪瘟病毒三重荧光定量检测试剂盒，其包括以下检测引物和探针：
A、猪瘟病毒的特异性引物
上游引物:TTCAATTTGGTTCAGGGCCTCC
下游引物:TACTCAGGACTTAGACCACCCAGG
猪瘟病毒的特异性探针
荧光探针:CY5-ATGCCCATAGTAGGACTAGCAAACGG-BHQ3
B、蓝耳病病毒美洲株的特异性引物
上游引物:TGGTTTCTCTCTGGCTTTTAGGTC
下游引物:GTAGGTTCCATCTGGTGCGGT
蓝耳病病毒美洲株的特异性探针
荧光探针:FAM-TTGCTGGTCTCGTCACCCCCTAT-BHQ1
C、高致病蓝耳病病毒的特异性引物
上游：TGTCCCCAAGCTGATGACAC
下游：ATGGTGCTAAGGGGAAAGCC
高致病蓝耳病病毒的特异性探针
探针：HEX-CGTAGAACTGTGACA-MGB
进一步，所述检测试剂盒还包括病毒总RNA萃取试剂、RT-QPCR混合酶液、RNase Free dH2O、阳性对照和阴性对照中的一种或多种。
其中，所述引物和探针包含于RT-QPCR反应液中，该反应液还包括Mg2+和dNTPs。Mg2+可以是常用的MgCl2形式，浓度为0.05M，dNTPs的浓度为0.2M，引物和探针优选的浓度为各0.5M，缓冲液为TrisM针优选的浓缓冲液(0.01M pH8.0)。当然，也可以按照常规方式将各试剂单独存放，在使用时进行配置，通常这种方式可以延长试剂的保存期限。然而，本发明对引物和探针的选择，包括荧光试剂的选择已经对稳定性进行了优化，该混合反应液能在低温下保存6个月。
其中，所述病毒总RNA萃取试剂包括TRIZOL试剂、氯仿/异戊醇和异丙醇。
其中，所述RT-QPCR混合酶液包括RNA酶抑制剂、AMV逆转录酶和Taq酶。
其中，所述阳性对照包括猪蓝耳病病毒美洲株基因组RNA，高致病性猪蓝耳病病毒基因组RNA和猪瘟病毒RAN。
其中，所述阴性对照为空白缓冲液。
本试剂盒基于三重RT荧光定量PCR技术，同时检测猪蓝耳病病毒分子，高致病猪蓝耳病病毒分子和猪瘟病毒分子，用于动物肺、淋巴结、脾脏、肾、心、肝、血液及肉品等低微含量样品的检测，诊断样品供体是否染毒，适用于活畜和肉品检疫。
本发明试剂盒的特异性好、灵敏度高、三种常见猪病毒联合检测大大降低了检测成本，节省了检测时间，能在疫情爆发时便于在短时间内确定疫病的种类。
具体实施方式
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1 引物及探针的设计与筛选
在RT-PCR检测中，引物及探针的设计直接影响到检测的特异性及灵敏性。尤其是在多重RT-PCR检测中，不同引物及探针之间又存在着相互之间的影响。本发明在充分考虑相关因素后，设计了若干组引物及探针，但不尽如意，然而意外发现以下引物及探针组显示出良好的特异性及灵敏性。
1.猪瘟病毒的特异性引物
上游引物:TTCAATTTGGTTCAGGGCCTCC
下游引物:TACTCAGGACTTAGACCACCCAGG
猪瘟病毒的特异性探针
荧光探针:CY5-ATGCCCATAGTAGGACTAGCAAACGG-BHQ3
2.蓝耳病病毒美洲株的特异性引物
上游引物:TGGTTTCTCTCTGGCTTTTAGGTC
下游引物:GTAGGTTCCATCTGGTGCGGT
蓝耳病病毒美洲株的特异性探针
荧光探针:FAM-TTGCTGGTCTCGTCACCCCCTAT-BHQ1
3.高致病蓝耳病病毒的特异性引物
上游：TGTCCCCAAGCTGATGACAC
下游：ATGGTGCTAAGGGGAAAGCC
高致病蓝耳病病毒的特异性探针
探针：HEX-CGTAGAACTGTGACA-MGB
本发明在各探针的荧光染料选择上，充分考虑发射波长等因素，使用CY5&BHQ3、FAM&BHQ1以及HEX&MGB的组合，使得在多重检测上不存在干扰问题。
实施例2 试剂盒组装
按试剂的理化特性，将试剂盒分为A和B两部分组装。A部分为病毒总RNA萃取试剂，B部分为荧光定量PCR检测试剂，方便保存和运输。
用合适的外包装盒包装以下试剂，贴标签(标示名称、批号、生产日期、有效期等)。
A部分
(1)溶液A(TRIzoL)一瓶，25mL；
(2)溶液B(氯仿/异戊醇)一瓶，6mL；
(3)溶液C(异丙醇)一瓶，18mL；
B部分
(4)溶液D(RNase Free dH2O)两支，2mL；
(5)溶液E(三重RT-QPCR反应液)一支，1.5mL；
(6)溶液F(混合酶液)一支，65μL；
(7)溶液G(阳性对照)一支，40μL；
(8)溶液H(阴性对照)一支，40μL；
(9)使用说明书1份。
具体配制及组成如下：
1.1 引物
人工合成实施例1中的引物，稀释为50pmol/μL。
紫外测定：取引物稀释液100μL加入1cm标准比色皿中(或相当的比色皿)，分别在260nm和280nm波长下测定吸光度。1A260等于1个OD值，1OD等于33μg，每个碱基的分子量约为330，根据摩尔数公式计算含量。或采用下列公式计算引物浓度：
摩尔数(μmol)＝1×OD值/(15.2×A数)+(7.4×C数)+(11.5×G数)+(8.3×T数)。
紫外测定结果应为OD260/OD280﹥1.80，OD260值应不低于1。电泳检测：取2-3μL引物加入1.5％琼脂糖凝胶板，电压80V-100V，或电流40mA-50mA，电泳15min。电泳结果3对引物分别应有明显的条带。
1.2 提取总RNA试剂
1.2.1 TRIZOL(溶液A)：为样本总RNA提取试剂，市售生化试剂，在无菌条件下按20mL定量分装。
1.2.2 氯仿/异戊醇(溶液B)市售生化试剂，定量分装。
1.2.3 异丙醇(溶液C)市售生化试剂，定量分装。
1.3 RNase Free dH2O(溶液D)每100mL H2O中加入DEPC(焦碳酸二乙酯)0.1mL，混匀，高压灭菌，定量分装。
1.4 双重RT-QPCR反应液(溶液E)的制备
主要成分：含有0.05M MgCl2、0.2M dNTPs及猪蓝耳病病毒美洲株特异性引物和探针(各0.5M)，高致病猪蓝耳病病毒特异性引物和探针(各0.5M)，猪瘟病毒特异性引物和探针(各0.5M)的Tris—EDTA缓冲液(0.01M pH8.0)。
试剂包装：1.5mL普通冻存管(配橙红色盖)。
1.5 混合酶液(溶液F)
包括RNA酶抑制剂(40U/μl)，AMV逆转录酶(200U/μl)，Taq酶(5U/μl)，均为市售生化制剂，在无菌条件下按10μL定量分装。
1.6 阳性对照制剂(溶液G)
使用猪蓝耳病病毒美洲株基因组RNA，高致病性猪蓝耳病病毒基因组RNA和猪瘟病毒RAN三者的基因序列分别克隆成相应的质粒，等浓度混合生成阳性制剂，使用Tris-EDTA缓冲液(0.01M pH8.0)稀释至5ng/μl后冷冻保存。将检验合格的阳性对照制剂按400μL定量分装。
1.7 阴性对照制剂(溶液H)
使用无猪蓝耳病病毒美洲株基因组RNA和猪瘟病毒RAN的其他病毒RNA为阴性模板，使用Tris-EDTA缓冲液(0.01M pH8.0)稀释后冷冻保存。
2.保存期检测
新组装的试剂盒A部分在4℃保存6个月，B部分在-20℃保存6个月后，检测阴、阳性样品，阳性样品全为阳性结果，阴性样品和空白对照全为阴性结果。
实施例3 特异性实验
1、试剂及材料
1.1 试剂采用实施例2的试剂盒。
1.2 受试材料
1.2.1 常见相关试样：猪健康体细胞培养物、猪圆环病毒、伪狂犬病病毒、猪流感病毒、猪细小病毒、猪轮状病毒、猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒。
1.2.2 阳性试样：猪蓝耳病病毒(美洲株)组织与细胞培养物、高致病性猪蓝耳病病毒组织与细胞培养物、猪瘟病毒组织与细胞培养物，以及前三者的混合物。
以上受试材料各十份。
2.试验方法
试剂准备：用无水乙醇(75mL，加入25mL RNAse Free dH2O，)配置成75％的乙醇，使用之前预冷。
2.1 总RNA提取
2.1.1 取100μL组织样品研磨上清液置1.5mL eppendorf管中，加500μL溶液A，混匀，室温剧烈震荡15s，室温静置5min。
2.1.2 加120μL溶液B，小心盖上帽盖，室温剧烈震荡15s，室温放置5min。
2.1.3 12，000rpm，4℃，离心15min，可见分为三层，上层水相含RNA。
2.1.4 转移水相至一新eppendorf管，加入等量溶液C(约500μL)，混匀，室温放置15min。
2.1.5 12，000rpm，4℃，离心10min，离心后在eppendorf管边和底部可见有胶样RNA沉淀。
2.1.6 洗RNA：弃上清，加1000μL 75％乙醇(使用前用溶液D加无水乙醇配置而成，-20℃预冷)漂洗沉淀，12000rpm，4℃，离心5min，弃上清。
2.1.7 室温充分干燥RNA沉淀。加15μL RNase Free dH2O，即可用于PCR扩增。可以-20℃保存备用。
2.2 三重RT-QPCR
反应总体积25μL。向扩增管中加入下列反应物：
表1 反应体系
空白对照：以RNase Free dH2O代替模板，同样条件下扩增。
高速离心10s后，将反应管放入扩增仪中，指令设定程序开始工作。反应程序：
表2 RT-PCR反应程序
2.3 结果分析和判定方法
2.3.1 试剂盒有效性判定：
(1)阳性对照：Ct值≤25，有明显指数增长.
(2)阴性对照：Ct值＞43或无Ct值，线形为直线或轻微斜线，无明显
指数增长期和平台期。
2.标本结果判定：
(1)阳性：标本检测结果Ct值≤35，有明显指数增长。
(2)可疑：标本检测结果Ct值在35～38范围。此时应对标本进行重复
检测，如重复实验结果Ct值仍在35～38范围，有明显指数增长。则判定
为阳性，否则为阴性。
(3)阴性：标本检测结果Ct值＞38或无Ct值。
2.3.2 检验结果的判定方法
表3 检验结果的判定方法
3.试验结果
将受试材料按照以上操作步骤和评判标准进行操作，检测结果如下：
表4 特异性检测结果
从以上检测结果来看，用制备的试剂检测包括猪健康细胞培养物，猪圆环病毒，伪狂犬病病毒，猪细小病毒等结果全为阴性；检测10份猪蓝耳病病毒(美洲株)组织与细胞培养物，结果FAM检测通道全为阳性。检测10份高致病性猪蓝耳病病毒组织与细胞培养物，结果HEX检测通道全为阳性。检测10份猪瘟病毒组织与细胞培养物，结果CY5检测通道全为阳性。检测10份猪蓝耳病病毒(美洲株)，高致病性猪蓝耳病病毒和猪瘟病毒的组织与细胞培养物的混合物，FAM，HEX和CY5双通道结果全为阳性。可见本发明试剂盒具备良好的特异性。
实施例4 敏感性检验
将猪蓝耳病病毒(美洲株)、高致病性猪蓝耳病病毒、猪瘟病毒培养增殖并测定病毒滴度，然后按Reed-Muench氏法计算TCID50，将病毒培养液进行10倍梯度稀释，抽提核酸后进行荧光RT-PCR检测，观察其最低的检测限。
随机抽取一件试剂盒，按以上实施例3的试验方法操作，检测10×递进稀释的猪蓝耳病病毒(美洲株)细胞毒，可检测到0.01TCID50的病毒量。
检测10×递进稀释的高致病性猪蓝耳病病毒细胞毒，可检测到0.01TCID50的病毒量。
检测10×递进稀释的猪瘟病毒细胞毒，可检测到0.01TCID50的病毒量。
检测10×递进稀释的猪蓝耳病病毒(美洲株)，高致病性猪蓝耳病病毒细胞毒和猪瘟病毒细胞毒混合物，可检测到0.01TCID50的病毒量。
通过以上试验可以看出，本发明检测试剂盒具有良好的检测灵敏度。
实施例5 临床样品检验
取多个疫区疑似样品各50份，分别采用传统的病毒分离免疫检测方法(检测试剂盒为：森贝伽/senbeijia，Anti-PRRSV试剂盒；Ceditest CSFV-Ag检测试剂盒)以及本发明的RT-QPCR检测方法进行检测。检测方法按照试剂盒的说明进行。结果如下：
表5 不同方法的样品检测结果
从以上检测结果来看，本发明检测试剂盒具有良好的检出率，比传统的检测方法快捷方便且准确。

Claims (9)

1.猪蓝耳病病毒、高致病性猪蓝耳病病毒和猪瘟病毒三重荧光定量检测试剂盒，其包括以下检测引物和探针：
A、猪瘟病毒的特异性引物
上游引物:TTCAATTTGGTTCAGGGCCTCC
下游引物:TACTCAGGACTTAGACCACCCAGG
猪瘟病毒的特异性探针
荧光探针:CY5-ATGCCCATAGTAGGACTAGCAAACGG-BHQ3；
B、蓝耳病病毒美洲株的特异性引物
上游引物:TGGTTTCTCTCTGGCTTTTAGGTC
下游引物:GTAGGTTCCATCTGGTGCGGT
蓝耳病病毒美洲株的特异性探针
荧光探针:FAM-TTGCTGGTCTCGTCACCCCCTAT-BHQ1；
C、高致病蓝耳病病毒的特异性引物
上游：TGTCCCCAAGCTGATGACAC
下游：ATGGTGCTAAGGGGAAAGCC
高致病蓝耳病病毒的特异性探针
探针：HEX-CGTAGAACTGTGACA-MGB。
2.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒还包括病毒总RNA萃取试剂、RT-QPCR混合酶液、RNase FreedH2O、阳性对照和阴性对照中的一种或多种。
3.根据权利要求1或2所述的检测试剂盒，其特征在于，所述引物和探针包含于RT-QPCR反应液中，该反应液还包括Mg2+和dNTPs。
4.根据权利要求3所述的检测试剂盒，其特征在于，所述RT-QPCR反应液中Mg2+浓度为0.05M，dNTPs的浓度为0.2M，各引物和探针的浓度分别为0.5M，缓冲液为0.01M pH8.0的Tris-EDTA缓冲液。
5.根据权利要求1或2所述的检测试剂盒，其特征在于，所述病毒总RNA萃取试剂包括TRIZOL试剂、氯仿/异戊醇和异丙醇。
6.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述RT-PCR扩增混合酶液包括RNA酶抑制剂、AMV逆转录酶和Taq酶。
7.根据权利要求1或2所述的检测试剂盒，其特征在于，所述阳性对照为包括猪蓝耳病病毒美洲株基因组RNA，高致病性猪蓝耳病病毒基因组RNA和猪瘟病毒RAN的混合液。
8.根据权利要求1或2所述的检测试剂盒，其特征在于，所述阴性对照为空白缓冲液。
9.权利要求1～8任一项所述的检测试剂盒在检测猪蓝耳病病毒、高致病性猪蓝耳病病毒和/或猪瘟病毒中的应用。
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Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105483294A (zh) * 2016-02-01 2016-04-13 北京佰鸥创投生物科技有限公司 Prrsv美洲型经典株数字pcr绝对定量检测试剂盒
CN105648114A (zh) * 2016-02-22 2016-06-08 深圳市易瑞生物技术有限公司 一种用于检测样品中新变异型高致病性猪蓝耳病病毒的荧光rt-pcr引物、探针和试剂盒及检测方法
CN106834539A (zh) * 2017-01-20 2017-06-13 北京市动物疫病预防控制中心 高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒与猪瘟病毒同时定量检测试剂盒
CN110885900A (zh) * 2018-09-10 2020-03-17 中国动物疫病预防控制中心（农业部屠宰技术中心） 用于鉴别猪蓝耳病毒经典株与NADC30-Like株的冻干微芯片、试剂盒及方法
CN114574632A (zh) * 2022-03-10 2022-06-03 山东省滨州畜牧兽医研究院 用于同时检测pev和ptv的直接扩增荧光rt-pcr引物探针组和试剂盒及方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102212623A (zh) * 2011-06-02 2011-10-12 广东省农业科学院兽医研究所 一种猪瘟病毒和猪蓝耳病病毒的双色荧光定量pcr联合检测方法及其试剂盒
CN102234693A (zh) * 2011-03-11 2011-11-09 重庆理工大学 用于检测猪瘟病毒、猪圆环病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒的基因芯片及检测方法
CN102586477A (zh) * 2012-02-15 2012-07-18 山东省动物疫病预防与控制中心 猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒和猪瘟病毒的rt-pcr检测及其专用引物
CN103740864A (zh) * 2014-01-21 2014-04-23 北京亿森宝生物科技有限公司 一种高致病性猪蓝耳病毒荧光定量qRT-PCR检测方法及检测试剂盒

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102234693A (zh) * 2011-03-11 2011-11-09 重庆理工大学 用于检测猪瘟病毒、猪圆环病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒的基因芯片及检测方法
CN102212623A (zh) * 2011-06-02 2011-10-12 广东省农业科学院兽医研究所 一种猪瘟病毒和猪蓝耳病病毒的双色荧光定量pcr联合检测方法及其试剂盒
CN102586477A (zh) * 2012-02-15 2012-07-18 山东省动物疫病预防与控制中心 猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒和猪瘟病毒的rt-pcr检测及其专用引物
CN103740864A (zh) * 2014-01-21 2014-04-23 北京亿森宝生物科技有限公司 一种高致病性猪蓝耳病毒荧光定量qRT-PCR检测方法及检测试剂盒

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
施开创等: "CSFV及美洲型、欧洲型PRRSV多重qRT-PCR鉴别检测方法的建立及应用", 《家畜生态学报》 *
莫胜兰等: "猪瘟病毒和不同型猪繁殖与呼吸综合征病毒的多重RT-PCR检测方法的建立", 《动物医学进展》 *

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105483294A (zh) * 2016-02-01 2016-04-13 北京佰鸥创投生物科技有限公司 Prrsv美洲型经典株数字pcr绝对定量检测试剂盒
CN105648114A (zh) * 2016-02-22 2016-06-08 深圳市易瑞生物技术有限公司 一种用于检测样品中新变异型高致病性猪蓝耳病病毒的荧光rt-pcr引物、探针和试剂盒及检测方法
CN105648114B (zh) * 2016-02-22 2020-04-10 深圳市易瑞生物技术股份有限公司 检测新变异型高致病性猪蓝耳病病毒的荧光rt-pcr引物、探针和试剂盒及检测方法
CN106834539A (zh) * 2017-01-20 2017-06-13 北京市动物疫病预防控制中心 高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒与猪瘟病毒同时定量检测试剂盒
CN110885900A (zh) * 2018-09-10 2020-03-17 中国动物疫病预防控制中心（农业部屠宰技术中心） 用于鉴别猪蓝耳病毒经典株与NADC30-Like株的冻干微芯片、试剂盒及方法
CN110885900B (zh) * 2018-09-10 2023-08-22 中国动物疫病预防控制中心（农业部屠宰技术中心） 用于鉴别猪蓝耳病毒经典株与NADC30-Like株的冻干微芯片、试剂盒及方法
CN114574632A (zh) * 2022-03-10 2022-06-03 山东省滨州畜牧兽医研究院 用于同时检测pev和ptv的直接扩增荧光rt-pcr引物探针组和试剂盒及方法

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