ES2627344T3

ES2627344T3 - Medio de cultivo, método para cultivar listeria y método para detectar listeria

Info

Publication number: ES2627344T3
Application number: ES12812126.6T
Authority: ES
Inventors: Gabriela Martinez; David Claveau; Lila MADURO
Original assignee: Foodchek Systems Inc
Current assignee: Foodchek Systems Inc
Priority date: 2011-07-13
Filing date: 2012-07-11
Publication date: 2017-07-27
Anticipated expiration: 2032-07-11
Also published as: CA2841820C; AU2012283715A1; CN103748211A; KR101602286B1; HUE034397T2; JP2018033462A; AU2012283715B2; HK1191374A1; BR112014000414B1; WO2013006960A1; EP2732024A4; KR20140146039A; CA2841820A1; EP2732024A1; GB2497059A; BR112014000414A2; GB2497059B8; DK2732024T3; JP6640810B2; EP2732024B1

Abstract

Un medio de cultivo que comprende: 5 g/l de fitona; 5 g/l de triptona; 5 g/l de extracto de ternera; 5 g/l de extracto de levadura; 22,2 g/l de tampón MOPS; 0,5 g/l de citrato de hierro (III); 8 g/l de cloruro de litio; 2 g/l de MgSO4; y 1 g/l de piruvato de sodio, y que comprende ácido nalidíxico, cicloheximida e hidrocloruro de acriflavina.

Description

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Tabla 2: Muestra la receta para medios base de acuerdo con una alternativa particular descrita.

Ingredientes: Cantidad (g/l)

Fitona: 5

Triptona: 5

Extracto de ternera: 5

Extracto de levadura: 5

Los expertos en la materia entenderán fácilmente que el crecimiento de un microorganismo deseado será el más promovido a temperaturas seleccionadas adecuadas para el microorganismo en cuestión. En alternativas 5 particulares descritas, el microorganismo deseado es Listeria spp y el cultivo se puede llevar a cabo aproximadamente a 29°C, 30°C, 31°C, 32°C, 33°C, 34°C, 35°C, 36°C, 37°C, 38°C, 39°C, 40°C, 41°C, 42°C, 43°C o más y el caldo a usar está o puede estar precalentada a esta temperatura preparatoria para la inoculación con una muestra para el ensayo. En alternativas particulares descritas, el cultivo se puede llevar a cabo aproximadamente a 35°C y el caldo a usar se puede precalentar a esta temperatura preparatoria para la inoculación con una muestra 10 para el ensayo. En alternativas descritas en el presente documento, el cultivo se puede llevar a cabo a cualquier temperatura entre 29°C y 43°C y se puede llevar a cabo aproximadamente a 29°C, 30°C, 31°C, 32°C, 33°C, 34°C, 35°C, 36°C, 37°C, 38°C o 39°C o 40°C o 41°C o 42°C o 43°C o entre 29°C y 30°C, 30°C y 31°C, 31°C y 32°C, 32°C y 33°C, 33°C y 34°C, 34°C y 35°C, 35°C y 36°C, 36°C y 37°C, 37°C y 38°C, 38°C y 39°C, 39°C y 40°C, 40°C y 41°C, 41°C y 42°C o 42°C y 43°C o a una temperatura de entre 34°C y 43°C o entre 35°C t 42°C o entre 36°C y 42°C, 15 38°C t 42°C o entre 39°C y 41°C o entre 39°C y 40°C o entre 38°C y 39°C o entre 39°C y 40°C o entre 40°C y 41°C

o entre 41°C y 42°C o entre 42°C y 43°C. En alternativas descritas, la temperatura está entre 32°C y 38°C, o entre 33°C. y 37°C. En la presente divulgación, "enriquecimiento" de un medio se refiere a la adición de componentes seleccionados para promover el crecimiento u otras características de uno o más microorganismos deseados. Una "solución de enriquecimiento" se refiere a una solución que comprende estos componentes adicionales. En

20 alternativas descritas, los componentes incluidos en una solución de enriquecimiento incluyen uno o más de MOPS, sal de Fe(III), sal de litio, piruvato, y en alternativas descritas, un suplemento de enriquecimiento selectivo comprende uno o más agentes selectivos tales como ácido nalidíxico, cicloheximida e hidrocloruro de acriflavina. En alternativas particulares descritas, el caldo de enriquecimiento contiene uno o más de sulfato de magnesio, cloruro de litio, citrato férrico, piruvato de sodio y suplemento de enriquecimiento.

25 Tabla 3: Muestra la composición general de un medio enriquecido descrito.

Ingredientes: Fabricantes Cantidad (g/l)

Sal de sodio-Mops: Sigma (M9381) X-Y

Ácido libre de Mops: Sigma (M1254) X-Y

Citrato férrico III: Sigma (F6129) X-Y

Cloruro de litio: Sigma (L4408) X-Y

MgSO4: BDH (BDH0246) X-Y

Piruvato de sodio: Sigma (15990) X-Y

Suplemento de enriquecimiento selectivo Composición de suplemento de enriquecimiento selectivo (componentes que también se denominan en el presente documento de manera colectiva o individual un "agente selectivo" o un "agente de selección" o un "agente que selecciona") Cicloheximida Ácido nalidíxico Hidrocloruro de acriflavina: Oxoid (SR0141E) Número CAS 66-81-9 3374-05-8 8048-52-0 2,7 ml Cantidad (g/l) en caldo enriquecido final A-B A-B A-B

Cada uno de X e Y pueden ser independientemente 0,0, 0,01, 0,02, 0,03, 0,04, 0,05, 0,06, 0,07, 0,08, 0,09, 0,1, 0,11, 0,12, 0,13, 0,14, 0,15, 0,16, 0,17, 0,18, 0,19. 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3,0, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4,0, 4,1, 4,2,

4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8, 7,9, 8,0, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9, 9,0, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7, 9,8, 9,9, 10,0, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30 gramos o cualquier valor entre los mismos y en variantes de alternativas particulares descritas, el intervalo X a Y se puede

5 delimitar por cualquiera de los valores de X e Y. Se entenderá que las cantidades relativas de sales de MOPS y de ácido sin MOPS se ajustarán como sea necesario para lograr el pH deseado.

Cada uno de A y B puede ser independientemente 0,0, 0,01, 0,02, 0,03, 0,04, 0,05, 0,06, 0,07, 0,08, 0,09, 0,1, 0,11, 0,12, 0,13, 0,14, 0,15, 0,16, 0,17, 0,18, 0,19. 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 10 1,8, 1,9, 2,0, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3,0, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4,0, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8, 7,9, 8,0, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9, 9,0, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7, 9,8, 9,9, 10,0, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10.000,

15 11.000, 12.000, 13.000, 14.000, 15.000, 16.000, 17.000, 18.000, 19.000, 20.000, 30.000, 40.000, 50.000, 60.000, 70.000, 80.000, 90.000 o 100.000 mg/litro.

Tabla 4: Muestra la composición de un medio de enriquecimiento particular descrito.

Ingredientes: Fabricantes Cantidad (g/l)

Sal de sodio-Mops: Sigma (M9381) 13,7

Ácido libre de Mops: Sigma (M1254) 8,5

Citrato férrico III: Sigma (F6129) 0,50

Cloruro de litio: Sigma (L4408) 8

MgSO4: BDH (BDH0246) 2

Piruvato de sodio: Sigma (15990) 1

Suplemento de enriquecimiento selectivo (también denominado en el presente documento un "agente selectivo") que comprende los siguientes componentes: Cicloheximida Ácido nalidíxico Hidrocloruro de acriflavina: Oxoid (SR0141E) 66-81-9 3374-05-8 8048-52-0 2,7 ml 33,75 mg 27 mg 10,125 mg

*Reconstituir un frasco como se indica, y añadir 2,7 ml del contenido a 1 l de medio. Sin embargo, se entenderá fácilmente por los expertos en la materia que estas cantidades pueden variar para adecuarse a requerimientos particulares y en alternativas descritas, el medio enriquecido final contiene aproximadamente 1x10-6, 2x10-6, 3x106, 4x10-6, 5x10-6, 6x10-6, 7x10-6, 8x10-6, 9x10-6, 1x10-5, 2x10-5, 3x10-5, 4x10-5, 5x10-5, 6x10-5, 7x10-5, 8x10-5, 9x10-5, 1x10-4, 2x10-4, 3x10-4, 4x10-4, 5x10-4, 6x10-4, 7x10-4, 8x10-4, 9x10-4, 1x10-3, 2x10-3, 3x10-3, 4x10-3, 5x10-3, 6x10-3, 7x10-3, 8x10-3, 9x10-3, 1x10-2, 2x10-2, 3x10-2, 4x10-2, 5x10-2, 6x10-2, 7x10-2, 8x10-2, 9x10-2, 1x10-1, 2x10-1, 3x10-1, 4x10-1, 5x10-1, 6x10-1, 7x10-1, 8x10-1, 9x10-1, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 1x102, 2x102, 3x142, 4x102, 5x102, 6x102, 7x102, 8x102, 9x102, 1x103, 2x103, 3x103, 4x103, 5x103, 6x103, 7x103, 8x103, 9x103, o más o menos g/litro o mg/litro de componentes individuales en el caldo.

20 En la presente divulgación, un "suplemento" para un medio de cultivo significa una solución, líquido, sólido u otro material para añadir a un medio de cultivo. Un suplemento tiene el efecto o el propósito de promover el crecimiento de uno o más microorganismos y en alternativas específicas descritas promueve de manera selectiva el crecimiento de uno o más microorganismos en relación con otros microorganismos no deseados. En alternativas particulares descritas, un suplemento comprende uno o más de: sal de magnesio, sal de litio, una sal de hierro (III), un piruvato y

25 un agente selectivo o comprende precursores o formas modificadas que se pueden convertir o metabolizar fácilmente para formar cualquiera de los anteriores. En alternativas descritas, un suplemento es un suplemento para promover el crecimiento de Listeria spp. En la presente divulgación, la expresión "agente selectivo" se refiere a un compuesto químico o condición del cultivo que sirve para favorecer el crecimiento de un microorganismo deseado o para inhibir el crecimiento de un microorganismo no deseado. En alternativas particulares descritas, los agentes

30 selectivos incluyen antibióticos, sulfanamidas o antisépticos. En alternativas particulares descritas, un agente selectivo es o comprende uno, dos o todos los tres de ácido nalidíxico, cicloheximida e hidrocloruro de acriflavina. o incluye equivalentes adecuados o alternativas a los mismos. La expresión "suplemento de enriquecimiento selectivo" es equivalente a la expresión "agente selectivo". En alternativas particulares descritas, la concentración de trabajo de cicloheximida es aproximadamente 33.75 mg por litro de medio de cultivo, y en alternativas descritas está entre

35 15 y 50 mg/litro de medio de cultivo o puede ser mayor de 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100 o más mg/litro de medio de cultivo. En alternativas particulares descritas, la concentración de trabajo

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una sal de litio y una sal de piruvato. En una serie adicional de alternativas descritas los componentes seleccionados comprenden una sal de piruvato y un tampón quelante no de magnesio o una sal de piruvato y una sal de magnesio,

o una sal de piruvato y una sal de litio o una sal de piruvato y una sal de óxido de hierro (III).

5 En una serie adicional de alternativas descritas, los componentes seleccionados comprenden una sal de óxido de hierro (III) y una sal de litio, y o una sal de óxido de hierro (III) y una sal de piruvato, o una sal de óxido de hierro (III) y un tampón quelante no de magnesio, o una sal de óxido de hierro (III) y una sal de magnesio.

En series adicionales de alternativas descritas, el medio comprende adicionalmente un agente selectivo. En

10 alternativas descritas, el agente selectivo comprende al menos uno de ácido nalidíxico, hidrocloruro de acriflavina y cicloheximida. En alternativas descritas, la sal de hierro (III) está presente en una concentración de más de aproximadamente 0,05 g/l; La sal de litio está presente en una concentración de más de aproximadamente 0,1 g/l; la sal de magnesio está presente en una concentración de más de aproximadamente 0,1 g/l; y la sal de piruvato está presente en una concentración de más de aproximadamente 0,1 g/l. En alternativas descritas, la sal de hierro (III)

15 está presente en una concentración de entre 0,05 g/l y 50g/l; dicha sal de litio está presente en una concentración de entre 0,1 g/l y 100 g/l; dicha sal de magnesio está presente en una concentración de entre 0,1 g/l y 100 g/l; dicha sal de piruvato está presente en una concentración de entre 0,1 g/l y 100 g/l.

La composición de un medio de acuerdo con la invención se muestra en la Tabla 5. 20 Tabla 5: La composición de un medio de cultivo de acuerdo con la invención.

Ingredientes: Fabricantes Cantidad (g/l)

Fitona: BD BBL (211906) 5

Triptona: Oxoid (LP0042) 5

Extracto de ternera: BD BBL (212303) 5

Extracto de levadura: BD Bacto (212750) 5

Sal de sodio-Mops: Sigma (M9381) 13,7

Ácido libre de Mops: Sigma (M1254) 8,5

Citrato férrico III: Sigma (F6129) 0,5

Cloruro de litio: Sigma (L4408) 8

MgSO4: BDH (BDH0246) 2

Piruvato de sodio: Sigma (15990) 1

Suplemento selectivo (uno o más componentes, los cuales también se denominan en el presente documento "agente selectivo"). El suplemento selectivo comprende cada uno de: Oxoid (SR0141 E) 2,7 ml

cicloheximida, ácido nalidíxico e hidrocloruro de acriflavina

*Reconstituir un frasco como se indica, y añadir 2,7 ml del contenido a 1 l de medio. Los 2,7 ml de suplemento selectivo comprenden 33,75 mg de cicloheximida, 27 mg de ácido nalidíxico y 10,125 mg de hidrocloruro de acriflavina. Esterilizar los medios con el suplemento añadido mediante tratamiento con autoclave a 110°C durante 15 minutos.

Métodos para cultivar de acuerdo con las alternativas descritas

25 En alternativas descritas se describe un método para cultivar una muestra biológica, el método comprende cultivar la muestra en la presencia de concentraciones biológicamente eficaces de: iones de magnesio no quelados; y un secuestrante de oxígeno. En alternativas develadas, el secuestrante de oxígeno se selecciona del grupo que consiste en una sal de piruvato, catalasa, una sal de tioglicolato, cisteína, oxyrase™, Na2S y FeS. En variantes de alternativas descritas se describe un método para cultivar una muestra biológica, comprendiendo el método: cultivar

30 la muestra en un medio que comprende una concentración biológicamente eficaz de iones de magnesio no quelados y una concentración biológicamente eficaz de al menos un componente seleccionado del grupo que consiste en: una sal de litio, una sal de hierro (III) y una sal de piruvato. En alternativas descritas, el cultivo tiene lugar en presencia de al menos dos, tres, cuatro, cinco o seis componentes seleccionados del grupo que consiste en un tampón quelante que sustancialmente no es de magnesio, una sal de magnesio, una sal de litio, una sal de hierro (III), una sal de

35 piruvato y un agente selectivo. En alternativas descritas, el método comprende cultivar las bacterias en un medio de

acuerdo con la divulgación.

En realizaciones, la detección además comprende una etapa de PCR, unión a lectina, difusión simple, difusión lateral, detección inmunológica, flujo lateral o flujo continuo. En alternativas descritas, el cultivo tiene lugar en

5 presencia de un agente selectivo. De acuerdo con la invención las bacterias son o incluyen Listeria spp y en alternativas descritas, la detección comprende preferentemente cultivar una especie bacteriana que, de acuerdo con la invención, es una Listeria spp. En variantes de alternativas descritas, el método comprende cultivar la muestra biológica usando medios de acuerdo con las alternativas descritas. En alternativas descritas, la muestra biológica comprende bacterias, en realizaciones, las bacterias son Listeria spp y en alternativas descritas, el método preferentemente comprende cultivar Listeria spp u otras cepas de bacterias.

Métodos para detectar bacterias de acuerdo con las alternativas descritas En alternativas descritas se describe un método para detectar bacterias en una muestra, el método comprende cultivar la muestra en la presencia de concentraciones biológicamente eficaces de: iones de magnesio no quelados;

15 y un secuestrante de oxígeno. En alternativas develadas, el secuestrante de oxígeno se selecciona del grupo que consiste en una sal de piruvato, catalasa, una sal de tioglicolato, cisteína, oxyrase™, Na2S y FeS.

En una serie adicional de alternativas descritas se describe un método para detectar bacterias en una muestra, comprendiendo el método la etapa de cultivar la muestra en la presencia de una combinación biológicamente eficaz de iones de magnesio no quelados y al menos un componente seleccionado del grupo que consiste en una sal de litio, una sal de hierro (III), una sal de piruvato y un agente selectivo. En alternativas descritas, el cultivo tiene lugar en presencia de al menos dos, tres, cuatro, cinco o seis componentes seleccionados del grupo que consiste en un tampón quelante sustancialmente no de magnesio, una sal de magnesio, una sal de litio, una sal de hierro (III), una sal de piruvato y un agente selectivo. En alternativas descritas, el método comprende cultivar las bacterias en un

25 medio de acuerdo con la realización. En alternativas descritas, la detección comprende adicionalmente una etapa de PCR, unión a lectina, difusión simple, difusión lateral, detección inmunológica, flujo lateral o flujo continuo. En alternativas descritas, el cultivo tiene lugar en presencia de un agente selectivo. En alternativas descritas, las bacterias son Listeria spp y en realizaciones, la detección comprende cultivar preferentemente una especie de bacteria que puede ser Listeria spp.

En alternativas descritas, tras cultivar los microorganismos en los medios de acuerdo con las alternativas descritas durante un período de tiempo adecuado en condiciones de cultivo adecuadas, la presencia del microorganismo de interés se detecta mediante uno cualquiera de un intervalo de métodos fácilmente evidentes para los expertos en la materia. Tales métodos incluyen, pero no se limitan a métodos de detección mediante PCR, detección con PCR en

35 tiempo real, unión a lectina, difusión simple, difusión lateral, detección inmunológica, flujo lateral o flujo continuo. Los métodos inmunológicos pueden incluir inmunoprecipitación, transferencias, inmunorradioensayo o inmunoprecipitación asociada con ligandos magnéticos, o puede usar cualquier otro método adecuado.

En alternativas descritas particulares, se calienta una alícuota del cultivo o se trata de otro modo para eliminar los microorganismos antes del ensayo. La muestra calentada se puede procesar entonces mediante la metodología deseada para identificar la presencia de antígenos o de secuencias diagnóstico de ácido nucleico del microorganismo de interés.

En alternativas descritas, el medio se puede usar en combinación con la tecnología patentada existente de

45 FoodChek™, denominada en lo sucesivo en el presente documento como MICT. Ampliamente, en un ejemplo del uso de la metodología MICT, una alícuota del cultivo enriquecido se calienta para eliminar el analito diana. La muestra calentada se carga en un casete de flujo lateral, que está compuesto de un lecho de muestra/conjugado que contiene partículas magnéticas de tamaño nanométrico conjugadas con un anticuerpo que se unirá al antígeno del patógeno. Los ensayos también contienen un segundo anticuerpo en una tira estrecha llamada zona de captura. El flujo capilar toma el líquido cargado a través del lecho de la muestra al lecho conjugado, en donde la bacteria diana se une a las partículas cubiertas con anticuerpo. Este complejo inmunitario fluye en la tira de ensayo hacia la zona de captura. El resultado es una acumulación de partículas magnéticas en la zona de captura. Si el patógeno diana está ausente, el complejo inmunitario no se forma, las partículas no se acumulan en la línea de captura y el resultado del test es negativo. Además, aguas abajo, una línea de control que se ha despojado de manera similar pero con un

55 reactivo diferente verifica que el ensayo se ha realizado de manera correcta y que los reactivos aún son activos. El casete se lee en un instrumento capaz de detectar bajas concentraciones de partículas magnéticas. El detector detecta pequeños cambios en un campo magnético a lo largo de la tira de ensayo a medida que pasa por debajo de un grupo de bobinas de detección. Las bobinas se enrollan en direcciones alternas, de manera que se genera un perfil de señal característico por la presencia de partículas magnéticas unidas al ensayo o a las líneas de control. El instrumento compara la señal de detección con un valor umbral positivo codificado en el código de barras pegado en cada casete individual y entonces comunica un resultado positivo o negativo. Los resultados se presentan en la pantalla de cristal líquido del instrumento y se imprimen o se transfieren a un ordenador relacionado. Además de todos los parámetros de análisis, el código de barras también codifica el nombre de ensayo, el número del lote y la fecha de expiración, que se imprimen junto con el resultado del ensayo. La aplicación detallada y el uso de tal

65 metodología de detección será fácilmente entendida por los expertos en la materia. Las realizaciones de la tecnología MICT para ensayar o determinar la presencia o ausencia de un microorganismo se exponen en uno o

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Tabla 6: Muestra la composición de medio de cultivo de Listeria de acuerdo con un ejemplo

Ingredientes: Fabricantes Cantidad (g/l)

Fitona: BD BBL (211906) 5

Triptona: Oxoid (LP0042) 5

Extracto de ternera: BD BBL (212303) 5

Extracto de levadura: BD Bacto 5

(212750)

Sal de sodio-Mops: Sigma (M9381) 13,7

Ácido libre de Mops: Sigma (M1254) 8,5

Citrato férrico III: Sigma (F6129) 0,5

Cloruro de litio: Sigma (L4408) 8

MgSO4: BDH (BDH0246) 2

Piruvato de sodio: Sigma (15990) 1

Suplemento de enriquecimiento selectivo* que comprende:: Oxoid (SR0141E) 2,7 ml

Cicloheximida: 66-81-9 33,75 mg

Ácido nalidíxico: 3374-05-8 27 mg

Hidrocloruro de acriflavina: 8048-52-0 10,125 mg

*Reconstituir un frasco como se indica, y añadir 2,7 ml del contenido a 1 l de medio de Listeria. Esterilizar el caldo base de enriquecimiento con el suplemento mediante tratamiento con autoclave a 110 °C durante 15 minutos.

En una serie adicional de ejemplos se describe un medio, su preparación y su uso. Reactivos: Medio enriquecido con Actero Listeria. -Medio optimizado de manera específica para el crecimiento y la recuperación de Listeria spp. 5 en un enriquecimiento de una única etapa. De acuerdo con el ejemplo, el medio se proporciona en dos formatos: una botella de 500 g y un pack de 20 sobres individuales de 4,9 g de polvo cada uno.

Suministros y reactivos adicionales: Agua estéril, destilada/desionizada. Cualquier fuente.; El caldo neutralizante Dey-Engley (D/E) (Lab M Limited, Lancashire, Reino Unido) se usa para el ensayo de desinfectantes y eficacia 10 sanitaria; Agar Oxford modificados (MOX; Difco Becton Dickinson, Nueva Jersey, EE.UU.); El agar Rapid'L.mono (RLM; Bio-Rad, Missisauga, Ontario, Canadá) es un medio cromogénico para la detección, enumeración y diferenciación de Listeria spp., específicamente, L. monocytogenes de muestras de alimento y ambientales; Sistema de panel de ensayos bioquímicos API® (Biomereieux, Marcy-L’etoile, Francia); Esponjas de muestreo de celulosa estéril no bactericida de 8x4x0,3 cm humedecidas previamente con D/E; Bolsas stomacher estériles con filtro; Tubos 15 de polipropileno con tapa. Disponibles de múltiples fuentes; Pipetas de transferencia desechables. Cualquier fuente; Agujas de inoculación de plástico y 10 μl de bucles calibrados. Cualquier fuente. Aparatos: Homogeneizador Stomacher Seward 400 (Seward, Londres, Inglaterra). -Para la mezcla concienzuda de esponjas de muestra ambiental en caldo de enriquecimiento; Micropipeta y puntas estériles desechables; Incubador estacionario Symphony™ (VWR, EE.UU.) o equivalente. -Para proporcionar 29 °C±0,5 °C; Incubador estacionario, modelo 1555

20 (VWR, EE.UU.) o equivalente. - Para proporcionar 35 °C±2 °C.

Preparación general de los medios: Para preparar el Actero Listeria, suspender 53,8 g del polvo en un litro de agua destilada. Calentar la mezcla a 100°C y agitar constantemente hasta la disolución completa del polvo (aprox. 35 min). Dispensar en recipientes finales y esterilizar mediante tratamiento con autoclave a 110°C durante 15 min.

25 No es necesario tratar con autoclave el medio si se usa inmediatamente tras la preparación. El uso de agua estéril es recomendable en este caso.

Preparación de la muestra: Para preparar esponjas de muestra ambiental, hacer un frotis de una superficie ambiental de 100 cm2 usando esponjas de muestreo de celulosa no bactericidas humedecidas previamente con

30 caldo D/E neutralizante aproximadamente 5 veces en vertical y 5 veces en horizontal (de arriba a abajo o de lado a lado se considera una vez). Colocar cada esponja en una bolsa de muestra estéril y mantener a 4°C±2°C hasta el ensayo.

Análisis: Añadir 90 ml de Actero Listeria precalentado a 29°C±0,5 °C a cada esponja de muestra en una única

35 bolsa, mantener 30 segundos y enriquecer a 29 C±0,5 °C durante 24 horas. Mezclar a mano es una alternativa aceptable para el mantenimiento. Para mezclar a mano, masajear cada esponja durante aproximadamente un

minuto. Al final del periodo de enriquecimiento, cultivar en estrías las muestras directamente en placas de agar MOX y/o RLM. Confirmar las presuntas colonias de Listeria spp. tal como se recomienda en MLG 8.07 (12) o enviarlas al laboratorio independiente para su confirmación.

5 Interpretación y comunicación del resultado: Si no se han encontrado colonias sospechosas con la morfología típica de Listeria spp. en placas de agar MOX y/o RPM tras 48±2 h de incubación total, la muestra se considera negativa para Listeria spp. Si se han encontrado colonias sospechosas con la morfología típica de Listeria spp. en placas de agar MOX y/o RPM tras 48±2 h de incubación total, la muestra debería considerarse como potencialmente positiva. Las colonias sospechosas se deben confirmar de acuerdo con el Capítulo 8.07 de USDA FSIS Microbiology

10 Laboratory Guidebook.

Otros suplementos, reactivos y aparatos usados en el presente estudio: Placas de agar sangre de caballo con sobrecapa (agar HBO o HL; Quélab Inc., Quebec, Canadá); Caldo Lactobacillus M.R.S. (MRS; Quélab Inc., Quebec, Canadá); Caldo modificado de la Universidad de Vermont (UVM; Quélab Inc, Quebec, Canadá) -se usa para el 15 aislamiento y el enriquecimiento selectivo de L. monocytogenes; Caldo de enriquecimiento de Listeria tamponado con ácido morfolinopropanosulfónico (MOPS-BLEB; Oxoid LTD, Ontario, Canadá); Agar tripticasa de soja (TSA; Quélab Inc., Quebec Canadá) con extracto de levadura al 0,6 % (TSA-YE; Extracto de levadura Bacto™; BD Diagnostics, Nueva Jersey, EE.UU.); Placas de agar tripticasa de soja con sangre de oveja al 5 % (agar sangre; BBL™Stacker™, proporcionado por BD Diagnostics, Nueva Jersey, EE.UU.); Caldo de tripticasa de soja (TSB;

20 Quélab Inc., Quebec, Canadá) con extracto de levadura al 0,6 % (TSB-YE; Extracto de levadura Bacto™, BD Diagnostics, Nueva Jersey, EE.UU.); Stomacher Seward Circulator 3500 (Seward, Londres, Inglaterra). -Para la mezcla concienzuda de esponjas de muestra ambiental en caldo de enriquecimiento; Mezclador de vórtice (VWR, EE.UU.).

25 Estudios de validación interna: Los siguientes estudios de validación interna se realizaron en los laboratorios de Maxivet Inc., una compañía subsidiaria de FoodChek Systems Inc. Estudio de robustez: El estudio de robustez se llevó a cabo para evaluar los efectos de perturbaciones en dos parámetros del método (la temperatura y el tiempo de incubación), que pueden afectar a la realización del Actero Listeria. Las variables de robustez y sus respectivos intervalos se muestran en la Tabla 1.

30 Metodología: Cada condición de intervalo de ensayo se evaluó usando cultivos puros. Una cepa diana, L. monocytogenes HPB 5949, y una cepa no diana, E. faecalis ATCC 19433, se ensayaron.

L. monocytogenes HPB 5949 se ensayó en placas de agar sangre y se incubó durante toda la noche a 35°C± 1°C. Unas pocas colonias de la cepa diana se transfirieron a 9 ml de TSB-YE durante 6-7 h a 35°C. El cultivo se diluyó a

1:10 en TSB-YE fresco y se incubó durante toda la noche a la misma temperatura. Después se diluyó el cultivo para 35 obtener un nivel de inoculación fraccional (< 1 UFC por muestra) en el caldo ALEM.

Para la cepa no diana se usó la misma metodología de cultivo excepto en que el nivel de inoculación fue aproximadamente 10 veces más concentrado que el del organismo diana. Diez (10) réplicas de la bacteria diana y 5 réplicas de la bacteria no diana se ensayaron para cada parámetro.

40 Al final del periodo de enriquecimiento, las muestras se cultivaron en estrías en placas de agar MOX y RLM para confirmar el crecimiento de Listeria.

Resultados: De acuerdo con el análisis de PDD, no se observaron diferencias significativas entre cada uno de los parámetros analizados, ya que los intervalos de confianza entre los valores de dPDD de condiciones extremas

45 contienen un cero (Tabla 7). Por lo tanto, la capacidad del medio Actero para recuperar L. monocytogenes HPB 5949 no se vio afectada a lo largo de los intervalos de temperatura y de tiempo ensayados. La presencia de la cepa no diana de E. faecalis ATCC 19433 en las muestras de ALEM no se detectó en ningún caso (datos no mostrados).

50

Tabla 7: Resultados de robustez del método con ALEM

Inclusividad: Para ensayar la capacidad de Actero Listeria para enriquecer una variedad de Listeria spp., se analizaron 54 cepas (Tabla 8) que representan 6 especies del género Listeria con un énfasis en el patógeno humano

Parámetro patrón: Condición N" Condición A Condición B dPDD (AB)a IC 95 %f

A: B xb PDD (A)c IC 95 % X PDD (B)d IC 95 %

Temperatura de incubación (29 °C) 22 h 28 h 10 4 0,4 (0,168, 0,687) 6 0,6 (0,313, 0,814) -0,2 (-0,528, 0,206) Tiempo de incubación (24 h) 28°C 30°C 10 3 0,3 (0,108, 0,603) 4 0,4 (0,168, 0,687) -0,1 (-0,446, 0,282)

aN - número de porciones de ensayo;bx - número de porciones de ensayo positivas; cPDD(A) - resultados positivos para la condición A divididos entre el número total de ensayos;dPDD(B) - resultados positivos para la condición B divididos entre el número total de ensayos; edPDD(AB) - diferencia entre los valores PDD de la condición A y de la condición B; fIC 95 % -intervalo de confianza del 95 % (si el IC del 95 % de un valor dPDD no contiene cero, entonces la diferencia es estadísticamente significativa al nivel del 5 %).

5 L. monocytogenes (33 aislados pertenecientes a los 8 serotipos más prevalentes).

Metodología: Todas las cepas de Listeria se cultivaron en estría en placas de agar sangre y se incubaron durante toda la noche a 35°C. Unas pocas colonias se transfirieron a 10 ml de TSB-YE durante 6-7 horas a 35°C. Cada cultivo se diluyó a 1:10 en TSB-YE fresco y se incubó durante toda la noche a la misma temperatura. El cultivo

10 después se diluyó para inocular aproximadamente 5-20 UFC de cada cepa en 10 ml del caldo ALEM. Cada cepa se incubó por triplicado a 29°C durante 24 h. Al final del periodo de enriquecimiento, las muestras se cultivaron en estrías en placas de agar MOX y RLM para confirmar el crecimiento de Listeria. Resultados: Los resultados del estudio de inclusividad se resumen en la tabla 7. Todas las 54 cepas de Listeria ensayadas fueron capaces de crecer en 24 h a 29°C usando ALEM.

15 Tabla 8: Listado de aislados de Listeria - Resultados del estudio de inclusividad

n.º: Género y especie Número de cepa Serotipo Fuentea Origen Resultado

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17: Listeria grayi Listeria grayi Listeria grayi Listeria grayi Listeria innocua Listeria innocua Listeria innocua Listeria innocua Listeria innocua Listeria ivanovii Listeria ivanovii Listeria ivanovii Listeria monocytogenes Listeria monocytogenes Listeria monocytogenes Listeria monocytogenes Listeria monocytogenes HPB 1114 B-33023 (ATCC19120) B-33018 (ATCC25401) ATCC 700545 HPB 118 HPB 34 B-33314 (OB10387) MAX-L-3 512 MAX-L-6 ATCC 191 19 ATCC BAA-139 ATCC 43256 MAX-PT-O-2 513 514 515 ---------1/2b 1/2a 4b 4b 4b Health Canada ARS ARS ATCC Health Canada Health Canada ARS IRDA CRDA IRDA ATCC ATCC ATCC IRDA CRDA CRDA CRDA Sin datos disponibles Heces de chinchilla Maíz plantado Sin datos disponibles Alimentos Sin datos disponibles Palitos de jamón/queso/pavo Aislado de campo Sin datos disponibles Aislado de campo Oveja Agua de lavar Queso estilo mexicano Estiércol (suelo) Sin datos disponibles Sin datos disponibles Sin datos disponibles + + + + + + + + + + + + + + + + +

n.º: Género y especie Número de cepa Serotipo Fuentea Origen Resultado

18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43: Listeria monocytogenes Listeria monocytogenes Listeria monocytogenes Listeria monocytogenes Listeria monocytogenes Listeria monocytogenes Listeria monocytogenes Listeria monocytogenes Listeria monocytogenes Listeria monocytogenes Listeria monocytogenes Listeria monocytogenes Listeria monocytogenes Listeria monocytogenes Listeria monocytogenes Listeria monocytogenes Listeria monocytogenes Listeria monocytogenes Listeria monocytogenes Listeria monocytogenes Listeria monocytogenes Listeria monocytogenes Listeria monocytogenes Listeria monocytogenes Listeria monocytogenes Listeria monocytogenes 516 517 HPB 5255 HPB 5916 HPB 5904 HPB 5254 HPB 5089 HPB 5949 HPB 5668 HPB 4141 HPB 3 HPB 5246 SHT-2010-00482 STF-2010-02440 SHT-2010-00483 SHT-2010-00159 STF-2010-03562 STF-2010-03540 SHT-2009-01007 SHY-2010-03610 SHY-2010-00373 SHT-2010-00055 STF-2010-00989 SHT-2010-00122 SHT-2010-00150 STF-2011-00729 1/2a 4b 1/2a 1/2b 1/2a 1/2b 1/2c 1/2c 3a 3b 4b 4c 1/2a 4b 1/2a 1/2a 1/2a 1/2b 1/2a 1/2a 1/2a 1/2a 1/2a 1/2a 1/2a 1/2a CRDA CRDA Health Canada Health Canada Health Canada Health Canada Health Canada Health Canada Health Canada Health Canada Health Canada Health Canada LEPAQ LEPAQ LEPAQ LEPAQ LEPAQ LEPAQ LEPAQ LEPAQ LEPAQ LEPAQ LEPAQ LEPAQ LEPAQ LEPAQ Sin datos disponibles Sin datos disponibles Pozo de estiércol Alimento - lechuga Alimento - lechuga Ternera - Estiércol fresco Alimento - Carne Alimento - Carne lista para el consumo Alimentos Alimento - Pavo crudo Alimento - leche Ternera - Pozo de estiércol Cabra Cabeza de oveja Cabra Cabra Leche Leche Cabra Tejido reciente: hígado y riñón Leche Cabra Leche Cabra Cabra Leche + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +

n.º: Género y especie Número de cepa Serotipo Fuentea Origen Resultado

44 Listeria monocytogenes SHT-2011-00011 1/2a MAPAQ-FMV Oveja viva + 45 Listeria monocytogenes STF-2010-06277-1 1/2a LEPAQ Cabra muerta + 46 Listeria seeligeri MAX-L-4 -IRDA Aislado de campo + 47 Listeria seeligeri MAX-PT-LAI-3 -IRDA Aislado de campo + 48 Listeria seeligeri HPB 3522 -Health Canada Ambiental - Agua de campo + 49 Listeria seeligeri HPB 272 -Health Canada Animal - leche cruda + 50 Listeria seeligeri ATCC 35967 -ATCC Suelo +/51 Listeria welshimeri HPB 5864 -Health Canada Alimento - bebedero de pollos + 52 Listeria welshimeri HPB 1137 -Health Canada Alimento - bebedero de pollos + 53 Listeria welshimeri B-33020 (ATCC35897) -ARS Vegetación en descomposición + 54 Listeria welshimeri B-33328 (OB20088) -ARS Cerdo a la barbacoa con salsa +

"ATCC: American Type Culture Collection, Manassas (VA), Estados Unidos. IRDA: Research and Development Institute for the Agri-Environment, Quebec (QC), Canadá. CRDA: Food Research and Development Center, St-Hyacinthe (QC), Canadá. LEPAQ: Laboratory of Expertise in Animal Pathology of Quebec, Quebec (QC), Canadá. ARS: Agricultural Research Service, Washington (DC), Estados Unidos. MAPAQ: Ministry of Agriculture, Fisheries and Food of Quebec, Quebec (QC), Canadá. FMV: Laboratory of Bacteriology, Diagnostic Service, Faculty of Veterinary Medicine, St-Hyacinthe (QC), Canadá. + Presencia de colonias típicas de Listeria spp. +/- Presencia de colonias típicas de Listeria spp. en MOX y/o RLM observadas solo cuando el inóculo era mayor de 50 UFC/10 ml del medio.

Exclusividad: Treinta (30) cepas que no eran de Listeria, enumeradas en la Tabla 9, se analizaron para determinar la capacidad del Actero Listeria para discriminar microorganismos diana de microorganismos no diana. Las cepas, pertenecientes a 19 géneros diferentes de bacterias y levaduras, se eligieron debido a que son parientes cercanos a

5 Listeria spp. o debido a que se encuentran en el mismo ambiente. Metodología: Cada cepa que no es de Listeria se cultivó en estría en placas de agar sangre y se incubó durante toda la noche a 35°C y después se cultivaron en sus condiciones óptimas tal como se indica en a Tabla 9. Cada suspensión se diluyó para inocular 10 ml del ALEM con una concentración 10 veces mayor de la que se usó para los microorganismos diana. Esta etapa se realizó por triplicado. El cultivo creció a 29°C durante 24 h. Al final del período

10 de enriquecimiento, las muestras se cultivaron en estría en placas de agar MOX y RLM para verificar su capacidad para crecer en el ALEM. Resultados: Los resultados obtenidos del estudio de exclusividad se resumen en la Tabla 9. Ninguna de las cepas ensayadas dio un resultado positivo tras el enriquecimiento en ALEM en las condiciones ensayadas.

15 Tabla 9: Listado de aislados de no Listeria - Resultados del estudio de exclusividad

n.º: Microorganismo Número de cepa Fuentea Origen Resultado

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10: Alcaligenes faecalis Bacillus cereus Bacillus subtilis Campylobacter jejuni€ Candida albicans Carnobacterium divergens Carnobacterium mobile Enterobacter aerogenes Enterobacter cloacae Enterococcus faecalis ATCC 8750 ATCC 14579 MAX-B-1 -ATCC 24433 ATCC 35677 ATCC 49516 ATCC 13048 ATCC 23355 ATCC 19433 FMV FMV Maxivet Inc. Sin datos disponibles FMV ARS ARS FMV FMV FMV Sin datos disponibles Sin datos disponibles Estiércol Aislado de campo Infección de las uñas Ternera molida envasada al vacío Carne de pollo irradiada Esputo Sin datos disponibles Sin datos disponibles Sin crecimiento Sin crecimiento Sin crecimiento Sin crecimiento Sin crecimiento Sin crecimiento Sin crecimiento Sin crecimiento Sin crecimiento Sin crecimiento

n.º: Microorganismo Número de cepa Fuentea Origen Resultado

11 Enterococcus faecium ATCC 8459 ARS Productos diarios (queso) Sin crecimiento 12 Escherichia coli ATCC 25922 FMV Aislado clínico Sin crecimiento 13 Hafnia alvei ATCC 13337 FMV tipo 32011 de Stuart Sin crecimiento 14 Kocuria rhizophila ATCC 9341 FMV Suelo Sin crecimiento 15 Lactobacillus acidophilus* ATCC 314 FMV Sin datos disponibles Sin crecimiento 16 Lactobacillus casei* ATCC 393 ARS Productos diarios (queso) Sin crecimiento 17 Lactobacillus plantarum* ATCC 14917 ARS Repollo en vinagre Sin crecimiento 18 Lactococcus lactis*€ ATCC 7963 ARS Sin datos disponibles Sin crecimiento 19 Leuconostoc mesenteroides ATCC 8086 ARS Habichuelas de fermentación Sin crecimiento 20 Proteus mirabilis ATCC 29906 Sin datos disponibles Sin datos disponibles Sin crecimiento 21 Pseudomonas aeroginosa MSR-0132 FMV Suelo Sin crecimiento 22 Pseudomonas fluorescens -FMV Sin datos disponibles Sin crecimiento 23 Pseudomonas putida -Maxivet Inc. Sin datos disponibles Sin crecimiento 24 Rhodococcus equi* ATCC 6939 FMV Absceso pulmonar de potro Sin crecimiento 25 Salmonella typhimurium ATCC 14028 Sin datos disponibles Tejido, animal Sin crecimiento 26 Staphylococcus aureus ATCC 25923 FMV Aislado clínico Sin crecimiento 27 Staphylococcus epidermidis -MAPAQ Sin datos disponibles Sin crecimiento 28 Staphylococcus saprophyticus -FMV Mastitis Sin crecimiento 29 Staphylococcus xylosus -FMV Mastitis Sin crecimiento 30 Streptococcus agalactiae ATCC 13812 FMV Sin datos disponibles Sin crecimiento

aARS: Agricultural Research Service, Washington (DC), Estados Unidos. FMV: Laboratory of Bacteriology, Diagnostic Service, Faculty of Veterinary Medicine, St-Hyacinthe (QC), Canadá. MAPAQ: Ministry of Agriculture, Fisheries and Food of Quebec, Quebec (QC), Canadá. *48 h de incubación en caldo MRS. **48 h de incubación en caldo TSB. €CO2 al 5 %

Ensayo lote a lote: El objetivo de este estudio es asegurar que la fabricación es consistente entre los lotes del medio.

Metodología: Se usaron tres lotes independientes para confirmar la reproducibilidad de la fabricación del ALEM.

5 Cada lote se evaluó usando una cepa diana, L. monocytogenes HPB 5949, y una cepa no diana, E. faecalis ATCC 19433. La cepa diana se cultivó en estrías en placas de agar sangre y se incubó durante toda la noche a 35 °C. Unas pocas colonias se transfirieron a 9 ml de TSB-YE durante 6-7 horas a 35°C. El cultivo bacteriano se diluyó a

1:10 en TSB-YE fresco y se incubó durante toda la noche a la misma temperatura. El cultivo se diluyó después para obtener un inóculo fraccional (aproximadamente 0,5 UFC por muestra) en 10 ml del caldo ALEM.

10 Para la cepa no diana, se usó la misma metodología de cultivo excepto en que el nivel de inoculación fue aproximadamente 5 CFU (10 veces más concentrado que el del organismo diana). Diez (10) réplicas de la bacteria diana y 5 réplicas de la bacteria no diana se ensayaron. Los cultivos crecieron a 29°C durante 24 h. Al final del período de enriquecimiento, las muestras se cultivaron en estría en placas de agar MOX y RLM para la confirmación.

15 Resultados: Se llevó a cabo una realización del ensayo con éxito con tres lotes diferentes del Actero Listeria. La estabilidad del proceso de fabricación se probó mediante el análisis de PDD con un intervalo de confianza del 95 % (véase la Tabla 10).

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Claims

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