CN100393883C - 含高浓度甘油的pcr和rt－pcr全预混试剂 - Google Patents

含高浓度甘油的pcr和rt－pcr全预混试剂 Download PDF

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Abstract

本发明提供用于PCR和RT-PCR全预混试剂组合物，包括研究用全预混PCR和一管法RT-PCR试剂，以及临床核酸检测用全预混PCR和一管法RT-PCR试剂。特别地，全预混试剂含30-65%(v/v)的甘油，优选40-55%(v/v)。研究和临床核酸检测用两类全预混试剂包括完成反应所需要DNA聚合酶和反转录酶，但研究用全预混试剂不包括引物而临床核酸检测用全预混试剂还包括引物。全预混试剂设计成10/9倍浓至10倍浓，试剂与样品的加量之比相应为9∶1至1∶9。本发明设计的全预混试剂最小PCR反应体积仅为2微升，在一20℃或更低的温度下保存，有效期一年以上，且能提高扩增的专一性。适用于分子生物学实验室和临床实验室快速配制PCR反应液，实现快速检测的目的。

Description

含高浓度甘油的PCR和RT-PCR全预混试剂
技术领域
本发明涉及分子生物学技术，特别是涉及用于聚合酶链式反应的试剂。
技术背景
聚合酶链反应(PCR)是一种简单、专一、快速、灵敏地扩增特定DNA的方法，其反应液由十几种试剂组成(见表1的试剂栏)。反转录PCR(RT-PCR)是则是在PCR基础上发展起来的以RNA为原始模板的扩增方法，除了PCR所需的各种试剂外又增加了反转录酶、反转录用引物和RNase抑制剂等。在PCR技术建立之初，各种PCR试剂盒均将每一种试剂分别制备成几至几十倍浓度的储液，使用时按需要进行配制。这种试剂盒可随意改变反应液组成成份的配比，适合用于探索PCR反应液的最佳配比。但是其缺点也很明显：第一，加液操作多达十次以上费时又麻烦。第二，多次使用移液管增加了污染的机会。第三，每一次加样操作都可能有误差从而影响了扩增的重复性、稳定性和定量准确性，使管与管之间的误差较大。第四，有些试剂如DNA聚合酶、反转录酶等往往制备成50或100倍浓的储液，各种试剂分开操作使单管测定时缩小反应液的总体积受到限制。为了克服这些缺点将部分试剂预混的各种PCR试剂盒应运而生(表1)，被预混的试剂成份越来越多，但大多数预混试剂不包括DNA聚合酶和反转录酶。
表1.各种PCR试剂盒试剂预混方式
近年来Roche(PCR Master)和Promega(PCR Master Mix)等公司分别推出了包括DNA聚合酶的全预混液体试剂，但这种试剂只能在4℃左右储存保存期仅3个月，而通常DNA聚合酶能在-20℃或更低温度下保存有效期一年以上。为了能达到长期保存国外(P.A.Klaster等Jornal Clinical Microbiology，1998，36(6)：1978)和国内研究者(中国专利申请号00112540)将含DNA聚合酶的全预混溶液制备成冷冻干燥制剂。这种方法虽然延长了保存期，但却增加了冷冻干燥制备步骤，并造成酶在冷干过程中的损失。冷冻干燥制剂很难制备成单管用制剂，分装不方便，一旦解冻就不能久存。在反转录PCR方面Clontech公司推出了一种含反转录酶的预混试剂(BD SprintPowerScript Single Shots)，但也是冷冻干燥制剂，而且与PCR试剂完全分开。Promega公司推出一种将PCR试剂包括DNA聚合酶与反转录试剂共同预混的试剂(AccessQuick RT PCR System)，但也只能保存于4℃，而且将AMV反转录酶单独制备成50倍储液分开供应。
发明内容
所要解决的技术问题
本发明所要解决的技术问题是提供用于PCR和RT-PCR的全预混试剂组合物，包括研究用全预混PCR和一管法RT-PCR试剂，以及临床核酸检测用全预混PCR和一管法RT-PCR试剂，以克服现有预混试剂预混成分不全、不能在-20℃或更低的温度下保存而有效期达到一年以上、以及最终反应体积不能达到2微升的缺陷。
发明构思
含高浓度甘油全预混PCR试剂和RT-PCR试剂的开发基于下述事实和试验：
1.分子生物学研究用酶制剂包括各种DNA指导的DNA聚合酶，如Taq和PfuDNA聚合酶，以及各种RNA指导的DNA聚合酶，如AMV和M-MuLV反转录酶，均保存于含50％甘油的溶液中。本发明在全预混试剂中添加高浓度甘油，对酶有同样的保护和稳定作用而无副作用。
2.高浓度甘油与PCR或RT-PCR反应的其他试剂包括dNTPs、镁离子、钠离子、钾离子、寡聚核苷酸等在-20℃低温下不发生任何物理化学反应，或其他影响PCR和RT-PCR的物理化学反应。
3.甘油对PCR和RT-PCR反应有促进作用。其一，甘油显著降低DNA和RNA二级结构，对PCR和反转录有利。其二，甘油显著增强TaqDNA聚合酶等和AMV反转录酶等对高温的耐受。虽然甘油对TaqDNA聚合酶等和AMV反转录酶的活力有一定程度的抑制作用，但抑制作用比较微弱。按目前RT-PCR的常规操作反转录酶和DNA聚合酶的量远远超过实际需要，所以微弱的抑制作用实际上对反转录和扩增没有影响。试验表明在PCR反应体系中添加5-40％(v/v)甘油，在RT-PCR反应体系中添加5-25％(v/v)甘油并调整反应条件能提高扩增的专一性和其他特性而无负面影响。
本发明的全预混试剂有二大类。第一类为研究用全预混PCR试剂和全预混RT-PCR试剂，包括了引物以外完成PCR和一管法RT-PCR所需的全部试剂。全预混试剂能在-20℃或更低的温度下保存有效期一年以上。第二类为临床核酸检测用PCR和一管法RT-PCR试剂盒，含包括引物在内的完成PCR和一管法RT-PCR所需的全部试剂。两类全预混试剂都含有高浓度甘油，能在-20℃或更低的温度下保存有效期一年以上。临床核酸检测用全预混试剂制备成不同倍数，配制反应液时只需将试剂和样品以一定的比例混合即可，非常方便准确。研究用全预混试剂也制备成不同倍数，配制反应液时只需将试剂、样品和引物以一定的比例混合即可，同样非常方便准确。
技术方案
本发明的一种用于聚合酶链式反应的全预混试剂组合物，其组分包括：dNTPs、DNA聚合酶、甘油和水，其中甘油含量为30-65％(v/v)，且使用时所述组合物与待测样品溶液混合的体积比为9∶1至1∶9；优选方案为甘油含量4055％(v/v)，且使用时所述组合物与样品溶液混合的体积比为3∶1至1∶3。
本发明的全预混试剂组合物所配制的PCR反应液的最终反应液体积为2-100微升，优选为2-10微升。
本发明的另一方案为，上述的全预混试剂组合物中，除所述的dNTPs、DNA聚合酶、甘油和水之外，还含有PCR引物。
本发明的另一方案为，上述的全预混试剂组合物中，除所述的dNTPs、DNA聚合酶、甘油和水之外，还含有反转录酶。
本发明的另一方案为，上述的全预混试剂组合物中，除所述的dNTPs、DNA聚合酶、甘油、水和反转录酶之外，还含有RT-PCR反应所需的反转录引物和PCR引物。
本发明的上述技术方案根据其应用方向不同，事实上包括：(1)研究用全预混PCR试剂；(2)研究用全预混一管法RT-PCR试剂；(3)临床核酸检测用全预混PCR试剂；和(4)临床核酸检测用全预混一管法RT-PCR试剂。研究和临床核酸检测用PCR/RT-PCR全预混试剂均包括完成反应所需要DNA聚合酶或反转录酶，区别在于研究用全预混试剂不包括引物，可根据研究需要加入引物，而临床核酸检测用全预混试剂包括了该项检测的引物。
全预混试剂设计成10/9倍浓至10倍浓，应用时试剂与样品的加量之比相应为9∶1至1∶9。全预混试剂设计成4/3倍浓至4倍浓，则用时试剂与样品的加量之比相应为3∶1至1∶3。每管PCR反应液体积可采用通用的50或100微升也可缩小。假定认为用通常的微量移管操作达到准确加样的限度为1微升，则本发明设计的全预混试剂最小PCR反应体积仅为2微升。
具体实施方式
表2列出使用不同倍数预混试剂时样品和试剂加量，及全预混试剂甘油浓度为40、50或60％(v/v)时PCR反应液中的甘油浓度。
表2.应用不同倍数预混试剂时样品和试剂的加量及反应液的甘油终浓度
Figure C0311701100091
*假定反应体积为20微升，可据此表放大或缩小体积
**空白表示反应液甘油终浓度超过40％
配制1毫升不同倍数临床核酸检测用全预混PCR试剂盒的方法示于表3。表中假定PCR反应液引物和四种脱氧核糖核苷酸的终浓度分别为0.5μM和0.2mM；DNA聚合酶储液、缓冲液储液、dNTPs和引物储液分别为50、50、100和200倍浓。改变储液浓度或加量可调节引物、dNTPs和其他各种成份达到所需要的浓度。
表3.不同倍数全预混临床核酸检测用PCR试剂的配制＊
Figure C0311701100101
*空白表示反应液甘油终浓度超过40％
配制1毫升全预混临床核酸检测用一管法RT-PCR试剂盒的方法示于表4，表中假定反转录酶和RNase抑制剂储液分别为50和100倍浓。
表4.不同倍数全预混临床核酸检测用一管法RT-PCR试剂的配制
Figure C0311701100111
*空白表示反应液甘油终浓度超过25％(v/v)
配制1毫升研究用全预混PCR试剂盒和研究用全预混一管法RT-PCR试剂盒的方法分别与表2和表3相仿但不需要加引物相应增加无离子水加量。为了给引物储液的浓度和加量留有更大的空间无离子水的用量可再调节。
有益效果
1.使用方便，只需将全预混试剂与含模板样品按一定比例混合即可。
2.可长期低温保存，其储存期与商品DNA聚合酶和反转录酶保存期相同。
3.PCR或RT-PCR反应液配制操作仅一步，大大增强了检测的准确性、重复性和稳定性。
4.PCR或RT-PCR反应液配制操作仅一步，大大减少了各种污染的机会。
5.PCR或RT-PCR反应液配制操作仅一步，也为高通量和自动化检测创造了条件。
6.PCR或RT-PCR反应液含有4-40％(v/v)或4-25％(v/v)的甘油，增强了PCR反应的专一性和其他有益特性。
实施例
实施例1.
全预混乙型肝炎(HBV)PCR诊断试剂盒。
HBV是一种DNA病毒根据其基因组顺序(基因库编号E00010)在其保守区设计了一对引物，其顺序和特性示于表5和表6。
表5.实施例1引物顺序
  引物   位置   顺序(5’至3’)
HBV正 390-433   GGC GTT TTA TCA TAT TCC TCT TCA TCC TGCTGC TAT GCC TCA TC
HBV反 709-748   CAT CCA TAT AGC TGA AAG CCA AAC AGTGGG GGA AAG CCC T
表6.实施例1引物特性
Figure C0311701100131
配制1毫升3倍浓含50％甘油的全预混HBV诊断试剂盒的方法示于表7，全预混试剂的主要试剂原料取自ClonTech公司的Advantage2PCR试剂盒。
表7.3倍浓全预混HBV PCR诊断试剂盒配制
试剂储液 加量   全预混试剂中浓度 反应液中浓度
  10X缓冲液<sup>＊</sup>   300微升   3X   1X
  50XDNA聚合酶<sup>**</sup>   60微升   3X   1X
  10μM dNTPs   60微升   0.6mM   0.2mM
  100μM HBV正引物   15微升   1.5μM   0.5μM
  100μM HBV反引物   15微升   1.5μM   0.5μM
  甘油   470微升   50％   16.7％
  无离子水   80微升
＊含400mM tricine-KOH，pH8.7，150mM KOAc，35mM Mg(OAc)2，37.5μg/ml BSA，0.05％Tween-20和0.05％Nonidet-P40。
＊＊含TaqDNA聚合酶，Taq酶抗体，具校读功能DNA聚合酶，50％甘油(v/v)，15mM Tris-HCl，pH8.0，75mM KCl和50μM EDTA。
测定时每管取1微升全预混试剂并与2微升从乙肝病人血清制备的DNA样品混合，置于扩增仪开始反应。首次变性95℃1分钟，循环变性95℃10秒钟，退火60℃30秒钟，延伸72℃1分钟，循环数30。收尾延伸72℃3分钟。经5％聚丙烯酰胺凝胶电泳后染色，呈现359碱基条带表示为阳性。试剂盒保存-20℃于3个月、半年和一年后对同一DNA样品进行测定，得到同样清晰条带，表明试剂保持原有活性。
实施例2.
全预混甲状腺球蛋白基因表达一管法RT-PCR诊断试剂盒。
甲状腺球蛋白是一种组织专一表达基因(基因库编号NM003235)，各种组织含基因但仅在甲状腺组织细胞中表达。如果在血液或其他体液中出现甲状腺球蛋白基因的mRNA，提示可能为因甲状腺肿瘤或其他甲状腺疾病而导致甲状腺细胞脱落所造成的。测定时从血液制备总RNA，以甲状腺组织总RNA作为检测的阳对照。根据甲状腺球蛋白基因顺序设计一对引物，其顺序和特性示于表8和表9。
表8.实施例2引物顺序
  引物   位置   顺序(5’至3’)
TG正 7355-7382   CCT GCC TCC GCC AGA AGC CTG CCAATG T
TG反 7520-7554   GTT GAT GAG CCC GTC GTC CTG AGAACT CCC AAT GA
表9.实施例2引物特性
Figure C0311701100151
配制1毫升2倍浓含40％甘油的全预混甲状腺球蛋白RT-PCR诊断试剂盒的方法示于表10，全预混试剂的主要试剂原料取自ClonTech公司的TITANIUM一管法RT-PCR试剂盒。
表10.全预混甲状腺球蛋白基因RT-PCR诊断试剂盒配制
试剂储液 加量   全预混试剂中浓度 反应液中浓度
  10X缓冲液   200微升   2.0X   1X
  50XDNA聚合酶和反转录酶混合物 40微升 2.0X 1X
  100XRNase抑制剂   20微升   2.0X   1X
  热稳定剂   250微升
  10mM dNTPs   40微升   0.4mM   0.2mM
  100μM TG正引物   10微升   1.0μM   0.5μM
  100μM TG反引物   10微升   1.0μM   0.5μM
  甘油   398微升   40％   20％
  无离子水   32微升
测定时每管取5微升试剂，与5微升浓度分别为10ng/μL，1ng/μL，100pg/μL和10pg/μL的人甲状腺组织总RNA混合后置于扩增仪。60℃保温10分钟完成cDNA合成后，立即转入PCR程序。首次变性95℃5分钟，循环变性95℃10秒钟，退火60℃30秒钟，延伸72℃1分钟，循环数30。收尾延伸72℃3分钟。经5％聚丙烯酰胺凝胶电泳后染色，呈现200碱基条带表示为阳性。试剂盒保存于-20℃，间隔3个月、半年和1年后，对不同样稀释度的样品测定得到同样清晰的条带表明试剂保持原有活性。
实施例3.
全预混PCR试剂盒。
配制1毫升4倍浓含40％甘油(v/v)PCR试剂盒的方法示于表11，全预混试剂的主要试剂原料取自ClonTech公司的Advantage2PCR试剂盒。
表11.4倍浓40％甘油全预混PCR剂盒配制
试剂储液 加量   全预混试剂中浓度 反应液中浓度
  10X缓冲液<sup>＊</sup>   400微升   4X   1X
  50XDNA聚合酶<sup>＊＊</sup>   80微升   4X   1X
  10mM dNTPs   80微升   0.8mM   0.2mM
  甘油   360微升   40％(v/v)   10％(v/v)
  无离子水   80微升
＊含400mM tricine-KOH，pH8.7，150mM KOAc，35mM Mg(OAc)2，37.5μg/ml BSA，0.05％Tween-20和0.05％Nonidet-P40。
＊＊含TaqDNA聚合酶，Taq酶抗体，具校读功能DNA聚合酶，50％(v/v)甘油，15mM Tris-HCl，pH8.0，75mM KCl和50μMEDTA。
根据引物储液浓度和设定的终浓度按表12配制PCR反应液，其中X为每一个引物的加量，最高加量可为3.75微升。
表12.从全预混PCR试剂配制PCR反应液
  反应体积10微升   反应体积20微升   反应体积50微升
  全预混试剂   2.5微升   5微升   12.5微升
  正引物   X微升   2X微升   5X微升
  反引物   X微升   2X微升   5X微升
  无离子水   7.5-2X   15-4X   37.5-10X
实施例4.
全预混RT-PCR试剂盒。
配制1毫升3/2倍浓含30％(v/v)甘油RT-PCR试剂盒的方法同表10所示，全预混试剂的主要试剂原料取自，全预混试剂的主要试剂原料取自ClonTech公司的TITANIUM一管法RT-PCR试剂盒。
表13.3/2倍浓30％甘油全预混RT-PCR试剂盒配制
  试剂储液   加量   全预混试剂中浓度   反应液中浓度
  10X缓冲液   150微升   1.5X   1X
  50XDNA聚合酶和反   30微升   1.5X   1X
  转录酶混合物
  100XRNase抑制剂  15微升   1.5X   1X
  热稳定剂  400微升
  10mM dNTPs  30微升   0.3mM   0.2mM
  甘油  285微升   30％(v/v)   20％(v/v)
  无离子水  90微升
根据引物储液浓度和设定的终浓度按表14配制PCR反应液，其中X为每一个引物的加量，X最高可为1微升。用试剂盒扩增实施例1所示的HBV基因和其他基因得到实验设计的预期结果。
表14.从全预混RT-PCR试剂配制RT-PCR反应液
 反应体积6微升   反应体积15微升   反应体积30微升
  全预混试剂  4微升   10微升   20微升
  正引物  X微升   2.5X微升   5X微升
  反引物  X微升   2.5X微升   5X微升
  无离子水  2-2X   5-5X   10-10X
用试剂盒扩增实施例2所示TG基因和其他基因得到实验设计的预期结果。

Claims (10)

1.一种用于聚合酶链式反应的全预混试剂组合物，其组分包括：dNTPs、DNA聚合酶、甘油和水，其特征在于甘油体积百分含量为30-65％。
2.根据权利要求1所述的试剂组合物，其特征在于甘油体积百分含量为40-55％。
3.根据权利要求1所述的试剂组合物，其特征在于最终反应液体积为2-100微升。
4.根据权利要求1、2或3中任一项所述的试剂组合物，其特征在于还含有PCR引物。
5.根据权利要求1、2或3中任一项所述的试剂组合物，其特征在于还含有反转录酶。
6.根据权利要求5所述的试剂组合物，其特征在于还含有RT-PCR反应所需的反转录引物和PCR引物。
7.权利要求1所述的试剂组合物在分子生物学试剂中的应用。
8.权利要求4所述的试剂组合物在临床核酸检测试剂中的应用。
9.权利要求5所述的试剂组合物在分子生物学试剂中的应用。
10.权利要求6所述的试剂组合物在临床核酸检测试剂中的应用。
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甘油和聚乙二醇对PCR扩增的影响(摘要）. 张学，等..中国医科大学学报，第20卷第4期. 1991
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