CN111808932B

CN111808932B - 一种环形rna检测方法及试剂盒

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Publication number: CN111808932B
Application number: CN202010705814.0A
Authority: CN
Inventors: 刘明; 李自强; 黄宁宁
Original assignee: Guangzhou Bio Polytron Technologies Inc
Current assignee: Guangzhou Bio Polytron Technologies Inc
Priority date: 2020-07-21
Filing date: 2020-07-21
Publication date: 2021-02-19
Anticipated expiration: 2040-07-21
Also published as: CN111808932A

Abstract

本发明涉及分子生物学领域，涉及一种环形RNA检测方法及试剂盒，环形RNA检测方法，包括以下步骤：S1.引物设计；S2.逆转录反应：取0.1～1μg抽提的总RNA加入N6 Random Primer，RNase‑Free H₂O混合得反应液I；然后向反应液I中加入5×HT RT Buffer，将HT M‑MLV Mix加入反应液I中，最后加入RNase‑Free H₂O得到cDNA；S3.HS PCR扩增：使用步骤S1得到的FSjod Primers、2×SNP Taq Mix、50×ROX Mix*、RNase‑Free H₂O和步骤S2得到的cDNA进行qPCR检测。

Description

一种环形RNA检测方法及试剂盒

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，尤其是涉及一种环形RNA检测方法及试剂盒。

背景技术

环形RNA(circular RNAs,环形RNAs)是一类具有闭合环状结构的RNA分子，在多物种中广泛存在，比线性RNA更稳定。环形RNA可以miRNA sponge、与聚合酶II(RNApolymerase II，Pol II)相互作用调控宿主转录活性、直接翻译蛋白质等多种功能途径在脑发育、帕金森、阿尔兹海默病和肿瘤发生中发挥重要作用，有望作为疾病诊断标志物或治疗靶标。因此可靠的环形RNA定量检测方法至关重要。

目前对环形RNA的定量检测有RT-PCR、RT-qPCR、Taqman qPCR、ddPCR和Northernblot等方法，其中RT-qPCR是保证特异性和灵敏度时使用最广泛，检测最简便经济的方法。Taqman qPCR法在临床检测中应用最广泛，但检测成本较高。而RT-qPCR和Taqman qPCR都基于PCR扩增，区别在于信号的检测方式和灵敏度的差异。

具体对于环形RNA来讲，PCR扩增的特异性、准确性和灵敏性都受很大限制。

一个限制因素是环形RNA与对应的线性RNA (mRNA)碱基序列完全相同，仅在环化剪切位点(Splice junction)处有特异性，能与线性RNA区分开。因此特异检测环形RNA常设计反向引物(Divergent primers)，但引物设计难度大，容易扩增含相同序列的其他环形RNA，特别是在序列末端多或少一个或多个外显子的其他环形RNA，即反向引物对检测环形RNA的特异性有限。同时由于引物位置偏差，可能会非特异扩增到线性RNA。另外来自两条或更多pre-mRNA的剪切会因反式剪切形成tsRNA (trans-spliced RNA)，这类tsRNA可能和环形RNA有相同的Splice junction序列，干扰环形RNA检测的特异性和准确性。

另一个限制因素是逆转录过程，常用的逆转录酶(如M-MLV(H-))有很强的模板置换活性，RNase H活性缺失使RNA模板不会消化，因此逆转录酶与环形RNA模板链紧密结合，形成滚环逆转录的cDNA产物，即一条cDNA链中有多个Splice junction相连接。导致特异检测环形RNA的模板数量被放大，PCR扩增时会扩增到滚环条带或多条带，导致丰度和相对含量失真，定量检测结果出现较大偏差。

使用RNase R消化去除线性RNA并富集环形RNA，可以减少对环形RNA特异性检测的干扰。但总RNA经RNase R消化后，线性和环形RNA的丰度和相对比例都发生变化，且部分环形RNA也会被消化降解，因此导致环形RNA定量检测失真，所以RNase R不适用于环形RNA的准确定量检测。

本发明人前期公布了一种特殊设计的跨环化位点引物，Sjod Primers(SpliceJunction Overlapping Divergent Primers)，能提高环形RNA PCR扩增的特异性。这种引物针对环形RNA特异性的环化位点序列设计，其中一条引物设计在环化位点的3’端，以使环化位点包含在引物上，而不是包含在PCR产物中，PCR时这条引物只有匹配目的环形RNA才能正常扩增，而有错配时基本不能扩增，以此提高特异性。受限于环形RNA特异性的环化位点序列，Sjod Primers的一条引物设计需要跨越环化位点4～7个碱基，跨越碱基过少，可能PCR时被忽略错配差异，无法精确匹配环化位点；跨越碱基过多特别是超过10nt时，可能只由3’端部分序列主导PCR过程，此时引物的5’端相当于悬挂接头，不在PCR过程中匹配模板，最终扩增产物大部分是线性基因的序列，会导致假阳性结果。因此在实际应用中SjodPrimers设计难度太大，不能兼顾PCR扩增的效率和特异性。

因此急需开发一种特异性高且无偏差的PCR检测方法，为环形RNA的准确定量检测需求提供技术基础。

发明内容

针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种环形RNA检测方法，特异性高且无偏差，灵敏度高，操作简便易行，经济快速，无需昂贵的Taqman荧光探针和高配置的定量PCR仪，为研究和临床应用中精准可靠的环形RNA定量检测提供技术基础和配套试剂。

为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：

一种环形RNA检测方法，包括以下步骤：

S1.引物设计：从数据库中获得circRNA的序列和Splice junction序列,将Splicejunction位置的上游20bp和下游10bp共30bp序列输入引物设计软件中，搜索计算以使引物符合GC含量、Tm值常规的参数要求，并使包含不少于上游13bp和不多于下游7bp的序列，即跨越环化位点1～7个碱基，从而得到FSjod的上游引物，接着根据上游引物的参数和位置使用软件自动设计得到一条FSjod下游引物，获得FSjod Primers；

S2.逆转录反应：抽提各类组织、细胞、血液、体液、外泌体、口腔拭子、肺泡灌洗液样品的总RNA，取0.1～1μg抽提的总RNA加入N6 Random Primer，RNase-Free H₂O混合，在温度为60～70℃反应5～10min，迅速冰浴2～3min，得反应液I；然后向反应液I中加入5×HTRT Buffer，将HT M-MLV Mix加入反应液I中，在温度为20～30℃条件下反应5～10min，升温至50～60℃条件下反应15～20min，再升温至80～90℃条件下反应5～10min，最后加入RNase-Free H₂O得到cDNA，-20℃保存备用；

S3.HS PCR扩增：使用步骤S1得到的FSjod Primers、2×SNP Taq Mix、50×ROXMix*、RNase-Free H₂O和步骤S2得到的cDNA进行qPCR检测，PCR扩增结束后，按照2^-△△Ct法计算环形RNA的表达量。

优选地，所述HT M-MLV Mix包含逆转录酶HT M-MLV(RNase H+)和RNaseInhibitor，所述逆转录酶HT M-MLV(RNase H+)的突变型为A32V/E69K/L72R/E286R/E302R/T306L/W313F/W388R/L435R/N454K，所述逆转录酶HT M-MLV(RNase H+)基因序列如SEQ IDNO.1。

优选地，所述2×SNP Taq Mix包括SNP Taq、dNTP和Mg²⁺，SNP Taq的突变型为V155A/G418K/N483Q/S486Q/T539N/W604R/R660V/F667Y/M747R，所述SNP Taq基因序列如SEQ ID NO.2。

优选地，所述步骤S2中逆转录中反应液I的组成包括：

所述步骤S2中逆转录中cDNA的组成包括：

优选地，所述PCR扩增反应体系组成为：

PCR反应条件为：1)预变性：95℃5min；2)循环反应：40循环(95℃10s,60℃X s)；3)熔解曲线：95℃1min，55℃1min，55℃～98℃(10s/cycle,0.5℃/cycle)，其中50×ROX Mix需根据仪器选用。

本发明还提供了一种环形RNA检测试剂盒，包括HT逆转录试剂和HS PCR扩增试剂，所述HT逆转录试剂包括HT M-MLV Mix、5×HT RT Buffer、N6 Random Primer和RNase-FreeH₂O；

所述HS PCR扩增试剂包括2×SNP Taq Mix、50×ROX Mix和RNase-Free H2O。

优选地，所述HT M-MLV Mix包括HT M-MLV(RNase H+)200U/μL、RNase Inhibitor40U/μL、RNase-Free H₂O和50％甘油。

优选地，5×HT RT Buffer包括150mM pH8.3的Tris-HCl、375mM KCl、15mM MgCl2、10mM dNTP和20mM DTT。

优选地，2×SNP Taq Mix包括2U/μLSNP Taq、10mM dNTP、100mM pH8.5的Tris-HCl、20mM(NH₄)₂SO₄、4mM MgCl₂、50mM KCl、500mM Glycine betaine、0.8％Tween-20、5％DMSO和10％甘油。

本发明利用逆转录酶M-MLV的天然RNase H活性，通过点突变设计和测试验证，实现高度热稳定性和提升的cDNA合成速度，获得HT M-MLV(RNase H+)用于逆转录反应。改造优化的逆转录酶HT M-MLV(RNase H+)可以在50～60℃进行逆转录，能更好地打开环形RNA的二级结构。并在逆转录过程中消化模板RNA链，缩短逆转录时间至15min，增加随机引物浓度，以此减少滚环逆转录产物的生成。生成的cDNA中保留最真实的环形RNA环化位点数量和相对比例，使PCR无法扩增到滚环条带或多条带，保证检测结果的真实准确性，丰度和相对含量无偏差。

本发明利用Taq DNA聚合酶，通过点突变设计和测试验证，提升外切酶活性、错配介导的外切酶活性和模板特异性聚合活性，获得SNP Taq用于PCR扩增。改造优化的SNP Taq对引物3’末端序列和模板配对的容错率低，扩增纠正活性强，单个碱基的错配也能高效检出，极大增加了扩增的特异性和区分度。另外扩展了检测引物，使用FSjod Primers(Flexible Splice Junction Overlapping Divergent Primers)，针对环形RNA特异性的环化位点序列设计，其中一条引物设计在环化位点的3’端，以使环化位点包含在引物上，而不是包含在PCR产物中。这条引物设计可跨越环化位点1～7个碱基，使引物设计更灵活，配合SNP Taq的高特异性扩增，极大提高PCR扩增的特异性和区分度。综合使用FSjod Primers和SNP Taq进行HS PCR扩增，能实现对环形RNA的高特异性检测，区分可能错配的其他环形RNA或线性RNA，无需对样品进行RNase R消化，保证检测结果的特异性和准确性。

其中，2^-△△Ct法的计算原理为：

设定Ct_A1为1号样本目标基因Ct值，Ct_B1为1号样本内参基因Ct值；Ct_A2为2号样本目标基因Ct值，Ct_B2为2号样本内参基因Ct值，则1号样本和2号样本目标基因表达水平比值可粗略计算为(2^-△△Ct法)：

△△Ct＝(CtA2-CtB2)-(CtA1-CtB1)＝X

则2号样本内目标基因的表达水平为1号样本内的2^-X倍。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明提供的环形RNA检测方法能对组织、细胞、血液、体液、外泌体、口腔拭子、肺泡灌洗液等各类样品抽提的总RNA直接进行检测，无需进行RNase R消化处理，操作简便易行，检测特异性高且无偏差，检测灵敏度高，经济快速，无需昂贵的Taqman荧光探针和高配置的定量PCR仪，为研究和临床应用中精准可靠的环形RNA定量检测提供技术基础和配套试剂。

附图说明

图1为本发明环形RNA hsa_circ_0005836，Divergent Primers，HT cDNA样品扩增曲线和熔解曲线；

图2为本发明环形RNA hsa_circ_0005836，Divergent Primers，ES cDNA样品扩增曲线和熔解曲线；

图3为本发明环形RNA hsa_circ_0005836，FSjod Primers，HT cDNA样品扩增曲线和熔解曲线；

图4为本发明环形RNA hsa_circ_0005836，FSjod Primers，ES cDNA样品扩增曲线和熔解曲线；

图5为本发明实施例1环形RNAhsa_circ_0005836的PCR产物电泳检测图；

图6为本发明环形RNAhsa_circ_0007874，Divergent Primers，HT cDNA样品扩增曲线和熔解曲线；

图7为本发明环形RNAhsa_circ_0007874，Divergent Primers，ES cDNA样品扩增曲线和熔解曲线；

图8为本发明环形RNAhsa_circ_0007874，FSjod Primers，HT cDNA样品扩增曲线和熔解曲线；

图9为本发明环形RNAhsa_circ_0007874，FSjod Primers，ES cDNA样品扩增曲线和熔解曲线；

图10为本发明实施例2环形RNAhsa_circ_0007874的PCR产物电泳检测图；

图11为本发明环形RNAhsa_circ_5836-FF6/FR6，TS qPCR样品扩增曲线和熔解曲线；

图12为本发明环形RNAhsa_circ_5836-FF1/FR1，TS qPCR样品扩增曲线和熔解曲线；

图13为本发明环形RNAhsa_circ_5836-FF6/FR6，HS qPCR样品扩增曲线和熔解曲线；

图14为本发明环形RNAhsa_circ_5836-FF1/FR1，HS qPCR样品扩增曲线和熔解曲线；

图15为本发明实施例3的PCR产物电泳检测图；

图16为本发明环形RNAhsa_circ_7874-FF7/FR，TS qPCR样品扩增曲线和熔解曲线；

图17为本发明环形RNAhsa_circ_7874-FF2/FR，TS qPCR样品扩增曲线和熔解曲线；

图18为本发明环形RNAhsa_circ_7874-FF1/FR，TS qPCR样品扩增曲线和熔解曲线；

图19为本发明环形RNAhsa_circ_7874-FF7/FR，HS qPCR样品扩增曲线和熔解曲线；

图20为本发明环形RNAhsa_circ_7874-FF2/FR，HS qPCR样品扩增曲线和熔解曲线；

图21为本发明环形RNAhsa_circ_7874-FF1/FR，HS qPCR样品扩增曲线和熔解曲线；

图22为本发明实施例4的PCR产物电泳检测图；

图23为本发明环形RNA_hsa_circ_0016600扩增曲线和熔解曲线；

图24为本发明环形RNAhsa_circ_0063411扩增曲线和熔解曲线；

图25为本发明环形RNAhsa_circ_0006188样品扩增曲线和熔解曲线；

图26为本发明环形hsa_circ_0027664样品扩增曲线和熔解曲线；

图27为本发明实施例5的PCR产物电泳检测图。

具体实施方式

以下结合附图及实施例，对本发明作进一步详细说明。

如本文所用，除非特别注明，其他实验方法都可采用本领域中的常规方法，例如参考《分子克隆实验指南(第四版)》(科学出版社，2017)或按照供应商所建议的条件。

在以下实施例中，HT逆转录试剂包括HT M-MLV Mix、5×HT RT Buffer、N6 RandomPrimer和RNase-Free H2O；

所述逆转录酶HT M-MLV(RNase H+)的突变型为A32V/E69K/L72R/E286R/E302R/T306L/W313F/W388R/L435R/N454K，其基因序列如SEQ ID NO.1；

所述2×SNP Taq Mix包括SNP Taq、dNTP和Mg²⁺，SNP Taq的突变型为V155A/G418K/N483Q/S486Q/T539N/W604R/R660V/F667Y/M747R，其基因序列如SEQ ID NO.2；

其中N6 Random Primer为合成的寡核苷酸5’-N₆-3’，浓度50μM。

实施例1

以qPCR检测环形RNA hsa_circ_0005836，使用本发明中的HT逆转录试剂进行逆转录反应，以常规逆转录试剂盒为对照。

1.引物设计与合成

从circBase数据库中获得环形RNA的序列和Splice junction序列，将Splicejunction位置的上游20bp和下游10bp共30bp序列输入引物设计软件中，分别设计两对引物，将序列发送至生工生物合成，PAGE纯化。

Divergent Primers:

5836-DF:ATCATCAGGGCATCTATGTA

5836-DR:ACTCATCCTTGAACCTTGCAG

扩增大小122bp

FSjod Primers:

5836-FF2:TTAGAACATGCATCTAAGGT

5836-FR2:ATACTGTTTTCCTGCAGACAT

扩增大小198bp

2.RNA抽提和逆转录

使用Trizol Reagent抽提293T细胞的总RNA，然后进行HT组逆转录(使用本发明中HT逆转录试剂)。逆转录反应体系和程序如下：

按表1配置反应液，反应条件65℃5min，迅速冰浴2min。

表1 HT逆转录步骤①

按表2配置反应液，反应条件25℃5min,55℃15min,85℃5min。结束后加180μLRNase-Free H₂O得到200μL稀释的cDNA，-20℃保存待用。

表2 HT逆转录步骤②

同时使用

First-Strand cDNA Synthesis SuperMix(全式金生物)，按照说明书进行ES组逆转录，作为实验对照。

3.qPCR扩增

分别以Divergent Primers和FSjod Primers两对引物，使用HT和ES两组cDNA样品，在ABI 7500上进行HS qPCR扩增，以检测hsa_circ_0005836。反应程序为1)预变性：95℃5min；2)循环反应：40循环(95℃10s,60℃34s)；3)熔解曲线：95℃1min，55℃1min，55℃～98℃(10s/cycle,0.5℃/cycle)。反应体系如下：

表3检测hsa_circ_0005836扩增反应体系

4.qPCR检测数据分析

此例只有一个样品293T RNA，因此以Ct值、扩增曲线和熔解曲线、PCR产物电泳检测进行结果分析，省略以2^-△△Ct法计算相对表达量。

qPCR检测数据显示以Divergent Primers扩增时，HT组cDNA样品中平均Ct值为32.986，扩增曲线和熔解曲线如图1；ES组cDNA样品中平均Ct值为32.358，扩增曲线和熔解曲线如图2。以FSjod Primers扩增时，HT组cDNA样品中平均Ct值为32.457，扩增曲线和熔解曲线如图3；ES组cDNA样品中平均Ct值为31.787，扩增曲线和熔解曲线如图4。熔解曲线显示ES组cDNA样品中有双峰，提示有滚环逆转录产物。而HT组cDNA样品中Divergent Primers的扩增曲线重复性偏差大，熔解曲线有双峰，提示FSjod Primers比Divergent Primers的特异性更高。

分别将4个反应的PCR产物进行电泳检测，结果如图5。结果显示以DivergentPrimers扩增时，HT组cDNA样品中为单一条带(轻微引物二聚体)，ES组cDNA样品中为多条带，即扩增到了滚环逆转录产物。以FSjod Primers扩增时，HT组cDNA样品中为单一明亮条带，ES组cDNA样品中为明显多条带，即扩增到了滚环逆转录产物。

结果说明以本发明中HT逆转录试剂进行逆转录，能明显减少滚环逆转录产物的生成，生成的cDNA中保留真实的环形RNA环化位点数量和相对比例，PCR无法扩增到滚环条带，确保检测结果的真实准确性，丰度和相对含量无偏差。

另外Divergent Primers的扩增产物条带为单一条带但有轻微引物二聚体，滚环条带较模糊。而FSjod Primers的扩增产物为单一明亮条带，滚环条带也清晰可见。说明FSjod Primers的扩增效率和特异性更高，能实现对环形RNA的高特异性检测，区分可能错配的其他环形RNA或线性RNA，保证检测结果的特异性和准确性。

实施例2

qPCR检测环形RNA hsa_circ_0007874，使用本发明中的HT逆转录试剂进行逆转录反应，以常规逆转录试剂盒为对照。

1.引物设计与合成

Divergent Primers:

7874-DF:GAGCTGTAGAAGATCTTATTC

7874-DR:TAATGTACACCAGACTGGTC

扩增大小193bp

FSjod Primers:

7874-FF3:TCAGTGGGGTTGTTTTGGGTC

7874-FR3:TGAGCTCTCAGACCCCACACA

扩增大小184bp

2.RNA抽提和逆转录

与实施例1相同。

3.qPCR扩增

与实施例1相同。

4.qPCR检测数据分析

qPCR检测数据显示以Divergent Primers扩增时，HT组cDNA样品中平均Ct值为31.632，扩增曲线和熔解曲线如图6；ES组cDNA样品中平均Ct值为30.735，扩增曲线和熔解曲线如图7。以FSjod Primers扩增时，HT组cDNA样品中平均Ct值为31.201，扩增曲线和熔解曲线如图8；ES组cDNA样品中平均Ct值为30.160，扩增曲线和熔解曲线如图9。熔解曲线显示ES组cDNA样品中有双峰，提示有滚环逆转录产物。而HT组cDNA样品中Divergent Primers的扩增曲线和熔解曲线重复性偏差大，提示FSjod Primers比Divergent Primers的特异性更高。

分别将4个反应的PCR产物进行电泳检测，结果如图10。结果显示以DivergentPrimers扩增时，HT组cDNA样品中为单一条带(轻微杂带)，ES组cDNA样品中为多条带，即扩增到了滚环逆转录产物。以FSjod Primers扩增时，HT组cDNA样品中为单一明亮条带，ES组cDNA样品中为多条带，即扩增到了滚环逆转录产物。

另外Divergent Primers的扩增产物条带为单一条带但有轻微杂带，滚环条带明显。而FSjod Primers的扩增产物为单一明亮条带，滚环条带也明显可见。说明FSjodPrimers的扩增效率和特异性更高，能实现对环形RNA的高特异性检测，区分可能错配的其他环形RNA或线性RNA，保证检测结果的特异性和准确性。

实施例3

以qPCR检测环形RNA hsa_circ_0005836，使用本发明中的HS PCR扩增试剂进行qPCR扩增，以常规qPCR扩增试剂盒为对照。

1.引物设计与合成

从circBase数据库中获得环形RNA的序列和Splice junction序列，将Splicejunction位置的上游20bp和下游10bp共30bp序列输入引物设计软件中，分别设计跨越环化位点1个碱基和6个碱基的两对FSjod引物，将序列发送至生工生物合成，PAGE纯化。

FSjod Primers:

5836-FF1:TTTAGAACATGCATCTAAGG

5836-FR1:ACTGTTTTCCTGCAGACATCT

扩增大小197bp

5836-FF6:GAACATGCATCTAAGGTTTAC

5836-FR6:TGAAGTACATAGATGCCCTGA

扩增大小150bp

2.RNA抽提和逆转录

与实施例1相同。

3.qPCR扩增

分别以FSjod Primers两对引物，使用HT组cDNA样品，在ABI 7500上进行HS qPCR扩增，以检测hsa_circ_0005836。反应程序为1)预变性：95℃5min；2)循环反应：40循环(95℃10s,60℃34s)；3)熔解曲线：95℃1min，55℃1min，55℃～98℃(10s/cycle,0.5℃/cycle)。反应体系如下：

表4检测hsa_circ_0005836扩增反应体系

同时使用

Green qPCR SuperMix(全式金生物)，按照说明书进行TS组qPCR扩增，作为实验对照。

4.qPCR检测数据分析

qPCR检测数据显示TS qPCR组中，以5836-FF6/FR6扩增时，平均Ct值为32.447，扩增曲线和熔解曲线如图11；以5836-FF1/FR1扩增时，平均Ct值为33.478，扩增曲线和熔解曲线如图12。在HS qPCR组中，以5836-FF6/FR6扩增时，平均Ct值为31.702，扩增曲线和熔解曲线如图13；以5836-FF1/FR1扩增时，平均Ct值为31.539，扩增曲线和熔解曲线如图14。

熔解曲线显示TS qPCR组中以5836-FF1/FR1扩增时明显有双峰，提示有非特异性扩增。而HS qPCR组中扩增曲线和熔解曲线重复性更好，说明本发明中的HS PCR扩增试剂配合FSjod引物的扩增特异性更高。

分别将PCR产物进行电泳检测，结果如图15。结果显示以5836-FF6/FR6扩增时，TSqPCR组和HS qPCR组都是单一条带，而以5836-FF1/FR1扩增时，TS qPCR组有杂带多条带，HSqPCR组为单一明亮条带。说明本发明中的HS PCR扩增试剂能更好地匹配特异性引物，FSjod引物设计为跨越1个碱基也能高特异扩增，避免扩增到杂带或其他基因。

结果说明本发明中HS PCR扩增试剂的SNP Taq对引物3’末端序列和模板配对的容错率低，扩增纠正活性强，单个碱基的错配也能高效检出，FSjod引物设计为跨越1～6个碱基都能高效特异检测环形RNA，极大增加了扩增的特异性和区分度。综合使用FSjodPrimers和SNP Taq进行HS PCR扩增，能实现对环形RNA的高特异性检测，区分可能错配的其他环形RNA或线性RNA，保证检测结果的特异性和准确性。

实施例4

以qPCR检测环形RNA hsa_circ_0007874，使用本发明中的HS PCR扩增试剂进行qPCR扩增，以常规qPCR扩增试剂盒为对照。

1.引物设计与合成

从circBase数据库中获得环形RNA的序列和Splice junction序列，将Splicejunction位置的上游20bp和下游10bp共30bp序列输入引物设计软件中，分别设计跨越环化位点1个、2个和7个碱基的三对FSjod引物，将序列发送至生工生物合成，PAGE纯化。

FSjod Primers:

7874-FF1:TGTCAGTGGGGTTGTTTTGGG

7874-FR:TGGTCACAGATGCGAGAACAC

扩增大小114bp

7874-FF2:TCAGTGGGGTTGTTTTGGGT

7874-FR:TGGTCACAGATGCGAGAACAC

扩增大小118bp

7874-FF7:TGGGGTTGTTTTGGGTCAGAT

7874-FR:TGGTCACAGATGCGAGAACAC

扩增大小120bp

2.RNA抽提和逆转录

与实施例1相同。

3.qPCR扩增

与实施例3相同。

4.qPCR检测数据分析

qPCR检测数据显示TS qPCR组中，以7874-FF7/FR扩增时，平均Ct值为32.958，扩增曲线和熔解曲线如图16；以7874-FF2/FR扩增时，平均Ct值为31.071，扩增曲线和熔解曲线如图17；以7874-FF1/FR扩增时，平均Ct值为30.600，扩增曲线和熔解曲线如图18。在HSqPCR组中，以7874-FF7/FR扩增时，平均Ct值为31.143，扩增曲线和熔解曲线如图19；以7874-FF2/FR扩增时，平均Ct值为30.996，扩增曲线和熔解曲线如图20；以7874-FF1/FR扩增时，平均Ct值为31.113，扩增曲线和熔解曲线如图21。

熔解曲线显示TS qPCR组中以7874-FF2/FR和7874-FF1/FR扩增时明显有双峰，提示有非特异性扩增。而HS qPCR组中扩增曲线和熔解曲线重复性更好，说明本发明中的HSPCR扩增试剂配合FSjod引物的扩增特异性更高。

分别将PCR产物进行电泳检测，结果如图22。结果显示以7874-FF7/FR扩增时，TSqPCR组和HS qPCR组都是单一条带，而以7874-FF2/FR和7874-FF1/FR扩增时，TS qPCR组有杂带多条带，HS qPCR组为单一条带。说明本发明中的HS PCR扩增试剂能更好地匹配特异性引物，FSjod引物设计为跨越1个碱基也能高特异扩增，避免扩增到杂带或其他基因。

结果说明本发明中HS PCR扩增试剂的SNP Taq对引物3’末端序列和模板配对的容错率低，扩增纠正活性强，单个碱基的错配也能高效检出，FSjod引物设计为跨越1～7个碱基都能高效特异检测环形RNA，极大增加了扩增的特异性和区分度。综合使用FSjodPrimers和SNP Taq进行HS PCR扩增，能实现对环形RNA的高特异性检测，区分可能错配的其他环形RNA或线性RNA，保证检测结果的特异性和准确性。

实施例5

以qPCR检测人的混合细胞系样品中环形RNAhsa_circ_0016600、hsa_circ_0063411、hsa_circ_0006188和hsa_circ_0027664，使用本发明中的HT逆转录试剂进行逆转录反应，使用本发明中的HS PCR扩增试剂进行qPCR扩增。

1.引物设计与合成

从circBase数据库中获得环形RNA的序列和Splice junction序列，将Splicejunction位置的上游20bp和下游10bp共30bp序列输入引物设计软件中，分别对环形RNA设计FSjod引物，将序列发送至生工生物合成，PAGE纯化。

FSjod Primers:

16600-F5:AGACAGAGAAGAGCAGCCAGT

16600-R:CTAATGGTTTCACATCTTCAT

扩增大小173bp

63411-F:AACAGCACAGCACAATCGAG

63411-R3:CTTGCATAGATTTGGAATCTG

扩增大小120bp

6188-F2:GCAACACACATAGCACTTCGA

6188-R:TGAAGATACTTTCTGACACAG

扩增大小114bp

27664-F3:TCTGTATGCAGAATCTGAAGG

27664-R:CACTATCTTGTGTCCAAAATGA

扩增大小144bp

2.RNA抽提和逆转录

与实施例1相同。

3.qPCR扩增

与实施例3相同。

4.qPCR检测数据分析

此例只有一个人的混合细胞系样品，因此以Ct值、扩增曲线和熔解曲线、PCR产物电泳检测进行结果分析，省略以2^-△△Ct法计算相对表达量。

qPCR检测数据显示hsa_circ_0016600的平均Ct值为24.380，hsa_circ_0063411的平均Ct值为30.138，hsa_circ_0006188的平均Ct值为33.794，hsa_circ_0027664的平均Ct值为30.278。

扩增曲线和熔解曲线显示重复性好，无双峰，提示无滚环条带或非特异扩增条带，说明检测结果特异性高，真实准确。

分别将PCR产物进行电泳检测，结果如图27。结果显示PCR产物都是单一明亮条带，无滚环逆转录产物或非特异扩增的杂带。

结果说明本发明中对HT逆转录试剂、HS PCR扩增试剂盒FSjod引物的联用和综合改进优化，避免了PCR扩增滚环逆转录条带，能区分可能错配的其他环形RNA或线性RNA，大大提升了环形RNA检测的特异性和准确性，保证检测丰度和相对含量无偏差。

实施例6

一种环形RNA检测试剂盒，包括HT逆转录试剂、HS PCR扩增试剂和使用说明，HT逆转录试剂包括HT M-MLV Mix、5×HT RT Buffer、N6 Random Primer和RNase-Free H₂O；

所述HS PCR扩增试剂包括2×SNP Taq Mix、50×ROX Mix和RNase-Free H2O；

所述HT M-MLV Mix包括HT M-MLV(RNase H+)200U/μL、RNase Inhibitor 40U/μL、RNase-Free H₂O和50％甘油；

5×HT RT Buffer包括150mM pH为8.3的Tris-HCl、375mM KCl、15mM MgCl2、10mMdNTP和20mM DTT；

2×SNP Taq Mix包括2U/μLSNP Taq、10mM dNTP、100mM pH8.5的Tris-HCl、20mM(NH₄)₂SO₄、4mM MgCl₂、50mM KCl、500mM Glycine betaine、0.8％Tween-20、5％DMSO和10％甘油。

本具体实施方式的实施例均为本发明的较佳实施例，并非依此限制本发明的保护范围，故：凡依本发明的结构、形状、原理所做的等效变化，均应涵盖于本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 广州吉赛生物科技股份有限公司

<120> 一种环形RNA检测方法及试剂盒

<130> 2020.7.7

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 672

<212> PRT

<213> 逆转录酶HT M-MLV(RNase H+)

<400> 1

Met Leu Asn Ile Glu Asp Glu His Arg Leu His Glu Thr Ser Lys Glu

1 5 10 15

Pro Asp Val Ser Leu Gly Ser Thr Trp Leu Ser Asp Phe Pro Gln Val

20 25 30

Trp Ala Glu Thr Gly Gly Met Gly Leu Ala Val Arg Gln Ala Pro Leu

35 40 45

Ile Ile Pro Leu Lys Ala Thr Ser Thr Pro Val Ser Ile Lys Gln Tyr

50 55 60

Pro Met Ser Gln Lys Ala Arg Arg Gly Ile Lys Pro His Ile Gln Arg

65 70 75 80

Leu Leu Asp Gln Gly Ile Leu Val Pro Cys Gln Ser Pro Trp Asn Thr

85 90 95

Pro Leu Leu Pro Val Lys Lys Pro Gly Thr Asn Asp Tyr Arg Pro Val

100 105 110

Gln Asp Leu Arg Glu Val Asn Lys Arg Val Glu Asp Ile His Pro Thr

115 120 125

Val Pro Asn Pro Tyr Asn Leu Leu Ser Gly Leu Pro Pro Ser His Gln

130 135 140

Trp Tyr Thr Val Leu Asp Leu Lys Asp Ala Phe Phe Cys Leu Arg Leu

145 150 155 160

His Pro Thr Ser Gln Pro Leu Phe Ala Phe Glu Trp Arg Asp Pro Glu

165 170 175

Met Gly Ile Ser Gly Gln Leu Thr Trp Thr Arg Leu Pro Gln Gly Phe

180 185 190

Lys Asn Ser Pro Thr Leu Phe Asp Glu Ala Leu His Arg Asp Leu Ala

195 200 205

Asp Phe Arg Ile Gln His Pro Asp Leu Ile Leu Leu Gln Tyr Val Asp

210 215 220

Asp Leu Leu Leu Ala Ala Thr Ser Glu Leu Asp Cys Gln Gln Gly Thr

225 230 235 240

Arg Ala Leu Leu Gln Thr Leu Gly Asn Leu Gly Tyr Arg Ala Ser Ala

245 250 255

Lys Lys Ala Gln Ile Cys Gln Lys Gln Val Lys Tyr Leu Gly Tyr Leu

260 265 270

Leu Lys Glu Gly Gln Arg Trp Leu Thr Glu Ala Arg Lys Arg Thr Val

275 280 285

Met Gly Gln Pro Thr Pro Lys Thr Pro Arg Gln Leu Arg Arg Phe Leu

290 295 300

Gly Leu Ala Gly Phe Cys Arg Leu Phe Ile Pro Gly Phe Ala Glu Met

305 310 315 320

Ala Ala Pro Leu Tyr Pro Leu Thr Lys Thr Gly Thr Leu Phe Asn Trp

325 330 335

Gly Pro Asp Gln Gln Lys Ala Tyr Gln Glu Ile Lys Gln Ala Leu Leu

340 345 350

Thr Ala Pro Ala Leu Gly Leu Pro Asp Leu Thr Lys Pro Phe Glu Leu

355 360 365

Phe Val Asp Glu Lys Gln Gly Tyr Ala Lys Gly Val Leu Thr Gln Lys

370 375 380

Leu Gly Pro Arg Arg Arg Pro Val Ala Tyr Leu Ser Lys Lys Leu Asp

385 390 395 400

Pro Val Ala Ala Gly Trp Pro Pro Cys Leu Arg Met Val Ala Ala Ile

405 410 415

Ala Val Leu Thr Lys Asp Ala Gly Lys Leu Thr Met Gly Gln Pro Leu

420 425 430

Val Ile Arg Ala Pro His Ala Val Glu Ala Leu Val Lys Gln Pro Pro

435 440 445

Asp Arg Trp Leu Ser Lys Ala Arg Met Thr His Tyr Gln Ala Leu Leu

450 455 460

Leu Asp Thr Asp Arg Val Gln Phe Gly Pro Val Val Ala Leu Asn Pro

465 470 475 480

Ala Thr Leu Leu Pro Leu Pro Glu Glu Gly Leu Gln His Asn Cys Leu

485 490 495

Asp Ile Leu Ala Glu Ala His Gly Thr Arg Pro Asp Leu Thr Asp Gln

500 505 510

Pro Leu Pro Asp Ala Asp His Thr Trp Tyr Thr Asp Gly Ser Ser Leu

515 520 525

Leu Gln Glu Gly Gln Arg Lys Ala Gly Ala Ala Val Thr Thr Glu Thr

530 535 540

Glu Val Ile Trp Ala Lys Ala Leu Pro Ala Gly Thr Ser Ala Gln Arg

545 550 555 560

Ala Glu Leu Ile Ala Leu Thr Gln Ala Leu Lys Met Ala Glu Gly Lys

565 570 575

Lys Leu Asn Val Tyr Thr Asp Ser Arg Tyr Ala Phe Ala Thr Ala His

580 585 590

Ile His Gly Glu Ile Tyr Arg Arg Arg Gly Leu Leu Thr Ser Glu Gly

595 600 605

Lys Glu Ile Lys Asn Lys Asp Glu Ile Leu Ala Leu Leu Lys Ala Leu

610 615 620

Phe Leu Pro Lys Arg Leu Ser Ile Ile His Cys Pro Gly His Gln Lys

625 630 635 640

Gly His Ser Ala Glu Ala Arg Gly Asn Arg Met Ala Asp Gln Ala Ala

645 650 655

Arg Lys Ala Ala Ile Thr Glu Thr Pro Asp Thr Ser Thr Leu Leu Ile

660 665 670

<210> 2

<211> 832

<212> PRT

<213> SNP Taq

<400> 2

Met Arg Gly Met Leu Pro Leu Phe Glu Pro Lys Gly Arg Val Leu Leu

1 5 10 15

Val Asp Gly His His Leu Ala Tyr Arg Thr Phe His Ala Leu Lys Gly

20 25 30

Leu Thr Thr Ser Arg Gly Glu Pro Val Gln Ala Val Tyr Gly Phe Ala

35 40 45

Lys Ser Leu Leu Lys Ala Leu Lys Glu Asp Gly Asp Ala Val Ile Val

50 55 60

Val Phe Asp Ala Lys Ala Pro Ser Phe Arg His Glu Ala Tyr Gly Gly

65 70 75 80

Tyr Lys Ala Gly Arg Ala Pro Thr Pro Glu Asp Phe Pro Arg Gln Leu

85 90 95

Ala Leu Ile Lys Glu Leu Val Asp Leu Leu Gly Leu Ala Arg Leu Glu

100 105 110

Val Pro Gly Tyr Glu Ala Asp Asp Val Leu Ala Ser Leu Ala Lys Lys

115 120 125

Ala Glu Lys Glu Gly Tyr Glu Val Arg Ile Leu Thr Ala Asp Lys Asp

130 135 140

Leu Tyr Gln Leu Leu Ser Asp Arg Ile His Ala Leu His Pro Glu Gly

145 150 155 160

Tyr Leu Ile Thr Pro Ala Trp Leu Trp Glu Lys Tyr Gly Leu Arg Pro

165 170 175

Asp Gln Trp Ala Asp Tyr Arg Ala Leu Thr Gly Asp Glu Ser Asp Asn

180 185 190

Leu Pro Gly Val Lys Gly Ile Gly Glu Lys Thr Ala Arg Lys Leu Leu

195 200 205

Glu Glu Trp Gly Ser Leu Glu Ala Leu Leu Lys Asn Leu Asp Arg Leu

210 215 220

Lys Pro Ala Ile Arg Glu Lys Ile Leu Ala His Met Asp Asp Leu Lys

225 230 235 240

Leu Ser Trp Asp Leu Ala Lys Val Arg Thr Asp Leu Pro Leu Glu Val

245 250 255

Asp Phe Ala Lys Arg Arg Glu Pro Asp Arg Glu Arg Leu Arg Ala Phe

260 265 270

Leu Glu Arg Leu Glu Phe Gly Ser Leu Leu His Glu Phe Gly Leu Leu

275 280 285

Glu Ser Pro Lys Ala Leu Glu Glu Ala Pro Trp Pro Pro Pro Glu Gly

290 295 300

Ala Phe Val Gly Phe Val Leu Ser Arg Lys Glu Pro Met Trp Ala Asp

305 310 315 320

Leu Leu Ala Leu Ala Ala Ala Arg Gly Gly Arg Val His Arg Ala Pro

325 330 335

Glu Pro Tyr Lys Ala Leu Arg Asp Leu Lys Glu Ala Arg Gly Leu Leu

340 345 350

Ala Lys Asp Leu Ser Val Leu Ala Leu Arg Glu Gly Leu Gly Leu Pro

355 360 365

Pro Gly Asp Asp Pro Met Leu Leu Ala Tyr Leu Leu Asp Pro Ser Asn

370 375 380

Thr Thr Pro Glu Gly Val Ala Arg Arg Tyr Gly Gly Glu Trp Thr Glu

385 390 395 400

Glu Ala Gly Glu Arg Ala Ala Leu Ser Glu Arg Leu Phe Ala Asn Leu

405 410 415

Trp Lys Arg Leu Glu Gly Glu Glu Arg Leu Leu Trp Leu Tyr Arg Glu

420 425 430

Val Glu Arg Pro Leu Ser Ala Val Leu Ala His Met Glu Ala Thr Gly

435 440 445

Val Arg Leu Asp Val Ala Tyr Leu Arg Ala Leu Ser Leu Glu Val Ala

450 455 460

Glu Glu Ile Ala Arg Leu Glu Ala Glu Val Phe Arg Leu Ala Gly His

465 470 475 480

Pro Phe Gln Leu Asn Gln Arg Asp Gln Leu Glu Arg Val Leu Phe Asp

485 490 495

Glu Leu Gly Leu Pro Ala Ile Gly Lys Thr Glu Lys Thr Gly Lys Arg

500 505 510

Ser Thr Ser Ala Ala Val Leu Glu Ala Leu Arg Glu Ala His Pro Ile

515 520 525

Val Glu Lys Ile Leu Gln Tyr Arg Glu Leu Asn Lys Leu Lys Ser Thr

530 535 540

Tyr Ile Asp Pro Leu Pro Asp Leu Ile His Pro Arg Thr Gly Arg Leu

545 550 555 560

His Thr Arg Phe Asn Gln Thr Ala Thr Ala Thr Gly Arg Leu Ser Ser

565 570 575

Ser Asp Pro Asn Leu Gln Asn Ile Pro Val Arg Thr Pro Leu Gly Gln

580 585 590

Arg Ile Arg Arg Ala Phe Ile Ala Glu Glu Gly Arg Leu Leu Val Ala

595 600 605

Leu Asp Tyr Ser Gln Ile Glu Leu Arg Val Leu Ala His Leu Ser Gly

610 615 620

Asp Glu Asn Leu Ile Arg Val Phe Gln Glu Gly Arg Asp Ile His Thr

625 630 635 640

Glu Thr Ala Ser Trp Met Phe Gly Val Pro Arg Glu Ala Val Asp Pro

645 650 655

Leu Met Arg Val Ala Ala Lys Thr Ile Asn Tyr Gly Val Leu Tyr Gly

660 665 670

Met Ser Ala His Arg Leu Ser Gln Glu Leu Ala Ile Pro Tyr Glu Glu

675 680 685

Ala Gln Ala Phe Ile Glu Arg Tyr Phe Gln Ser Phe Pro Lys Val Arg

690 695 700

Ala Trp Ile Glu Lys Thr Leu Glu Glu Gly Arg Arg Arg Gly Tyr Val

705 710 715 720

Glu Thr Leu Phe Gly Arg Arg Arg Tyr Val Pro Asp Leu Glu Ala Arg

725 730 735

Val Lys Ser Val Arg Glu Ala Ala Glu Arg Arg Ala Phe Asn Met Pro

740 745 750

Val Gln Gly Thr Ala Ala Asp Leu Met Lys Leu Ala Met Val Lys Leu

755 760 765

Phe Pro Arg Leu Glu Glu Met Gly Ala Arg Met Leu Leu Gln Val His

770 775 780

Asp Glu Leu Val Leu Glu Ala Pro Lys Glu Arg Ala Glu Ala Val Ala

785 790 795 800

Arg Leu Ala Lys Glu Val Met Glu Gly Val Tyr Pro Leu Ala Val Pro

805 810 815

Leu Glu Val Glu Val Gly Ile Gly Glu Asp Trp Leu Ser Ala Lys Glu

820 825 830

Claims

1.一种环形RNA检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1.引物设计：从数据库中获得circRNA的序列和Splice junction序列，将Splicejunction位置的上游20bp和下游10bp共30bp序列输入引物设计软件中，搜索计算以使引物符合GC含量、Tm值常规的参数要求，并使包含不少于上游13bp和不多于下游7bp的序列，即跨越环化位点1~7个碱基，从而得到FSjod的上游引物，接着根据上游引物的参数和位置使用软件自动设计得到一条FSjod下游引物，获得FSjod Primers；

S2.逆转录反应：抽提样品中的总RNA，取0.1～1μg抽提的总RNA加入N6 RandomPrimer，RNase-Free H₂O混合，在温度为60～70℃反应5～10min，迅速冰浴2～3min，得反应液I；然后向反应液I中加入5×HT RT Buffer，将HT M-MLV Mix加入反应液I中，在温度为20～30℃条件下反应5～10min，升温至50～60℃条件下反应15～20min，再升温至80～90℃条件下反应5～10min，最后加入RNase-Free H₂O得到cDNA，-20℃保存备用；

S3.HS PCR扩增：使用步骤S1得到的FSjod Primers、2×SNP Taq Mix、50×ROX Mix^*、RNase-Free H₂O和步骤S2得到的cDNA进行qPCR检测，PCR扩增结束后，按照2^-△△Ct法计算环形RNA的表达量；所述HT M-MLV Mix包含逆转录酶HT M-MLV RNase H⁺和RNase Inhibitor，所述逆转录酶HT M-MLV RNase H⁺的突变型为A32V/E69K/L72R/E286R/E302R/T306L/W313F/W388R /L435R/N454K，所述逆转录酶HT M-MLV RNase H⁺氨基酸序列如SEQ IDNO.1；

所述2×SNP Taq Mix包括SNP Taq、dNTP和Mg²⁺，SNP Taq的突变型为V155A/ G418K/N483Q/S486Q/T539N/W604R/R660V/F667Y/M747R，所述SNP Taq氨基酸序列如SEQ ID NO.2；

所述步骤S2中逆转录中反应液I的组成包括：

实验材料体积

总RNA up to 12μL0.1~1 μg

N6 Random Primer 2μL

RNase-Free H₂O Up to 14 μL

所述步骤S2中逆转录中cDNA的组成包括：

实验材料体积

反应液I 14μL

HT M-MLV Mix 2μL

5× HT RT Buffer 4μL。

2.根据权利要求1所述的一种环形RNA检测方法，其特征在于，所述PCR扩增反应体系组成为：

实验材料体积

2×SNP Taq Mix 12.5μL

cDNA 2μL

Primer-F10μM 0.4 μL

Primer-R10μM 0.4 μL

50× ROX Mix* 0.4μL

RNase-Free H₂O 9.3μL

PCR反应条件为：1）预变性：95℃ 5 min；2）循环反应：40循环95℃ 10 s, 60℃ Xs；3）熔解曲线：95℃ 1 min，55℃ 1 min，55℃~98℃10s/cycle,0.5℃/cycle，其中50×ROX Mix需根据仪器选用。

3.一种环形RNA检测试剂盒，其特征在于，包括HT逆转录试剂和HS PCR扩增试剂，所述HT逆转录试剂包括HT M-MLV Mix、5×HT RT Buffer、N6 Random Primer和RNase-FreeH₂O；所述HS PCR扩增试剂包括权利要求1所述的2×SNP Taq Mix、50×ROX Mix和RNase-Free H₂O。

4.根据权利要求3所述的环形RNA检测试剂盒，其特征在于，所述HT M-MLV Mix包括权利要求1所述的HT M-MLV 200U/μL、RNase Inhibitor 40 U/μL、RNase-Free H₂O和50%甘油。

5.根据权利要求3所述的环形RNA检测试剂盒，其特征在于，5×HT RT Buffer包括150mM pH8.3的Tris-HCl、375 mM KCl、15 mM MgCl₂、10 mM dNTP和20 mM DTT。

6.根据权利要求3所述的环形RNA检测试剂盒，其特征在于，2×SNP Taq Mix包括2U/μLSNP Taq、10 mM dNTP、100 mM pH8.5的Tris-HCl、20 mM (NH₄)₂SO₄、4 mM MgCl₂、50 mMKCl、500 mM Glycine betaine、0.8% Tween-20、5% DMSO和10%甘油。