CN117230171B - 端粒扩增子测序用试剂盒及预文库构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开端粒扩增子测序用试剂盒及预文库构建方法。本发明设计了一种端粒特异性接头，其包括引物结合区和含有封闭基团的端粒特异性结合区，该端粒特异性结合区能够与端粒3’端悬臂的至少部分特异性结合。本发明的端粒特异性接头可识别完整端粒末端，并避免非完整末端被建库。此外，本发明在端粒序列附近的基因组序列上还设计了针对端粒扩增使用的端粒特异性PCR引物，在连接接头后不需要进行酶切处理，同时也不需要再在片段两端添加通用接头，进一步简化了实验流程。
Description
技术领域
本发明涉及基因测序，具体地涉及基于定点成环连接的端粒扩增子预文库的试剂盒及构建方法。
背景技术
端粒是位于真核生物线性染色体末端，由端粒DNA重复序列和相关蛋白质构成的复合物。由于线性染色体的DNA复制机制，使得细胞的每次分裂导致端粒缩短。端粒的变化与多种疾病密切相关，如癌症、早衰综合征等。因此尽可能准确的对端粒进行检测可以提供与疾病相关的重要信息。
由于端粒序列较长，且其中含有大量6碱基简单重复序列，人端粒序列的重复单元为TTAGGG(forward strand)/CCCTAA(reverse strand)，总长度约2kb-20kb，使用二代测序(NGS，代表平台为Illumina、MGI)无法测通，只能使用针对长片段测序方法(比如纳米孔测序技术)对长度在5kb以上的片段进行序列测定。
在上述测序中的常规建库方法依然存在无法区分完整端粒末端和基因组断裂端点的问题，由于基因组在提取过程中会造成大量断裂端点，此外还会存在一定量的不完整端粒末端，数量远远多于完整的端粒末端，常规的端粒建库方式无法有效地对其进行区分，将会导致这一类的建库方法无法对完整或长片段端粒序列进行有效富集，长片段端粒序列占比极低，短片段偏好严重，导致文库有效数据占比低下，会造成测序数据量的极大浪费，同时也极易导致纳米孔测序失败，很难测到准确的端粒序列和真实的长度分布状态，严重影响后续分析和解读。
此外，由于三代测序等长片段测序平台的芯片孔数限制，常规建库方法直接建库很难测到端粒序列，很难通过加大数据量来弥补，因此测序时多在带有接头的文库基础上，使用设计的端粒特异性引物和文库接头上的另一条引物进行PCR扩增，进行端粒序列的富集，但因为提取时产生的断点数量较多，还有大量的不完整端粒末端，造成富集效率较低，测到的端粒序列很少，无法有效进行端粒序列测定。另外，存在多个染色体末端序列未确定，也存在染色体的末端序列不能找到理想的引物序列，因此此方法也有局限，只能测定部分染色体的端粒序列，且其比例异常。
目前仍需要一种基于定点成环连接的端粒扩增子预文库的构建方法及试剂盒。
发明内容
针对现有技术中存在的至少部分技术问题，本发明人设计了基于定点成环连接的端粒特异性接头，该端粒特异性接头可识别完整端粒末端，并避免非完整末端被建库。同时，本发明利用端粒特异性的PCR外侧引物进行巢式扩增，获得完整端粒扩增子预文库。具体地，本发明包括以下内容。
本发明的第一方面，提供一种基于定点成环连接的端粒扩增子预文库构建试剂或试剂盒，其包含端粒特异性接头和端粒特异性PCR引物，所述端粒特异性接头包括引物结合区和含有封闭基团的端粒特异性结合区，所述端粒特异性结合区包含能够与端粒3’端悬臂的至少部分特异性结合的序列。
在某些实施方案中，根据本发明所述的基于定点成环连接的端粒扩增子预文库构建试剂或试剂盒，其中，所述端粒特异性PCR引物包括SEQ ID No.1-12所示序列中的至少一种外侧引物和SEQ ID No.13-24所示序列中的至少一种内侧引物序列。
在某些实施方案中，根据本发明所述的基于定点成环连接的端粒扩增子预文库构建试剂或试剂盒，其中，所述端粒特异性接头序列的5’端具有磷酸化修饰。
在某些实施方案中，根据本发明所述的基于定点成环连接的端粒扩增子预文库构建试剂或试剂盒，其中，所述封闭基团选自双脱氧核苷、氨基、间臂、磷酸化基团中的任意一种。
在某些实施方案中，根据本发明所述的基于定点成环连接的端粒扩增子预文库构建试剂或试剂盒，其中，所述端粒特异性接头进一步包含非标准DNA或RNA类似物，其选自/iXNA_A/、/iXNA_T/、/iXNA_G/和/iXNA_C/中的至少一种。
在某些实施方案中，根据本发明所述的基于定点成环连接的端粒扩增子预文库构建试剂或试剂盒，其中，所述端粒特异性结合区具有高于55℃的Tm值。
在某些实施方案中，根据本发明所述的基于定点成环连接的端粒扩增子预文库构建试剂或试剂盒，其中，所述引物结合区对应的引物序列的Tm值在55℃-70℃之间。
在某些实施方案中，根据本发明所述的基于定点成环连接的端粒扩增子预文库构建试剂或试剂盒，其中，所述端粒特异性结合区的长度为5-30nt。
本发明的第二方面，提供一种基于定点成环连接的端粒扩增子预文库的构建方法，其包括以下步骤：
(1) 使包含端粒3’悬臂的样本片段与本发明所述的试剂或试剂盒中的端粒特异性接头混合，在适于杂交的条件下进行杂交得到杂交体；
(2) 在环化酶的作用下，使所述杂交体中的端粒特异性接头末端与端粒3’悬臂末端连接成环；
(3) 使用本发明所述的试剂或试剂盒中的端粒特异性接头引物和端粒特异性PCR引物对步骤(2)得到产物进行扩增，得到所述基于定点成环连接的端粒扩增子预文库。
在某些实施方案中，根据本发明所述的基于定点成环连接的端粒扩增子预文库的构建方法，其中，步骤(3)中的扩增包括：
a. 使用本发明所述的试剂或试剂盒中的端粒特异性PCR引物的外侧引物和用于扩增端粒特异性接头的外侧引物进行第一扩增；和
b. 使用本发明所述的试剂或试剂盒中的端粒特异性PCR引物的内侧引物和用于扩增端粒特异性接头的内侧引物进行第二扩增。
本发明设计的基于定点成环连接的端粒特异性接头、预文库及其制备方法高效地富集了完整端粒末端序列，从而有效地对其进行序列测定，更真实准确地展示各染色体端粒长度的分布状态，实现更准确的关联分析和解读。此外，本发明在端粒序列附近的基因组序列上还设计了针对端粒扩增使用的端粒特异性PCR引物，在连接接头后不需要进行酶切处理，同时也不需要再在片段两端添加通用接头，进一步简化了实验流程。
附图说明
图1示出了根据本发明的基于定点成环连接的端粒扩增子预文库的制备方法。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为具体公开了该范围的上限和下限以及它们之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
本说明书中提供了相应引物或探针的具体序列，同时根据相关规定，本申请还提供了计算机可读形式的序列表。需要说明的是，计算机可读形式的序列表中的序列仅供参考，在本说明书中的序列与计算机可读形式的序列表中的序列不一致的情况下，以本说明书中的序列内容为准。
在以下关于序列的描述中，除非另有说明，序列的方向为5’-3’。
端粒扩增子预文库构建试剂或试剂盒
本发明一个方面，提供一种基于定点成环连接的端粒扩增子预文库构建试剂或试剂盒，其包含端粒特异性接头和端粒特异性PCR引物。端粒特异性PCR引物用于扩增端粒相邻区域，其是针对端粒序列附近的基因组序列上端粒进行扩增所使用的端粒特异性PCR引物。在优选的实施方案中，用于扩增端粒相邻区域的引物选自以下的至少一种或组合：SEQID No.1的外侧引物和SEQ ID No.13的内侧引物、SEQ ID No.2的外侧引物和SEQ ID No.14的内侧引物、SEQ ID No.3的外侧引物和SEQ ID No.15的内侧引物、SEQ ID No.4的外侧引物和SEQ ID No.16的内侧引物、SEQ ID No.5的外侧引物和SEQ ID No.17的内侧引物、SEQID No.6的外侧引物和SEQ ID No.18的内侧引物、SEQ ID No.7的外侧引物和SEQ ID No.19的内侧引物、SEQ ID No.8的外侧引物和SEQ ID No.20的内侧引物、SEQ ID No.9的外侧引物和SEQ ID No.21的内侧引物、SEQ ID No.10的外侧引物和SEQ ID No.22的内侧引物、SEQID No.11的外侧引物和SEQ ID No.23的内侧引物、SEQ ID No.12的外侧引物和SEQ IDNo.24的内侧引物。
本发明中，端粒特异性接头可用于端粒，特别是长片段端粒，尤其是人类完整端粒末端序列的碱基序列分析。本发明中，特异性是指该接头能够特异性结合(或锚定)至完整端粒末端，定点成环是指端粒特异性接头的末端在环化酶的作用下与端粒的3’悬臂末端连接成环。
本发明的端粒特异性接头为单链接头，其包括第一引物结合区和含有封闭基团的端粒特异性结合区，所述端粒特异性结合区包含能够与端粒3’端悬臂的至少部分特异性结合的序列。本发明所用术语“悬臂(overhang)”有时也可以称为悬突、悬端等，是指位于端粒双链中3’端向外侧突出延伸形成的一段单链核苷酸序列。完整的端粒末端通常存在6-300碱基长度的单链“3’ overhang”。在一个优选的实施方案中，本发明的端粒特异性结合区能够与端粒3’端悬臂的5-30个碱基的区域，优选6-20个碱基，还优选7-16个碱基，更优选8-15个碱基，例如8、9、10、11、12、13、14、15个碱基的区域特异性结合。在具体实施方案中，所述端粒特异性结合区的序列选自SEQ ID No.27(CCTAACCCTAAC)和SEQ ID No.28(TAACCCTAACCCTA)中的任意一种或其组合。
本发明所用术语“结合”、“锚定”、“互补”和“杂交”可互换使用，其指两个核苷酸之间配对的能力。即，如果在核酸的给定位置处，核苷酸能够与另一个核酸的核苷酸氢键键合，那么这两个核酸被认为在该位置处与彼此互补。两个单链核酸分子之间的互补性可以是“部分的”，也可以是完全的。
本发明的“特异性杂交”是指在限定的严格条件下，与存在于杂交混合物中的其他核苷酸序列的基本结合不存在时，核酸与靶核苷酸序列的结合。本领域技术人员可以理解，适当的杂交条件允许序列错配的存在。在具体实施方案中，在严格杂交条件下进行杂交。
本发明的端粒特异性接头的5’端具有磷酸化修饰，优选地，该5’端与端粒的3’overhang形成环结构，并可结合1-2个引物。
本发明的端粒特异性接头的第一引物结合区含有引物结合位点，优选巢式引物结合位点。在一个优选的实施方案中，引物结合区含有2条巢式引物的结合位点。本发明人通过研究发现，相较于在引物结合区设置1条引物结合位点，设置2条巢式引物的结合位点能够显著去除背景噪音，从而进一步富集完整端粒序列。
在一个优选的实施方案中，端粒特异性接头的第一引物结合区所对应的巢式引物包括第一引物(外侧引物)和第二引物(内侧引物)，第一引物的序列如SEQ ID No.25所示(GACTGGTCCATATGACTTGC)，第二引物的序列如SEQ ID No.26所示(GCATATGGCATTCTGTCATCC)。
本发明的端粒特异性接头的3’端含有封闭基团，以防止其在聚合酶作用下进行延伸。优选地，封闭基团选自以下中的任意一种：双脱氧核苷(例如ddA、ddG、ddC、ddT)、氨基、间臂(C3 spacer、C6 spacer、C12 spacer)、磷酸化基团。接头3’末端的封闭修饰具有以下双重作用：(1)保证接头自身不会在环化酶的作用下进行环化；(2)阻止接头3’端在聚合酶的作用下以端粒单链区域为模板进行延伸。
本发明的端粒特异性接头进一步包括非标准DNA或RNA类似物，其选自/iXNA_A/、/iXNA_T/、/iXNA_G/、/iXNA_C/中的至少一种，其中，其中/iXNA_A/是指对碱基A进行修饰；/iXNA_T/是指对碱基T进行修饰；/iXNA_G/是指对碱基G进行修饰；/iXNA_C/是指对碱基C进行修饰，XNA为非标准DNA和RNA类似物，包含但不限于锁核酸LNA。本发明中，在XNA为锁核酸的情况下，本发明的端粒特异性接头可含2-8个XNA碱基，优选3-5个XNA碱基。
本发明的端粒特异性接头序列的Tm至少高于55℃，优选58℃，还优选60℃以上，最优选65-70℃，例如65、66、67、68、69、70℃。
本发明的端粒特异性接头可用于待测样本中核酸的扩增和富集，“扩增”包含通过其复制了至少一种靶核酸的至少一部分的任何方法，典型地以模板依赖性的方式，包括且不限于用于线性地或指数地扩增核酸序列的技术。用于进行扩增步骤的非限制性方法包括连接酶链式反应(LCR)、连接酶检测反应(LDR)、聚合酶链式反应(PCR)、引物延伸、链置换扩增(SDA)、多重置换扩增(MDA)、基于核酸链的扩增(NASBA)、多重扩增、滚环扩增(RCA)等。
本发明所用术语“样本”涉及包含一种或多种所感兴趣的分析物的材料或材料混合物，通常但不一定为液体形式。本发明的样本含有核酸样本，核酸样本可以是复杂样品，其包含多种不同的含有目的序列的分子，这样的样本可具有多于10、50、100或200个不同的核酸分子。
本文中，核酸样本包含DNA片段，DNA片段可源于任何来源，例如基因组DNA、cDNA(来自RNA)、cfDNA、ctDNA或人工DNA构建体或人工片段化DNA片段。本文可以采用含有DNA片段(例如基因组DNA)的任何样品，包括但不限于血液、组织样品或FFPE样品。优选地，本发明中基因组DNA片段源自人基因组DNA。
在一个优选的实施方案中，本发明的试剂盒进一步包括用于扩增端粒特异性接头的引物，优选地，所述引物包括外侧引物和内侧引物，其中，所述外侧引物具有SEQ IDNo.25所示的序列，所述内侧引物具有SEQ ID No.26所示的序列。
除了上述组分，本发明的试剂盒可选地包括用于巢式PCR反应或高通量测序用试剂。用于巢式PCR反应的试剂包括那些常规PCR使用的任何试剂，例如聚合酶、缓冲液等。
除了上述组分之外，本发明的试剂盒还可包括与调控制造、使用或销售试剂盒相关的注意事项。另外，本发明的试剂盒还可提供有使用、储存和故障排除的详细说明书。试剂盒还可任选地设置在适合的优选用于以高通量设置的机器人操作的装置中。
在某些实施方案中，本发明的试剂盒的组分可以溶液形式提供，例如水溶液的形式提供。在以水溶液状态存在的情况下，这些成分的浓度或含量是本领域技术人员能够根据不同需求而方便地确定的。例如，用于储存的目的时，例如组分的浓度可以较高的形式存在，当处于工作状态或使用时，可通过例如稀释上述较高浓度的溶液来将浓度降低至工作浓度。
在试剂盒中存在超过一种组分的情况下，该试剂盒还通常会包含可单独放置另外的组分的第二、第三或其它另外的容器。另外，可在容器中包含各多种组分的组合。本文所述的任何组合或试剂可为试剂盒中的组分。
端粒扩增子预文库构建方法
本发明提供一种基于定点成环连接的端粒扩增子预文库的构建方法，其包括使用本发明的端粒特异性接头的步骤，下面进行详细说明。
步骤(1)
在步骤(1)中，首先使包含端粒3’悬臂的样本片段与本发明的端粒特异性接头混合，在适于杂交的条件下进行杂交得到杂交体。可以理解的是，样本片段可以包含末端携带3’ overhang的完整端粒以及不含有3’ overhang的非完整端粒或其它基因组片段。
在一个优选的实施方案中，单链端粒特异性接头序列为AGGATGACAGAATGCCATATGCAAGTCATATGGACCAGTCAATTAACCCTAACC/iXNA_C//iXNA_T//iXNA_A/。在另一个优选的实施方案中，单链端粒特异性接头序列为AGGATGACAGAATGCCATATGCAAGTCATATGGACCAGTCAATAA/iXNA_C/CT/iXNA_A/ACC/iXNA_C/TA/iXNA_A/C。
本发明中，适于杂交的条件下是指温度为60-75℃，例如60、62、64、66、68、70、75℃等。
步骤(2)
本发明的步骤(2)中，在环化酶的作用下，使所述杂交体中的端粒特异性接头末端与端粒3’悬臂末端连接成环。优选地，在连接成环反应中，端粒特异性接头的5’端与端粒的overhang单链区域末端进行单链成环，从而将接头连接至端粒3’overhang单链区域的末端。环化酶可以采用本领域已知的单链DNA环化酶，优选商品化CircLigase，例如单链DNA环化酶CircLigase II。
本发明的端粒特异性接头由于添加了XNA碱基，提高了其Tm值和结合效率，当其结合至端粒末端的单链区域后，此接头的5’端与端粒3’端单链区域的3’末端距离拉近，通过单链DNA环化连接酶CircLigase介导模拟成环进行连接，若接头不含3’端的端粒特异性结合区，则单链DNA环化连接酶的效率极低，几乎不会进行分子间的连接，也不会将接头连接至端粒的3’末端。
本发明的上述步骤(1)和(2)可同时进行，即待测样本、端粒特异性接头、单链DNA环化连接酶和可选的适于连接反应的物质(如金属离子、甜菜碱、缓冲液)等可以置于同一体系内进行连接反应。
本发明的步骤(3)中，使用本发明所述的试剂或试剂盒中的端粒特异性接头引物和端粒特异性PCR引物对步骤(2)得到产物进行扩增，得到所述基于定点成环连接的端粒扩增子预文库。优选地，步骤(3)所述的扩增包括：a. 使用本发明所述的试剂或试剂盒中的端粒特异性PCR引物的外侧引物和用于扩增端粒特异性接头的外侧引物进行第一扩增；和b.使用本发明所述的试剂或试剂盒中的端粒特异性PCR引物的内侧引物和用于扩增端粒特异性接头的内侧引物进行第二扩增，具体参见图1。
本发明的预文库适合在长片段测序平台进行测序，包括但不限于OxfordNanopore Technologies(ONT)公司的Nanopore、Pacific Biosciences(PacBio)公司的Sequel II等。本领域技术人员将理解，依据测序平台对应的试剂盒的操作说明，在添加含index序列的测序接头后可以进行高通量测序过程。
需要注意的是，在本发明的步骤(1)-(3)前后，或步骤之间还可包含其他步骤或操作，例如进一步优化和/或改善本发明所述的方法，例如在每个步骤完成之后进一步对产物进行纯化的步骤。
实施例
以下示出了使用本发明设计的端粒特异性接头以及端粒特异性接头引物用于人类完整的端粒末端序列的方法。
一、样本信息
本实施例使用的样本为选用EDTA抗凝管采集的全血样本，4℃短期保存，-20℃长期期保存(人类的其他DNA亦可用于实验，例如从组织、口腔拭子、各种体液，只要保存条件较好的样本中提取的基因组DNA均可用于本发明)。
二、实验步骤
1. DNA提取
颠倒混匀全血样本后吸取200µl至1.5ml离心管中，使用Magbead Blood DNA Kit(CW2361S)，参照试剂盒说明书步骤进行基因组DNA提取。提取后的基因组DNA使用Nanodrop2000和Qubit® RNA HS Assay Kit及Qubit3.0 Fluorometer进行定量，Qubit浓度为508ng/µl，OD260/280=1.827。进行琼脂糖凝胶电泳，基因组DNA片段主要分布≥23kb。
2. 端粒3’单链末端连接端粒特异性接头
在1个新的0.2ml PCR管中配制反应体系Mixture，试剂在冰上配制，具体见下表1：
表1
混匀并离心，PCR仪60℃过夜反应(热盖75℃)。立即加入36µl(1.8×)VHATS DNAClean beads(N411-02)进行纯化，42µl无核酸酶水回溶得到产物1。ssAdaptor(10µM)序列包括以下中的任意一种：
ssAdaptor plus-1：AGGATGACAGAATGCCATATGCAAGTCATATGGACCAGTCAATTAACCCTAACC/iXNA_C//iXNA_T//iXNA_A/。
ssAdaptor plus-2：AGGATGACAGAATGCCATATGCAAGTCATATGGACCAGTCAATAA/iXNA_C/CT/iXNA_A/ACC/iXNA_C/TA/iXNA_A/C。
3. 端粒片段巢式扩增
3.1 以下为本发明设计的端粒特异性PCR引物组合(方向5’-3’)：
P1-Outer：GCATCTCTAGTGCTGGAGTGGATGG(SEQ ID No.1)；
P2-Outer：CCACCTAGGCCAATCCACTG(SEQ ID No.2)；
P3-Outer：TTCTGTCCTGGGATACTCCACATC(SEQ ID No.3)；
P4-Outer：GAAGATTTGAGGTGCAGTAGTGGG(SEQ ID No.4)；
P5-Outer：ACGGAGTTTCGCTCTTGTTGC(SEQ ID No.5)；
P6-Outer：TACCAGAGTGGATTCGGATTGA(SEQ ID No.6)；
P7-Outer：CACATAGCACGGATAAGGAGGACA(SEQ ID No.7)；
P8-Outer：CTTCCCAACATTCTCATGCTCT(SEQ ID No.8)；
P9-Outer：GGGTGTTGGGATCGCTGGTACAGA(SEQ ID No.9)；
P10-Outer：AGCCCAAGCATTATCTCCAGG(SEQ ID No.10)；
P11-Outer：GCCACCATATCATACTCGGAAGG(SEQ ID No.11)；
P12-Outer：CGGTGCAAATCAAGTTCCGAAGG(SEQ ID No.12)；
P1-inner：TGAGGAGGTCCCACAAGGCTAA(SEQ ID No.13)；
P2-inner：GGACACGGGAAGTCTGGGCTAA(SEQ ID No.14)；
P3-inner：AGTTTGCCTTCTCCAGTGTCTCAT(SEQ ID No.15)；
P4-inner：AGCACAGTAGACAAGGGTAAGGTT(SEQ ID No.16)；
P5-inner：CAATCTCGGCTCACCATAACC(SEQ ID No.17)；
P6-inner：CAATCAGCCCACTCCTCCCTA(SEQ ID No.18)；
P7-inner：CGTAGACAAGCGGGTCCTGTAGTT(SEQ ID No.19)；
P8-inner：AACCACAAGGCTTAGACATTCG(SEQ ID No.20)；
P9-inner：TGAAGCGGGAAGGCTGGACACC(SEQ ID No.21)；
P10-inner：GTGTCGGAGGTGATTTCATAGTTG(SEQ ID No.22)；
P11-inner：ACTGCTCCCTTTGCCACGAT(SEQ ID No.23)；
P12-inner：CCTCCCAGACCCACGACTCACA(SEQ ID No.24)。
3.2端粒特异性PCR引物及扩增的端粒区域关系见下表2：
表2
扩增区域中的E 为chromosome end；S为chromosome start，例如10E为chr10，end；XS为chrX，start。
3.3第一轮PCR
使用TaKaRa LA Taq® with GC Buffer(TaKaRa，RR02AG)，在1个新的0.2ml PCR管中配制反应体系Mixture，具体见下表3：
表3
按照下表程序进行PCR反应，得到产物3，见下表4。
表4
3.4第二轮PCR
使用TaKaRa LA Taq® with GC Buffer(TaKaRa，RR02AG)，在1个新的0.2ml PCR管中配制反应体系Mixture，具体见下表5：
表5
按照下表程序进行PCR反应，然后加入30µl(0.6×)VHATS DNA Clean beads进行纯化，30µl无核酸酶水回溶得到产物4，见下表6：
表6
4. 端粒片段筛选
通过琼脂糖凝胶电泳对产物4进行≧2Kb片段筛选，使用Gel Extraction Kit(OMEGA，D2500-02)进行回收，得到产物5。
5. Nanopore预文库构建及上机测序
将经过片段筛选的富集端粒片段(产物5)使用PCR Barcoding Kit(Nanopore，SQK-PBK004)进行预文库构建及上机测序。其中PCR扩增反应使用TaKaRa LA Taq® withGC Buffer(TaKaRa，RR02AG)进行。
测序获取的端粒序列示例如SEQ ID No.31所示：
CAAATGGCTGTGGTCAGTTTTGTGAATTTGGGTGTTTATGATGTCGCCCTACCGTGACAAAGAAAGTTGTGATATCTTTTGTGACTTGCCTGTCCTTTCTATCTTCAGCGTCTGCTTGGGTGTTAACATGAGGAGGTCCCTAAG GCTAAGTGGGGCAAGTCCAAAGGACCTGGGCAGTAGCAGGAAGATGGGAAAAAGCATAGACTTGAGACAGAGGCAGGAATGTGAAGAAATTGGCTGAAGGTTGGACTCTTAGGCTGTTTTCATGCACTATGAACCCACTCCTCCTATTTTCCTACAATAGCTCTTTACACTGTTTCTTTGTGGGATTGTAATATTCCATCTTTGTACCTCTTGGTGAATCTTTCTTCAAGTTAATAGCTTTGGGACATCAGCTCTCCCCAGTAATAGCTCCTTTTCAGTTTTAATTTACAGGGCAGTGGGGATTAATAACTGGCGCTCTGGCTTTGAAGTGTGGTGCGGAGGCGACTGATGAGGACGCCAGCCGTCACCAGGGCAAGAGGGCCTGGCAGTCCCCATCTGCCTGCATGTGGCGTGCAGCCACGACAGTGTCAACAAGAGGGCCCGGCAGTGTCCCTAGCTGCAGCAGGAGCAGGCACCTTCACGCCAGGCTGGGCCTGCAGTGTCCTCTGCTTTGCAGGAGGTGGCGTAGGGGGCACCACCATGAGCAGAGGACCATTGGTGCCCTGGTTGCCAGCAGGGGCGTGCTGCCACCACTGAGCAAGAGGATCACTGTAGTGCCCCAGCGGACAGAAGAGGGCGTGCCCCGACTACACTGCAAGCAGGGCGGCAGTGTCCCAGCTGCCAACAGAAGGCATGCCACGCGCACTAGACAGGGGCCGGCAGTGTCCCCAGCTGCCAGCAGGCAGGTGTGCTGCCACTACAATGAGCAGGAGGCCCTGAAATGTCCTGGACATGTGACGGCGTGCCGCCGGTATACTGGACAGAGAGCCCTGCCGTGCCCGTCGCCAGCAGGGCTGGAGGATGCTGTAAGGAAGAGGGCCCTGAAGTTGCCTAGTCGCCAGCACGGGGCGCAATGGCGCTGCCGTGGGCAGCGGATTCCTGTAGTGCCCGGGTACAAGCAGGGACACCCGGAGCCGGGCTTTTCAGATTACTCCAGGTTCCACCCGTCTGTGCGGCGCCGCCGAGGACGTGTGTCTCTGCGTACCACCTCGCCATTCCGCGCTCCCGCCCGGCGGCGTGCAACTGTACACCTGCAACACGCCCCGCGCCTGACCCAGCGACGTGCGTGCGCCTGCGCCTGCGCCGCGCCTCCTCCTACCTTGTGACCCGCATTGCCGGGGACGCGGGCTGCGTCTATGCCCTGCGCCGCGTCGCCACGAACGGCTCCTGCGCCGGCGCGGCGCCTACGCCGGCGCCAGCGCGCCGTTCTTTGCAGGCGGGTTGGGTTCTCCTCAAACAGCACAGACGCGGAGAGCATCGCGAGGGCGTTCTCATCTGCACAGATTTCAGTGGTACTCTGCGAAGGCGGGCAGAGTTCTCCTCAGGTCAGACCGGGCGGGCGGGCTGAGGGCACCGCGAGGGCGGGCTGCGTTCTGTAGCACAGACCTGGGGACACCTGGCAGGTGGAGCAGCATTCTCCTACCAGCACAGACGTTGGGGGCACTGCACAGCTTTGGACAACTAAGGACATCGACAGTGAATAAAATCTTTCAGTTGCAGCCGTTAATAATCAAGGTCAGAGACCAGTTGAGAACGGTTCGGTGTGGAAAACAGGAAACCAAAAGCCCCCTCTGAATCTGCGCACCAGTTCTCCCAAGTCCAAGACGAGGGCTGCATTGCAGGGGCCAACTGCAGTGTCCAGGTTGCAAATGCAGCATTCCTAATGCACACATGACACAAAAATATAACACCACATTGCTCATGTGGTTTGGGTCAGACAGAGTTAGGGGTTAGGGGTTGGATTAAAGTTGGGGTTAGGAGTTGGGGTTAAGGTTAGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTGAGAGGGTTAGAGAGGGCTGGGGGTTGAAAGGGTTGAATGGAATGGGGTTAGGGTTAGGGTTGAGTTGGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGAGAGATGGGGTTAGGGTTGGGGTTAGAGTTGGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGTTGAGTTAGGGTTGGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGTTAGGGTTAGGGTAGGGTTAGGAGTTAGGGTCAGGATTAGGGTTTAGGGTTAGGGGTCAGGGGTCGGGTCAGGTTAGAGGTTAGGAGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTCAGGGTCGGGTCCGGGTAGGGGTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTGAGGTTAGGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTATAGGGTTAGGGTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGG…… …… …… …… …… …… …… …… …… …… …… ……TTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTGGAGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGAGTTAGGGTTAGGAGTTGAGGTTAGGGTTAGGGTTGAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTGAGGTTAGGAGTTAGGGTTAGGTTAGGGTTAGGGTTAGGTTAGGGTTAGGAGTTGCAGGGTTAGGTAGGGTTAGGGTTAAGTTAGGTTAGAAGTTAGGTTAGGTTAGGGTTAGGTTAGAGGTAGAGTTAGGTTAGGAGTTGAGTTAGGGTTAGGGTTAAGTTAAAGGTTAGAGTTTAGGTTAAAGTTAGGAGACTGGACTGTAAAGAAAATTTAGAGTTAGAAAGTTAGTTAGGTTAAGTTAGGGTTAGGGTTAGTTGGGTTAGGGTTAGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGAGTTGGTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGAGTTAGAGTTAGGAAGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGAGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAACGGGGTTAGGGTTGGGGTTAGGTTGAGGTTAGAGTTAGGTTGGGGTTAGGGTTGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGAGTTAGGGTTAGGGTTAGGGGTTAGGTTGAGGTTAGGGTTGGGGTTAGAGGGTTAGGGTTAGAGGATGACAGAATGCCATATGCAGTTAAACACAGCTTGAGCACAATATCAACACCAACAGAAACAAAGACTTTGTTATTTCTTTCTTGT。其中省略号表示TTAGGG重复单元，位于5’端的横线标注的序列表示端粒特异性PCR引物P1-inner，位于3’端的横线标注的序列表示完整端粒特异性接头内侧引物。
因为本发明设计的接头的3’端序列可定量与端粒的3’overhang单链区域互补结合，因此可识别完整端粒末端，基因组DNA提取过程中产生的断裂端，或者非完整的端粒(双链DNA)都不具有此特点，因此不会产生接头的连接。此外，本发明在端粒序列附近的基因组序列上还设计了针对端粒扩增使用的端粒特异性PCR引物，在连接接头后不需要进行酶切处理，同时也不需要再在片段两端添加通用接头，进一步简化了实验流程。
本发明能够显著提高端粒序列占比，经实验测定，常规建库(Y型接头)的端粒序列占比约0.4%，本申请的方法测定的端粒序列占比约12-18%。
尽管本发明已经参考示例性实施方案进行了描述，但应理解本发明不限于公开的示例性实施方案。在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的示例性实施方案做多种调整或变化。权利要求的范围应基于最宽的解释以涵盖所有修改和等同结构与功能。
Claims (5)
1. 一种基于定点成环连接的端粒扩增子预文库构建试剂或试剂盒，其特征在于，包含端粒特异性接头和端粒特异性PCR引物，所述端粒特异性PCR引物包括SEQ ID No.1-12所示序列中的至少一种外侧引物和SEQ ID No.13-24所示序列中的至少一种内侧引物序列，所述端粒特异性接头包括引物结合区和含有封闭基团的端粒特异性结合区，所述端粒特异性结合区包含能够与端粒3’端悬臂的至少部分特异性结合的序列，所述端粒特异性接头序列的5’端具有磷酸化修饰，该5’端在环化酶的作用下与端粒的3’悬臂的末端形成环结构，所述引物结合区含有巢式引物结合位点，所述端粒特异性结合区具有高于55℃的Tm值，所述引物结合区对应的引物序列的Tm值在55℃-70℃之间，所述端粒特异性接头的3’端含有封闭基团，所述端粒特异性接头进一步包含非标准DNA或RNA类似物，其选自/iXNA_A/、/iXNA_T/、/iXNA_G/和/iXNA_C/中的至少一种，其中/iXNA_A/是指对碱基A进行修饰；/iXNA_T/是指对碱基T进行修饰；/iXNA_G/是指对碱基G进行修饰；/iXNA_C/是指对碱基C进行修饰，所述端粒特异性接头序列为AGGATGACAGAATGCCATATGCAAGTCATATGGACCAGTCAATTAACCCTAACC/iXNA_C//iXNA_T//iXNA_A/，或AGGATGACAGAATGCCATATGCAAGTCATATGGACCAGTCAATAA/iXNA_C/CT/iXNA_A/ACC/iXNA_C/TA/iXNA_A/C。
2.根据权利要求1所述的基于定点成环连接的端粒扩增子预文库构建试剂或试剂盒，其特征在于，所述封闭基团选自双脱氧核苷、氨基、间臂、磷酸化基团中的任意一种。
3.根据权利要求1所述的基于定点成环连接的端粒扩增子预文库构建试剂或试剂盒，其特征在于，所述端粒特异性结合区的长度为5-30nt。
4.一种基于定点成环连接的端粒扩增子预文库的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1) 使包含端粒3’悬臂的样本片段与权利要求1-3任一项所述的试剂或试剂盒中的端粒特异性接头混合，在适于杂交的条件下进行杂交得到杂交体；
(2) 在环化酶的作用下，使所述杂交体中的端粒特异性接头末端与端粒3’悬臂末端连接成环；
(3) 使用权利要求1-3任一项所述的试剂或试剂盒中的端粒特异性接头引物和端粒特异性PCR引物对步骤(2)得到产物进行扩增，得到所述基于定点成环连接的端粒扩增子预文库。
5. 根据权利要求4所述的基于定点成环连接的端粒扩增子预文库的构建方法，其特征在于，步骤(3)中的扩增包括：
a. 使用权利要求1-3任一项所述的试剂或试剂盒中的端粒特异性PCR引物的外侧引物和用于扩增端粒特异性接头的外侧引物进行第一扩增；和
b. 使用权利要求1-3任一项所述的试剂或试剂盒中的端粒特异性PCR引物的内侧引物和用于扩增端粒特异性接头的内侧引物进行第二扩增。
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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