CN104105796A - 组合不同温度步骤的核酸转录扩增方法 - Google Patents

组合不同温度步骤的核酸转录扩增方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及转录扩增方法，其中：a)使至少一种存在于生物学样品中的靶核酸与以下化合物接触：扩增引物，进行扩增需要的所有试剂，包括参与扩增的酶，以及至少一种用以稳定实施扩增所需要酶的多元醇，b)在44℃以上的温度加热混合物，c)在44℃以上的温度实施靶核酸转录扩增。本发明还涉及检测通过扩增方法获得的扩增子的方法，对待测靶核酸进行预处理的方法，以及体外诊断存在所述靶核酸的方法。本发明优选应用于医学诊断领域。

Description

组合不同温度步骤的核酸转录扩增方法
本发明涉及一种方法，其中通过转录扩增方法对存在于生物学样品中的至少一种靶核酸进行扩增，所述方法可组合不同温度的步骤，即本质上是变性和扩增。
现有技术包括一些研究多元醇对酶热稳定化作用的科学论文。尤其是这些例子：
-Lee在1981年发表于J.Biol.Chemistry256(14)：7193-7201，题目为“蔗糖对蛋白的稳定化”的论文，其描述了蔗糖对α-糜蛋白酶、糜蛋白酶原和RNA酶的热稳定化作用。
-Bernier在1988年发表于J.Biotechnol.7：293-298，题目为“多元醇对α-葡萄糖苷酶的稳定化”的论文，证明多元醇对α-葡萄糖苷酶的热稳定化作用。
-Carninci在1998年发表于Proc.Natl Acad.Sci.95：520-524，题目为“海藻糖对不耐热酶的热稳定化和热活化及其用于全长cDNA的合成的应用”的论文，其提出海藻糖对逆转录酶和限制性内切酶的热稳定化作用。
-Spiess在2004年发表于Clinical Chemistry50(7)：1256-1259，题目为“海藻糖是一种有效的PCR增强剂：二糖海藻糖降低DNA的解链温度和热稳定化taq聚合酶”的论文，文中证明了海藻糖对Taq聚合酶的热稳定化作用。
因此，很明显，大约三十年来，许多研究者对多元醇对酶的热稳定化作用感兴趣。此外，十五年前提交的专利申请EP-A-0821058提供了一种用于在高温下提高酶活性的方法。相应的专利要求保护多元醇用于热稳定化聚合酶和限制性内切酶的用途。
虽然科学家感兴趣，但似乎没有人尝试在NASBA、TMA等的转录扩增中，采取这种方法。此类方法施行中，都要用到多种不同酶的活性。第一个步骤包括靶在65℃下进行2分钟变性，所述靶为核酸，通常为核糖核酸(RNA)。第二个步骤自身包括添加需要的酶，用于在41℃下进行等温扩增。由于要依次使用两个温度，这两个步骤使得该方法对使用者而言存在技术上的局限性。
此外，使用单一温度(41℃)目前造成了各种问题，比如，扩增富含鸟嘌呤和胞嘧啶的靶，后者具有难以扩增二级结构。用转录扩增技术使这些二级结构易于扩增的最熟知方法是在扩增混合物中使用第五种核苷酸，即三磷酸核糖核苷(K Nakahara et al.Nucleic Acids Res 1 April1998，26(7)：.1854-1856)。
用核酸序列的扩增(NASBA)技术，易于使用脱氧核糖核酸(DNA)靶。要实现这些要做的就是，例如，预先将根据EP-B-0397269或专利申请WO-A-02/070735的方法应用于已处理的样品，使DNA靶能够进行扩增。
虽然本领域技术人员用两个具有不同温度的步骤进行这类DNA靶的转录已经几十年了。但是他们还没考虑到尝试提高所用酶的热稳定性来减少此类转录扩增方法的局限性。
因此本发明描述了转录扩增方法的简化，由于同时加入靶核酸和扩增试剂如缓冲液、酶或核苷酸，并存在热稳定化化学添加剂，该方法可在单一的步骤中实施，所述热稳定化化学添加剂使得使用更高扩增温度(达到所述靶核酸变性步骤所使用的温度)成为可能。这个效果是特别令人意想不到的且因此是令人惊讶的。
创新之处在于通过使用化学添加剂，例如多元醇，使T7RNA聚合酶，RNA酶H和AMV-RT的活性能够在高于41℃的温度能够得到保护，从而使所有的酶活性，特别是在NASBA扩增法中3种酶活性同时热稳定化，进而使变性和扩增的实验步骤能够结合起来。
本发明提供了一种转录扩增方法，其中：
a)将生物学样品中存在的至少一种靶核酸与以下化合物相接触：
·扩增引物，
·实施扩增所需要的所有试剂，包括参与扩增的酶，以及
·至少一种能稳定扩增所需要的酶的多元醇，
b)将混合物在41℃以上的温度加热，
c)在41℃以上的温度实施靶核酸的转录扩增。
根据所述扩增方法的一个实施方式，扩增在41至49℃之间的温度进行。
根据所述扩增方法的另一个实施方式，扩增在大于或等于46℃的温度进行。
所述扩增方法的任何实施方式中，所述酶提供的酶活性为：
·RNA聚合酶活性(T7、SP6等)，
·逆转录酶活性(AMV-RT、MMLV-RT等)，
·RNA酶H活性
RNA酶H活性可以由一个独立的酶(“单独的”活性)或有其它酶活性的酶(“组合的”活性)提供。这种与RNA酶H结合的其它活性可以由逆转录酶或RNA聚合酶或不同的酶提供。
酶的活性使实施等温扩增成为可能，如：
-NASBA(基于核酸序列的扩增)，
-TMA(转录介导的扩增)，
-3SR(自我持续序列复制)，
-SMART(信号介导的RNA扩增技术)，
-MDA(多重置换扩增)，以及
-任何涉及上述三种活性中至少一种且用于全基因组扩增或特定DNA或RNA序列的扩增的其它等温扩增。
所述扩增方法的任何实施方式中，多元醇是由下列一种化合物或这些化合物的组合构成：
·乳糖，
·山梨醇，
·蔗糖，
·甘露醇，以及
·海藻糖。
所述扩增方法的任何实施方式中，多元醇的浓度在0.4至1.5M之间。
本发明还涉及一种通过如上所述的扩增方法获得的扩增子的检测方法，其特征在于在步骤a)的过程中针对且可能存在于生物学样品中的每种待测靶核酸的添加至少一种检测探针，并实施以下附加步骤：
d)通过探针与溶液中每个扩增子的杂交检测步骤c)中所实施的扩增得到的扩增子的存在。
本发明还涉及一种对可能存在于生物学样品中的待测靶核酸进行预处理的方法，所述靶核酸用于根据权利要求1至5任一项所述的方法进行扩增，所述方法包括在步骤a)前实施下列附加步骤，其中对于RNA，将所述生物学样品置于低于或等于65℃的温度，而对于DNA将所述生物学样品置于低于或等于95℃的温度。
本发明还涉及一种对可能存在于生物学样品中的待测靶核酸进行预处理的方法，所述靶核酸用于根据权利要求1至5任一项所述的方法进行扩增，所述方法包括在步骤a)前实施下列附加步骤，其中将所述生物学样品置于为低于或等于49℃的温度。
本发明还涉及一种体外诊断一种或多种可能存在于生物学样品中的待测靶核酸的方法，包括：
a)实施预处理的方法，如上所述，
b)实施扩增的方法，如上所述，
c)实施检测的方法，如上所述。
根据诊断方法的一个实施方式，整个方法是在一个单一容器内实施的。
根据上述方法的一个实施例变型，整个方法是在41℃以上的单一温度实施的。
根据上述方法的一个实施例变型，整个方法是在46℃至49℃间的单一温度实施的。
这里的附图是作为解释性例子给出，并且没有限制性。它们将使更清楚地理解本发明成为可能。
图1表示在7.5cps/反应HIV-1B转录本(每个筛选进行七个重复)存在下，46℃下进行NASBA扩增的过程中热稳定化化合物(thermostabilizingcompound)的功能性筛选。其中：
-图1A浓度为0.21M的乳糖，
-图1B浓度为0.9M的麦芽糖，
-图1C浓度为0.05M的棉子糖，
-图1D浓度为1.2M的山梨醇，
-图1E浓度为0.6M的蔗糖，和
-图1F浓度为1.09M的松二糖。
图2描述了在不同温度和不同热稳定化化合物存在的情况下，3分钟预温育后，T7RNA聚合酶的残余活性(％)。
图3A描述了在不同温度和存在或不存在0.4M海藻糖的情况下，15分钟预温育后，T7RNA聚合酶的残余活性(％)。
图3B描述了在不同温度和存在或不存在0.4M海藻糖的情况下，25分钟预温育后，RNA酶H的残余活性(％)。
图3C描述了在不同温度和存在或不存在0.4M海藻糖的情况下，25分钟预温育后，AMV-RT的残余活性(％)。
图4为灵敏度(％)的测量，是在NASBA扩增HIV-1B型的过程中存在不同热稳定化化合物的情况下获得的，所述扩增为5cps/测试，没有靶变性阶段(N＝24)。应该注意，在46℃下，没有受益于热稳定化添加剂的参比不再能得到扩增。
虽然糖和，更普遍地，多元醇用于使酶热稳定是一条可以在文献中找到信息，但是在转录扩增(例如NASBA)中使用高浓度糖和多元醇，以在高于41℃，特别是在高于44℃并优选地高于46℃，且可能在高达49℃预温育的情况下进行等温扩增是一项技术进步，使为终端用户从技术上简化此类扩增成为可能。
虽然工作温度是在41至45℃之间，但是为了帮助结构化的靶变性，将NASBA扩增温度增加到46℃尤为必要，这样可以提高检测的水平。
下面的实施例使用了NASBA(基于核酸序列的扩增)转录和等温扩增的方法。然而，本发明中所描述的方法也适用于其他的等温扩增方法，如TMA(转录介导的扩增)或3SR(自我持续序列复制)例如(Gill and Ghaemi，2008，Nucleosides，Nucleotides and Nucleic Acids，27：224-245；Leone et al1998，NAR，26-9：2150-2155)。
NASBA技术是一种替代PCR的技术，不同于后者的是，它可以通过RNA扩增遗传性检测活的微生物(细菌，病毒等)。这种扩增技术需要3种酶的活性来进行，包括T7RNA聚合酶，RNA酶H和AMV-RT。这三种酶的活性中，T7RNA聚合酶是最热敏感的酶。
实施例1：选择与NASBA转录和等温扩增法兼容的热稳定化化合物
根据供应商推荐，在Nuclisens EasyQTM扩增平台(bioMérieux，Marcyl′Etoile，France)上进行的NASBA HIV-12.0扩增测试中，对一组具有热稳定化性能或视为有此类性能的化合物进行评估。在要评估化合物的存在或不存的情况下，将5cps到30cps的HIV-1B型转录本在各反应中用作靶，。
在所述化合物存在的情况下于46℃进行扩增能够证明该化合物对于NASBA反应是兼容的且有热稳定化作用的。
如图1A，1B，1C，1D，1E和1F例子所示，在46℃，存在或不存在NASBA扩增，使选择热稳定化化合物，如蔗糖、山梨醇和乳糖(在大多数情况下扩增都有相符合的信号(七个重复至少有四个阳性信号))，能很容易地进行。由此分离的添加剂在下面会更清晰地研究。
实施例2：通过紫外分光光度法监测T7RNA聚合酶热变性来选择热稳定化化合物
本实施例中证明，与无添加剂的对照相比，T7RNA聚合酶的变性温度(T7Tm)在一定化学添加剂的存在下，显著增加。T7RNA聚合酶被选为酶的模型，因为它对热变性最为敏感，无添加剂条件下T7Tm是48.5℃。
紫外分光光度法技术被用于测量Tm T7值。测定在λ＝280nm的蛋白质的吸光度变化作为温度的函数。当酶被加热时，溶液变得混浊，聚集物形态相当于变性形态。Tm对应具有50％的天然形态和50％的变性形态时的温度(吸光度曲线的一阶导数＝F(温度))。
在聚丙烯瓶中，将4ml300mM PBS磷酸盐缓冲液(Aldrich P-4417，StQuentin Fallavier，France)与12μl17mg/ml的T7RNA聚合酶(bioMérieux，Marcy，France)混合，即蛋白终浓度为0.05mg/ml。500μl0.05mg/ml的T7RNA聚合酶和500μl浓缩的添加剂溶液(Aldrich，St Quentin Fallavier，France)或作为对照的300mM PBS，加入到石英比色皿中进行紫外分光光度法测定。混匀后，测定在λ＝280nm下吸光度的变化，产生在30至65℃之间，1℃/min的温度函数，，以如先前所述地确定T7Tm((Cary UV spectrophotometer，Varian，Les Ulis，France)。
根据上述方法得到的一些有代表性的结果示于下表1中(ΔTm的值作为该类型添加剂的函数)。
表1：作为该类型添加剂函数的ΔTm测量总结表
很清楚地观察到，在某些添加剂，如山梨糖醇，蔗糖或乳糖存在的情况下，加热T7RNA聚合酶，可以使酶的变性温度非常显著的增加几度，因而证实了其热稳定化作用。
实施例3：测量T7RNA聚合酶在46℃下的热稳定性(T1/2)
在此实施例中，在多元醇存在或不存在的情况下测定T7RNA聚合酶的T1/2值。该测量方法的描述和用到的各种试剂如下所示。
溶液W1：
根据下文比例将缓冲液B、C和D与下述NuclisensTMHIV-12.0试剂(ref.：285033，bioMérieux，Marcy l′Etoile，France)(8个反应)混合：
-36.08μl缓冲液A
-6.32μl缓冲液B
-25.36μl缓冲液C
-173.6μl缓冲液D
-8份“NuclisensTMHIV-12.0accusphere reagent”
-960ul“NuclisensTMHIV-12.0dilution reagent”
溶液S(混合底物)：
-Tris-HCl70mM，pH8.5
-dNTP，各3mM
-rATP、rCTP和rUTP各2.6mM
-rGTP，2mM
-rITP，0.6mM
-葡萄糖，60mM
-甘露醇，40mM
-葡聚糖T-40，7g/L
-MgCl2，16mM
-KCl，320mM
-DTT，20mM
-DMSO，3.5M
-分子信标MB1，在0.1至0.3μM间
-T7负链寡核苷酸，在10nM至20nM间
-T7正链寡核苷酸，在10nM至20nM间。
所用序列(5′-3′方向)：
T7负链 AATTCTAATACGACTCACTATAGTATGAGGGCAGCAGACATCGAATTT
T7正链 AAATTCGATGTCTGCTGCCCTCATACTATAGTGAGTCGTATTAGAATT
MB1 FAM-CTATCCCTTCGATGTCTGCTGCCCTCGGGATAG-Dabcyl
1.将要以这种方式评估的酶进行稀释，使其体积活性为109kU/ml。
2.将20μl要评估的酶在840μl W1溶液中稀释。
3.将114μl要评估的化合物接着被加入到193.5μl上面第2步中所述的酶混合液中。
4.取12份20μl在第3步中产生的混合液，分装入0.2ml的管，在热循环仪中46℃温育。110分钟里，每十分钟从热循环仪中取出一管，在测定残余的酶活性前在4℃保存。
5.将20μl溶液S加入到5μl此预温育混合物中，以测量5到10分钟间的荧光增长率，所述荧光增长率与残余酶活性有关。
6.根据下列计算，用未预温育的酶(其活性对应100％)的活性的百分数表示各T7RNA聚合酶的残余酶活性：
ρN＝未预处理T7RNA聚合酶5到10分钟间获得的斜率，
ρT＝在存在或不存在多元醇条件下，在46℃预温育T7RNA聚合酶5到10分钟间获得的斜率，和
％相对活性＝％(ρT/ρN)
7.T1/2的值对应于酶的活性降至初始活性50％所需的时间。
测量T7RNA聚合酶T1/2的结果在表2中表述：
表2：在46℃下T7RNA聚合酶T1/2热稳定值
根据表2，可以得出，所检测的所有化学化合物，在特定于NASBA的环境下操作，对T7RNA聚合酶活性都具有热稳定化作用。1.48M的山梨醇对T7RNA聚合酶有最强的热稳定化作用，乳糖有弱热稳定化能力，即使这样，结果也是可见的和显著的。
实施例4：测量保持T7RNA聚合酶活性的最高预温育温度
本实施例中，测定了T7RNA聚合酶在热稳定化化合物存在的情况下能耐受3分钟预处理的最高温度。这个步骤类似于靶预变性或预温育阶段。
除了温度是可变的，预温育时间固定在3分钟外，本实施例所用实验方案与实施例2类似。图2显示，0.7M蔗糖，0.4M海藻糖和1.4M山梨醇，在48℃下T7RNA聚合酶可保持100％活性3分钟，山梨醇甚至可以使其在49℃下保持3分钟。
实施例5：测量T7RNA聚合酶，RNA酶H和AMV-RT在存在或不存在0.4M海藻糖条件下，在不同温度的热稳定性
首先如图3A、3B和3C所示，本实施例证明T7RNA聚合酶(T7)是最热敏感的，以及使用添加剂，比如海藻糖，能够使之更加热稳定。其次也证明了海藻糖对RNA酶H(RH)和AMV-RT(RT)的活性有热稳定化作用。
实施例5中测量T7RNA聚合酶、RNA酶H和AMV-RT活性的方法的描述：
1.分别在其体积活性为109kU/ml、1kU/ml和25kU/ml使用T7RNA聚合酶，RNA酶H和AMV-RT酶。
2.用实施例3中的W1溶液，分别按1/43、2/191和2/27的比率稀释T7RNA聚合酶，RNA酶H和AMV-RT酶，以模拟NASBA反应的物理化学环境。
3.随后将1.1M海藻糖溶液加到上述混合液中，以达到终浓度0.4M。
4.多份20μl上述溶液，分别加入0.2ml的管，在各种温度以预先确定的时间温育。
5.将5μl酶溶液加到20μl含有对应于各自活性测量的试剂的溶液S中，测量T7RNA聚合酶、RNA酶H和AMV-RT各自的残余活性。
测量T7RNA聚合酶活性的溶液S：
与实施例3相似。
测量RNA酶H活性的溶液S：
-dNTP，各1.3mM，
-rATP，rCTP，rUTP各2.6mM，
-rGTP，2mM，
-rITP，0.25mM，
-蔗糖，60mM，
-甘露醇，40mM，
-葡聚糖，T-407g/L，
-MgCl2，16mM，
-KCl，400mM，
-DTT，25mM，
-Tris-HCl，80mM，pH8.5，
-DMSO，4.4M以及
-RNA酶H探针0.2至2μM：5′FAM-AUAA-TAMRA-3′。
测量DNA依赖的AMV-RT活性的溶液S：
-dNTP，各0.3mM，
-rATP、rCTP、rUTP，各0.6mM，
-rGTP，0.5mM，
-rITP，0.25mM，
-蔗糖，15mM，
-甘露醇，10mM，
-葡聚糖T-40，1.7g/L
-MgCl2，4mM，
-KCl，800mM，
-DTT，50mM，
-Tris-HCl，165mM，，pH8.5，
-DMSO，8.8M，
分子信标MB2，0.2至2μM，分子式(formula)：
5′ROX-GATGCGGAGCGCAGTAGACATGCATCCGAACATCACAGCAGACACAGCCTGGTTTT-DABCYL3′，和
-PRT寡核苷酸，1至5μM，分子式：
5′-AAAACCAGGCTGTGTCTG-3′。
6.根据下列计算，用未预温育的酶(其活性对应100％)的活性的百分数表示各突变体的残余酶活性：
·ρN＝未预处理的酶5到10分钟间获得的斜率，
·ρT＝在各温度，存在或不存在要研究的多元醇条件下，预处理的酶5到10分钟间获得的斜率，以及
·相对活性百分比＝％(ρT/ρN)。
实施例6：研究通过NASBA转录扩增法在46℃和热稳定化化合物存在的条件下检测的灵敏度
在本实施例中，证明了在46℃和热稳定化化合物存在而没有用作靶的HIV-1B转录本(浓度5cps/反应，此为NASBA的检出限)的变性阶段的条件下能实施NASBA扩增。其目的是通过同时添加酶的靶标和扩增试剂混合物而简化方法。
NuclisensTMHIV-12.0扩增试剂盒(Ref.：285033，bioMerieux，Marcyl′Etoile，France)用于在含海藻糖，蔗糖或山梨醇，HIV-1B型转录本浓度在5cps/测试的检出限的情况下，实施扩增实验。每个扩增重复24次，以估计46℃和热稳定化化合物存在的条件下测试的灵敏度。
灵敏度用分析系统EasyQTM确定的阳性信号相对于总重复数的百分比表示。
图4通过获得的灵敏度的增加，显示在某些多元醇存在的条件下使用高于41℃的反应温度的优势，特别是使用山梨醇可以检测到100％的HIV-1B转录本。

Claims (13)

1.转录扩增方法，其中：
a)将至少一种存在于生物学样品中的靶核酸与以下化合物接触：
·扩增引物，
·实施扩增需要的所有试剂，包括参与扩增的酶，以及
·至少一种能稳定实施扩增所需要的酶的多元醇，
b)在存在所有上述化合物的条件下，在44℃以上的温度加热混合物，使靶变性，
c)在44℃以上的温度实施靶核酸转录扩增。
2.根据权利要求1所述的扩增方法，其中实施变性和扩增的温度在44℃至49℃之间。
3.根据权利要求1所述的扩增方法，其中实施变性和扩增的温度大于或等于46℃。
4.根据权利要求1至3任一项所述的扩增方法，其中所述酶所提供的酶活性是：
i.RNA聚合酶活性(T7、SP6等)，
ii.逆转录酶活性(AMV-RT、MMLV-RT等)，和
iii.RNA酶H活性。
5.根据权利要求1至4任一项所述的扩增方法，其中的多元醇由以下一种化合物或这些化合物的组合组成：
i.乳糖，
ii.山梨醇，
iii.蔗糖，
iv.甘露醇，和
v.海藻糖。
6.根据权利要求1至5任一项所述的扩增方法，其中多元醇的浓度为0.4至1.5M。
7.用于检测通过根据权利要求1至5任一所述扩增方法获得的扩增子的方法，其包括在步骤a)中针对可能存在于生物学样品中的每种待测靶核酸添加至少一种检测探针，以及实施以下附加步骤：
d)通过探针与溶液中每个扩增子的杂交检测步骤c)中所实施的扩增得到的扩增子的存在。
8.对可能存在于生物学样品中的待测靶核酸进行预处理的方法，所述靶核酸用于根据权利要求1至5任一项所述的方法进行扩增，所述方法包括在步骤a)前实施以下附加步骤，其中对于RNA，将所述生物学样品置于低于或等于65℃的温度，而对于DNA，将所述生物学样品置于低于或等于95℃的温度。
9.对可能存在于生物学样品中的待测靶核酸进行预处理的方法，所述靶核酸用于根据权利要求1至5任一项所述的方法进行扩增，所述方法包括在步骤a)前实施以下附加步骤，其中将所述生物学样品置于低于或等于49℃的温度。
10.体外诊断一种或多种可能存在于生物学样品中的待测靶核酸的方法，包括：
a)实施预处理或变性的方法，并实施根据权利要求1至6任一项所述的扩增方法，
b)实施根据权利要求7所述的检测方法。
11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所有所述方法均在单一容器内实施。
12.根据权利要求10或11所述的方法，其特征在于，所有所述方法均在44℃以上的单一温度实施。
13.根据权利要求10或11所述的方法，其特征在于，所有所述方法均在介于46℃至49℃之间的单一温度实施。
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