KR20000036247A

KR20000036247A - 필터 조립체 및 핵산 물질 분리 방법

Info

Publication number: KR20000036247A
Application number: KR1019997002337A
Authority: KR
Inventors: 에켄버그스티븐제이.
Original assignee: 랜들 엘. 다이어몬드; 프로메가 코포레이션
Priority date: 1996-09-18
Filing date: 1997-09-18
Publication date: 2000-06-26
Also published as: JP2001501527A; EP0927077A4; EP0927077A1; AU730718B2; WO1998011989A1; AU4425597A; CA2265702A1; KR100486402B1

Abstract

본 발명은 세포 분쇄물에서 핵산을 분리하는 여과 시스템 및 방법에 관한 것이다. 상기 여과 시스템은 마이크로 원심 분리 튜브(9) 및 진공 매니폴드 어댑터(12)의 양자에 모두 결합되도록 설계된 한쪽 단부에 필터(28)를 구비하는 필터 바스켓(10)을 구비한다.

Description

필터 조립체 및 핵산 물질 분리 방법{Improved Filteration System and Method}

핵산이 실리카와 결합한다는 사실은 공지되어 있다. 상기 특성은 세포 분쇄물 및 다른 물질로부터 핵산, 특히 DNA, 보다 상세하게는 플라스미드 DNA를 수집 또는 분리하는데 사용된다. 문헌 참조(국제 특허 협력 조약의 국제 특허 출원 WO 95/06652). 후술하는 일반적인 공정에 따라서 세포 내의 다른 물질로부터 생세포에 포함된 핵산을 분리하기 위해서 수지를 포함하는 실리카 형태 또는 실리카가 충전된 필터 형태의 실리카 물질을 사용한다. 먼저, 세포를 분쇄 또는 용해하여 세포 용해액, 즉 용해된 물질을 포함하는 용액을 생성한다. 두 번째로 세포 용해액을 처리하여 세포 분쇄물을 제거하고 투명한 세포 용해액을 생성한다. 투명한 세포 용해액은 통상적으로 세포 용해액을 원심 분리하여 세포 분쇄물을 펠릿화하고, 상등액을 옮겨서 보관하여 투명한 세포 용해액을 생성한다. 세 번째로, 실리카에 대해 핵산 물질의 부착을 촉진시키도록 설계된 케이아트로픽(chaotropic) 작용제의 분위기하에서 투명한 세포 용해액을 실리카와 접촉시킨다. 공정에서의 마지막 단계는 (대략적으로 몇 번에 걸친 중간 세척 또는 처리 단계 이후에) 실리카에 결합된 핵산을 제거, 즉, 무뉴클레아제수를 사용하여 실리카에서 핵산을 용리하여 제거하는 것이다.

상술한 일반 공정에서는, 세포 용해액 내의 핵산 물질에 결합되기 전·후에 실리카 물질을 필터 바스켓 내에 위치시킨다. 필터 바스켓은 바스켓/튜브 조립체는 표준 원심 분리 장치에 결합되도록 표준 크기의 마이크로 원심 분리 수집 튜브에 결합되게 설계된다. 필터 바스켓은 또한 세포 용해액과 동시에 적재될 때 실리카 물질을 포함하고, 외력, 예를 들면 원심력이나 진공과 같은 외력에 노출될 때 상기 세포 용해액이 상기 물질을 관통하여 수집 튜브로 통과하도록 설계된다. 개략적으로 상술한 공정 형태에 따라서 핵산 분리에 사용하도록 설계된 상업적인 필터 바스켓으로는, 두 가지의 일반적인 제품을 입수할 수 있다. 그와 같은 제품의 첫 번째는 실질적으로 평평한 바닥을 구비한 필터 바스켓으로, 스핀 여과법에 사용되도록 설계(즉, 수집 튜브에 삽입되어 원심 분리 장치 내에서 스핀되도록 설계)되었다. 미국 특허 제 5,552,325 호와 미국 특허 제 4,683,058 호에 개시된 필터 바스켓과 글래스막스^TM스핀 카트리지(GLASSMAX^TMSpin Cartridges)(미국 메릴랜드 게이더스버그 소재의 라이프 테크놀러지스(Life Technologies)) 참조. 다른 일반적인 제품은 필터 바스켓 제품을 원심 분리 또는 진공 여과에서 상호 교환하여 사용할 수 있도록 설계된, 필터 바스켓의 바닥에서 돌출하여 결합하는 메일 레르 록^R(male Ler Lok)이 있다. 이에 대해서는 키아프렙^R스핀 미니프렙 키트(QIAprep Spin Miniprep Kit) 마이크로 원심 분리 스핀 컬럼(독일 힐덴 소재의 키아젠 인코포레이티드(QIAGEN, Inc.)) 참조.

현재 사용중인, 상기 상업적으로 입수 가능한 두 가지의 중요한 필터 바스켓 제품은 DNA와 같은 핵산을 분리하는데 바스켓을 사용하고자 하는 사람이 취급하기가 곤란하다. 평평한 바닥의 필터 바스켓은 수집할 다량의 용액 때문에 필터 바스켓의 바닥이 수집 튜브의 바닥 보다 충분히 높고, 필터 바스켓의 바닥에서 깨끗하게 유지되므로 단일 원심 분리 단계에서 다량의 용액을 필터를 통해서 스핀시킬 수 있다는 장점이 있다. 그러나, 평평한 바닥의 바스켓은 상술한 일반적인 핵산 분리 절차에서의 결합 및 세척 단계에서 사용자가 바스켓의 내용물을 처리하는데 진공 여과법을 사용할 수 없다는 단점이 있다.

돌출 진공 어댑터를 구비한 필터 바스켓은 핵산을 분리하기 위해서 원심 분리식 여과 및/또는 진공식 여과를 사용할 수 있다는 유연성이 있다. 그러나, 필터 바스켓의 돌출 진공 어댑터 부분은 필터 바스켓의 바닥(즉, 어댑터 단부)과 접촉하지 않고 수집 튜브의 내부로 분리되어 들어가는 용액의 양을 제한한다. 상기 마지막 문제점에 대해서, 상기 필터 바스켓의 사용자는 자주, 바닥이 평평한 필터 바스켓을 사용하면 단 한 번의 스핀 사이클로 처리될 수 있는 동일한 체적의 세포 용해액을 처리하기 위해서 마이크로 원심 분리 장치에서 두 번 또는 그 이상의 스핀 사이클을 사용해야 한다. 두 번째 형태에 속하는 일부 상업적인 필터 바스켓에는 진공 매니폴드 장치의 피메일 루어-록^R(female Luer-Lok^R)과 상호 결합하도록 설계된 내측면 상의 그루브와 결합하는 메일 루어-록^R결합부가 있다. 이에 대해서는, 상술한 키아젠(Qiagen)에서 시판되는 미니프렙 마이크로 원심 분리 스핀 칼럼을 참조. 이와 같은 필터 바스켓에서 돌출하는 결합부는 결합부의 그루브에 수집되는 필터를 통해서 스핀 분리된 용액이 하나의 분리 공정에서 다음의 분리 공정으로 진행해갈 때 잠재적인 문제점을 초래한다는 추가적인 문제점이 있다.

본 발명은 체적의 제한 없이 상업적인 평평한 바닥의 필터 바스켓 조립체와 유사한 체적을 처리할 수 있고, 상업적인 돌출형 진공 어댑터 필터 바스켓에 존재하는 문제점을 극복할 수 있는 원심 분리법 또는 진공 여과법에서 상호 교환 가능하게 사용할 수 있는 개선된 여과 시스템이다.

본 발명은 또한, DNA와 같은 핵산을 분리하는데 본 발명의 개선된 여과 시스템을 사용하는 방법이기도 하다. 본 발명의 방법은 응용이 매우 유연하고, 핵산의 분리 수율이 높다는 점에서 매우 효율적이며, 종래의 공지된 핵산 분리 기술에 비해서 덜 노동 집약적이다. 본 발명의 방법의 실행에서 생성되는 핵산은 특히 순수하며, 자동 형광 DNA 서열 분석, 증폭 반응(특히 폴리메라제 연쇄 반응(PCR: polymerase chain reaction)), 형질 감염, 유전자 치료 및 유전자 발현 등과 같은 후속 응용에 매우 적합하다. 본 발명을 이용한 핵산 분리에 대한 다른 많은 응용에 대해서는 본 기술 분야에서 숙련된 자에는 명백할 것이다.

모든 종래 기술을 망라한 것은 아니지만, 대표적인 종래 기술에는 다음과 같은 것들이 있다.

발명자 특허 번호

라이만 등(Lyman et al.) 미국 특허 제 4,683,058 호

림(Limb) 미국 특허 제 4,832,842 호

세트캐비지 등(Setcavage et al.) 미국 특허 제 5,491,067 호

팰리(Paley) 미국 특허 제 4,046,479 호

거기스(Guirguis) 미국 특허 제 5,429,803 호

디크만(Diekmann) 미국 특허 제 4,956,298 호

뉴커크(Nieuwkerk) 미국 특허 제 5,438,128 호

쉬어 등(Sheer et al.) 미국 특허 제 5,124,041 호

본 출원은 U.S.C. 제 119 조의 35 항에 따라서 1996 년 9 월 18 일자 미국 가출원 번호 제 60/026,582 호의 우선권을 주장한다.

본 발명은 생물학적인 실체를 분리하기 위한 여과 시스템 또는 장치 및 방법에 관한 것이다. 범위를 한정하고자 하지는 않지만, 보다 상세하게, 본 발명은 세포 분쇄물로부터 리보핵산(RNA) 또는 데옥시리보핵산(DNA)과 같은 핵산을 분리하기 위한 시스템 및 방법에 관한 것이다. 본 발명은 특히 DNA, 보다 자세하게는 플라스미드 DNA를 분리하기 위한 여과 시스템 또는 장치 및 방법에 관한 것이다.

도 1은 본 발명의 필터 바스켓의 상부 투시도.

도 2는 본 발명의 필터 바스켓의 하부 투시도.

도 3은 본 발명의 필터 바스켓의 저면도.

도 4는 도 3의 선(3-3)을 따라서 취한 본 발명의 필터 바스켓의 단면도.

도 5는 본 발명의 진공 어댑터의 상부 투시도.

도 6은 본 발명의 진공 어댑터의 하부 투시도.

도 7은 본 발명의 진공 어댑터의 상부 단부도.

도 8은 도 7의 선(7-7)을 따라서 취한 본 발명의 진공 어댑터의 단면도.

도 9는 본 발명의 진공 어댑터로 삽입되는 필터 바스켓을 포함하는 본 발명의 필터 조립체의 단면도.

도 10은 수집 튜브 내에 포함되는 본 발명의 필터 바스켓의 단면도.

도 11은 수집 튜브의 단면도.

도 12는 플라스미드 DNA를 분리하기 위한 본 발명의 여과 시스템을 사용하는 방법을 도시한 작업 순서도.

요약하면, 한 측면으로, 본 발명은 개선된 여과 시스템이다. 다른 측면에서, 본 발명은 세포질 분쇄체로부터, 핵산, 특히 DNA를 분리하기 위한 방법이다. 본 발명의 시스템 및 방법은 종래 기술의 원심 분리 장치와, 다른 다수 종류의 종래 기술의 진공 매니폴드 장치 중의 하나의 양자와 함께 사용할 수 있도록 설계된다.

본 발명의 여과 시스템 또는 조립체는 독립적인 필터 바스켓과 진공 어댑터 성분을 포함한다. 선택적인 실시에서, 상기 시스템 또는 조립체는 또한 종래 기술의 마이크로 원심 분리 장치의 수집 튜브를 구비한다.

진공 어댑터는 제 1 단부와 제 2 단부를 구비하는 실린더형 튜브를 포함한다. 진공 어댑터의 제 1 단부는 필터 바스켓과 협력하여 그 내부에 삽입되고, 어댑터의 통과를 제한하고 이들 사이에서 실질적인 공기 기밀 밀봉을 형성한다. 어댑터의 제 2 단부는 진공 매니폴드와 같은 진공원과 결합되도록 설계된다. 예를 들어, 진공 어댑터의 제 2 단부는 피메일 루어-록^R(female Luer-Lok^R) 연결 장치를 포함할 수도 있다. 시스템의 진공 어댑터의 피메일 루어-록^R연결 장치 부분은 미국 위스컨신 매디슨 소재의 프로메가 코포레이션(Promega Corporation)으로부터 양자 모두 상업적으로 입수 가능한, 백-맨^RVan-Man^R래버러토리 매니폴드(laboratory manifold) 또는 백-맨^R주니어(Van-Man Jr.^R래버러토리 매니폴드와 같은 메일 루어-록^R포트 및 표준 진공 매니폴드와 동시에 사용 가능하다.

필터 바스켓 및 진공 어댑터는 협력하여 필터 바스켓이 진공 어댑터의 제 1 단부 내에서 제한적으로 및 마찰적으로 결합되도록 하고, 이들 사이에서 실질적인 공기 기밀 밀봉을 형성한다. 필터 바스켓의 외측면 또는 진공 어댑터의 내측면 중의 어느 하나가 적절하게 약하게 벌어져 있거나 테이퍼져 있기 때문에 실질적인 공기 기밀 밀봉이 생성된다. 실질적인 공기 기밀 밀봉은 어댑터의 제 2 단부가 진공 매니폴드에 장착될 때 바스켓 필터와 어댑터 사이에 진공 밀봉을 형성할 수 있도록 한다. 한 실시에서, 필터 바스켓은 한쪽 단부에서 실리카 필터 또는 필터 디스크(또는 다수의 디스크)를 지지하는 높은 표면 영역을 구비한다. 본 발명의 유리한 방법에서, 핵산이 궁극적으로 분리되는 곳은 실리카 필터 물질이다. 여기에서, 실리카를 포함하는 필터 바스켓의 단부는 유리하게는 구멍이 뚫려 있어서, 내부에 디스크를 유지하면서 원심 분리력 또는 진공 지지력 중의 하나에 의해서 유체가 필터 바스켓을 통과할 수 있게 된다.

본 발명의 방법은 본 발명의 여과 시스템을 사용하여 세포 용해액으로부터 관심있는 물질을 분리하는데 사용되는 방법 절차를 선택하여 사용하여 생물학적인 물질, 특히 플라스미드 DNA를 정제 또는 분리하는 방법이다. 보다 상세하게는, 본 발명의 핵산 물질 분리법은 마이크로 원심 분리 단계에서 생성되는 것과 같은 원심력 또는 래버러토리 진공 매니폴드에 의해서 이용 가능한 진공 지지 중의 하나를 사용할 수 있다. 본 발명자가 알고 있는 한, 놀랍고 예상할 수 없을 정도의 융통성을 제공하는 어떠한 여과 시스템 또는 방법도 이전에 개시되거나 제안된 적이 없다.

본 발명의 여과 시스템을 구성하는 두 개의 주요 성분, 필터 바스켓(10)과 진공 어댑터(12)가 각각 도 1 내지 도 4 및 도 5 내지 도 8에 도시되어 있다. (동일한 구조임을 나타내기 위해서 각각의 도면에서 동일한 도면 부호를 사용하였다.) 필터 바스켓(10)은 제 1 단부(16)와 제 2 단부(18)를 구비하는 속이 빈 실린더형 튜브(14)를 포함한다. 필터 바스켓의 단면 형상이 중요하지 않음에도 불구하고, 실시예에서는, 제 1 단부(16)가 숄더(20)와 림(22)을 포함한다. 숄더(20)와 림(22)은 하기에서 보다 상세하고 설명되고, 도 11에 도시되어 있는 수집 튜브 또는 포착 튜브 상의 대응하는 구조와 협력하는 형상이다. 제 1 단부(16)는 개방 단부(24)를 구비한다. 제 2 필터 바스켓 단부(18)는 다공 구조 또는 수단, 즉 일련의 작은 개구 또는 창(26)을 구비한다. 실린더형 튜브(14)의 벽과 함께 상기 개구는 필터 바스켓의 "바스켓" 구조를 한정한다. 여기에서, 다공 구조 또는 수단(26)이 필터 바스켓(10)의 축(27)에 대해 대략 직각인 평면을 한정한다는 점은 중요하다. 따라서, 다공 구조(26)는 대략 필터 바스켓(10)의 제 2 단부(18)에서 평평한 바닥이라고 특징지워지는 것을 한정한다. 필터 바스켓의 상기 특징은, 평평한 바닥이 협력하는 수집 튜브 내에 더 큰 체적의 비어있는 공간을 남길 수 있다는 점 때문에 매우 중요하다. 필터 바스켓(10)의 평평한 바닥은(도 4에서 가장 잘 도시되어 있는 바와 같이), 바스켓 구조 내에 최소한 하나의 실리카 필터 디스크를 유지한다. 도 4는 바스켓 구조 내에 유지되는 두 개의 그와 같은 실리카 필터 디스크(28)를 도시하고 있다.

도 3 및 도 4는 필터 수단 또는 실리카 디스크(29)에 대한 다공 구조(26)를 도시하고 있다. 실리카 디스크(28)는 필터 바스켓(28)의 바닥에 제한적으로 결합된다. 본 발명의 범위 내에서 속이 빈 실린더형 몸체(14) 내에 필터 디스크(28)를 유지하는데, 내향으로 방사 방향으로 지향되는 구조인 융기부, 함몰부 또는 비드(bead)와 같은 다른 접근 방법도 가능하다.

도 5 내지 도 8은 본 발명의 진공 매니폴드 어댑터(12: 때때로 필터 컵이라고도 불림)를 도시하고 있다. 매니폴드 어댑터(12)는 실린더형 몸체(34)에 의해 한정되는 제 1 단부(30)와 제 2 단부(32)를 각각 구비한다. 제 1 단부(30)는 필터 바스켓(10)의 제 2 단부(18)가 삽입되는 개구(36)를 한정한다. 필터 바스켓(10)의 제 2 단부(18)는 진공 어댑터(12)의 내측 직경과 협력하도록 설계되어 필터 바스켓(10)이 내부에 제한적으로 또는 마찰적으로 결합되거나 수용되어 실질적인 공기 기밀 밀봉을 생성한다. (이는 도 9에 가장 잘 도시되어 있다.) 진공 어댑터(12)에서 제 2 단부(32)는 내부에 나삿니(36)를 한정한다. 나삿니(36)는 래버러토리 진공 매니폴드의 루어-록^RLuer-Lok^R포트와 같은 협력하는 구조와 결합, 즉 나사 결합되는 내부 나삿니이다. 래버러토리 진공 매니폴드의 백-맨^RVac-Man^R시리즈는 본 발명에서 사용되는 그와 같은 매니폴드 종류 중에서 특히 선호하는 예이다. 루어-록^R포트와 협력하는 백-맨^RVac-Man^R래버러토리 매니폴드는 설명과 내용이 참조에 의해서 본원에 합체되는, 1996 년 프로메가 코포레이션의 카탈로그 155 페이지에 도시되어 있다. 마지막으로, 매니폴드 어댑터(12)의 제 2 단부(32) 또한 내부적으로 방출 개구(38)를 한정하도록 형성되어 있다. 본 발명에 의해서 여과된 물질은 방출 개구(38)를 통해서 유출된다. 진공 어댑터(12)는 손가락 사이에서의 파지를 보다 용이하게 하기 위해서 선택적인 거친, 즉 톱니 모양의 거친 외부면(40)을 구비한다.

도 9는 매니폴드 어댑터(12)에 삽입된 필터 바스켓(10)의 단면도이다. 상호 결합부(42)의 표면에서의 마찰 결합으로 바스켓(10)이 진공 어댑터(12)에 완전하게 삽입되는 것이 방지되고, 그 사이에서 실질적인 공기 기밀 밀봉을 형성한다. 필터 바스켓(10)과 진공 어댑터(12) 사이의 마찰 결합은 쳄버(44)를 한정한다.

도 10은 수집 튜브(46) 내에 삽입되는 본 발명의 필터 바스켓(10)의 단면도이다. 수집 튜브(46)는 개방 단부(47)와 폐쇄 단부(49)를 구비한다. 필터 바스켓(10)과 수집 튜브(46) 사이에 어떠한 제한적인 결합도 상정되지 않음은 명백하다. 협력하는 숄더(20)와 수집 튜브의 립(48)은 필터 바스켓(10)이 수집 튜브(46) 내로 완전하게 미끄러져 들어가는 것을 방지한다. 수집 튜브(46) 내의 수집 쳄버(50)는 튜브의 벽에 의해서 및 필터 바스켓(10)의 평평한 바닥에 의해서 한정된다. 상기 수집 튜브의 크기는 돌출 루어-록^R`연결 장치와 수집 튜브 조립체를 구비하는 상업적으로 입수 가능한 필터 바스켓으로 형성되는 쳄버에 비해서 현저하게 크다. 왜냐하면, 필터 바스켓(10)의 평평한 바닥은 수집 튜브의 쳄버 체적을 내재적으로 제한하는 이와 유사한 돌출부를 가지고 있지 않기 때문이다. 필터 바스켓(10)의 평평한 바닥은 또한 종래 기술의 돌출 결합부에서 내재적인 수율 문제를 동반하지도 않는다.

도 11은 수집 튜브의 단면도이다. DNA와 같은 핵산을 분리하는데 원심 분리 방식을 사용하는 경우, 수집 튜브와 본 발명의 필터 바스켓는 합쳐서 사용할 수 있다.

본 발명의 필터 시스템은 임의의 종류의 핵산 물질을 포함하여, 임의의 어떠한 서로 다른 종류의 물질을 분리하는데라도 사용할 수 있다. 그러나, 필터 시스템을 사용하는 가장 유리한 방법은 실리카 물질이 충만된 필터와 결합된 본 발명의 필터 시스템을 사용하여 DNA, 가장 유리하게는 분리된 DNA 종류는 플라스미드 DNA를 분리하는 것이다. 충만형 필터 물질로 가장 선호되는 것은 미국 캘리포니아 어빈의 안시스 코포레이션(Ansys Corporation)으로부터 상업적으로 입수 가능한 스펙^TM(SPEC^RM) 실리카 디스크 물질이다. 본 발명에서 사용되는 필터 바스켓에서 사용하기 위해 고려되는 다른 적절한 실리카 기반의 물질에는 본원에서 참조에 의해서 합체되는 국제 특허 협력 조약 공개 번호 WO 95/06652에서 기술된 수지 물질이 포함된다. 관심있는 DNA 종류를 포함하는 생물학적인 물질을 용해하고 필터 바스켓 조립체의 실리카 성분에 결합시키는데 임의의 다른 처리 기술을 사용할 수도 있다. 이렇게 하기 위한 적합한 물질 및 방법에는 프로메가 코포레이션(Promega Corporation: 위저드^R(Wizard^R) 및 위저드^R플러스(Wizard^Rplus) 에스브이(SV) DNA 정제 시스템)과 키아젠 코포레이션(Qiagen Corporation: QIA^R프렙(Prep.))을 포함하는 다수의 서로 다른 공급원으로부터 키트 형태로 상업적으로 입수 가능하다. 바스켓 필터로부터 DNA를 세척하고 용리하는 적절한 기술에 대해서도 문헌에 기재되어 있다.

후술하는 비제한적인 실시예는 본 발명의 한 실험예의 이용에 대한 상세한 설명이다. 실시예에 기술된 본 발명의 필터 조립체 및 방법의 특정 실험예는 프로메가 코포레이션(Promega Corporation)에서 최근에 개발된 시스템인 위저드플러스(Wizard^RPlus) 에스브이(SV) 미니프렙스 DNA 정제 시스템의 구성 성분으로 언급된다. 진공 어댑터 성분은 하기에서 미니프렙 진공 어댑터(Miniprep Vacuum Adapter)로 언급된다. 본 실시예는 본 발명의 단 하나의 실험예이다. 본원에서의 개시에 따라서 본 기술 분야의 숙련자에 의한 본 발명의 추가적인 실험예도 가능하다.

<실시예>

Ⅰ. 시스템의 개관

"미니프렙(miniprep)"으로 더 잘 알려져 있는 플라스미드 DNA를 분리하기 위한 소규모의 실험은 분자 생물학 실험에서 일반적이다. 문헌 참조(Ausubel, F. M. et al. (1989) Current protocols in Molecular Biology, Vol. 2, John Wiley & Sons, NY). 몇 년 동안, 다수의 미니프렙 프로토콜이 개발되었으나, 소수만이 일관성 있게 신뢰성이 있는 것으로 증명되었다. 플라스미드 DNA 수율이 자주 양과 질의 면에서 변동이 있었으므로, 사용될 수 있는 응용 분야에 제한이 있었다. 또한, 공지된 미니프렙 실험은, 특히 다수의 미니프렙을 병행하여 수행하는 경우에 지루하고 시간을 낭비할 수 있다.

위저드^R플러스 에스브이 미니프렙스 DNA 정제 시스템은 플라스미드 DNA의 신속한 분리에 적합한 간단하고 신뢰성 있는 방법을 제공함으로써 표준 미니프렙 실험과 관련된 다수의 문제점을 해소한다. 상기 시스템은 어떠한 플라스미드를 분리하는데도 사용될 수 있지만, 플라스미드가 20,000 bp 이하인 경우에 가장 효율적으로 작동한다. 표준 위저드^R플러스 에스브이 미니프렙스 DNA 정제 시스템을 사용하는 경우에, 전체 미니프렙 실험은 실험할 표본의 수에 따라서 30 분 또는 그 이하로 완료할 수 있다. 또한, 상기 프로토콜을 사용하여 분리된 플라스미드는 추가적인 조작을 하지 않고도 자동 형광 DNA 서열 분석 또는 제한 효소 절단 등에 직접적으로 사용 가능(고복제수의 플라스미드를 사용하는 경우에)하며, 또한 RNasin^R리보뉴클레아제 억제 인자(프로메가 카탈로그 번호: N2511)와 같은 리보뉴클레아제 억제 인자를 첨가하는 경우에는 시험관내 전사 반응에도 사용할 수 있다.

본 실시예에서 사용된 것과 같은 위저드^R플러스 에스브이 미니프렙스 DNA 정제 시스템은 플라스미드 DNA의 정제에 적합한 방법 중의 하나를 선택할 수있게 한다. 위저드^R플러스 에스브이 미니프렙스 스핀 컬럼을 통하여 박테리아 세포 용해액을 순수하게 하고, 마이크로 원심 분리 장치를 사용하여 플라스미드 DNA를 세척하여 박테리아상 세포 용해액으로부터 DNA를 정제할 수 있다. 대안으로, 단락(Ⅶ. B.)에 기재한 바와 같이, 박테리아상 세포 용해액을 위저드^R플러스 에스브이 미니프렙스 스핀 컬럼으로 투입하고 진공 매니폴드(예를 들어, 백-맨^R래버러토리 진공 매니폴드, 용량: 표본 20, 프로메가 카탈로그 번호: A7231, 또는 백-맨^R주니어 래버러토리 진공 매니폴드, 용량: 표본 2, 카탈로그 번호 A7660 등)를 사용하여 플라스미드 DNA를 정제할 수 있다. 진공 매니폴드를 사용하면, 플라스미드 DNA를 정제하는데 필요한 시간과 노력을 매우 감소시키고, 종래의 시스템과 비교하여 사용된 플라스틱의 양을 현저하게 감소시킬 수 있다.

도 12는 작업 순서도로서, 위저드^R플러스 에스브이 미니프렙스 DNA 정제 시스템을 사용하여, 단일 콜로니에서 성장시킨 배양액 내의 박테리아로부터 플라스미드 DNA를 분리시키는데 사용되는 실험에 대한 개략적인 내용을 도시하고 있다. 위저드^R플러스 에스브이 미니프렙스 스핀 컬럼은 도 1 내지 도 4에서 도시된 필터 바스켓(10)의 실험예라는 것을 나타내기 위해서 도 12에서 필터 바스켓(10)으로 도시되어 있다. 마찬가지로, 진공 어댑터(12) 및 수집 튜브(46)는 각각 도 5 내지 도 8 및 도 10 및 도 11에서 도시된 진공 어댑터(12)와 수집 튜브(46)의 실험예이다. 작업 순서도(도 12)는 작업 순서도의 왼쪽 경로에 도시된 진공 여과법 또는 작업 순서도의 오른쪽 경로에 도시된 원심 분리법 중의 하나를 사용하여 플라스미드 DNA를 분리하는 시스템을 사용하는 방법을 도시하고 있다.

도 12에서 도시된 공정은, 다섯 가지의 단계(Ⅰ-Ⅴ)로 구성된다. 단계(Ⅰ)에서, 배양 플레이트(3)에서 단일 콜로니(1)의 박테리아를 선택하고, 적절한 항생 물질을 포함하는 1 ml 내지 10 ml의 LB 배지에 접종한다. 최종 접종체는 37 ℃에서 밤새도록(12 내지 16 시간) 배양한다. 밤새 배양된 배양액을 원심 분리하고, 표면에 뜨는 배지는 폐기한다. 이후에 위저드^R플러스 에스브이 미니프렙스 셀 리서스펜션 용액에 펠릿을 완전하게 재부유 처리한다. 단계(Ⅱ)에서, 재부유된 박테리아 세포 용액을 마이크로 원심 분리 튜브(2)로 이동시킨다. 이후에 세포액에 셍포 용해액을 추가하고, 반전 혼합하고, 1 분 내지 5 분간 배양하고, 이후에 셀을 강제로 파괴하고 용액 내로 DNA를 방출시킨다. 알칼라인 프로테아제 용액을 최종 세포 용해액에 추가하고, 실온에서 5 분간 배양한다. 이후에 중화액을 추가하고, 용액의 pH를 중성 또는 생리학적 pH로 맞춘다. 중화액은 또한 DNA가 실리카에 잘 부착되도록 촉진하는 구아니딘을 포함한다. 이후에 최종 중화 혼합물을 원심 분리하여 세포 분쇄물을 펠릿화한다. 단계(Ⅲ)에서, DNA를 분리하는데 사용하는 진공 여과 경로 또는 원심 분리 경로의 어느 것을 사용할 것인가에 따라서 2 ml 수집 튜브(46) 또는 진공 매니폴드(8) 상의 미니프렙 진공 어댑터(12) 내로 위저드^R플러스 에스브이 미니프렙스 스핀 컬럼(개방 단부(24)와 실리카 디스크(28)를 구비한 스핀 바스켓(10)으로 도시된)을 삽입한다. 세포 분쇄물을 펠릿화한 이후에 상청액을 위저드^R플러스 에스브이 미니프렙스 스핀 컬럼 내로 옮겨 따른다.

도 12의 진공 여과 경로(단계: ⅣA)에 진공 매니폴드(8)의 포트(7)에 삽입 장착되는 위저드^R플러스 에스브이 미니프렙스 스핀 컬럼(필터 바스켓(10))이 도시되어 있다. 상기 경로의 단계(ⅣB)에서, 진공을 매니폴드에 가해서 필터 바스켓(10)에서 상청액을 제거하고, 이후에 진공을 해제한다. 필터 바스켓은 위저드^R플러스 에스브이 미니프렙스 컬럼 워시 용액으로 두 번에 걸쳐서 세척하며, 각각의 세척에 뒤이어 진공을 가해서 바스켓에서 세척액을 제거한다. 단계(Ⅳ.C)에서, 수집 튜브(46)로 필터 바스켓(10)을 이동한다. 이후에 원심 분리 장치에서 최종 필터 바스켓/튜브 조립체를 2 분간 회전시켜서 남아있는 모든 컬럼 워시 용액을 제거한다.

대안으로, 도 12의 원심 분리 경로(Ⅳ)에서, 위저드^R플러스 에스브이 미니프렙스 스핀 컬럼(필터 바스켓(10))을 제 2 수집 튜브(46)에 삽입하고, 마이크로 원심 분리에 의해 상청액을 제거한다. 필터 바스켓(10)은 이후에 원심 분리를 사용하여 컬럼 워시 용액으로 두 번 세척하여 바스켓에서 워시 용액을 제거한다. 각각의 세척 이후에 상기 액체를 폐기한다.

상청액을 제거하고 필터 바스켓을 세척하는데 원심 분리 또는 진공 여과법을 사용하든 간에, 용리 단계(Ⅴ)는 도 12에서 수렴하는 화살표로 도시한 바와 같이 동일하다. 보다 상세하게는, 단계(Ⅴ)에서, 위저드^R플러스 에스브이 미니프렙스 스핀 컬럼(필터 바스켓(10))은 살균된 1.5 ml의 마이크로 원심 분리 튜브(9)로 옮겨진다. 무뉴클레아제수를 이후에 추가하고, 최종 조립체를 원심 분리하여 필터 바스켓에서 플라스미드 DNA를 용리한다.

Ⅱ. 시스템 구성

본 실시예에서 사용된 위저드^R플러스 에스브이 미니프렙스 DNA 정화 시스템은 1 ml 내지 10 ml의 배양액에서 50 개의 분리체에 대해 충분한 양의 시약과 성분을 포함한다.

20 ml 위저드^R플러스 에스브이 셀 리서스펜션 용액

20 ml 위저드^R플러스 에스브이 셀 리시스 용액

30 ml 위저드^R플러스 에스브이 뉴트럴라이제이션 용액

20 ml 위저드^R플러스 에스브이 컬럼 워시 용액

50 위저드^R플러스 에스브이 미니프렙스 스핀 컬럼

50 수집 튜브(2 ml)

550 ㎕ 알칼라인 프로테아제 용액

13 ml 무뉴클레아제수

본 시스템의 각 용액의 조성에 대해서는 후술하는 섹션(X)을 참조할 것.

Ⅲ. 플라스미드와 이. 콜라이(E. coli) 균주의 선택과 준비

위저드^R플러스 에스브이 미니프렙스 DNA 정화 시스템을 사용하여 이. 콜라이을 밤새 배양시킨 배약액 1 ml 내지 10 ml에서 플라스미드 DNA를 정제한다. 플라스미드의 수율은 박테리아 배양액의 체적, 플라스미드 복제수, 배양액 배지형 및 박테리아 균주 등을 포함하는 다수의 인자에 의해서 변한다. 본 실시예에서 사용된 프로토콜은 이. 콜라이 박테리아로부터 플라스미드 DNA를 분리하는 것에 관한 것이다.

A. 이. 콜라이의 준비

항생 물질을 포함하는 신선한 루리아-베르타니(LB: Luria-Bertani) 우뭇가사리 플레이트에서 단일하고, 제대로 분리된 이. 콜라이 콜로니를 선택하고, 이 선택된 콜로니를 사용하여 역시 항생 물질을 포함하는 LB 배지에 1 ml 내지 10 ml 접종한다. LB 이외의 배양액 배지, 예를 들어 테리픽 브로쓰(Terrific Broth)와 같은 농후한 배양액 배지를 사용하는 것은 권장하지 않는데, 이들은 DNA 정제 시스템에 과부하를 걸 수 있는 매우 고밀도의 세포 밀도를 초래할 수도 있다. 접종된 LB 배지를 37 ℃에서 밤새(12 시간 내지 16 시간) 배양한다. 배양 기간이 길어짐에 따라서 플라스미드 손실을 초래하는 세포의 파괴와 용해가 발생할 수 있기 때문에, 배지는 16 시간 이상 배양하지는 않는다. 600 안가트롬(Angatrom: OD₆₀₀으로 읽히는)으로 읽히는 2 내지 4의 흡광도는 세포가 충분한 성장 밀도가 되어 수확하고 플라스미드 DNA를 분리하기에 적합하다는 것을 나타낸다.

우뭇가사리와 액체의 양자의 모든 배양 배지에 항생 물질을 포함시켜, 목표로 하는 플라스미드를 포함하는 이. 콜라이 세포만의 번식을 보장한다. 플라스미드가 항생 물질 저항력을 이. 콜라이에 부여하므로, 플라스미드를 포함하지 않는 것과 비교하여 플라스미드를 포함하는 박테리아를 선택할 수 있다. 복제 과정 중에 플라스미드를 포함하지 않는 이. 콜라이의 자손은 플라스미드를 포함하는 것에 비해서 항생 물질 없이 배지 중에서 성장할 수 있다. 따라서, 이와 같은 자손은, 항생 물질의 선택적인 압력이 없는 상태의 플라스미드를 포함하는 세포의 배양액이 과성장하게 된다. 본 실시예에서 사용된 배양액 배지에 포함된 항생 물질은 저항 유전자를 포함하는 분리될 플라스미드에 적합한 하나이다. 하기의 표 1에, 클로닝에 공통적으로 사용된 몇 가지 항생 물질에 대해서 및 모액 농도와 실시 농도를 준비하는 것뿐만 아니라 항생 물질의 효율성을 유지하기 위한 적절한 보관 상태에 대해서도 나열하였다.

B. 플라스미드 DNA의 수율

플라스미드 복제수는 플라스미드 DNA의 수율에 미치는 가장 중요한 인자 중의 하나이다. 복제수는 주로 플라스미드 내의 복제원을 둘러싸고 포함하는 DNA 영역에 의해 결정된다. 상기 영역은, 레플리콘이라고 알려져 있으며, 박테리아 효소 복합물에 의해서 플라스미드 DNA의 복제를 제어한다. 어떤 DNA 서열을 특정 플라스미드에 삽입하여, 복제를 방해하여 플라스미드의 복제수를 감소시킬 수도 있다. 또한, 엄청나게 큰 DNA 삽입체는 플라스미드 복제수를 감소시킨다. 대부분의 경우에, 특정 플라스미드의 생성물의 정확한 복제수는 알려져 있지 않다. 그러나, 이러한 플라스미드의 대부분은 부모 생성물에서 공통적으로 사용된 작은 수에서부터 유도된다. 표 2에 보고된 세포당 복제수와 함께 이와 같은 플라스미드의 몇 가지 종류를 나열하였다. 이와 같은 플라스미드에 대한 공개된 복제수에 근거한 이론적인 수율 또한 표 2에 나열하였다. 본 실시예에 대해서, 고복제수는 플라스미드 복제수가 200 이상이다. 저복제수의 플라스미드는 복제수가 50 미만이다.

*: 이론적인 플라스미드 수율은 보고된 복제수에서 계산하였으며, 각 플라스미드의 크기는 37 ℃에서 16 시간 동안 성장시킨 배양액의 밀리리터당 2.0 ×109 개의 세포가 있다고 가정함.

**: 외부 DNA가 삽입될 수 있는 일련의 특정 제한 부위에 의해서 분리되는 두 개의 서로 다른 박테리오파지 RNA 폴리메라제 억제 인자 서열을 가지는 전사 벡터에 대해서 프로메가 코포레이션(Promega Corporation)의 미국 특허 제 4,766, 072 호가 허여되었다.

표 2에서의 참고 서적:

1. Sambrook, J., Fritsch, E. F. and Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition, Cold Spring Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1.4.

2. Studier, F. W. and Moffat, B. A. (1986) J. Mol. Biol. 189: 113

3. Bolivar, F. et al. (1977) Gene 2: 95

4. Kahn, M. et al. (1979) Meth. Enzymol. 68: 268.

5. Stoker, N. G. et al. (1982) Gene 19: 335.

C. 박테리아 균주의 선택

엔도뉴클레아제Ⅰ는 이중 나선 DNA를 분해하는 12kDa 근플라스미드 단백질이다. 이 단백질은 유전자 endA로 암호화된다. 이. 콜라이(E. coli) 유전자형 endA1은 불활성 형태의 엔도뉴클레아제 Ⅰ를 생성하는 endA 유전자의 돌연변이를 가리킨다. endA 유전자에서의 상기 돌연변이를 가진 이. 콜라이 균주는 endA 네거티브(endA^-)를 가리킨다. 표 3에 endA^-이. 콜라이 균주의 목록을 포함시켰다. 이. 콜라이 유전자형에서 endA1이 없는 것은 활성 엔도뉴클레아제 Ⅰ를 나타내는 야생형 유전자가 존재함음을 암시한다. 상기 야생형은 endA⁺로 표시된다. 위저드^R플러스 에스브이 미니프렙스 DNA 정화 시스템을 사용하여, endA⁺및 endA^-균주의 양자로부터 고품질의 DNA을 용이하게 얻을 수 있다. 그러나, 일부 endA⁺균주는 다수의 응용 분야에서 문제점을 일으킨다는 것을 알았다. 표 4에 야생형 endA 유전자(endA⁺균주)를 가진다고 공지된 이. 콜라이 균주의 목록을 포함시켰다. 일반적으로, 특히 자동 형광 서열 분석과 같은 응용 분야에 대해서 상기 시스템과 함께 가능한한 endA^-균주를 사용할 것을 권장한다.

이. 콜라이의 endA⁺와 endA^-균주의 양자에서 분리되는 플라스미드 DNA의 품질을 향상시키기 위해서는 프로메가(Promega)의 위저드^R플러스 에스브이 미니프렙스 DNA 정화 시스템에 알칼라인 프로테아제 용액이 포함된다. 애초에 서브실리신 칼스버그(subtilisin Calsberg)라고 알려진 알칼라인 프로테아제는, 박테리아 Bacillus licheniformis.에서 분리된다. 문헌 참조(Guentelberg, A. V. and Otteson, M. (1954) Compt. Rend. Trav. Lab. Calsberg 29, 36). 알칼라인 프로테아제는 엔도뉴클레아제를 비활성화시키기 위해서 순수한 박테리아 세포 용해액의 준비 중에 현재 DNA 분리 단계의 용균 단계의 마지막에 첨가된다. 알칼라인 프로테아제는 또한 불특정 절단 단백질로 작용하기 때문에, 순수한 박테리아 세포 용해액 중에 전체적인 단백질 오염 정도를 감소시키게 된다. 문헌 참조(Aehle, W. et al. (1993) J. Biotechnology 28, 31; 및 Van der Osten, C. et al. (1993) J. Biotechnology 28, 55). 알칼라인 프로테아제는 pH 9 또는 그 이상에서 최적으로 활성화된다. 문헌 참조(미국 특허 제 5,352,603 호 및 제 5,439,817 호). 섹션(Ⅵ)에서 위저드^R플러스 에스브이 미니프렙스 DNA 정화 시스템 내에서의 알칼라인 프로테아제의 사용에 대해서 추가적으로 설명한다.

Ⅳ. 자동 형광 서열 분석에서 고려할 사항

자동 형광 서열 분석에서 사용할 플라스미드 DNA를 분리하기 위해서는, 수율과 플라스미드의 품질을 최적화하기 위해 플라스미드형과 이. 콜라이 균주를 특별히 고려하여 선택해야 한다. 최적의 자동 형광 서열 분석의 결과는 고복제수의 플라스미드와 이. 콜라이의 endA^-균주를 사용하여 통상적으로 입수할 수 있다.

정제된 플라스미드 DNA는 적합하게는 0.1 ㎍/㎕ 이하가 아니고, 이상적으로는 0.2 ㎍/㎕인, 자동 사이클의 서열 분석에 성공적인 적절한 농도 범위 내에 들어야 한다. 문헌 참조(Kahn, M. et al. (1979) Meth. Enzymol. 68, 268.) 위저드^R플러스 에스브이 미니프렙스 DNA 정제 시스템을 사용하여 정제된 플라스미드 DNA에 대해서 적합한 농도 범위를 달성하기 위해서는, 후술하는 바와 같이, 박테리아에서 고복제수의 플라스미드로부터 플라스미드 DNA를 분리해야 하며, 이후에 1 ㎍의 분취량을 제거하여 농축하고, 스피드-백(Speed-Vac) 마이크로 원심 분리 장치 내에서 진공하에 건조시킨다. 건조된 DNA는 6 ㎕의 무뉴클레아제수에 재부유 처리하고, 농도를 측정한다. 저복제수의 플라스미드에서의 플라스미드 DNA를 사용하여 작업하는 경우에는, 용리 단계 이후에, 섹션(Ⅶ.A 또는 B)에 나열된 에탄올 침전법을 사용한다. DNA 농도는 적용하기 전에, 저복제수의 플라스미드(Id)를 사용할 때 특히 추천되는 분석 절차인 아가로우스 겔/에티듐 브로마이드 정량화를 수행하여 측정한다. 분광 분석법에 의한 DNA 정량화는 오류가 발생하기 쉽고, 다수의 표본을 필요로 한다.

위저드^R플러스 에스브이 미니프렙스 DNA 정화 시스템은 통상적으로 pGEM^R벡터(pGEM^RVector)와 1.5 ml의 LB 배지의 DH5α^R세포를 사용하는 경우에 3.5 ㎍ 내지 5 ㎍의 플라스미드 DNA를 생산한다. 저복제수의 플라스미드를 서열 분석하기에 충분한 DNA를 얻기 위해서는 더 많은 양의 배양액이 필요하다. 저복제수의 플라스미드의 수율은 pALTER^R-1(Amp') 스트라타겐 벡터(Stratagene Vector) 및 DH5α^R라이프 테크놀로지스: Life Technologies) 세포를 사용하는 경우에, 10 ml의 LB 배양액 배지에서의 플라스미드 DNA는 1.5 ㎍ 내지 3.0 ㎍까지 변동한다.

주: 저복제수의 일부 플라스미드는 플라스미드 정제 시스템에 대해서 낮은 비율의 플라스미드 DNA 때문에 세포 용해액 중의 오염 물질이 상기 시스템 또는 다른 DNA 정제 시스템에 의해서 DNA와의 공동 정제 가능성을 현저하게 증가시킨다는 특별한 문제점을 보인다. 따라서, 자동 형광 서열 분석 응용 분야에 대해서 고복제수의 플라스미드의 사용을 권장한다.

Ⅴ. 사용된 추가적인 물질들

(용액의 조성은 섹션(Ⅹ)에 제시되어 있다.)

항생 물질을 포함한 LB 우뭇가사리 플레이트

항생 물질을 포함한 LB 배지

에탄올(95 %)

14,000 ×g가 가능한 마이크로 원심 분리 장치

살균된 1.5 ml의 마이크로 원심 분리 튜브

선택 사항: 에탄올(70 %)

선택 사항: 7.5 M 암모늄 아세테이트

선택 사항: 파스퇴르 피펫(9" 짜리 또는 팁을 가열하여 연장된 것 중의 하나)

선택 사항: 10X TE 버퍼

선택 사항: 10,000 ×g가 가능한 탁상용 원심 분리 장치(2 ml 내지 10 ml의 배양액 배지에서의 이. 콜라이 수확용)

선택 사항: 진공 매니폴드(즉, 백-맨^R(Vac-Man^R또는 백-맨^R주니어(Vac-Man^RJr.) 래버러토리 진공 매니폴드)

선택 사항: 진공원

Ⅵ. 순수한 세포 용해액의 제조

본원에서 사용된 위저드^R플러스 에스브이 미니프렙스 DNA 정화 시스템 공정에서의 제 1 단계는 순수한 박테리아 세포 용해액의 제조에서 시작된다. 이는 알칼라인 리시스(alkaline lysis)에 이. 콜라이를 포함하는 플라스미드를 노출시켜서(참조: Birnboim, H. C. 및 Doly, J. (1979) Nucl. Acids Res. 7, 1513), 순수하고 점착성이 있는 세포 용해액을 얻음으로써 완수된다. 다음 단계는, 알칼라인 리시스의 중화이며, 이에 의해서 상청액 내의 가용성 플라스미드 DNA와 동시에 세포 분쇄물의 백색 침전물을 형성하게 된다. 원심 분리로 액체를 제거하고 처리하여 플라스미드 DNA를 정제한다.

고복제수의 플라스미드를 분리할 때는(표 2 참조), 다수의 분자 생물학 응용 분야에 적합한 충분한 플라스미드 DNA를 얻기 위해서 5 ml 이상의 박테리아 배양액을 처리할 필요는 없다. 5 ml 이상의 배양액을 처리하게 되면, 위저드^R플러스 에스브이 미니프렙스 스핀 컬럼의 용량을 초과하게 되고, 플라스미드 수율에서의 증가를 관찰할 수 없다. 저복제수의 플라스미드를 분리하는 경우, 10 ml의 박테리아 배양액을 처리하며 추가적인 응용에 대해서 충분한 DNA를 회수할 필요가 있다. 그러나, 10 ml 이상의 배양액을 처리하게 되면 박테리아 세포 용해액의 순수화가 불충분하게 되고, 따라서 플라스미드 DNA에 오염물이 증가하게 된다. 따라서, (저복제수의 플라스미드에 대해서) 10 ml 이상 또는 (고복제수의 플라스미드에 대해서) 5 ml 이상을 처리해야 하는 경우에는, 배양액을 (저복제수에 대해서) 10 ml 또는 (고복제수에 대해서) 5 ml의 분취량으로 분할하고, DNA를 분리하도록 처리하고, 용리된 DNA는 정제 공정의 마지막에서 혼합된다.

알칼라인 프로테아제는 리시스 용액을 추가한 이후에 사용한다. 상기 효소는 대략 표본당 250 ㎍씩 첨가하여 박테리아 세포의 용균 중에 방출되는 엔도뉴클레아제와 다른 단백질을 비활성화한다. 상기 단백질은 분리되는 DNA의 품질에 나쁜 영향을 미칠 수 있다. 알칼라인 리시스 단계 중에 나타나는 pH 9 또는 그 이상의 상태에서 최적으로 활성화되기 때문에 상기 단계 중에는 알칼라인 프로테아제가 유용하다. 상기 방법으로 준비된 플라스미드 DNA 표본에 이월된 알칼라인 프로테아제 활성도를 측정하였다. DNA 표본에 10 ng 미만의 프로테아제가 잔존하고 있음(첨가된 프로테아제의 0.0004 % 이하)을 확인하였고, 플로테아제는 실질적으로 pH 9 이하에서 활성도가 떨어진다는 사실을 확인하였다. 상기 방법에 의해 준비된 DNA를 형광 서열 분석, 제한 효소 절단, 프로메가(Promega)의 TNT^R커플드 트랜스크립션/트랜슬레이션 시스템(Coupled Transcription/Translation System) 및 클로닝을 포함하는 다양한 분자 생물학 응용 분야에서 심도깊게 테스트하였다. 결과는 프로테아제가 상기 응용 분야에서 영향을 미치지 않는다는 것을 나타냈다. 그러나, 알칼라인 프로테아제의 활성도가 문제가 되면, 65 ℃에서 5 분간 DNA 표본을 가열하여 효소를 비가역적으로 비활성화시킬 수 있다.

이하는 위저드^R플러스 에스브이 미니프렙스 DNA 정화 시스템을 사용하는 분리 공정을 시작하기 위해 박테리아 배양액에서 순수한 세포 용해액을 생산하기 위한 후속 단계의 상세한 요약이다. 공정을 시작하기 전에, 위저드^R플러스 에스브이 컬럼 워시 용액을 35 ml의 95 % 에탄올에 희석시켜서 최종 용량을 55 ml로 한다.

<제 1 단계>

고복제수의 플라스미드를 포함하는 1 ml 내지 5 ml의 박테리아 배양액 또는 저복제수의 플라스미드를 포함하는 10 ml의 박테리아 배양액을 탁상형 원심 분리 장치를 사용하여 10,000 ×g에서 5 분간 원심 분리시켜서 펠릿화한다. 상청액은 따라 버리고, 과량의 액체를 제거하기 위해서 페이퍼 타월로 위에서 아래쪽으로 닦아낸다.

<제 2 단계>

250 ㎕의 위저드^R플러스 에스브이 셀 리서스펜션 용액을 추가하고, 보텍스 웰(well) 또는 피펫팅에 의해서 세포 펠릿을 완전하게 재부유 처리한다. 아직 마이크로 원심 분리 튜브 내에 있지 않는 경우에, 살균된 1.5 ml의 마이크로 원심 분리 튜브로 재부유된 세포를 옮긴다.

주: 염색체 DNA의 파괴와 이로 인한 플라스미드 DNA의 오염을 막기 위해서는, 이 단계 이후에 보텍스 처리를 하지 않을 것을 권장한다. 튜브를 단지 거꾸로 하여 혼합해야 한다.

<제 3 단계>

250 ㎕의 위저드^R플러스 에스브이 셀 리시스 용액을 이후에 추가하고, 튜브를 네 번 거꾸로 하여 혼합한다(보텍스 처리를 하지 않는다). 최종 용액을 대략 1 분 내지 5 분간 세포 부유물이 순수해질 때까지 배양한다.

주: 알칼라인 프로테아제 용액을 첨가하는 단계(단계 4)로 진행하기 전에 세포 용해액을 부분적으로 순수하게 해야 한다. 그러나, 5 분 이상 배양하지는 말 것.

<제 4 단계>

10 ㎕의 알칼라인 프로테아제 용액을 첨가하고, 튜브를 네 번 거꾸로 하여 혼합한다. 최종 혼합물은 이후에 실온에서 5 분간 배양한다.

주: 5 분 이상 배양하게 되면 플라스미드 DNA가 파손될 수도 있다.

<제 5 단계>

350 ㎕의 위저드^R플러스 에스브이 뉴트럴라이제이션 용액을 첨가하고 직후에 바로 튜브를 네 번 거꾸로 하여 혼합한다.

<제 6 단계>

박테리아 세포 용해액을 실온에서 10 분간 마이크로 원심 분리 장치에서 14,000 ×g로 원심 분리한다.

Ⅶ. 플라스미드 DNA의 정제

위저드^R플러스 에스브이 미니프렙스 DNA 정화 시스템으로 몇 가지의 플라스미드 DNA의 정제 방법이 가능하다(도 12에서 도시된 두 개의 분리 경로를 참조할 것). 보다 자세하게는, 마이크로 원심 분리를 사용하여 위저드^R플러스 에스브이 미니프렙스 스핀 컬럼을 통해서 박테리아 용균체를 순수하게 하고 플라스미드 DNA를 세척하여 박테리아 용균체에서 플라스미드 DNA를 정제한다. 대안으로는, 진공을 사용하여 박테리아 용균체를 스핀 컬럼(Spin Column)에서 뽑아내고, 플라스미드 DNA를 세척할 수도 있다. 미니프렙 진공 어댑터(Miniprep Vacuum Adapter)는 DNA 정제에 진공 매니폴드(즉, 백-맨^R(Vac-Man^R) 또는 백-맨^R주니어(Vac-Man^RJr.) 래버러토리 진공 매니폴드) 및 진공원을 사용할 수 있도록 한다. 백-맨^R주니어 래버러토리 진공 매니폴드는 1 리터 또는 2 리터의 사이드암 플라스크로 용이하게 삽입되는 단일 장치로서, 두 개의 일방향 루어-록^R(Luer-Lok^R) 콕 마개를 구비한 #8 네오프렌 스토퍼이다. 이것은 물흡입형 진공원과 연합하여 사용된다. 백-맨^R래버러토리 매니폴드는 최대 20 개의 표본을 수용할 수 있는 단일의, 자체 독립식 장치이다.

위저드^R플러스 에스브이 미니프렙스 스핀 컬럼을 사용하기 위해서, 대응하는 표본 번호를 붙이고 진공 매니폴드에 부착되어 있는 미니프렙 진공 어댑터에 삽입한다. 미니프렙 진공 어댑터/스핀 컬럼의 연결부는 스핀 컬럼이 미니프렙 진공 어댑터의 바닥과 마주치지 않도록 설계된다. 이렇게 하여 진공 밀봉을 유지하면서 미니프렙 진공 어댑터를 유지할 수 있게 된다. 순수한 박테리아 세포 용해액(섹션(Ⅵ))을 스핀 컬럼에 추가한다. 진공을 가해서 용액을 스핀 컬럼을 통해서 빨아 들이고 컬럼에 플라스미드 DNA를 남겨둔다. 위저드^R플러스 에스브이 컬럼 워시 용액을 이후에 스핀 컬럼에 적용하고 진공을 통해서 빨아낸다. 스핀 컬럼은 DNA를 용리하기 전에 진공 매니폴드에서 제거한다. DNA의 용리는 무뉴클레아제수를 첨가한 이후에 스핀 컬럼의 원심 분리에 의해서 완수된다(섹션(Ⅶ.A 또는 B)).

본 실시예의 섹션(Ⅶ.A)에는 원심 분리에 의한 플라스미드 DNA 정제를 설명하고, 한편 섹션(Ⅶ.B)에는 진공을 통한 플라스미드 DNA 정제에 대해 상세하게 기술한다.

A. 원심 분리에 의한 방법

각각의 표본에 대해서 하나의 위저드^R플러스 에스브이 미니프렙스 스핀 컬럼을 하나의 2 ml 수집 튜브로 삽입하여 플라스미드 DNA 정제 여과 장치를 준비한다.

<제 1 단계>

순수한 세포 용해액은 Ⅵ에서 설명한 바와 같이 준비하고, 이를 위저드^R플러스 에스브이 미니프렙스 스핀 컬럼에 옮겨 따른다(섹션(Ⅵ), 제 6 단계; 대략 850 ㎕). 상청액과 백색 침전물이 서로 교란되거나 이동되지 않도록 조심스럽게 옮겨 따른다. 백색 침전물이 잘못하여 스핀 컬럼으로 이동되는 경우에는, 스핀 컬럼의 내용물을 다시 살균된 1.5 ml의 마이크로 원심 분리 튜브로 따르고, 14,000 ×g로 5 분 내지 10 분간 원심 분리하고 이후에 다시 옮겨 따른다. 최종 상청액을 본 표본에서 초기에 사용한 동일한 스핀 컬럼으로 옮긴다. 스핀 컬럼은 하기의 후속하는 단계에서 재사용되지만, 동일한 표본에 대해서만 재사용될 뿐이다.

<제 2 단계>

상청액을 실온에서 1 분간 마이크로 원심 분리 장치에서 14,000 ×g로 원심 분리한다. 이후에 튜브에서 위저드^R플러스 에스브이 미니프렙스 스핀 컬럼을 제거하고 수집 튜브에서 흘러 나온 것들은 폐기한다. 이후에 수집 튜브에 스핀 컬럼을 재삽입한다.

<제 3 단계>

750 ㎕의 위저드^R플러스 에스브이 미니프렙스 컬럼 워시 용액을 스핀 컬럼에 첨가한다.

<제 4 단계>

최종 스핀 컬럼 수집 튜브 조립체를 실온에서 1 분간 마이크로 원심 분리 장치 내에서 14,000 ×g로 원심 분리한다.

<제 5 단계>

위저드^R플러스 에스브이 미니프렙스 스핀 컬럼을 수집 튜브에서 제거하고 흘러 나온 것들은 폐기한다. 수집 튜브에 스핀 컬럼을 재삽입한다.

<제 6 단계>

250 ㎕의 위저드^R플러스 에스브이 미니프렙스 컬럼 워시 용액을 스핀 컬럼에 첨가한다.

<제 7 단계>

최종 스핀 컬럼 수집 튜브 조립체를 실온에서 2 분간 마이크로 원심 분리 장치 내에서 14,000 ×g로 원심 분리한다.

<제 8 단계>

위저드^R플러스 에스브이 워시 용액과 스핀 컬럼을 함께 옮기지 않도록 조심하면서, 위저드^R플러스 에스브이 미니프렙스 스핀 컬럼을 새로운, 살균된 1.5 ml의 마이크로 원심 분리 수집 튜브로 옮긴다. 스핀 컬럼에 컬럼 워시 용액이 섞여 있는 경우에는, 상기 조립체를 14,000 ×g로 1 분간 다시 원심 분리하고 나서 새로운 1.5 ml의 수집 튜브로 옮긴다.

<제 9 단계>

플라스미드 DNA를 100 ㎕의 무뉴클레아제수를 위저드^R플러스 에스브이 미니프렙스 스핀 컬럼에 첨가하여 용리한다. 컬럼 수집 튜브 조립체는 이후에 마이크로 원심 분리 장치 내에서 실온으로 1 분간 14,000 ×g로 원심 분리한다.

<제 10 단계>

DNA를 용리한 이후에, 조립체를 1.5 ml 마이크로 원심 분리 수집 튜브에서 제거하고, 위저드^R플러스 에스브이 미니프렙스 스핀 컬럼은 폐기한다. 형광 서열 분석에 저복제수의 플라스미드를 사용하는 경우에 하기의 주를 준수하는 것이 중요하다는 것을 알아냈다.

주: 저복제수의 플라스미드와 다량의 배양액을 사용하여 최적의 형광 서열 분석을 보장하기 위해서는, 스핀 컬럼에서 DNA를 용리한 이후에 에탄올 침전 단계를 수행하여 DNA를 농축하여야 한다. 상기 침전 단계는 하기의 시약과 조건을 준수하여 수행하여야 한다.

<제 11 단계>

용리된 DNA를 다음과 같이 농축한다. 50 ㎕의 7.5 M 암모늄 아세테이트와 375 ㎕의 95 % 에탄올을 100 ㎕의 용리된 DNA 표본에 첨가하여 DNA를 침전시킨다. 최종 혼합물을 실온에서 15 분간 14,000 ×g로 원심 분리한다. 상청액을 9" 파스퇴르 피펫 또는 팁을 가열하여 연장시킨 표준 파스퇴르 피펫의 을 사용하여 반투명의 DNA 펠릿을 교란시키지 않도록 조심스럽게 빨아들인다. 펠릿을 250 ㎕의 70 % 에탄올에 간단하게 세척하고, 이후에 5 분간 14,000 ×g로 원심 분리한다. 이후에 에탄올을 빨아 들이고, 남아있는 에탄올을 소산시키기 위해서 3 분 내지 5 분간 펠릿을 공기 건조한다. 건조 DNA 펠릿은 10 ㎕ 내지 25 ㎕의 무뉴클레아제수에 재부유 처리한다. DNA 펠릿을 재부유 처리하는데 사용된 물의 양은 DNA의 농축에 따라서 실험적으로 결정할 필요가 있다. 본 공정에 따라서 분리된 DNA의 정량화에 아가로우스 겔/에티듐 브로마이드를 사용한다.

<제 12 단계>

최종적으로, 농축되어 분리된 DNA를 준비하고, 100 ㎕의 용리된 DNA에 10 ㎕의 10X TE 버퍼를 첨가하여 TE 버퍼에 보관한다. TE 버퍼 내의 마이크로 원심 분리 튜브의 DNA는 -20 ℃ 또는 그 이하에서 보관한다.

주: DNA는 -20 ℃ 또는 그 이하에서 보관될 때 TE 버퍼와 같은 버퍼를 첨가하지 않고도 물 속에서 안정하다. DNA는 4 ℃의 TE 버퍼 내에서 안정하다.

중요한 사실은 TE 버퍼 내에 DNA 보관 순서를 고려해야 한다는 것이다. 특히, TE 버퍼 내의 EDTA가 효소의 활성도에 대한 인자로써 필요한 마그네슘을 키일레이트와함으로써 일부 효소의 활성도를 억제할 수도 있다. TE 버퍼의 추가(및 EDTA의 존재)는 DNA의 농도가 낮고, 다량의 DNA 용액을 반응에 첨가해야 할 때 가장 큰 문제를 발생시키기 쉽다. TE 버퍼는 형광 DNA 서열 분석에 사용할 수 없다.

B. 진공에 의한 방법

루어-록^R(Luer-Lok^R) 결합부를 구비한 미니프렙 진공 어댑터 하나를 진공 매니폴드(즉, 프로메가(Promega)의 백-맨^R또는 백-맨^R주니어 래버러토리 진공 매니폴드)의 포트 하나에 부착한다. 미니프렙 진공 어댑터에 위저드^R플러스 에스브이 미니프렙스 스핀 컬럼을 제 위치에 제대로 삽입될 때까지 삽입한다.

<제 1 단계>

섹션(Ⅵ)의 제 6 단계에서의 순수한 박테리아 세포 용해액의 상등액을 취하여 위저드^R플러스 에스브이 미니프렙스 스핀 컬럼에 옮긴다. 액체만의 상등액을 취하여 스핀 컬럼으로 옮기기 전에 스핀 컬럼에 침전물이 옮겨지는 경우에는, 액체와 침전물을 다시 마이크로 원심 분리 장치로 부어 넣고 14,000 ×g로 1 분 동안 다시 원심 분리한다(참조: 단계(Ⅵ)의 제 6 단계). 스핀 컬럼은 재사용하지만, 동일한 표본에 대해서만 재사용한다.

<제 2 단계>

진공을 가하여 위저드^R플러스 에스브이 미니프렙스 스핀 컬럼을 통해서 액체를 뽑아낸다. 컬럼을 통해서 모든 액체를 뽑아낸 경우에, 진공을 해제한다.

<제 3 단계>

사전에 95 %의 에탄올로 희석시킨 750 ㎕의 위저드^R플러스 에스브이 컬럼 워시 용액을 스핀 컬럼에 첨가한다(참조: 섹션(Ⅵ)).

<제 4 단계>

진공을 가해서 위저드^R플러스 에스브이 미니프렙스 스핀 컬럼을 통해서 위저드^R플러스 에스브이 컬럼 워시 용액을 뽑아낸다. 스핀 컬럼을 통해서 모든 액체를 뽑아내고, 진공을 해제한다.

<제 5 단계>

250 ㎕의 위저드^R플러스 에스브이 컬럼 워시 용액을 사용하여 세척 공정을 반복한다. 진공을 가해서 위저드^R플러스 에스브이 미니프렙스 스핀 컬럼을 통해서 액체를 뽑아낸다.

<제 6 단계>

진공에 의해서 모든 위저드^R플러스 에스브이 컬럼 워시 용액을 제거하였을 때, 진공을 폐쇄하고 위저드^R플러스 에스브이 미니프렙스 스핀 컬럼을 2 ml의 수집 튜브로 옮긴다. 최종 컬럼 및 수집 튜브 조립체는 2 분간 14,000 ×g로 원심 분리하여 남아있는 컬럼 워시 용액을 제거한다. 2 ml의 수집 튜브와 본 단계 중에 수집된 액체는 원심 분리 이후에 폐기한다.

<제 7 단계>

위저드^R플러스 에스브이 미니프렙스 스핀 컬럼을 새로운, 살균된 1.5 ml의 마이크로 원심 분리 튜브로 옮긴다.

<제 8 단계>

위저드^R플러스 에스브이 미니프렙스 스핀 컬럼에 100 ㎕의 무뉴클레아제수를 첨가하여 플라스미드 DNA를 희석하고, 마이크로 원심 분리 튜브 내에서 실온으로 1 분간 14,000 ×g로 스핀 컬럼과 물을 원심 분리한다.

<제 9 단계>

DNA를 용리시킨 이후에, 1.5 ml의 마이크로 원심 분리 튜브에서 위저드^R플러스 에스브이 미니프렙스 스핀 컬럼을 제거하고 폐기한다. 저복제수의 플라스미드를 사용하는 경우, 특히 자동 형광 서열 분석의 경우에는 하기의 주를 준수하는 것이 중요하다.

주: 저복제수의 플라스미드와 다량의 배양액을 사용하는 경우에 최적의 자동 형광 서열 분석을 보장하기 위해서는, 위저드^R플러스 에스브이 미니프렙스 스핀 컬럼에서 DNA를 용리시킨 이후에 에탄올 침전 단계를 수행하여 DNA를 농축하는 것이 필수이다. 상기 침전 단계는 하기의 시약과 조건을 준수하여 시행하여야 한다.

<제 10 단계>

용리된 DNA는 다음과 같이 농축된다. 50 ㎕의 7.5 M 암모늄 아세테이트와 375 ㎕의 95 % 에탄올을 용리된 DNA 100 ㎕ 표본에 첨가한다. 최종 혼합물을 실온에서 15 분간 14,000 ×g로 원심 분리한다. 9" 파스퇴르 피펫 또는 가열하여 팁을 연장시킨 표준 파스퇴르 피펫을 사용하여 조심스럽게 상청액을 빨아들여서 반투명 DNA 펠릿의 교란을 회피한다. 펠릿은 대략 250 ㎕의 70 % 에탄올로 세척하고, 이후에 5 분간 14,000 ×g로 원심 분리한다. 이후에 에탄올을 빨아들이고, 남아있는 에탄올을 소산시키기 위해서 펠릿을 3 분 내지 5 분간 공기 건조한다. 건조된 DNA 펠릿을 10 ㎕ 내지 25 ㎕의 무뉴클레아제수에 재부유 처리한다. DNA 펠릿의 재부유에 사용된 물의 양은 DNA의 농축도에 따라서 실험적으로 결정할 필요가 있다. 아가로우스/에티듐 브로마이드를 사용하여 본 공정에 따라서 분리된 DNA를 정량화한다.

<제 12 단계>

Ⅷ. 추가적인 고려 사항

A. 대규모로 플라스미드를 준비하기

대규모의 플라스미드를 준비하기 위해서는, 위저드^R플러스 미디프렙스(10 ml 내지 100 ml 배양액; 카탈로그 번호 A7640), 막시프렙스(100 ml 내지 500 ml 배약액; 카탈로그 번호 A7270) 또는 메가프렙스(500 ml 내지 1000 ml 배양액; 카탈로그 번호 A7300)) DNA 정제 시스템을 사용한다. 상기 시스템은 각각 최대 500 ㎍, 1 mg 및 2 mg까지 다량의 플라스미드 정제에 가능하도록 설계되었다.

B. 저융점/겔화 온도의 아가로우스 겔에서의 플라스미드 DNA의 정제

위저드^R플러스 에스브이 미니프렙스 DNA 정화 시스템는 아가로우스 내의 플라스미드 DNA와 함께 사용할 수 있도록 설계되지 않았다. 저융점/겔화 온도의 아가로우스 밴드 슬라이스에서 플라스미드 DNA(원형 또는 선형)를 정제하기 위해서, 프로메가(Promega)의 위저드^R피씨알 프렙스(PCR Preps) DNA 정제 시스템(카탈로그 번호: A7170) 또는 AgarACE^R엔자임(Enzyme)(카탈로그 번호: M1741)의 사용을 권장한다.

Ⅹ. 버퍼 및 용액

위저드^R플러스 에스브이 셀 리서스펜션 용액

50 mM 트리스-HCl(Tris-HCl), pH 7.5

10 mM EDTA

100 ㎍/ml RNase A

위저드^R플러스 에스브이 셀 라이시스 용액

0.2 M NaOH

1 % SDS

위저드^R플러스 에스브이 내추랄리제이션 용액

4.09 M 구아니딘 염산염

0.759 M 칼륨 아세테이트

2.12 M 결정 아세트산

최종 pH는 대략 4.2이다.

10X TE 버퍼

100 mM 트리스-HCl, pH 7.5

10 mM EDTA

위저드^R플러스 에스브이 컬럼 와시 용액

162.9 mM 칼륨 아세테이트

27.1 mM 트리스-HCl, pH 7.5

LB 배지

10 g 카세인 펩톤

5 g 이스트 추출물

5 g NaCl

15 g 우뭇가사리(플레이트에만)

1L의 증류수에 용해시킨다. 오토클레이브 처리하고 항생제를 첨가하기 전에 55 ℃까지 냉각시킨다(표 1 참조).

Claims

원심력 또는 진공을 보조로 하는 여과 물질에 대한 필터 조립체로서,

실린더형 튜브를 구비하고 제 1 단부와 제 2 단부를 갖는 필터 바스켓과, 제 1 단부와 제 2 단부를 구비하는 실린더형 진공 어댑터를 구비하는 진공 매니폴드 어댑터를 포함하며,

상기 필터 바스켓의 제 1 단부는 개방되어 있고, 상기 제 2 단부는 여과 수단을 수용하고 유지하며, 상기 구조는 제 2 단부에서 다공성 구조를 구비하고, 이 다공성 구조는 유체가 관통하여 유동할 수 있는 한편 상기 필터 수단을 지지하고 유지하기 충분한 다공성이며,

상기 어댑터의 제 1 단부는 상기 필터 바스켓의 상기 제 2 단부를 수용하도록 내부적으로 마찰적으로 구성되어 있으며, 상기 어댑터의 상기 제 2 단부는 진공 매니폴드와 결합하고 방출 개구를 한정하도록 내부적으로 구성되어 있는 필터 조립체.
제 1 항에 있어서, 다공성 구조는 필터 바스켓의 제 2 단부를 한정하는 필터 조립체.
제 1 항에 있어서, 상기 필터 수단은 실리카를 포함하는 필터 조립체.
제 1 항에 있어서, 상기 필터 바스켓의 제 2 단부는 수집 튜브 내로 추가적으로 결합되는 필터 조립체.
제 4 항에 있어서, 수집 튜브를 더 포함하는 필터 조립체.
원심력 또는 진공을 사용하여 물질을 여과하기 위한 필터 조립체를 사용하는 핵산 물질 분리 방법으로서,

실린더형 튜브를 구비하고 제 1 단부와 제 2 단부를 갖는 필터 바스켓과, 핵산 물질과 비가역적으로 결합하고 상기 필터 바스켓에 결합되는 필터 수단과, 제 1 단부와 제 2 단부를 갖는 실린더형 진공 어댑터를 구비하는 진공 매니폴드 어댑터와, 개방 단부와 폐쇄 단부를 갖고 상기 필터 수단에 인접한 상기 필터 바스켓의 단부가 수집 튜브의 개방 단부에 결합되는 수집 튜브를 포함하며,

상기 필터 바스켓의 상기 제 1 단부는 개방되어 있고 상기 제 2 단부는 여과 수단을 수용하여 유지하고, 상기 필터 바스켓의 구조는 제 2 단부에 다공성 구조를 갖고, 이 다공성 구조는 제 2 단부에서 다공성 구조를 갖고, 이 다공성 구조는 유체가 관통하여 유동할 수 있는 한편 상기 필터 수단을 지지하고 유지하기 충분한 다공성이며,

상기 어댑터의 제 1 단부는 상기 필터 바스켓의 상기 제 2 단부를 수용하도록 내부적으로 마찰적으로 구성되어 있으며, 상기 어댑터의 상기 제 2 단부는 진공 매니폴드와 결합하고 방출 개구를 한정하도록 내부적으로 구성되어 있고,

상기 방법은,

a. 핵산 물질을 포함하는 세포를 제공하는 단계와,

b. 세포를 용균시키거나 파괴하여 세포 용해액을 형성하는 단계와,

c. 실리카에 핵산 물질의 결합을 촉진할 수 있는 케이아트로픽(chaotropic) 작용제의 분위기 하에서 세포 용해액을 필터 바스켓으로 옮기는 단계와,

d. ① 수집 튜브 내에 필터 바스켓을 위치시키고 이를 원심력에 노출시키거나, ② 매니폴드 어댑터의 제 1 단부에 필터 바스켓을 결합시키고 제 2 단부를 진공 매니폴드에 결합시켜서 진공에 노출하는 것 중의 하나를 포함하는 제거 단계를 사용하여 필터 바스켓에서 세포 용해액을 제거하는 단계와,

e. 원심 분리 또는 진공을 사용하여 필터 바스켓을 세척액으로 세척하는 단계와,

f. 바스켓에 용리 버퍼 또는 물을 첨가하여 필터 바스켓에서 핵산을 용리하고, 바스켓을 제 2 수집 튜브에 위치시키고, 원심력에 노출하는 단계를 포함하는 핵산 물질 분리 방법.
제 6 항에 있어서, 상기 핵산 물질은 실리카를 포함하는 필터 수단과 결합되는 필터 바스켓을 사용하여 분리되는 핵산 물질 분리 방법.