CN109576379A - 鉴定阿胶中驴源性成分的特异性引物、试剂盒及鉴别方法 - Google Patents

鉴定阿胶中驴源性成分的特异性引物、试剂盒及鉴别方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种鉴定阿胶中驴源性成分的特异性引物、试剂盒及鉴别方法，基于驴的CYT B和COX‑1基因设计了大量的引物，且通过大量引物筛选研究，筛选出了具有种属特异性的引物，使用上述引物可用于阿胶中驴源性成分进行鉴定，能将驴与其他混淆品准确的分开，且其PCR扩增产物仅为70～120bp，分子量小，保证了其在短时间内进行大量的阿胶中驴源性成分鉴定，鉴定结果准确、稳定、可靠、灵敏度高。

Description

鉴定阿胶中驴源性成分的特异性引物、试剂盒及鉴别方法
技术领域
本发明属于中药材鉴定技术领域，具体涉及一种鉴定阿胶中驴源性成分的特异性引物、试剂盒及鉴别方法。
背景技术
阿胶(ASINI CORII COLLA)为马科动物驴(Equus asinm L.)的干燥皮或鲜皮经煎煮、浓缩，并可加入适量的黄酒、冰糖及豆油制成的固体胶，具有补血滋阴，润燥，止血的功效，用于治疗血虚萎黄、眩晕心悸、肌痿无力和心烦不眠等症状。阿胶为《中国药典》2015版的收录品种，其药用历史悠久，始载于《神农本草经》，被列为“上品”，称其“可久服轻身益气”，是药食同源的重要物种，尤其在治未病方面功效显著。关于阿胶的医方医案有3200多个，其中包括200多个膏方和200多个食疗方。现代研究表明阿胶能调节身体机能，增强免疫力，在肿瘤辅助治疗、血液病等重大疾病防治上，其治疗优势也正逐步凸显。我国药典明确规定生产阿胶的原料是驴皮。然而，我国驴养殖业发展严重滞后，驴的存栏数呈逐年下滑之势。以致近年制胶原料驴皮短缺、原料价格上涨，造成目前阿胶市场混乱，掺杂使假情况屡屡发生，主要掺假成分包括猪皮、牛皮、马皮甚至皮革下脚料等，给大众用药安全带来重大隐患，因此，建立有效的阿胶质量控制方法是当前急需解决的问题。
传统的阿胶真伪鉴别方法，采用通过产品的外观、颜色和气味等实现，需要极为丰富的个人经验和深厚的专业知识，而各种杂皮胶的制备工艺与正品相似，故其外观性状极为相近，更大大增加了鉴别的难度。
中国专利文献CN105586420A中公开了一种准确鉴别阿胶原料驴源性成分的特异性引物对及其方法，通过DNA提取、PCR特异性扩增、酶切、电泳检测可以鉴别阿胶原料即驴皮中是否存在驴源性成分。中国专利文献CN106636385A公开了一种用于驴源性的实时荧光PCR检测的特异性引物和探针，通过DNA提取、PCR特异性扩增、电泳检测可以鉴别肉食原料是否存在驴源性成分。以上两个专利文献均是对驴的直接产品(驴皮或驴肉)进行鉴定，难度相对较低，直接提取即可得到高质量DNA，然而阿胶为深加工产品，在阿胶的生产过程中，驴皮经高温长时间煎煮，DNA遭到严重破坏，成品中DNA含量少而且片段极短，而且，阿胶成品中主要成分为各种胶原蛋白肽段，大量蛋白的存在会严重影响DNA提取的效率。此外，制备阿胶成品的过程中，不仅要经过长时间煎煮，而且后期要加入黄酒、豆油等辅料，这些辅料的加入会加大提取成品阿胶DNA的难度并引入多种抑制PCR反应的成分，以上原因使得阿胶中驴源性成分的鉴别难度很大，使用上述现有技术的方法鉴定阿胶中驴源性成分时，易出现扩增困难，出现杂带等问题，准确度、灵敏度低，特异性差，均不适用于对阿胶的鉴别。
发明内容
本发明要解决的第一个技术问题在于提供一种鉴定阿胶中驴源性成分的特异性引物，采用所述引物鉴定阿胶中驴源性成分，鉴定结果准确、稳定、可靠、灵敏度高，能够在短时间内对大量阿胶中驴源性成分进行快速鉴定，效率高。
本发明要解决的第二个技术问题在于提供一种鉴定阿胶中驴源性成分的试剂盒，采用所述试剂盒鉴定阿胶中驴源性成分，鉴定结果准确、稳定、可靠、灵敏度高，能够在短时间内对大量阿胶中驴源性成分进行快速鉴定，效率高。
本发明要解决的第三个技术问题在于提供一种鉴定阿胶中驴源性成分的方法，采用所述方法鉴定阿胶中驴源性成分，鉴定结果准确、稳定、可靠、灵敏度高，能够在短时间内对大量阿胶中驴源性成分进行快速鉴定，效率高。
为此，本发明提供了一种用于鉴定阿胶中驴源性成分的引物，所述引物如下：
上游引物：5′-CCCCATCATTCCTACTTCTTCT-3′；
下游引物：5′-TAGGGGAGGATATACGGTTCAG-3′。
本发明还提供了一种鉴定阿胶中驴源性成分的试剂盒，含有所述的引物。
优选的，每支所述试剂盒包括各自独立包装的引物液部分和PCR反应液部分；所述PCR反应液部分含有用于进行PCR扩增的扩增缓冲液、dNTPs、Taq DNA聚合酶以及无菌超纯水。
所述的引物或所述的试剂盒在鉴定产品中驴源性成分中的应用；所述产品包括但不限于驴皮、阿胶半成品、阿胶成品、含阿胶的药物组合物或含阿胶的药物制剂。
本发明还提供了一种鉴定阿胶中驴源性成分的方法，包括如下步骤：
(1)对待测样品进行预处理，得到预处理样品；
(2)提取预处理样品中的总DNA，备用；
(3)以步骤(2)中提取的DNA为模板，采用如下引物进行PCR扩增：
上游引物：5′-CCCCATCATTCCTACTTCTTCT-3′；
下游引物：5′-TAGGGGAGGATATACGGTTCAG-3′；
(4)测定步骤(3)中所得的PCR扩增产物的大小，若所述PCR扩增产物中含有70～120bp的DNA片段，则所述待测样品中存在驴源性成分；反之，则所述待测样品中不存在驴源性成分。
进一步的，所述待测样品预处理方法为透析预处理；
优选的，所透析预处理的具体步骤为：取待测样品，加适量水，温浴烊化，得样品溶液，将样品溶液置于分子量为1～2kd的透析袋中，然后使用适量水作为透析介质对样品溶液进行透析，收集合并透析液，40～85℃的范围内浓缩蒸干，即得预处理样品。
优选的，所述样品溶液制备中，所述待测样品与水的用量比为：3～4重量份：30～50体积份；所述重量份和体积份的比值关系为g/ml；
优选的，所述透析过程中，重复透析2～3次，每次3～12小时；
优选的，所述透析袋内部的样品溶液与透析袋外部的透析介质的体积比为30～50：700～900。
进一步的，在步骤(3)中，所述PCR反应体系包括：
DNA模板，20～40ng/μL，1～5μL；
上游引物，10μM，0.5～1.5μL；
下游引物，10μM，0.5～1.5μL；
Taq DNA聚合酶，5U/μL，0.2～1.2μL；
dNTPs，10mM，0.25～1μL；
10×PCR扩增缓冲液，1.5～4.5μL；
无菌超纯水补至25μL；
优选的，所述PCR扩增程序如下：95℃预变性5min；94℃变性30s，48～68℃退火30s，72℃延伸30s，进行30～40个循环；然后继续72℃延伸5～10min，降温至4℃，获得的扩增产物4℃保存。
进一步的，所述步骤(4)中，所述70～120bp的DNA片段为80bp的DNA片段。
优选的，所述的80bp的DNA片段序列如SEQ ID NO：7所示。
本发明技术方案，具有如下优点：
(1)本发明所述的鉴定阿胶中驴源性成分的特异性引物，基于驴的CYT B和COX-1基因设计了大量的引物，且通过大量引物筛选研究，筛选出了具有种属特异性的引物对，使用上述引物对不仅能够用于简单加工的驴皮、长时间煮沸得到的阿胶半成品，尤其适用于深加工的阿胶产品以及含有阿胶产品的药物组合物和药物制剂中驴源性成分进行鉴定，鉴定结果准确、稳定、可靠、灵敏度高，并能将驴源性成分与其他亲源关系比较近的种属混淆品准确的分开，特异性高，且其PCR扩增产物仅为70～120bp，分子量小，保证了其在短时间内进行大量的阿胶中驴源性成分鉴定。
(2)本发明所述的鉴定阿胶中驴源性成分的试剂盒，所述试剂盒中含有所述的用于鉴定阿胶中驴源性成分的特异性引物，所述引物具有种属特异性，使用上述引物对能够对深加工的阿胶产品以及含有阿胶产品的药物中驴源性成分进行鉴定，鉴定结果准确、稳定、可靠、灵敏度高，并能将驴源性成分与其他亲源关系比较近的种属混淆品准确的分开，特异性高，且其PCR扩增产物仅为70～120bp，分子量小，保证了其在短时间内进行大量的阿胶中驴源性成分鉴定。
(3)本发明所述的鉴定阿胶中驴源性成分的方法，由于阿胶为深加工产品，在生产过程中存在较长时间高温煎煮及浓缩过程，使DNA严重降解；且阿胶主要成分为蛋白质成分，在DNA提取过程中存在污染，易影响后续扩增实验。本发明的鉴定方法首先通过对阿胶进行透析预处理，得到预处理样品，然后通过试剂盒提取总DNA，该方法相比于其他纯化方法，不仅能够明显提高DNA样品的纯度，且对DNA破坏性低，保证了鉴定结果准确性、稳定性、可靠性、灵敏度性。
(4)本发明所述的鉴定阿胶中驴源性成分的方法，所述步骤(3)中，所述70～120bp的DNA片段为80bp的DNA片段，PCR扩增产物分子量小，鉴定结果准确、稳定、可靠、灵敏度高。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单的介绍，很显然下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是实施例3中的琼脂糖凝胶电泳图；
图2是实施例3中PCR产物的测序结果；
图3是对比例1中以长度为138bp的COXI基因为目的基因片段得到的琼脂糖凝胶电泳图；
图4是对比例2中以长度为212bp的COXI基因为目的基因片段得到的琼脂糖凝胶电泳图；
图5是实验例1中对应的实施例4-6和对比例5-7的样品的琼脂糖凝胶电泳图；
图6是不同种属样品的琼脂糖凝胶电泳图。
具体实施方式
本发明所使用的主要样品和试剂如下：
阿胶成品1，厂家：北京同仁堂，批号：15191758；
阿胶成品2，厂家：北京同仁堂，批号：15191761；
阿胶成品3，厂家：北京同仁堂，批号：15191768；
阿胶半成品：将驴皮浸泡去毛，切块洗净，分次水煎，滤过，合并滤液，浓缩至稠膏状，冷凝即可；
黄明胶：将牛皮浸泡去毛，切块洗净，分次水煎，滤过，合并滤液，浓缩至稠膏状，冷凝即可；
猪皮胶：将猪皮浸泡去毛，切块洗净，分次水煎，滤过，合并滤液，浓缩至稠膏状，冷凝即可；
马皮胶：将马皮浸泡去毛，切块洗净，分次水煎，滤过，合并滤液，浓缩至稠膏状，冷凝即可；
空白对照样品：纯水或不加任何物质；
GMO Food DNA Extraction Kit(天根生化科技(北京)有限公司)；
Power Clean Pro DNA Clean-Up Kit DNA PCR抑制因子去除试剂盒(安必胜科技公司)；
DNA片段玻璃奶纯化回收试剂盒(北京庄盟国际生物基因科技有限公司)；
本发明所使用的主要设备如下：
ST16R高速冷冻离心机购自赛默飞世尔、V-GES电泳仪购自威泰克、Dolphin View凝胶成像系统购自威泰克。
实施例1引物
本实施例提供了一种用于鉴定阿胶中驴源性成分的特异性引物，针对驴的COXI基因设计的特异性引物如下，参见序列表中SEQ ID NO：1-2所示：
上游引物：5′-CCCCATCATTCCTACTTCTTCT-3′；
下游引物：5′-TAGGGGAGGATATACGGTTCAG-3′。
上述引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
实施例2试剂盒
本实施例提供了一种用于鉴定阿胶中驴源性成分的试剂盒，每支所述试剂盒包括各自独立包装的引物液部分和PCR反应液部分；所述引物液为含所述实施例1中的所述特异性引物；所述PCR反应液部分含有用于进行PCR扩增的扩增缓冲液、dNTPs、Taq DNA聚合酶以及无菌超纯水，每支所述试剂盒的配方为：
上游引物，10μM，1μL；
下游引物，10μM，1μL；
Taq DNA聚合酶，5U/μL，0.25μL；
dNTPs，10mM，0.5μL；
10×PCR扩增缓冲液，2.5μL；
无菌超纯水补至25μL。
实施例3鉴定方法
(1)待测样品透析预处理
取阿胶成品1、阿胶成品2和阿胶成品3，分别按照如下步骤，进行预处理，得到预处理样品1、预处理样品2和预处理样品3。
取4g阿胶成品，加30ml去离子水，温浴烊化，得样品溶液，将样品溶液置于分子量为1.5kd的透析袋中，以去离子水为透析介质对样品溶液进行透析。室温透析3次，每次使用800ml透析介质。第一次3小时，第二次3小时，第三次12小时，过夜透析，收集合并透析液，在80℃下浓缩并蒸干，即得预处理样品。
(2)DNA提取
取上述预处理样品和阿胶半成品分别采用GMO Food DNA试剂盒提取总DNA，按照说明书操作，步骤如下：
1.称取100mg的上述预处理的样品，加500μl缓冲液GMO1和20μl的Proteinase K(20mg/ml)，旋涡振荡1min。
2. 56℃孵育1h。孵育过程中每15min振荡一次。
3.加入200μl缓冲液GMO2，充分混匀，涡旋振荡1min。室温静置10min。
4. 12,000rpm(～13,400×g)离心5min，将上清转移至新的离心管中。
5.向上清液中加入1μl Carrier RNA，再加入0.7倍体积的异丙醇，充分混匀，12,000rpm(～13,400×g)离心3min，弃上清，保留沉淀(此步沉淀可能看不见)。
6.加入700μl 70％乙醇，涡旋振荡5sec，12,000rpm(～13,400×g)离心2min，弃上清。
7.重复操作步骤6。
8.开盖倒置，室温5-10min，彻底晾干残余的乙醇。
9.加入20-50μl洗脱缓冲液TE，旋涡振荡1min，最终得到DNA溶液。
(3)PCR扩增
以步骤(2)中提取的DNA为模板，采用如下引物进行PCR扩增：
上游引物：5′-CCCCATCATTCCTACTTCTTCT-3′；
下游引物：5′-TAGGGGAGGATATACGGTTCAG-3′。
所述PCR反应体系包括：
DNA模板，50ng/μL，3μL；
上游引物，10μM，0.7μL；
下游引物，10μM，0.7μL；
Taq DNA聚合酶，5U/μL，0.4μL；
dNTPs，10mM，0.5μL；
10×PCR扩增缓冲液，2.5μL；
无菌超纯水补至25μL。
扩增反应在PCR仪上进行，所述PCR扩增程序如下：
94℃预变性5min；94℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸30s，进行40个循环；然后继续72℃延伸7min，降温至4℃。
(4)取步骤(3)中的PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，测得各样品的PCR扩增产物的大小，琼脂糖凝胶电泳法按照2015年版中国药典三部附录ⅣB，胶浓度为2％，核酸染料GelRed浓度为1％，电泳缓冲液为TAE缓冲液(Tris-EDTA-乙酸缓冲液，pH 8.3)，上述步骤(3)中获得的各样品的PCR反应溶液的上样量分别为10μL，DNA分子量标记(50bp DNALadder Marker)上样量为5μL，电泳结束后，在凝胶成像仪上观察结果。
结果见图1所示，条带1为阿胶成品1，条带2为阿胶成品2，条带3为阿胶成品3，条带4为阿胶半成品，条带5为空白对照样品，条带6为Marker(50bp)，从图中可以看出阿胶成品与阿胶半成品同时具有特征谱带，则证明所述阿胶成品和阿胶半成品中同时存在驴源性成分，所得DNA序列如如SEQ ID NO：7所示的，取阿胶产品1的PCR扩增产物进行DNA序列测定，所得测序结果与NCBI中公开的驴源性基因序列相符，见图2所示。
实施例4鉴定方法
本实施例提供了一种鉴定阿胶中驴源性成分的方法，包括如下步骤：
(1)阿胶样品透析预处理
取3.5g阿胶成品1，加40ml去离子水，温浴烊化，得样品溶液，将样品溶液置于分子量为1.8kd的透析袋中，以去离子水为透析介质对样品溶液进行透析。室温透析2次，每次使用850ml透析介质。第一次3小时，第二次12小时，过夜透析，收集合并透析液，在80℃下浓缩并蒸干，即得预处理样品。
(2)DNA提取
取预处理样品采用GMO Food DNA试剂盒提取总DNA，按照说明书操作，且与前述GMO Food DNA试剂盒的提取步骤相同。
(3)PCR扩增
以步骤(2)中提取的DNA为模板，采用如下引物进行PCR扩增：
上游引物：5′-CCCCATCATTCCTACTTCTTCT-3′；
下游引物：5′-TAGGGGAGGATATACGGTTCAG-3′。
所述PCR反应体系包括：
DNA模板，50ng/μL，1μL；
上游引物，10μM，1.5μL；
下游引物，10μM，1.5μL；
Taq DNA聚合酶，5U/μL，1.2μL；
dNTPs，10mM，0.25μL；
10×PCR扩增缓冲液，2.0μL；
无菌超纯水补至25μL。
扩增反应在PCR仪上进行，所述PCR扩增程序如下：
95℃预变性5min，95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，进行30个循环，然后继续72℃延伸10min，降温至4℃。
(4)取步骤(3)中的PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，测得各样品的PCR扩增产物的大小，琼脂糖凝胶电泳法按照2015年版中国药典三部附录ⅣB，胶浓度为2％，核酸染料GelRed浓度为1％，电泳缓冲液为TAE缓冲液(Tris-EDTA-乙酸缓冲液，pH 8.3)，上述步骤(2)中获得的各样品的PCR反应溶液的上样量分别为10μL，DNA分子量标记(50bp DNALadder Marker)上样量为5μL，电泳结束后，在凝胶成像仪上观察结果。若所述PCR扩增产物中含有80bp的DNA片段，则所述阿胶存在驴源性成分；反之，则所述阿胶不存在驴源性成分。
实施例5
本实施例提供了一种鉴定阿胶中驴源性成分的方法，包括如下步骤：
(1)阿胶样品透析预处理
取3g阿胶成品2，加50ml去离子水，温浴烊化，得样品溶液，置于分子量为1.0kd的透析袋中，以去离子水为透析介质对样品溶液进行透析。室温透析3次，每次使用900ml透析介质。第一次3小时，第二次3小时，第三次12小时，过夜透析，收集合并透析液，在60℃下浓缩并蒸干透析液，即得预处理样品。
(2)DNA提取
取预处理样品采用GMO Food DNA试剂盒提取总DNA，按照说明书操作，步骤同实施例5。
(3)PCR扩增
以步骤(2)中提取的DNA为模板，采用如下引物进行PCR扩增：
上游引物：5′-CCCCATCATTCCTACTTCTTCT-3′；
下游引物：5′-TAGGGGAGGATATACGGTTCAG-3′。
所述PCR反应体系包括：
DNA模板，50ng/μL，5μL；
上游引物，10μM，0.5μL；
下游引物，10μM，0.5μL；
Taq DNA聚合酶，5U/μL，0.5μL；
dNTPs，10mM，1.0μL；
10×PCR扩增缓冲液，1.5μL；
无菌超纯水补至25μL。
扩增反应在PCR仪上进行，所述PCR扩增程序如下：
95℃预变性5min，95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，进行40个循环，然后继续72℃延伸5min，降温至4℃。
(4)取步骤(3)中的PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，测得各样品的PCR扩增产物的大小，琼脂糖凝胶电泳法按照2015年版中国药典三部附录ⅣB，胶浓度为2％，核酸燃料GelRed浓度为1％，电泳缓冲液为TAE缓冲液(Tris-EDTA-乙酸缓冲液，pH 8.3)，上述步骤(2)中获得的各样品的PCR反应溶液的上样量分别为10μL，DNA分子量标记(50bp DNALadderMarker)上样量为5μL，电泳结束后，在凝胶成像仪上观察结果。若所述PCR扩增产物中含有80bp的DNA片段，则所述阿胶存在驴源性成分；反之，则所述阿胶不存在驴源性成分。
实施例6
本实施例提供了一种利鉴定阿胶中驴源性成分的方法，包括如下步骤：
(1)阿胶样品透析预处理
取4g阿胶成品3，加30ml去离子水，温浴烊化，得样品溶液，置于分子量为2.0kd的透析袋中，以去离子水为透析介质对样品溶液进行透析。室温透析3次，每次使用900ml透析介质。第一次3小时，第二次6小时，第三次8h，过夜透析，收集合并透析液，在60℃下浓缩并蒸干透析液，即得预处理样品。
(2)DNA提取
取预处理样品采用GMO Food DNA试剂盒提取总DNA，按照说明书操作，步骤同实施例5。
(3)PCR扩增
以步骤(2)中提取的DNA为模板，采用如下引物进行PCR扩增：
上游引物：5′-CCCCATCATTCCTACTTCTTCT-3′；
下游引物：5′-TAGGGGAGGATATACGGTTCAG-3′。
所述PCR反应体系包括：
DNA模板，50ng/μL，1μL；
上游引物，10μM，1.5μL；
下游引物，10μM，0.5μL；
Taq DNA聚合酶，5U/μL，1.2μL；
dNTPs，10mM，0.25μL；
10×PCR扩增缓冲液，4.5μL；
无菌超纯水补至25μL。
扩增反应在PCR仪上进行，所述PCR扩增程序如下：
95℃预变性5min，95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，进行40个循环，然后继续72℃延伸5min，降温至4℃。
(4)取步骤(3)中的PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，测得各样品的PCR扩增产物的大小，琼脂糖凝胶电泳法按照2015年版中国药典三部附录ⅣB，胶浓度为2％，核酸燃料GelRed浓度为1％，电泳缓冲液为TAE缓冲液(Tris-EDTA-乙酸缓冲液，pH 8.3)，上述步骤(2)中获得的各样品的PCR反应溶液的上样量分别为10μL，DNA分子量标记(50bp DNALadderMarker)上样量为5μL，电泳结束后，在凝胶成像仪上观察结果。若所述PCR扩增产物中含有80bp的DNA片段，则所述阿胶存在驴源性成分；反之，则所述阿胶不存在驴源性成分。
对比例1
取阿胶成品1，阿胶成品2和阿胶成品3按照实施例3所示的方法进行鉴定，唯一实施例3的不同之处在于：步骤(3)中采用的引物对不同，本对比例中采用如SEQ ID NO：8所示的长度为138bp的COXI基因设计的引物对如下，参见序列表中SEQ ID NO：3-4所示：
上游引物：5′-TCCCAACCGGTGTAAAAGTATT-3′；
下游引物：5′-TAGCCAAGACGATTCCTGTTAG-3′。
结果如图3所示，条带1为DNA Marker(50bp)，条带2为阿胶成品1，条带3为阿胶成品2，条带4为阿胶成品3，条带5为驴皮，条带6为阿胶半成品，条带7为空白对照样品；从图中可知，阿胶成品中DNA不能有效扩增，杂带较多，无法准确鉴定，与阿胶成品制备过程中经过长时间煎煮以及加入多种辅料有关。
对比例2
取阿胶成品1，阿胶成品2和阿胶成品3按照实施例3所示的方法进行鉴定，唯一实施例3的不同之处，在于步骤(3)中，采用的引物对不同，本对比例中采用如SEQ ID NO：9所示的长度为212bp的COXI基因设计的引物对如下，参见序列表中SEQ ID NO：5-6所示：
上游引物：5′-TTCCCCCATCATTCCTACTTCT-3′；
下游引物：5′-GGGCTGGTGGTTTTATGTTGA-3′：
如图4所示，条带1为DNA Marker(50bp)，条带2为阿胶成品1，条带3为阿胶成品2，条带4为阿胶成品3，条带5为驴皮，条带6为阿胶半成品，条带7为空白对照样品；从图中可以看出，阿胶半成品和阿胶成品均无有效片段扩增，与阿胶成品和阿胶半成品在制备中经过长时间煎煮有关。
对比例3
取阿胶成品1按照实施例3的方法进行鉴定，与实施例2的区别仅在于去除步骤(1)的预处理，而在步骤(2)提取DNA后，增加试剂盒纯化方法，本对比例中，使用Power CleanPro DNA Clean-Up Kit DNA PCR抑制因子去除试剂盒对步骤(2)提取的DNA进行纯化，按照说明书操作，步骤如下：
1.加入100μL DNA样品到一个2mL Collection Tube(试剂盒提供)中。若DNA样品少于100μL，加入双蒸水调整体积。
2.加入50μL Solution DC 1到DNA溶液中，稍微涡旋混匀。
3.加入50μL Solution DC2，稍微涡旋混匀。
4.室温13000g离心2min。
5.避开沉淀，转移所有上清到一个新的2mL Collection Tube(试剂盒提供)中。
6.使用前摇匀Solution DC3。加入400μL Solution DC3，稍微涡旋混匀。
7.稍微离心，把Tube管帽上的溶液离下来。
8.最多加载600μL上步混合液到Spin Filter上，室温10000g离心1min，弃去滤液。
9.加入500μL Solution DC4到Spin Filter上，室温10000g离心30s，弃去滤液。
10.再加500μL Solution DC4到Spin Filter上，室温10000g离心30s，弃去滤液。
11.室温下最大转速充分甩干步骤9和10残留下来的乙醇。
12.小心转移Spin Filter到一个新的2mLCollection Tube(试剂盒提供)中。避免再次接触到任何Solution DC4。
13.若起始样品含有50μL基因组DNA，加入50μL Solution DC5到白色滤膜中心。若其实样品为100μL基因组DNA，则加入100μL Solution DC5到白色滤膜中心。室温孵育1min。
14.弃去Spin Filter。在收集管中的DNA可直接用于下游实验。
对比例4
取阿胶成品1按照实施例3的方法进行鉴定，与实施例2的区别仅在于去除步骤(1)的预处理，而在步骤(2)提取DNA后，增加试剂盒纯化方法，本对比例中，使用DNA片段玻璃奶纯化回收试剂盒对步骤(2)提取的DNA进行纯化，按照说明书操作，步骤如下：
1.在DNA溶液中加入2倍体积的溶胶液和10μL玻璃奶，振荡混匀，室温下放置5分钟，其间每隔2-3分钟混匀一次，12,000rpm离心30秒，吸弃上清。
2.加250μL漂洗液W2，用加样器吹打漂洗液，轻柔地将玻璃奶悬浮混匀,12,000rpm离心30秒，吸弃上清。
3.重复步骤2。吸取完漂洗液后再离心10秒钟，用10μL Tip头将最后一点儿漂洗液吸干净。然后，放置于37℃温箱干燥15-20分钟。
4.加适量洗脱缓冲液TE，混匀，60℃水浴5分钟，12,000rpm离心1分钟，回收上清备用。重复步骤4，能提高回收率。
对比例5
取阿胶成品1，按照实施例4的方法进行鉴定，与实施例4的区别仅在于阿胶成品1不经步骤(1)的预处理而是直接进行DNA提取。
对比例6
取阿胶成品2，按照实施例5的方法进行鉴定，与实施例5的区别仅在于阿胶成品2不经骤(1)的预处理而是直接进行DNA提取。
对比例7
取阿胶成品3，按照实施例6的方法进行鉴定，与实施例6的区别仅在于阿胶成品3不经骤(1)的预处理而是直接进行DNA提取。
实验例1DNA提取方法的考察
利用紫外分光光度计法检测实施例4-6和对比例5-7步骤(2)提取的总DNA的OD260值，以及对比例3和4纯化后的总DNA的OD260值，并计算OD260/OD280比值，根据OD260/OD280比值来考察所提取DNA样品纯度，当OD260/OD280比值介于1.8～2.0之间时，说明样品纯度较高，当样品中如果含有蛋白质干扰，OD260/OD280比值会明显下降，结果如下表所示。
从上表可知，相比于对比例3-7来说，本发明实施例4-6提取的DNA的OD260/OD280比值明显提高，且均在介于1.8～2.0之间，说明采用本发明中通过对阿胶成品进行预处理，提取的DNA的浓度和纯度得到显著提高，且经PCR扩增可用于鉴定阿胶中是否存在驴源性成分。
此外，从图5中可以看出，条带1为DNA Marker(50bp)，条带2为对比例5，条带3为对比例6，条带4为对比例7，条带5为驴皮，条带6为阿胶半成品，条带7为空白对照样品，条带8为实施例4，条带9为实施例5，条带10为实施例6，实施例4-6的阿胶成品具有特征谱带，明亮清晰，则证明所述阿胶成品中存在驴源性成分，而对比例5-7的谱带模糊或不可见。
实验例2特异性考察实验
为保证分子鉴别结果的可靠性，本实验收集了阿胶成品1、黄明胶、猪皮胶、马皮胶为待测样品，以对本实验方法进行适用性验证，确认本方法准确、可靠。
(1)阿胶样品透析预处理
取阿胶成品1、黄明胶、猪皮胶和马皮胶，分别按照实施例3公开的阿胶样品预处理步骤，进行预处理，得到预处理样品1、黄明胶预处理样品、猪皮胶预处理样品和马皮胶预处理样品。
(2)DNA提取
取预处理样品1、黄明胶预处理样品、猪皮胶预处理样品和马皮胶预处理样品分别采用GMO Food DNA试剂盒提取总DNA，按照说明书操作，具体方法见实施例3中公开的DNA提取方法。
(3)PCR扩增
以步骤(2)中提取的DNA为模板，采用如下引物进行PCR扩增：
上游引物：5′-CCCCATCATTCCTACTTCTTCT-3′；
下游引物：5′-TAGGGGAGGATATACGGTTCAG-3′。
所述PCR反应体系：同实验例1中的PCR反应体系。
扩增反应在PCR仪上进行，所述PCR扩增程序：同实施例3中的PCR扩增程序。
(4)凝胶电泳
取步骤(3)中的PCR扩增产物分别进行琼脂糖凝胶电泳，方法同实施例3公开的琼脂糖凝胶电泳步骤，电泳结束后，在凝胶成像仪上观察结果。
如图6所示，条带1为阿胶成品1，条带2为黄明胶，条带3为猪皮胶，条带4为马皮胶，条带5为空白对照样品，条带6为Marker(50bp)；其中只有条带1对应的阿胶能够扩增得到目的片段，而与驴皮种属接近的猪皮胶、黄明胶、马胶皮均不能扩增得到目的片段，说明本发明鉴定方法具有优良的种属特异性。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
SEQUENCE LISTING
<110> 北京同仁堂科技发展股份有限公司
<120> 鉴定阿胶中驴源性成分的特异性引物、试剂盒及鉴别方法
<130> HA201804184
<160> 9
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
ccccatcatt cctacttctt ct 22
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 2
taggggagga tatacggttc ag 22
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 3
tcccaaccgg tgtaaaagta tt 22
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 4
tagccaagac gattcctgtt ag 22
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 5
ttcccccatc attcctactt ct 22
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 6
gggctggtgg ttttatgttg a 21
<210> 7
<211> 80
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 7
ccccatcatt cctacttctt cttgcttcct caataattga agcaggcgct ggaacaggct 60
gaaccgtata tcctccccta 80
<210> 8
<211> 138
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 8
tcccaaccgg tgtaaaagta tttagctgac tagctaccct gcacggagga aatatcaaat 60
gatctccagc tatactctga gctctaggct tcatcttctt attcacagta ggaggcctaa 120
caggaatcgt cttggcta 138
<210> 9
<211> 212
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 9
ttcccccatc attcctactt cttcttgctt cctcaataat tgaagcaggc gctggaacag 60
gctgaaccgt atatcctggc tagctggaaa tctagcgcac gcaggggctt ctgttgactt 120
aaccatcttc tcccttcacc tagctggtgt atcttcaatt ttaggtgcca tcaatttcat 180
taccacaatc atcaacataa aaccaccagc cc 212

Claims (10)

1.一种鉴定阿胶中驴源性成分的特异性引物，其特征在于，所述引物如下：
上游引物：5′-CCCCATCATTCCTACTTCTTCT-3′；
下游引物：5′-TAGGGGAGGATATACGGTTCAG-3′。
2.一种鉴定阿胶中驴源性成分的试剂盒，其特征在于，含有权利要求1所述的引物。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，每支所述试剂盒包括各自独立包装的引物液部分和PCR反应液部分；所述PCR反应液部分含有用于进行PCR扩增的扩增缓冲液、dNTPs、Taq DNA聚合酶以及无菌超纯水。
4.一种如权利要求1所述的引物或权利要求2或3所述的试剂盒在鉴定产品中驴源性成分中的应用；
所述产品包括但不限于驴皮、阿胶半成品、阿胶成品、含阿胶的药物组合物或含阿胶的药物制剂。
5.一种鉴定阿胶中驴源性成分的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)对待测样品进行预处理，得到预处理样品；
(2)提取预处理样品中的总DNA，备用；
(3)以步骤(2)中提取的DNA为模板，采用如下引物进行PCR扩增：
上游引物：5′-CCCCATCATTCCTACTTCTTCT-3′；
下游引物：5′-TAGGGGAGGATATACGGTTCAG-3′；
(4)测定步骤(3)中所得的PCR扩增产物的大小，若所述PCR扩增产物中含有70～120bp的DNA片段，则所述待测样品中存在驴源性成分；反之，则所述待测样品中不存在驴源性成分。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述待测样品预处理方法为透析预处理；
优选的，所透析预处理的具体步骤为：取待测样品，加适量水，温浴烊化，得样品溶液，将样品溶液置于分子量为1～2kd的透析袋中，然后使用适量水作为透析介质对样品溶液进行透析，收集合并透析液，40～85℃的范围内浓缩蒸干，即得预处理样品。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述样品溶液制备中，所述待测样品与水的用量比为：3～4重量份：30～50体积份；所述重量份和体积份的比值关系为g/ml；
优选的，所述透析过程中，重复透析2～3次，每次3～12小时；
优选的，所述透析袋内部的样品溶液与透析袋外部的透析介质的体积比为30～50：700～900。
8.根据权利要求5-7中任一所述的方法，其特征在于，在步骤(3)中，所述PCR反应体系包括：
DNA模板，20～40ng/μL，1～5μL；
上游引物，10μM，0.5～1.5μL；
下游引物，10μM，0.5～1.5μL；
Taq DNA聚合酶，5U/μL，0.2～1.2μL；
dNTPs，10mM，0.25～1μL；
10×PCR扩增缓冲液，1.5～4.5μL；
无菌超纯水补至25μL；
优选的，所述PCR扩增程序如下：95℃预变性5min；94℃变性30s，48～68℃退火30s，72℃延伸30s，进行30～40个循环；然后继续72℃延伸5～10min，降温至4℃，获得的扩增产物4℃保存。
9.根据权利要求5-8任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤(4)中，所述70～120bp的DNA片段为80bp的DNA片段。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述的80bp的DNA片段序列如SEQ ID NO：7所示。
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