CN108027335A - 生物分子传感器和方法 - Google Patents

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Abstract

公开了配置成检测单分子靶标的电子传感器以及使用和制造这种电子传感器的方法。传感器可以包括由传感器间隙分开的第一电极和第二电极。所述第一和第二电极可以通过可包含生物聚合物桥分子和探针的传感器复合物偶联。探针可以与靶分子相互作用，并且探针和靶分子的相互作用可以产生适合于提供靶分子检测的信号。

Description

生物分子传感器和方法
相关申请的交叉参考
本申请要求于2015年6月25日提交的标题为“分子电子传感器的方法、组合物、设备和制造方法(METHODS，COMPOSITIONS，APPARATUS AND MANUFACTURING METHODS OFMOLECULAR ELECTRONIC SENSORS)”的美国临时专利申请号62/184,776的优先权，其公开内容通过引用纳入本文。
技术领域
本公开涉及电子传感器装置。具体而言，本公开涉及在测量电路中包括一个或多个生物分子组件的电子传感器装置。
背景技术
由于所需的灵敏度以及存在许多潜在的噪音源，在分子尺度上测量性质存在很多挑战。因此，在描述用于此目的的传感器时，清楚所有测量误差的来源是有帮助的。一般而言，对于任何可能被测量的系统或对象，测量的状态m仅仅是实际系统状态a的近似值。这可能是由于许多因素中的任何造成的，例如由传感器的操作、读出过程或信号解释导致的反映错误的不完美的信号解释，以及可能因为在某些情况下将传感器与系统接触会干扰系统的状态。测量的状态m不同于实际的状态a反映了合并的传感器、读出和解释的测量误差。理想情况下，构建传感器系统以尽可能减小这种测量误差。
为了测量分子级别的状态，例如在对DNA分子进行测序的情况下，已经致力于建立传感器系统，其中传感器装置具有与感兴趣分子接触的“探针”，优选在单分子尺度上，而传感器装置的其他特征处于较大的纳米或微米尺度以为了制造传感器装置或将它们集成到信号传导系统中。
具体而言，生物传感器是一种分析装置，其将生物识别成分功能性地整合到信号转导系统中，以测量生物相关分子(例如DNA，RNA或蛋白质)的性质。这种整合提供了生物事件向可检测电信号的快速和方便的转换。在已经设计的各种电生物传感架构中，基于场效应晶体管(FET)的系统看起来很有前景，因为它们可以直接将靶分子(例如生物分子)和FET表面之间的相互作用转化为可检测的电信号。在典型的FET装置中，电流沿着连接到两个电极(也被称为源极和漏极)的通道流动。源极和漏极之间的通道电导可以通过第三电极(也称为栅极)来调制，该第三电极通过薄介电绝缘层电容偶联至通道。FET可用于检测靶化学品并测量各种商业应用的化学浓度。经典和广泛使用的例子是基于FET的pH传感器，用于测量氢离子浓度。这是Bergveld在二十世纪七十年代推出的，用于固态pH传感器。离子敏感场效应晶体管(ISFET)装置的一般领域扩展了其他化学浓度测量的概念。
目前的FET型生物传感器系统的局限性在于它们的灵敏度。目前的生物传感器系统不能进行单分子检测和鉴定。同样，他们无法监测单分子反应动力学。FET型生物传感器的这些灵敏度限制阻止其在重要的生物化学测定中(例如在单分子测序反应中)用作检测器。
改善FET生物传感器灵敏度的一些努力集中于使用碳纳米结构(例如碳纳米管)来形成电极之间的通道。然而，碳纳米结构在生物传感器功能化方面提出了各种障碍。特别是，无法在特定的理想原子位置处的附连位点中进行工程设计，从而附连功能性或敏感性探针分子。此外，目前对碳纳米结构合成的精度，控制和规模的限制对于单个传感器的灵敏度和可靠生产，建立高密度可扩展的传感器阵列以及传感器制造的商业可行性提出了更多挑战。目前的碳纳米管合成方法通常产生长度大约为100nm或更长的结构，该尺度很可能在多传感器平台上对灵敏度和传感器密度造成限制。
因此，需要这样的分子级电子生物传感器装置，其具有与增加的灵敏度和精确度兼容的架构，可靠的工程设计，并且还与高效且商业可行的制造方法兼容以用于在多传感器平台上实现增加的传感器密度。同样，也需要制造这种传感器装置的改进方法。
发明内容
本公开总体上涉及传感器，包括传感器的系统以及形成和使用传感器和系统的方法。示例性的传感器可以用于例如对分子，例如DNA，RNA或其他寡核苷酸进行测序。尽管本公开的各种实施方式解决现有技术传感器的缺点的方式在下面更详细地讨论，但是一般而言，本公开提供了相对简单且制造便宜的传感器。
根据本公开的各种实施方式，传感器包括偶联到第一电极的第一触件，偶联至第二电极的第二触件，在所述第一触件和所述第一电极中的一个与所述第二触件和所述第二电极中的一个之间限定的传感器间隙，和包含第一端和第二端的桥分子，其中所述桥分子在所述第一端偶联至所述第一触件并且在所述第二端偶联至所述第二触件。根据这些实施方式的各个方面，桥分子是生物聚合物，或桥分子是化学合成的。根据其他方面，传感器包括第三或栅电极。在这些情况下，可以使用栅电极来调谐和/或激活传感器装置。根据其他方面，传感器间隙具有约5nm至约30nm的传感器间隙尺寸。根据其他方面，第一端或桥分子包含第一自组装锚；根据另外的方面，第二端包括第二自组装锚。示例性的桥分子可以包括以下属性中的一个或多个：桥分子可以是线性的(例如，线性生物聚合物)，桥分子具有小于桥分子的持续长度的端到端长度，并且桥分子包括被配置为近似传感器间隙的尺寸的端到端长度。示例性的传感器包括附连到桥分子上的探针。探针可以被配置为与单个靶分子结合。示例性探针可以包括或者是被配置成在溶液中反应期间与靶分子接合的酶。
根据本公开的其他实施方式，传感器包括覆盖基材表面的第一电极，覆盖基材表面的第二电极，在第一电极和第二电极之间(或附连到电极的触件之间)限定的传感器间隙，以及包含第一端和第二端的桥分子，其中所述桥分子在所述第一端处偶联至第一触件并且在所述第二端处偶联至第二触件。传感器间隙可以包括约5nm至约30nm的传感器间隙尺寸。根据这些实施方式的各个方面，桥分子是生物聚合物，或桥分子是化学合成的。根据其他方面，传感器包括第三或栅电极。在这些情况下，可以使用栅电极来调谐和/或激活传感器装置。根据其他方面，第一端或桥分子包含第一自组装锚；根据另外的方面，第二端包括第二自组装锚。示例性的桥分子可以包括本文所述的一个或多个属性。示例性的传感器包括附连到桥分子上的探针。探针可以被配置为与单个靶分子结合。示例性探针可以包括或者是被配置成在溶液中反应期间与靶分子接合的酶。
根据其他示例性实施方式，系统包括如本文所述的传感器。该系统可以另外包括一个或多个电路，例如使用基材形成的电路，所述基材用于形成传感器或者传感器驻留在其上。系统可以附加地或可选地包括其他电路和/或设备，从而例如从信号中去除噪音和/或辅助对信号的解释。
根据本公开的其他实施方式，方法包括提供传感器，例如本文所述的传感器；使核酸模板与聚合酶接触，其中所述聚合酶与包含传感器的一部分的桥分子偶联；提供核苷酸碱基混合物；通过聚合酶进行纳入事件，所述纳入事件包括将来自核苷酸碱基混合物的核苷酸纳入合成的核酸中；并检测由纳入事件产生的信号。根据这些实施方式的各个方面，方法还可以包括向传感器施加电势的步骤-从而例如调谐或激活传感器。根据另外的方面，可以从信号中去除噪音。
根据其他实施方式，制造生物分子感测装置的方法包括以下步骤：在基材表面上形成第一电极和第二电极，其中第一电极和第二电极通过电极间隙分开；将第一触件放置在所述第一电极上并且将第二触件放置在所述第二电极上，其中所述第一触件和所述第二触件被触件间隙分开；并将桥分子附着到第一触件和第二触件。示例性方法可以进一步包括使桥分子与探针接触以将探针与桥分子偶联的步骤。
并且，根据本公开的其他实施方式，对寡核苷酸进行测序的方法包括使用如本文所述的一个或多个传感器。
附图说明
本发明的主题将在说明书结束部分特别指出并明确地要求保护。然而，通过参考结合附图考虑的详细描述和权利要求，可以最好地获得对本公开的更完整的理解。
图1示出了根据各种实施方式的传感器的示意图；
图2A和2B示出了根据各种实施方式的传感器装置的视图；
图3示出了根据各种实施方式的传感器的一部分的轮廓图；
图4示出了根据各种实施方式的包含生物聚合物桥分子的传感器；
图5示出了根据各种实施方式的包含生物聚合物桥分子的传感器；
图6A和6B示出了根据各种实施方式的传感器装置的视图；
图7示出了根据各种实施方式的噪音去除之前和之后的信号轨迹；
图8示出了根据各种实施方式的使用CMOS技术制造电极的方法的工艺流程；
图9示出了根据各种实施方式的使用CMOS技术制造触件的方法的工艺流程；
图10示出了根据各种实施方式的使用CMOS技术制造触件并沉积预制的触件颗粒(contact paticles)的方法的工艺流程；
图11A-11C示出了根据各种实施方式的使用CMOS技术制造的传感器装置的视图；
图12示出了根据各种实施方式的生物聚合物桥自组装之后的触件阵列的扫描电子显微照片；
图13示出了在根据各种实施方式的传感器的生物聚合物桥自组装事件期间产生的信号轨迹；
图14示出了在探针结合根据各种实施方式的传感器的生物聚合物桥的过程期间产生的信号轨迹；
图15示出了在模板结合根据各种实施方式的探针期间产生的信号轨迹；
图16示出了通过根据各种实施方式的探针在模板依赖性碱基纳入期间产生的信号轨迹；
图17示出了由根据各种实施方式的传感器进行的单个模板依赖性碱基纳入事件所产生的信号轨迹；
图18示出了根据各种实施方式的传感器在各种实验条件下产生的信号轨迹；
图19示出了响应于包含未修饰的和5-甲基胞嘧啶修饰的核苷酸的靶标的在各种条件下由根据各种实施方式的传感器产生的信号轨迹；
图20示出了在各种实验条件下响应于长模板序列的由根据各种实施方式的传感器产生的信号轨迹；和
图21示出了根据各种实施方式的化学合成的桥分子。
具体实施方式
此处各示例性实施例的详细描述参照附随的图片，这些制图和图片通过说明示出示例性实施例及其最佳模式。尽管这些示例性实施例被充分详细地描述以使本领域技术人员能够实施本发明，但是应当理解其它实施例也可实现并且可做出逻辑、化学和机械改变而不背离本发明的精神和范围。因而，此处提供的详细描述仅仅出于说明的目的而非限制。例如，除非另外说明，任何方法或过程描述中所述的步骤可以任何次序执行且不必然受所提供的次序的限制。此外，任何对单数的引用均包括复数实施例，并且任何对一个以上组件或步骤的引用可包括单个实施方式或步骤。此外，对附连、固定、连接等的任何引用可以包括永久的、可移除的、临时的、部分的、完整的和/或任何其他可能的附连选项。另外，任何对无接触(或类似短语)的引用也可包括减少接触或最小接触。
在各种实施方式中，单分子生物传感器装置可以包括第一电极和第二电极。第一电极和第二电极被由电极和/或附连到电极的触件限定的传感器间隙分开。第一和第二电极可以通过跨越传感器间隙的桥分子偶联。桥分子可以包含生物聚合物，如核酸或氨基酸聚合物。该桥还可以包含化学合成的分子，其可以包括合成有机分子，包含生物聚合物单体的合成类似物的聚合物，或非源自生物分子的其他全合成单体。无论由生物聚合物还是由合成分子组成的桥分子都可以具有已知的原子精确的分子结构。桥分子与电极的附连可能由触件介导。探针分子或分子复合物可以偶联至桥分子上。探针可以是生物分子，例如配置成与单个靶分子相互作用的酶。在各种实施方式中，传感器装置可以包括并联排列的多个单分子生物传感器。这种多传感器装置可以用于执行靶标和其他分子的复杂混合物中的多个单独靶分子的并行检测、区分和/或表征或鉴定。
图1示出了包括根据各种实施方式的传感器101的传感器装置100的示意图。传感器101包括第一电极102和第二电极103。传感器101还可以包括栅104，如下详述。传感器101可以进一步包括在功能上偶联至第一电极102和第二电极103的传感器复合体105。在各种实施方式中，传感器复合体可以经由连接到相应电极的第一触件106和第二触件107偶联至电极。传感器复合体105可以包含多个组分，如桥分子和探针分子，如下详述。传感器复合体105可以与周围环境相互作用，从而使得传感器101能够执行感测功能。例如，如图1所示，传感器复合体105可以与例如DNA分子的靶分子108相互作用，并且传感器装置可以用于检测靶分子的存在和/或性质。
在各种实施方式中，传感器装置100和传感器101可以可操作地连接到电路120以检测传感器101的电性质的变化。电路120优选是具有与传感器101接近的微尺度的集成电路，但电路120也可以体现为外部电表，例如台式电流计。传感器装置100可以包括多个传感器101。集成电路120可以包括可以使用CMOS制造方法制造的电路架构。集成电路120可以包括用于每个传感器101的电子测量电路，其在提供对传感器的支持的相同芯片内制造。换句话说，传感器装置100可以包括集成微电路中的传感器101和集成电路120。集成电路120可以进一步包括用于连接到外部信号处理系统121的读出电路和输入/输出特征。
在各种实施方式中，使用位于具有传感器101的公共半导体芯片上的集成电路120可以减少可由宏观外部电路元件产生的读数中的电子噪音源。例如，这种电路可以是混合信号CMOS传感器，包括少量晶体管，取决于灵敏度和读出的性能要求，少量晶体管的范围为1至200。在各种实施方式中，这种电路可用于测量单个传感器101中的电流。此外，传感器装置100可以包括集成电路120，集成电路120包括用于传感器阵列101的传感器/读出电路，以便支持同时操作与相同样品接触的大量传感器。
在各种实施方式中，由传感器101接触的样品将包含液相样品。包含样品的溶液可能非常稀且离子强度低，以减少使用传感器进行的电测量中的噪音。所获取的信号通常将是在传感器中的电极102和103之间流动的电流，但它可以是相关的可观察的电子参数，例如电极之间的电压，电极之间的电阻/电导或栅极电压。
在各种实施方式中，集成微芯片格式中的传感器101和集成电路120的构型适合于使用调制解调器CMOS制造方法进行制造，这有助于具有高度紧凑架构的传感器装置的生产。在各种实施方式中，用于传感器的集成电路可以位于传感器间隙的大约100μm内，或者在传感器间隙的大约50μm内，或者在传感器间隙的大约20μm内，或者在传感器间隙的大约10μm内或者在传感器间隙的约5μm内，或者在传感器间隙的约1μm内。此外，在各种实施方式中，传感器装置可以包括多个传感器，每个传感器具有位于上述参数内的相关集成电路。
信号处理系统121可以被配置为提供传感器设备100的电子控制并且接收，存储和分析从传感器设备和其中的每个传感器101接收的信号。信号处理系统121可以包括具有处理器和/或软件的计算机系统，该处理器和/或软件被配置为执行电子控制功能，包括对施加到每个传感器101的电压和电流的控制，以及对从每个传感器101接收的信号执行信号处理功能。
例如并且如图1所示，包括传感器101的传感器装置100可用于进行核酸测序反应。在装置的操作期间，可以在传感器101的第一电极和第二电极之间施加电压，其中传感器与靶标的相互作用产生对流过生物聚合物桥分子的电流的调制(参见例如333，图3)，其可以使用集成电路120和信号处理系统121来测量。传感器101可以随着时间t产生信号模式122，其中传感器响应于传感器复合体与靶分子108的特征的相互作用而产生信号特征123。信号处理系统121可以接收并处理信号模式，并响应于信号模式提供序列输出124，在该情况中信号模式是对信号的解释。
在各种实施方式中，单分子生物传感器可以采取晶体管的形式，例如场效应晶体管(FET)，其中附连的桥分子和/或探针、和/或靶分子和/或溶液相分子非常接近这些部件，用作电路中的通道或导电路径。在这样的实施方式中，包含单个探针分子的传感器复合物可以被配置成与单个靶分子结合或相互作用，如下详述，由此提供具有单分子灵敏度的生物传感器。例如在多栅装置的情况下，这样的晶体管实施方式可以包括两个或三个端子晶体管，或者可能包括更多的端子。
图2A和2B示出了根据各种实施方式的传感器装置200的视图。在传感器装置200的图示中未示出传感器复合体。传感器装置200包括多个传感器201，每个传感器包括第一电极202和第二电极203。每个传感器可以进一步包括传感器间隙239。在所示的实施方式中，每个传感器包括附连到第一电极的第一触件206和附连到第二电极的第二触件207。在各种实施方式中，电极可以设置在半导体基材表面上。例如，传感器装置200可以包括覆盖二氧化硅层261的氮化硅层260。传感器装置200可以进一步包括在其上设置有电极的半导体基材层下面的掩埋栅极204。上述各种组件可以制造在例如硅芯片263的支撑件上。如图2A所示，第一电极201，第二电极202和栅极204中的每一个可以连接到信号处理系统221，信号处理系统221可以是外部计量器，如图所示，但也可以是集成电路(细节未示出)。
现在参照图3，更详细地示出传感器301和传感器复合体305的一部分的轮廓图。传感器301包括第一电极302和第二电极303。第一电极302和第二电极303可以设置在基材320上。在各种实施方式中，传感器301可以进一步包括分别可操作地偶联至第一电极302和第二电极303的第一触件306和第二触件307。然而，不严格需要触件，并且根据本公开的传感器不需要包括第一和第二触件。第一电极302和第二电极303的端部限定电极间隙330。类似地，对于包括触件的传感器例如传感器301来说，第一触件306和第二触件307之间的距离限定了触件间隙331。任何给定的第一触件和第二触件的触件间隙的实际尺寸可以根据触件的构型和用于参考的触件的点而变化。例如，对于图3所示的半球形第一触件306和第二触件307，触件间隙331的尺寸可以在触件的最近点之间或从中心到中心之间测量。在各种实施方式中，电极间隙和触件间隙中的一个，或者共同限定的间隙或者通过电极和/或触件的各种组合限定的间隙可以被称为传感器间隙。
继续参考图3，传感器301还包括传感器复合体305。在各种实施方式中，传感器复合体305可以包括桥分子333和探针334。探针334可以通过接头337与桥分子333偶联，接头337在此显示为链霉亲和素-生物素复合物，其中生物素共价整合到DNA桥333的核苷酸中，并且链霉亲和素化学地、共价交联到聚合酶334。下面更详细地描述传感器复合体305的各个部件中的每一个。
在各种实施方式中，桥分子333可以包含化学合成的桥分子或生物聚合物桥分子。化学合成的桥分子或生物聚合物桥分子可被配置成在结构上和功能上跨越传感器间隙。例如，化学合成的分子或生物聚合物分子可以通过下述来配置：选择和使用原子上精确的分子亚单元(例如，用于纳入聚合物桥分子中的单体单元)，其提供具有已知或可预测结构参数的桥分子的构建；纳入促进自组装至触件点以及探针分子自组装至桥分子的特征；以及用于电极的电连接的合适的电化学性质。
化学合成的桥分子是可由合成有机化学领域的技术人员组装的分子。例如，化学合成的分子可以包含聚吡咯，聚苯胺或聚噻吩骨架。简要参考图21，图示了基于聚噻吩而化学合成的桥分子2100的一般结构的示例。化学合成的桥分子2100可以包含形成桥分子的主链的噻吩环2101的链，在探针支撑部分2102的任一侧上具有n1和n2噻吩环，所述探针支撑部分可以配置在桥分子2100中的特定位置处。因为每个噻吩环2101的宽度约为0.3nm，所以可以构建包含约10至约100个环的化学合成的桥分子以跨越约3nm至约30nm的间隙。化学合成的桥分子的末端(例如A1和A2)可以包含巯基或胺基，或配置成结合电极或触件材料的其它基团。化学合成的桥分子也可以用适于提供探针分子附连的接头(例如L)构型。根据本公开的各种实施方式，可以使用由本领域普通技术人员现在已知的或可以在下文中设计的任何合适的主链部分组成的任何其他化学合成的桥分子构型。
如本文所用，术语“生物聚合物”可以包括包含至少一个单体单元的任何分子，所述单体单元可由活生物体产生的，尽管包含生物聚合物或聚合物本身的实际单体单元不需要由生物体产生并且可以是体外合成。生物聚合物的例子包括多核苷酸，多肽和多糖，包括其众所周知的形式，如DNA，RNA和蛋白质。包含生物聚合物的桥分子可以包括简单的“卷曲螺旋”构型的多链聚合物蛋白质(如在胶原蛋白中)或者重链和轻链聚合物蛋白质的更复杂的折叠，例如在免疫球蛋白分子(例如IgG)中。这种包含生物聚合物的复合物还包括常见的核酸双螺旋，例如DNA双螺旋，其是通过氢键结合成螺旋双链的两条DNA单链分子，PNA-PNA双链体以及DNA-RNA，DNA-PNA和DNA-LNA杂交双链体。生物聚合物分子不需要天然存在或由生物体产生才被分类为生物聚合物。相反，出于本公开的目的，术语“生物聚合物”可以包括酶促合成以及非酶合成的分子，并且同样可以包括包含天然存在的单体单元的合成类似物的分子。例如，生物聚合物可以包含肽核酸(PNA)和锁核酸(LNA)，具有增强的稳定性的DNA和RNA的合成类似物。另外，生物聚合物可以包含可以加入到分子中的各种修饰中的任何一种。使用生物聚合物桥分子可以提供各种益处，包括合成具有用于传感器功能的适合尺寸和化学性的精确控制结构，它们可以与传感器的靶分子(例如，与相同的液体缓冲介质兼容)天然相容，生物技术行业已经开发了设计、工程改造和合成这些分子并且经济地制造它们并具有高质量控制的广泛能力。
桥分子可以被配置为跨越传感器间隙并且以适于在桥分子和电极和/或触件之间提供电子通信的方式偶联至传感器间隙的任一侧上的电极和/或触件。
在各种实施方式中，桥分子可以包含线性生物聚合物，例如双链DNA螺旋或α-螺旋多肽。如图3所示，桥分子333包含线性生物聚合物双链DNA桥分子，其具有偶联至第一触件306的第一端334和偶联至第二触件307的第二端335。
在各种实施方式中，刚性桥结构可提供在组装传感器复合体期间和之后采取明确构型的优点。不希望受理论束缚，线性生物聚合物可以包含可通过其弯曲刚度描述的半柔性聚合物。在短尺度上，线性生物聚合物可能表现为刚性聚合物，需要强大的力才能弯曲聚合物，而在更长的尺度上，线性生物聚合物可能更容易弯曲或弯折。线性生物聚合物在一定环境条件下基本表现为刚性分子的特征弯曲长度量度被称为持续长度。持续长度可以取决于弯曲力施加在聚合物上的环境条件，其中例如周围环境的温度和离子条件等的变量影响持续长度。线性生物聚合物例如双链DNA的持续长度可以基于理论建模估计，或者可以根据经验就对应于预定实验条件的一组环境条件进行测量，其中可以使用根据各种实施方式的装置。例如，在可能接近使用根据本公开的各种实施方式的传感器的条件的各种条件下，已经计算了约30nm至约80nm的双链DNA的持续长度，和约80nm至约100nm的α-螺旋肽的持续长度。因此，在各种实施方式中，沿着其长轴测量的具有端到端长度小于上述相应持续长度参数的双链DNA分子或α-螺旋肽可表现为基本上刚性的聚合物，从而在装置组装和性能方面提供某些优点或益处。
在各种实施方式中，使用由DNA或氨基酸组成的线性生物聚合物允许基于生物聚合物的单体组成(即，一级结构)直接构建具有预定长度的纳米级传感器组件。不希望受理论束缚，使用具有小于持续长度的端到端长度的线性生物聚合物可以提高根据各种实施方式的生物分子感测装置的构建期间自组装步骤的效率。使用这种线性生物聚合物提供了将生物聚合物桥分子的规格保持在其参数中的能力，其中它们的微机械性能比可能弯曲或折叠的较长的线性生物聚合物更可预测，由此减少例如在桥分子合成、处理、自组装或传感器操作期间的不希望的随机效应的影响。此外，线性生物聚合物的使用允许对桥分子长度至传感器间隙(即，电极间隙和/或触件间隙的尺寸和结构)的精确指定，提供了易于测试理论结构模型和装置改进的性能的进一步能力和进行渐进式、控制良好和经验可测的修改的进一步能力。在各种实施方式中，线性生物聚合物桥分子可以被配置为使第一端处的第一自组装锚和第二端处的第二自组装锚二者与第一触件和第二触件之一的错配率均降低，这是由于在传感器装置中使用的规模(例如，约5nm和约30nm之间的端到端长度)下线性生物聚合物桥分子的本质上刚性的性质。类似地，生物聚合物桥分子可以被配置为提供降低的单端偶联速率。这可能是由于基本上刚性的桥分子一旦在第一触件处偶联，由于触件的间隔而限制第二端在所需的第二触件点附近花费更多时间，由此增加了期望的第二偶联反应速率。
如上所述，生物聚合物桥分子可以包含双链DNA分子。在各种实施方式中，双链DNA可以包含巯基修饰的寡核苷酸，其含有巯基修饰的核苷酸或碱基。巯基修饰的核苷酸可以包含被配置为结合金纳米珠或类似表面触件的自组装锚。在各种实施方式中，自组装锚可以包含5'-巯基修饰的核苷酸，其可以位于寡核苷酸的5'端或附近。双链DNA分子可以包含寡核苷酸的互补对，每个寡核苷酸包含5'-巯基修饰的核苷酸，使得组装的双链DNA包含位于双链DNA的两个末端的自组装锚。例如，在各种实施方式中，双链DNA分子可以包含具有以下序列的寡核苷酸：
5'-/5ThioMC6-D/TGC GTA CGT ATG TCA TGA ATG GCG CAG ACT GAT GTC CTATGA CGT CGC TAC TGC AGT ACT-3'(SEQ ID NO:1),和
5'-/5ThioMC6-D/AGT ACT GCA GTA GCG ACG TCA TAG GAC A/iBiodT/C AGT CTGCGC CAT TCA TGA CAT ACG TAC GCA-3'(SEQ ID NO:2),
其中“/5ThioMC6-D/”表示5'-巯基修饰剂，“/iBiodT/”表示内部生物素修饰的脱氧胸苷核苷酸(集成DNA科技公司，爱荷华州科拉尔维尔市)。当彼此退火时，这些寡核苷酸提供的双链DNA分子具有位于分子两端的5'-巯基修饰的核苷酸作为第一和第二自组装锚。
双链DNA分子桥还可以进一步包含生物素接头组分以促进探针分子与互补性亲和素型接头组分连接。在不同的实施方式中，如上述反向寡核苷酸序列所示，可以将生物素修饰的寡核苷酸纳入双链DNA分子桥的寡核苷酸之一中。在各种实施方式中，生物素修饰的寡核苷酸是内部修饰，例如通过经修饰的胸苷残基(生物素-dT)。可以使用各种生物素修饰构型，包括通过C6间隔物附连胸苷，通过三甘醇间隔物附连，通过光裂解间隔臂附连，双生物素修饰，脱硫生物素修饰和生物素叠氮化物修饰。本领域技术人员现在已知的或可以在下文中设计并且可以对寡核苷酸进行以促进与探针分子的连接的其他修饰在本公开的范围内。类似地，具有蛋白质结合伴侣的其他常见小分子如地高辛可以起到与生物素相似的作用，用于在桥分子中精确原子指定的点处与探针分子缀合的目的。
在各种实施方式中，肽生物聚合物桥分子可以包含适合于提供各种期望的桥分子结构和性能特征(包括电极或触件结合特征，结构特征，电性能特征等)的各种构型和/或特征。例如，肽生物聚合物桥可以在氨基端和羧基端之一或两者处包含L-半胱氨酸残基而用作自组装锚，通过巯基-金属结合至参与强巯基结合的特定金属触件，如金，钯或铂。在其他实施方式中，生物聚合物桥分子可包含具有选择性和强结合金触件的已知能力的肽，用于自组装和电-机械连接到电路中。具体的这种肽包括具有以下氨基酸序列的那些：MHGKTQATSGTIQS(SEQ ID NO:3),VSGSSPDS(SEQ ID NO:4),和LKAHLPPSRLPS(SEQ ID NO:5)。
针对这种性质选择的其他肽可以类似地结合其他特定的金属或材料触件。例如，VPSSGPQDTRTT(SEQ ID NO：6)是已知的铝结合肽，并且MSPHPHPRHHHT(SEQ ID NO：7)是已知的二氧化硅结合肽。在各种其他实施方式中，生物聚合物桥分子可以包含肽序列，其包括选自以下氨基酸序列基序之一的一个或多个氨基酸基序的重复，下述氨基酸序列基序已知有利于形成稳定的α-螺旋构象，提供线性、刚性导电桥：EAAAR(SEQ ID NO:8),EAAAK(SEQ IDNO:9),EEEERRRR(SEQ ID NO:10),和EEEEKKKK(SEQ ID NO:11)。这样的肽生物聚合物桥分子还可以包含由具有共价附连的生物素的赖氨酸残基组成的修饰氨基酸，以在精确原子限定的位置处为向探针分子复合物的基于亲和素的缀合提供缀合点。修饰的赖氨酸可以代替这种肽序列基序中的标准赖氨酸或精氨酸残基，以另外保持或最小程度地改变α-螺旋的性质。
在各种实施方式中，生物聚合物桥分子可具有其他构型。例如并且如图4所示，生物聚合物桥分子433可包含弯曲、折叠或包含一定程度的二级结构的线性生物分子。在各种实施方式中，生物聚合物桥分子可以进一步包含具有三级和/或四级结构的分子，包括球形蛋白质，抗体和多亚基蛋白质复合物。图5显示一个示例，其中生物聚合物桥分子533包含免疫球蛋白G蛋白(IgG)。在所示实施方式中，电触件(506,507)是金纳米颗粒，并且IgG已经以特定亲和力建立以结合这些颗粒。
类似于传感器301，图4和图5所示构型各自包含经由接头(分别为437和537)偶联至生物聚合物桥分子的探针(分别为436和536)。所示实施方式旨在举例说明可偶联至包含不同材料和构型的电极或触件的可能的生物聚合物桥分子构型的范围，在不同结构构型中包含不同金属或非金属导电或半导体触件。在各种实施方式中，可进一步涂覆、处理或衍生电极或触件以使用产品(例如InnovaCoat GOLD纳米颗粒(Innova生物科学公司)的产品)促进桥组装和/或附连。
根据各种实施方式的探针可以包含任何合适的分子或多组分分子复合物。可以基于待由传感器检测的分子或待监测的生物化学反应来选择探针。探针的各种实例包括肽，蛋白质，酶，核酸，核酶，催化DNA等。在各种实施方式中，酶可以包含溶菌酶，激酶或聚合酶。根据本公开的各种实施方式，响应于底物或靶分子的结合或加工而呈现物理，化学或电子构型的特定变化的任何分子或复合物可用作探针。
在各种实施方式中，探针可包含适合于与单个DNA或RNA靶分子相互作用的酶，例如聚合酶或逆转录酶。催化核苷酸碱基模板依赖性纳入生长的寡核苷酸链中的酶响应顺序遇到模板链核酸碱基和/或纳入模板特异性天然或类似碱基(即纳入事件)而发生构象变化。这种构象变化可以调节通过与探针偶联的桥分子的电流，从而以取决于模板分子的方式提供序列特异性信号模式。如上所述，信号模式可以由信号处理系统检测并翻译为序列数据输出。此外，靶核酸序列中修饰的核苷酸的存在可以在信号模式中产生独特的构象变化和相应的信号特征，其可以使传感器装置和信号处理系统能够逐个碱基地直接确定例如靶序列中碱基的甲基化。这种无标记的直接测序方法可以允许使用包含对应于DNA的全部四个碱基的天然和/或类似碱基的混合物的核苷酸碱基混合物在测序反应中区分核苷酸特异性纳入事件，尽管也可以使用包括顺序地以串行和/或循环方式提供单独的天然或类似碱基的测序过程。使用逆转录酶作为探针分子可以类似地实现RNA分子的直接测序，而不需要中间cDNA转化步骤。
在各种实施方式中并且如上简述，探针可以通过自组装接头附连到桥分子。
自组装接头可以包含适合于将第一生物分子附连于第二生物分子的多种结构中的任何一种。在各种实施方式中，自组装接头可以包括第一接头组分和与第一接头组分互补的第二接头组分。第一接头组分和第二接头组分可以通过自组装连接以基于第一接头组分对第二接头组分的亲和性形成组装接头。第一接头组分可以例如与桥分子关联，并且第二接头组分可以与探针关联。可以将与桥分子相关联的接头组分设计成桥分子中的特定位点，使得探针与桥的自组装在桥分子上的预定位置处产生探针与桥分子的偶联。选择用于与探针关联的接头组分可以被配置成使探针和靶之间的干扰最小化，涉及接头组分的大小和它与探针缀合的位置两方面。以这种方式，连接互补的第一和第二接头组分可以提供探针与桥分子的功能性附连。自组装接头可以包含生物素-亲和素偶联机制，具有亲和素(或其他亲和素样)蛋白质第一接头组分和生物素小分子第二接头组分，这些组分彼此形成强的非共价键。其他亲和素样蛋白包括链霉亲和素，根霉亲和素(rhizavidin)，慢根霉亲和素(bradavidin)，中和亲和素(NeutrAvidin)，其他各种氨基酸修饰形式的亲和素或链霉亲和素，以及保留生物素结合功能的这种亲和素的二价或单体衍生物。在各种实施方式中，例如，生物素可以缀合至桥分子并且链霉亲和素缀合至探针分子。自组装接头还可以包含用于生物缀合的众所周知的“点击化学”机制。自组装接头还可以包含抗原-抗体偶联(例如与缀合至探针分子的抗体偶联的桥分子上存在的抗原)。自组装接头还可以包含例如SpyCatcher肽第一接头组分和SpyTag肽第二接头组分，其中两个组分结合形成不可逆的共价键。本领域普通技术人员现在已知或可能在下文中设计的任何构型中的任何其它自组装接头系可用于将探针偶联至桥分子。
在各种实施方式中，传感器不需要包含不同于桥分子的探针分子。相反，桥分子本身可以被配置成被靶分子作用。例如，桥可以包含蛋白质结合位点，如激酶结合位点，并且可用于基于靶蛋白与桥的结合和/或靶蛋白对桥的修饰来检测样品中相应蛋白质的存在和/或活性。
现在参考图6A和图6B，示出了具有和不具有传感器外壳的部分制造的传感器装置600的透视图。传感器装置600是包括掩埋栅极640的三末端传感器装置。图6A中所示的装置600包括传感器装置的各种特征，所述传感器装置可以使用CMOS制造技术制造，例如位于基材641和氧化物642下方的栅极640，以及由电极间隙630分开的第一电极602和第二电极603，并且每个电极具有附连的触件606/607。上述各种传感器复合体组分(包括桥分子和探针)的附连可以在下游自组装步骤中进行。在各种实施方式中并且如图6B所示，传感器装置600可首先配置有外壳643，外壳643配置成封装传感器间隙630或在其周围形成流动池，之后通过使传感器与包含桥和/或探针分子的溶液接触完成传感器的组装。同样，外壳643也可以用于进行测定，例如测序反应。外壳643可以单独形成并附连到包括装置600的结构。
生物分子检测和核酸碱基区分
在各种实施方式中，提供了用于检测例如装置100(图1)的单分子感测装置的动态性(dynamics)和动力学(kinetics)的方法。用于测量包含桥分子的传感器101的电导变化的任何方法可用于监测本文所述的传感器装置。在各种实施方式中，可以将小于约10V的电压施加到包含生物分子桥分子的传感器，并且在下面更详细描述的各种实施方式中，施加约0.5V的电压。可以使用集成电路120测量流过传感器的电流作为时间的函数。通过传感器复合体105中的探针的靶标结合和/或加工事件(即，在酶促探针的情况下的酶活性)可以产生传感器101的电导率的变化，调制测量的电流以产生随时间t的信号模式122，包括信号特征123。包括结构、化学和电子变化(即酶，底物和周围溶液中的电荷分布)的相关的构象变化和这种事件可以包括靶标结合和加工的动力学特征，其中产生电流波动的各种事件包括可以使用本领域已知的信号处理技术来测量、记录、鉴别、分析或存储的信号特征123。信号特征可以包括一系列可能形式中的任何形式，包括具有三角形、正弦形状或具有任何数量的傅立叶分量的小波。例如，在传感器中用作探针的聚合酶可为与模板碱基(即靶分子特征)和/或模板依赖性核苷酸纳入(即聚合酶动力学特征是模板碱基依赖性的)的每个离散相互作用提供聚合酶动力学特征，其中核酸模板靶标包含靶分子中离散位置处的靶分子特征序列(即，第一，第二和第n靶分子位置处的第一，第二和第n靶分子特征)，每个靶分子特征在根据本公开的传感器的检测期间产生对应的信号特征。n个靶分子特征可以对应于单链DNA模板分子(即，靶标)的n个连续碱基，其通过聚合酶加工以顺序地在这n个靶分子特征处纳入互补核苷酸。包括一系列信号特征的信号模式的幅度、持续时间和形状可以编码靶特异性传感器响应，其可以使用信号处理系统121分析以将信号模式与信号解释图进行比较以确定靶标。增加信号检测和分析的时间分辨率可以提供进一步解析探针-靶标相互作用的动力学可变性、转变和中间状态的能力。
由于核苷酸纳入的保真度对于准确的核酸测序是极为重要的，因此在各种实施方式中，测序方法可依赖于增加基于模板的核苷酸纳入的构象变化的类似物碱基，由此产生更清楚的信号，和/或以其他方式提供区分类似物碱基纳入的增强能力，从而提供了提高的测序准确度。可以用于增强模板依赖性核苷酸纳入的动力学或动态学区分的非标记类似物碱基是众所周知的，并且可以包括核苷酸的脱氧核糖或核糖和磷酸部分以及嘌呤和嘧啶碱基的修饰。具体而言，这可以包括向核苷酸的γ-磷酸酯添加额外的基团，其接受在纳入期间切割掉的大量且多样化的分子修饰，因此不会永久影响生长链及其与聚合酶的相互作用。
在各种实施方式中，方法可以提供核酸模板序列中未修饰和修饰的核苷酸碱基的检测。例如，方法可能适用于区分修饰的模板核苷酸，包括N6-甲基腺苷，N4-甲基胞嘧啶，5-甲基胞嘧啶，5-羟甲基胞嘧啶，5-甲酰基胞嘧啶和5-羧基胞嘧啶碱基，以及受损的模板序列位置，如无碱基位点。不希望受理论束缚，在测序反应期间将核苷酸催化纳入互补核酸链的DNA聚合酶可以以取决于模板链中核苷酸的种类的方式显示差异性聚合酶动力学。使用根据本公开的装置和方法，基于检测到对应于纳入事件的电子特征，可以近实时地确定核酸模板中的核苷酸碱基的种类。与依赖于检测与荧光团标记的核苷酸纳入相关的荧光信号的其他系统和方法不同，不需要基于荧光的检测试剂和信号检测装置，从而降低了该方法的成本和复杂性。
在各种实施方式中，方法可以包括从信号轨迹去除噪音。去除噪音可以包括进行信号处理，例如去除60Hz线路噪音。去除信号轨迹中的噪音可以减少信号轨迹解释的误差。在图7中示出了从信号中去除60Hz线路噪音之前(上信号轨迹)和之后(下信号轨迹)，通过对12碱基核酸模板测序产生的信号轨迹的示例。取决于这种噪音的特性，可以使用各种噪音去除方法，并且这些方法对于信号处理领域的技术人员是众所周知的。
在各种实施方式中，确定与传感器结合的靶标的序列的信号处理可以包括对靶标的种类的概率确定，而不是对序列的精确确定。靶分子的实际序列可以是许多可能的独特序列之一，每个可能的独特序列具有独特的理论信号。确定靶分子的序列可能需要将实验测量的信号与包括独特理论信号数据库的信号解读图进行比较。可基于下述方法来生成信号解译图：使用已知靶标序列产生的训练数据集或库，基于正和负控制测量的信号处理以减少例如噪音、模糊、漂移等的信号伪像，以及应用机器学习和/或统计方法，如神经网络、聚类、曲线拟合、模型拟合、贝叶斯推断等。
传感器装置的制造和组装
在本公开的各种实施方式中，提供了生产如本文所述的分子生物传感器装置的方法。生产分子生物传感器装置的方法可以包括CMOS制造工艺和分子生物学方法的组合。CMOS制造工艺可以包括本领域公知的高分辨率光学光刻方法，并且适合于商业规模生产集成电路，包括例如FET的装置。在各种实施方式中，可以使用CMOS制造工艺来产生包括个体传感器的集成电路，所述个体传感器具有沉积在半导体基底上的第一电极和第二电极，其中第一电极和第二电极由精确限定的传感器间隙分开。在一个优选实施方式中，将选择纳米电极、间隙和触件设计以便完全在CMOS工艺内制造。特别地，如果为这些元件选择了特定简单的几何形状，则可以使用高分辨率光学光刻方法制作它们，例如极紫外(EUV)和深紫外(DUV)光源，结合相移掩模，多重图案化以及用于实现最高分辨率CMOS制造节点的其他技术，包括当前和未来的16nm节点，14nm节点，10nm节点，7nm节点和5nm节点，如通过特定制造设备所呈现，例如主要铸造公司(如TSMC或格罗方德公司(GlobalFoundries))的那些设备所呈现。这些过程具有独特的高分辨率，可用于制作某些特定的图案特征，例如直线段，直线切割和圆形点。在纳米电极，纳米触件和/或间隙几何形状的设计中使用这些工艺特定的几何元件可以便于根据相关CMOS工艺中的各种实施方式制造传感器装置。然而，通常所采用的制造技术还可以包括例如电子束光刻，纳米压印光刻之类的非CMOS工艺方法，或者例如聚焦离子束铣削和等离子蚀刻之类的铣削和蚀刻技术。分子生物学制造方法可以包括在对原子构型进行精确控制的情况下合成期望的桥分子，并且在适合允许生物分子与上游CMOS或其他制造方法过程中产生的电子传感器组件(和/或与其他生物分子)在特别设计的自组装反应过程中相互作用和偶联的条件下，递送液相中的这些生物分子溶液。
在各种实施方式中，本文描述的制造传感器装置的方法可以包括以下步骤：制造集成电路微芯片，制造传感器电极和/或触件，合成桥生物分子，将桥生物分子组装到电极和/或触件，将探针偶联至桥生物分子，并将传感器装置封装在流动池中。在各种实施方式中，传感器可以包括双末端电路，或者传感器可以包括具有栅极的三末端电路。在各种实施方式中，栅极可以具有掩埋栅极构型；然而，也可以使用横向栅极和其他栅极构型，包括finFET结构。
在各种实施方式中，电极、触件和/或栅极可以由导电金属材料构成。例如，电极，触件和/或栅极可以包括铝，钛，铬，铜，金，钯，铂等。在各种实施方式中，电极，触件和/或栅极可以包括半导体材料，包括可用于制造n型和p型半导体电极的掺杂半导体材料。在各种实施方式中，电极和附连到电极的触件可以包括相同的材料，并且在各种其他实施方式中，触件可以包括与其所附连的电极不同的材料。
在各种实施方式中，电极可具有任何合适的结构构型。例如，电极可以包括大致矩形的横截面，尽管其他几何和不规则的横截面轮廓也是可能的并且在本公开的范围内。在各种实施方式中，电极可以具有小于约30nm，或小于约25nm，或小于约20nm，或小于约15nm，或小于约14nm，或小于约13nm，或小于约12nm，或小于约11nm，或小于约10nm，或小于约9nm，或小于约8nm，或小于约7nm，或小于约6nm，或小于约5nm，或小于约4nm，或小于约3nm的最大横截面尺寸(即，电极的电极横截面中的最大尺寸)。
类似地，在各种实施方式中，触件可以具有任何合适的结构构型。例如，触件可以包括大致半球形或半球形的横截面轮廓，但是其他几何和不规则的横截面轮廓也是可能的并且在本公开的范围内。在各种实施方式中，触件可以具有小于约20nm，或小于约15nm，或小于约14nm，或小于约13nm，或小于约12nm，或小于约11nm，或小于约10nm，或小于约9nm，或小于约8nm，或小于约7nm，或小于约6nm，或小于约5nm，或小于约4nm，或小于约3nm的最大横截面尺寸(即，触件的触件横截面中的最大尺寸)。
在各种实施方式中，第一电极和第二电极可以被交替地称为源极和/或漏极，并且在各种实施方式中，源极和/或漏极可以包括与电极不同的结构部件。
制造方法可以包括使用光刻方法来限定基材表面上的第一电极位置和第二电极位置。第一电极位置和第二电极位置可被限定为在完成电极制造时在它们之间产生精确限定的电极间隙。类似地，在各种实施方式中，制造方法可以包括使用光刻方法来限定第一触件位置和第二触件位置。第一触件位置和第二触件位置可被限定为在完成触件制造时在它们之间产生精确限定的触件间隙。同样，可以使用限定的结构来配置触件。下面将更详细地描述可用于制造生物传感器的各种方法。
现在参考图8，示出了用于制造电极的光刻方法800。在各种实施方式中，制造方法可以开始于微芯片基材(例如硅基材880)，其覆盖有氧化硅层881，抗蚀剂层882。抗蚀剂层可以包含任何合适的抗蚀剂材料，例如聚(甲基丙烯酸甲酯)。根据本公开，粘合促进剂也可以用于制造过程中。在所示实施方式中，使用电子束光刻来曝光抗蚀剂层并且在抗蚀剂层中限定第一电极轨道883和第二电极轨道884(步骤810)。在光刻步骤之后，显影该抗蚀剂(步骤820)以去除光刻步骤中限定的区域中的抗蚀剂。接下来，可进行沉积步骤(步骤830)以在基材表面上形成第一电极802和第二电极803。可以使用任何合适的材料和沉积方法，包括例如金属溅射涂覆。类似地，可以在进行沉积步骤之前进行任何合适的基材表面处理，例如施加中间附连层以在电极和基材之间提供适当的结合。在各种实施方式中，第一和第二电极使用溅射沉积方法由金制成。在沉积步骤之后，进行剥离步骤(步骤840)以去除剩余的抗蚀剂，从而将第一电极和第二电极设置在基材的表面上。
在各种实施方式中，用于制造纳米电极的光刻方法例如方法800可实现高度精确的电极构型。例如，可以将电极配置为具有一致的长度，宽度和厚度规格。在各种实施方式中，电极可具有约10nm至约40nm的宽度，例如约20nm的宽度。类似地，由第一电极和第二电极限定的电极间隙可以被配置为具有精确的电极间隙尺寸。在各种实施方式中，电极间隙尺寸可以在约3nm与约30nm之间。例如，根据各种实施方式的传感器中的一对电极的电极间隙可以为约3nm至约30nm，或约4nm至约25nm，或约5nm至约20nm，或在约6nm至约17nm，或约7nm至约15nm。在各种实施方式中，可以制造具有约3nm，约4nm，约5nm，约6nm，约7nm，约8nm，约9nm，约10nm，约11nm，约12nm，约13nm，约14nm或约15nm的尺寸的电极间隙。对于本领域普通技术人员来说显而易见的是，上述各种方法步骤可以用于，使用CMOS制造和/或其他微电子制造方法，以适于传感器装置的商业规模生产的过程，以高密度并行生产具有高度精确的物理规格的多对电极。
不希望受理论束缚，提供具有如上所述的具有电极间隙尺寸的电极间隙(或传感器间隙)的传感器可以提供关于传感器性能和/或制造的各种优点。例如，对于尺寸低于约3nm的电极间隙，通过溶液(即样品环境)的电流传导的伪源和体积将开始增加，产生增加的噪音。另外，这种间隙可能不够大以容纳各种感兴趣的探针分子，例如酶。此外，这种间隙与当前的CMOS制造能力不兼容。对于大于约30nm的电极间隙，以原子上精确规格的制造桥分子(例如通过使用生物聚合物或化学合成的分子)的成本和复杂性显着提高，并且各种桥分子的刚性随着长度超过约30nm而降低。同样，超过这些长度时许多分子的电导率大大低于有用参数，并且更大的长度也限制了在高密度阵列中紧密包装传感器的能力。因此，具有约3nm至30nm范围内的电极间隙的传感器可以在传感器装置的功能、可制造性、可扩展性和经济性方面提供某些优点。
根据上述方法制造的传感器装置的示例在图11A-11C中示出，分别显示了37倍、5000倍和50,000倍放大的传感器装置1000的表面扫描电子显微照片。传感器装置1000包括用于20个传感器的纳米电极和纳米触件，以及用于连接到外部电流计的引线和垫。位于基材表面上的垫和引线在图11A中清晰可见。传感器电极表现为图11B中心的较亮的垂直带。在图11C中，可以清楚地看到第一电极1102和第二电极1103以及限定在第一和第二电极之间的电极间隙1120。
在各种实施方式中并且现在参考图9，制造生物分子感测装置的方法可以包括用于制造和/或确定触件位置的光刻方法900。在各种实施方式中，制造方法可以开始于微芯片，该微芯片包括其上设置有第一电极802和第二电极803的基材。微芯片可以包括覆盖有氧化硅层881和合适的抗蚀剂层982的硅基材880。在所示实施方式中，使用电子束光刻来曝光抗蚀剂层并且在抗蚀剂层中限定第一触件位置985和第二触件位置986(步骤910)。在各种实施方式中，触件位置可被限定为覆盖第一电极和第二电极中的一个，例如邻近电极间隙的电极远端附近。如下所述，限定触件的尺寸和模式可以有助于确定在稍后的工艺步骤中形成的触件的尺寸和形状。在光刻步骤之后，显影该抗蚀剂(步骤920)以去除光刻步骤中限定的触件位置中的抗蚀剂。接下来，可进行沉积步骤(步骤930)以在第一和第二电极表面上形成第一触件906和第二触件907。至于电极，可以使用任何合适的材料和沉积方法。类似地，可以在进行沉积步骤之前进行任何合适的基材表面处理，例如施加中间附连层以在电极和基材之间提供适当的结合。触件可以包括与电极不同的材料，或者触件可以包括用于制造电极的相同材料。在各种实施方式中，第一和第二触件使用电化学沉积方法由金制成。在沉积步骤之后，进行剥离步骤(步骤940)以去除剩余的抗蚀剂，留下设置在第一和第二电极的表面上的第一触件和第二触件。
可选地，在各种实施方式中，用于制造触件的方法可以包括预制的触件纳米颗粒的沉积。预制的触件纳米颗粒可以沉积到形成在抗蚀剂层中的空隙中并且被配置为接收触件纳米颗粒并将其定位在触件位置处，或者可以使用化学衍生层沉积触件纳米颗粒以实现在触件位置处的附连。
如图10所示，将预制的触件颗粒沉积到在抗蚀剂层中形成的空隙中的方法1000可以包括关于步骤910和920的上述方法900的相同步骤。在产生被配置为接收预制的触件颗粒的空隙之后，包含多个预制的触件颗粒1087的溶液可以与装置接触(步骤1030)，并且使用压力、混合、表面张力、浮力、离心力或其他方法将颗粒引入空隙。在沉积颗粒之后，可以去除过量的溶液和颗粒。可以进行如上文关于步骤940所述的剥离步骤以去除剩余的抗蚀剂，并且预制的触件颗粒可以随后在必要时任选退火至电极，以形成牢固附连的第一和第二触件(1006,1007)。
或者，使用化学衍生化处理来沉积预制的触件纳米颗粒的方法可以包括与上文关于图9中所示的方法所描述的步骤910和920相似的步骤。例如，一种与硅基底表面相容的广泛使用的表面衍生化是硅烷化，其可以包括用分子如氨基硅烷(例如APTES)或巯基硅烷(例如MPTES)涂覆基材表面。这些分子粘附在硅表面上，然后它们的暴露端容易交联到其他材料如金纳米颗粒上，从而将它们结合到表面上。然后，在类似于步骤930的步骤中，可以应用这种衍生化处理而不是沉积触件金属或其他材料。在进行类似于步骤940的剥离步骤之后，第一电极和第二电极将在旨在附连第一触件和第二触件的位置处包括表面衍生化。包含衍生化电极表面的装置可以与包含多个预制触件颗粒的溶液接触。颗粒可具有与衍生的电极表面互补或与其特异性结合的表面或涂层，从而将触件颗粒定位到限定的触件位置。根据需要，可以在去除步骤中去除衍生化处理和任何颗粒涂层，并且如上所述将预制的触件颗粒退火至电极。这种方法的一个例子是使用APTES涂覆的硅表面特异性结合金纳米颗粒。
在各种实施方式中，可通过各种直接手段产生触件结构，例如通过使用原子力显微镜(AFM)将金纳米颗粒珠子定位在电极上，或通过沉积过量珠子，随后通过AFM去除不需要的珠子。
在各种其它实施方式中，可通过例如使用聚焦离子束(FIB)铣削移除材料来原位形成触件结构和/或电极间隙。例如，可以使用FIB将电极间隙刻入先前建立的连续金属纳米线中，由此在形成电极间隙的同时形成第一电极和第二电极。
在制造传感器或传感器阵列的电极和触件之后，可以将传感器封装在适于允许将液体溶液可控地引入传感器的流动池或类似装置中。将传感器芯片封装在流动池中通常通过用PDMS或其他聚合物或塑料来模制流动池并使用其包围芯片，将制造的电极和触件适当暴露以用于桥和探针组装以及随后的使用完整传感器的测定。在各种实施方式中，表面钝化处理可以施加到基材表面和暴露电极的部分以减少可能由于与液体样品接触而发生的电噪音。可以应用钝化处理以使电极和/或触件在传感器间隙的区域中未被处理。例如，在各种实施方式中，与传感器间隙对齐的30nm宽的区域可以不被处理。钝化处理可以在用流动池封装传感器芯片之前进行。当施加约0.5V的电压并且将传感器浸入适用于支持酶(例如DNA聚合酶I酶)活性的低离子强度缓冲溶液中时，根据各种实施方式的传感器可具有小于约1pA，或小于约0.9pA，或小于约0.8pA，或小于约0.7pA，或小于约0.6pA，或小于约0.5pA，或者小于约0.4pA，或者小于约0.3pA，或者小于约0.2pA的电子噪音。
生物聚合物桥的制造可以通过可用于合成生物聚合物分子的各种方法中的任一种来进行，包括体内合成方法，体外酶促合成方法，化学合成方法或其任何组合。本领域普通技术人员熟知用于产生适合用作根据本公开的桥分子的生物聚合物分子的各种方法。同样，用于衍生或修饰生物聚合物桥分子以提供如本文所述的锚或接头组分的方法同样是众所周知的。本文所述的各种特定的生物聚合物桥分子通过举例的方式提供，且不应被解释为限制本公开的范围，并且可根据本公开的各种实施方式使用合成的桥分子。
在各种实施方式中，生物聚合物桥分子与探针的附连可以通过自组装化学反应来进行。同样，生物聚合物桥分子与电极或触件的附连也可以通过自组装化学反应来进行。这种自组装反应可以通过使要附连的两个组分经由包含至少一种组分的溶液而彼此接触来进行。在各种实施方式中，生物聚合物桥与探针的附连可以在桥附连至电极或触件之前、之后或同时进行。类似的考虑适用于由合成化学产生的桥分子。
在各种实施方式中，制造传感器装置的方法包括将生物聚合物桥分子组装到第一电极和第二电极。桥分子组装步骤可以包括自组装步骤。可以通过使包含第一和第二电极的部分构建的传感器装置与包含桥分子的溶液接触来进行自组装。基于桥分子的第一端和第二端与第一电极和第二电极之间的亲和力，桥分子可以自组装到第一电极和第二电极。在各种实施方式中，传感器组分的自组装可以通过传感器装置电子监控，如以下在实施例2中以及参照图13-15所述。电子监控可以提供质量控制功能，并用于识别正确组装的设备中的传感器。未提供在预定参数内的组装过程信号的传感器电路的信号可以在使用该装置进行下游分析(例如测序分析)中弃去。
实施例1
生物聚合物桥自组装
使用包含5'-巯基修饰的SEQ ID NO：1所示的寡核苷酸和包含5'-巯基修饰和内部生物素修饰的SEQ ID NO：2所示的寡核苷酸构建端到端长度约20nm的双链DNA生物聚合物桥分子。使用链霉亲和素-金标签将桥分子标记用于可视化目的。使用电子束光刻技术制造金纳米颗粒触件的测试阵列1200(图12)以沉积成对的金触件，每对触件限定约20nm的中心到中心的触件间隙。将包含金标记的桥分子的缓冲溶液与金纳米颗粒触件的测试阵列接触。在短暂的孵育期后，除去过量的溶液，洗涤阵列并通过扫描电子显微镜(SEM)成像。图12示出了显示金触件1270和金标签1271的排列的SEM图像。对于几个触件对(用箭头表示)，可以看到布置在触件对之间的金标签1271，表明生物分子桥分子成功地自组装至触件对。
实施例2
检测自组装步骤
使用电子束光刻技术制造具有单个传感器的传感器装置，该传感器包括附连到电极的金触件，具有约20nm的中心到中心的触件间隙。该传感器用PDMS流动池封装，该流动池包括1mm宽×0.4mm高的通道，该通道任一端打开以允许将液体引入流动池内部的第一端，并将液体从流动池的第二端排出，以及池接触传感器的溶液。流动池通道的方向与包含传感器的电极方向正交，传感器位于流动池通道长度的大约中间。将低离子强度缓冲溶液引入流动池中，并且在随后的下述整个连续步骤中将0.5V电势施加至传感器：双链DNA桥分子的引入和自组装(如上文实施例1所述，但是没有金标签)(图13)，链霉亲和素标记的Klenow片段的引入和结合(图14)，50个碱基引发的单链DNA分子的引入和结合(图15)，和dNTP混合物的引入以通过Klenow片段启动基于模板的合成(图16)。DNA模板分子的序列包括以聚A区域为特征的下列寡核苷酸序列：
5’-cgc cgc gga gcc aag aaa aaa aaa aaa aaa aaa aa ttgcatgtcctgtga-3’
并且所用的引物是：
3’-aac gta cag gac act-5’
另外，使用聚C，G和T区代替聚A区的相似序列用于研究不同模板碱基的作用。
如图13所示，测得的电流在三秒内上升。信号轨迹中的两个拐点(A和B)被认为对应于5'-巯基修饰的端碱基锚与第一和第二触件的结合。引入包含链霉亲和素标记的Klenow片段的溶液后的信号轨迹(图14)显示在约1.5秒处电流的急剧增加，其可能对应于接触并结合生物聚合物桥的生物素接头组分的Klenow片段酶的链霉亲和素接头组分。在图15中，在将模板链引入流动池之后的信号轨迹中存在尖锐的信号峰，该峰被解释为对应于Klenow片段的模板结合。图16示出在引入包含全部用于DNA碱基的dNTP混合物之后测量的信号轨迹，在大约1秒处同样表现出明显的信号特征。这可能表示合成的双链体从聚合酶解离，并且约0.7秒至约0.95秒的信号轨迹可对应于由传感器产生的响应于基于结合模板DNA的核苷酸纳入的动力学特征。
实施例3
核苷酸碱基纳入的检测
包含生物聚合物桥分子和Klenow片段探针的传感器装置如上述实施例2中所述制造和组装。响应于使用不同长度和序列组成的单链DNA模板进行的DNA合成反应，使用传感器装置产生信号轨迹。图17示出了用于提供纳入单个碱基的模板序列的信号轨迹。0.5秒处的信号特征被解释为对应于Klenow片段的模板依赖性活性和碱基纳入，并且在0.6秒之后的弱得多的信号特征被解释为对应于系统中的某种形式的噪音或伪信号。图18示出了各种模板区的信号轨迹。上述实施例2中所述的模板和引物用于所示的反应。
顶部和底部信号轨迹是对照实验，其中不含dNTP的缓冲液被引入传感器。响应于下述步骤产生第二，第三和第四信号轨迹(从顶部到底部)：向溶液中引入dTTP(预期导致由模板的20个A碱基引导的20个纳入事件)，随后添加dCTP(预期允许由GAA三联体以3'至5'在模板中引导另外3个纳入)，然后添加dNTP(预期如模板的剩余12个碱基所引导而聚合)，从而产生的信号来自20、3、和12个纳入事件。包含位于每个信号轨迹的箭头之间的信号特征的信号轨迹被解释为对应于由模板依赖性酶活性引起的信号调制。这些扰动的信号区域的相对持续时间在20：3：12的预期比例中，并且第三个这样的轨迹显示可以对应于12个离散的纳入事件的清晰尖峰。图7示出了通过使用上述装置和具有12个未配对模板碱基的上述模板进行的DNA合成反应产生的信号轨迹的其他示例。这些结果表明根据各种实施方式的传感器可以产生包含响应于模板依赖性DNA聚合酶探针活性的信号特征的信号轨迹。这也证明了在澄清信号中去除噪音的价值：图7的上图是原始测量信号，下图已经过信号处理以去除噪音，在这种情况下，通过带通滤波器消除了特定的60Hz线路噪音。
实施例4
甲基化模板碱基的检测
包含生物聚合物桥分子和Klenow片段探针的传感器装置如上述实施例2中所述制造和组装。响应于使用包含胞嘧啶和5-甲基胞嘧啶修饰的核苷酸的单链DNA模板进行的DNA合成，使用传感器装置产生信号轨迹。模板序列包括具有序列5’-13x(N)-5x(GmC)-5x(GC)-G-3’(即5’-NNN NNN NNN NNN NGmC GmCG mCGmC GmCG CGC GCG CGC G-3’(SEQ ID NO:12)，其中N是任何标准核苷酸，并且其中mC是5-甲基胞嘧啶)的未配对碱基核苷酸。设计该模板序列以产生具有序列5’-C-5x(GC)-5x(GC)-13x(N)-3’(即5’-CGC GCG CGC GCG CGCGCG CGC NNN NNN NNN NNN N-3’(SEQ ID NO:13))的互补合成链，其中加下划线的鸟苷碱基对应于模板链中5-甲基胞嘧啶修饰的核苷酸的位置。向传感器施加0.5V电压，并且在连续引入下述和用其孵育的过程中全程测量电流：水，缓冲液，dCTP缓冲溶液，dGTP缓冲溶液以及具有所有四种dNTP碱基的混合物的缓冲溶液。预期结果将是单个dCTP纳入事件，然后是20个dGTP和dCTP纳入事件，其中前10个针对未修饰的胞嘧啶碱基，而后10个针对5-甲基胞嘧啶修饰的核苷酸。在这20个事件中的第二个10个事件中，甲基化的检测将显示为信号的不同特征。
在与每种试剂孵育期间产生的信号轨迹在图19中示出。用水和缓冲液孵育产生非常低的基线电流，几乎没有变化。添加包含dCTP的溶液产生对应于针对模板前导碱基G的dCTP的单个碱基纳入的尖锐序列特征。
添加dGTP，产生包含dCTP和dGTP二者的溶液，允许通过对应于未修饰的核苷酸的10个碱基纳入进行合成随后通过对应于模板链中的5-甲基胞嘧啶碱基的10碱基纳入进行合成。在该孵育期产生的信号轨迹显示具有从约0.35秒到约0.5秒的较高电流的信号特征，随后是具有从约0.5秒到约0.65秒的较低电流的信号特征。响应于模板序列的甲基化状态对聚合酶和所得信号调制的影响，信号幅度的这种变化被解释为传感器信号的明显变化。该证据支持根据本公开的各种实施方式的传感器直接区分测序反应过程中靶序列中存在修饰的核苷酸的能力。
实施例5
检测长DNA链读数上的信号
包含生物聚合物桥分子和Klenow片段探针的传感器装置如上述实施例2中所述制造和组装。响应于使用包含衍生自phi X 174噬菌体的基因组的大约5400bp模板序列的单链DNA模板进行的DNA合成，使用传感器装置产生信号轨迹。在实验测序反应中提供dNTP混合物，同时提供ddNTP(双脱氧核苷酸三磷酸酯)混合物用于对照反应。ddNTP混合物在一次纳入这种双脱氧终止剂后终止聚合过程，因此基本上不会产生测序感应信号。这些数据是在20毫秒采样分辨率下获取的，这个数据过于粗糙，无法观察到单独的纳入峰值，但是允许在超过300秒的时间内收集数据，时间足够长，以每秒约20个碱基的预期酶速率观察整个聚合过程。
图20显示了与使用ddNTP混合物的对照反应(下轨迹)相比，由dNTP混合物(上信号轨迹)的实验反应产生的信号轨迹。实验测序运行的信号轨迹包括对照反应中缺乏的许多不同的总体信号特征(用箭头标出)并且产生了比对照反应更高的电流。在所示的100秒时间段内产生的信号轨迹表明，根据本公开的各种实施方式的传感器可适合于，在扩展的测序运行以获得长模板序列的过程中，响应于DNA聚合酶探针的基于模板的核苷酸纳入活性产生可检测信号。因此，此类传感器可以处理的长度或模板没有直接限制。
其他示例
本公开的其他非限制性示例包括以下内容。
1.一种传感器，包括：
偶联至第一电极的第一触件；
偶联至第二电极的第二触件；
在所述第一触件和所述第一电极中的一个与所述第二触件和所述第二电极中的一个之间限定的传感器间隙；和
包含第一端和第二端的桥分子；
其中所述桥分子是生物聚合物桥分子；和
其中所述桥分子在所述第一端偶联至所述第一触件并且在所述第二端偶联至所述第二触件。
2.一种传感器，包括：
覆盖基材表面的第一电极；
覆盖所述基材表面的第二电极；
在所述第一电极和所述第二电极之间限定的传感器间隙；和
包含第一端和第二端的桥分子；
其中所述传感器间隙包括约5nm至约30nm的传感器间隙尺寸；和
其中所述桥分子在所述第一端偶联至所述第一触件并且在所述第二端偶联至所述第二触件。
3.如示例1或2所述的传感器，还包括栅电极。
4.如示例1所述的传感器，其中传感器间隙具有约5nm至约30nm的传感器间隙尺寸。
5.如示例1或2所述的传感器，其中所述第一端包括第一自组装锚，和/或所述第二端包括第二自组装锚。
6.如示例2所述的传感器，其中所述桥分子包含生物聚合物桥分子。
7.如示例1-6中任一项所述的传感器，其中所述桥分子包含化学合成的桥分子。
8.如示例1-7中任一项所述的传感器，其中所述桥分子包含线性生物聚合物。
9.如示例1-8中任一项所述的传感器，其中所述桥分子包含小于所述桥分子的持续长度的端到端长度。
10.如示例1-9中任一项所述的传感器，其中所述桥分子包括配置成近似所述传感器间隙尺寸的端到端长度。
11.如示例1-10中任一项所述的传感器，其中所述桥分子包含核酸双链体。
12.如示例11所述的传感器，其中所述核酸双链体包含DNA双链体，DNA-RNA杂交双链体，DNA-PNA杂交双链体，PNA-PNA双链体和DNA-LNA杂交双链体中的一种。
13.如示例11所述的传感器，其中核酸双链体包含巯基修饰的寡核苷酸。
14.如示例6-13中任一项所述的传感器，其中所述第一自组装锚和所述第二自组装锚中之一包含5'-巯基修饰的核苷酸。
15.如示例11所述的传感器，其中所述核酸双链体还包含内部生物素修饰的核苷酸。
16.如示例1-15中任一项所述的传感器，其中所述桥分子包含肽序列，并且其中所述第一自组装锚和所述第二自组装锚中之一包含L-半胱氨酸残基。
17.如示例1-16中任一项所述的传感器，其中当包含桥分子的流体介质与第一触件和第二触件之一接触时，桥分子被配置为自组装以产生桥分子构象。
18.如示例1-17中任一项所述的传感器，其还包括探针，其中所述探针附连至所述桥分子。
19.如示例1-18中任一项所述的传感器，其进一步包含附连至所述桥分子的接头。
20.如示例18-19中任一项所述的传感器，其中所述探针被配置为接合单个靶分子。
21.如示例1-20中任一项所述的传感器，其中所述分子桥和/或探针包含酶。
22.如示例21所述的传感器，其中所述酶是聚合酶和逆转录酶中的一种。
23.如示例20-22中任一项所述的传感器，其中所述靶分子包括多个靶分子特征，每个靶分子特征具有离散位置，包括在第一位置处的第一靶分子特征，在第二位置处的第二靶分子特征和在第n位置处的第n靶分子特征。
24.如示例18所述的传感器，其中所述探针是酶，所述酶被配置为在包含多个不同靶分子的溶液中的反应期间接合所述靶分子，其中所述反应包括时间段t，并且其中所述靶分子的接触产生响应于所述多个靶分子特征的所述酶中的多个构象变化，其中所述多个构型变化中的每一个调节所述传感器中的电流以产生信号特征。
25.包括示例1-24中的任一项所述的传感器的系统。
26.如权利要求25所述的系统，还包括偶联至所述传感器并被配置为检测所述信号特征的信号处理系统。
27.如示例25-26中的任一项所述的系统或者如示例1-24中任一项所述的传感器，其中传感器被配置为产生信号轨迹，该信号轨迹包括在时间段t内检测到的多个信号特征。
28.如示例25-27中的任一项所述的系统，还包括信号解释装置。
29.如示例28所述的系统，其中信号解释装置包括信号解释图。
30.如示例28-29中任一项所述的系统，其中所述信号解释图相对于来自已知靶序列的信号轨迹进行校准。
31.根据如示例28-30中任一项所述的系统，其中所述信号解释装置被配置为响应于由靶序列产生的所述信号轨迹而返回信号解释。
32.如示例28-31中任一项所述的系统，其中信号解释包括信号轨迹解释与可能的实际序列相匹配的可能性的概率评估。
33.一种方法，所述方法包括：
提供如示例1-24、27中任一项所述的传感器；
使核酸模板与聚合酶接触，其中所述聚合酶与包含传感器的一部分的桥分子偶联；
可选地向传感器施加电势；
提供核苷酸碱基混合物；
通过聚合酶进行纳入事件，包括将来自核苷酸碱基混合物的核苷酸纳入合成的核酸中；和
检测由纳入事件产生的信号。
34.如示例33所述的方法，还包括在时间段t内进行的一系列纳入事件，其中所述一系列纳入事件产生信号轨迹，该信号轨迹包括信号特征的序列。
35.如示例34所述的方法，其中每个信号特征对应于一系列纳入事件中的一个。
36.根据如示例34-35中任一项所述的方法，其中所述信号轨迹还包括噪音，并且其中所述方法还包括从所述信号轨迹去除所述噪音。
37.如示例34-36中任一项所述的方法，其中每个纳入事件产生模板碱基依赖性的聚合酶动力学特征。
38.如示例34-37中任一项所述的方法，其中聚合酶动力学特征有助于信号特征。
39.如示例33-38中任一项所述的方法，其中所述方法适于区分响应于未修饰的模板核苷酸产生的第一信号特征和响应于修饰的模板核苷酸产生的第二信号特征。
40.如示例39所述的方法，其中修饰的模板核苷酸是N6-甲基腺苷，N4-甲基胞嘧啶，5-甲基胞嘧啶，5-羟甲基胞嘧啶，5-甲酰基胞嘧啶和5-羧基胞嘧啶中的一种。
41.如示例39所述的方法，其中修饰的模板核苷酸是无碱基位点。
42.一种制造生物分子感测装置的方法，包括：
在基材表面上形成第一电极和第二电极，其中所述第一电极和所述第二电极由电极间隙分开；
将第一触件放置在所述第一电极上并且将第二触件放置在所述第二电极上，其中所述第一触件和所述第二触件被触件间隙分开；和
将桥分子附连到所述第一触件和第二触件。
43.如示例42所述的方法还包括使桥分子与探针接触以使探针与桥分子偶联，其中探针通过自组装与桥分子偶联。
44.如示例42-43中任一项所述的方法，其中将所述桥分子附连到所述第一触件和所述第二触件包括自组装步骤。
45.如示例42-44中任一项所述的方法，其中所述电极间隙和/或所述触件间隙为约5nm至约30nm。
46.如示例42至45中任一项所述的方法，其中所述第一触件和/或所述第二触件包含直径为约5nm的金纳米颗粒。
47.如示例42-46中任一项所述的方法，其中使用光刻方法来确定第一触件位置和/或第二触件位置。
48.如示例42-47中任一项所述的方法；进一步包括在包括所述第一电极和所述第二电极的所述基材表面上放置光抗蚀剂层，并且使用光刻方法限定第一触件位置和第二触件位置。
49.如示例42-48中任一项所述的方法，还包括在所述第一触件位置和所述第二触件位置处对所述基材表面施加表面衍生化处理。
50.如示例49所述的方法，其中表面衍生化处理包括硅烷化。
51.如示例42-50中任一项所述的方法，还包括沉积金层并且进行剥离步骤以使第一金触件设置在所述第一电极上和/或使第二金触件设置在所述第二电极上。
52.如示例42-51中任一项所述的方法，还包括使所述装置与包含多个金纳米颗粒的溶液接触，并且在所述第一触件位置处引入第一金纳米颗粒和/或在所述第二触件位置处引入第二金颗粒。
53.如示例42-52中任一项所述的方法，其中在使所述桥分子与探针或所述探针接触之前，所述桥分子通过自组装与所述第一触件和所述第二触件附连。
54.如示例42-53中任一项所述的方法，其中在通过自组装将所述桥分子附连至所述第一触件和所述第二触件之前，所述桥分子与所述探针接触以通过自组装形成传感器复合体。
55.如示例42-54中任一项所述的方法，还包括制造电子偶联至所述第一电极和所述第二电极的集成电路。
56.如示例55所述的方法，其中集成电路，第一电极和第二电极包括混合信号集成电路。
57.如示例56所述的方法，其中所述集成电路、所述第一电极和所述第二电极使用CMOS制造方法来制造。
58.如示例42-57中任一项所述的方法，其中所述第一和第二触件使用CMOS制造方法制造。
59.如示例55-58中任一项所述的方法，其中所述集成电路，所述第一电极和所述第二电极使用适于制造场效应晶体管的制造方法来制造。
此处关于具体示例描述了好处、其它优点以及对问题的解决方案。此外，此处包含的各种图片中所示的连接线旨在表示各种元素之间的示例性功能关系和/或物理耦合。应当注意，在实际系统中可提供很多替换或附加功能关系或物理连接。但是，不应认为这些益处、优点、解决问题的方案，以及可能产生任何益处、优点或解决方案或者使其更为显著的任何元素是本发明的关键、需要或必需的特征或元素。因此本发明的范围仅由所附权利要求限制，其中，除非明确指出，否则对单数元素的引用不旨在表示“一个并且仅有一个”，而是表示“一个或多个”。此外，在权利要求中使用类似于“A，B或C中的至少一个”的短语的情况下，意图将短语解释为意味着在实施方式中可以单独存在A，在实施方式中可以单独存在B，在实施方式中可以单独存在C，或者单个实施方式中可以存在元素A，B和C的任何组合；例如A和B，A和C，B和C，或A和B和C。
在所有附图中使用不同的交叉阴影来表示不同的部分，但不一定表示相同或不同的材料。
本文提供了系统，方法和设备。本文的详细描述中，对“一个实施方式”，“实施方式”，“示例实施方式”等的引用指示所描述的实施方式可以包括特定的特征，结构或特性，但是每个实施方式可能不一定包括特定的特征，结构或特性。而且，这样的短语不一定指相同的实施方式。此外，当结合实施方式描述特定特征、结构或特性时，认为结合其他实施方式影响这种特征、结构或特性是在本领域技术人员的知识范围内的，无论是否明确描述。尽管本文描述的各种示例和实施方式涉及与核酸靶相关的信号检测方法，但本公开的装置和方法决不限于包含核酸检测和测序的应用。类似地，虽然本文所述的各种示例和实施方式涉及包含生物聚合物桥分子的传感器，但化学合成的桥分子在本公开的范围内。在阅读说明书之后，相关领域的技术人员将清楚如何在替代实施方式中实现本公开。
此外，本公开中的元素、组件或方法步骤不旨在致力于公众，无论权利要求书中是否明确列举这些元素、组件或方法步骤。此处的权利要求元素不能根据美国专利法第112条(f)的规定解释，除非使用短语“用于……的器件”特意地列举了该元素。如此处所使用的，术语“包括”、“包含”或其任意其它变型旨在覆盖非排他的包含，使得包括一列元素的过程、方法、物品或装置不仅包括这些元素而且还可包括并未特意列出的或这些过程、方法、物品或装置固有的其它元素。

Claims (22)

1.一种传感器，包括：
偶联至第一电极的第一触件；
偶联至第二电极的第二触件；
在所述第一触件和所述第一电极中的一个与所述第二触件和所述第二电极中的一个之间限定的传感器间隙；和
包含第一端和第二端的桥分子；
其中所述桥分子是生物聚合物桥分子；和
其中所述桥分子在所述第一端偶联至所述第一触件并且在所述第二端偶联至所述第二触件。
2.一种传感器，包括：
覆盖基材表面的第一电极；
覆盖所述基材表面的第二电极；
在所述第一电极和所述第二电极之间限定的传感器间隙；和
包含第一端和第二端的桥分子；
其中所述传感器间隙包括约5nm至约30nm的传感器间隙尺寸；和
其中所述桥分子在所述第一端偶联至所述第一触件并且在所述第二端偶联至所述第二触件。
3.如权利要求1或2所述的传感器，其中所述第一端包括第一自组装锚，并且所述第二端包括第二自组装锚。
4.如权利要求2所述的传感器，其中所述桥分子包含化学合成的桥分子。
5.如权利要求2所述的传感器，其中所述桥分子包含生物聚合物桥分子。
6.如权利要求1或2所述的传感器，其中所述桥分子包括配置成近似所述传感器间隙尺寸的端到端长度。
7.如权利要求1或4所述的传感器，其中所述生物聚合物桥分子包含核酸双链体。
8.如权利要求7所述的传感器，其中所述核酸双链体包含DNA双链体，DNA-RNA杂交双链体，DNA-PNA杂交双链体，PNA-PNA双链体和DNA-LNA杂交双链体中的一种。
9.如权利要求8所述的传感器，其中所述核酸双链体还包含内部生物素修饰的核苷酸。
10.如权利要求1-9中任一项所述的传感器，其中所述桥分子被配置为，当包含所述桥分子的流体介质与所述第一触件和所述第二触件中的一个接触时，自组装至所述第一触件和第二触件以产生桥分子构象。
11.如权利要求1-10中任一项所述的传感器，其进一步包含探针，其中所述探针经配置以通过自组装接头附连至所述桥分子，且其中所述探针经配置以接合单个靶分子。
12.如权利要求11所述的传感器，其中所述靶分子包括多个靶分子特征，每个靶分子特征具有离散位置，包括在第一位置处的第一靶分子特征，在第二位置处的第二靶分子特征和在第n位置处的第n靶分子特征。
13.如权利要求12所述的传感器，其中所述探针是酶，所述酶被配置为在包含多个不同靶分子的溶液中的反应期间接合所述靶分子，其中所述反应包括时间段t，并且其中所述靶分子的接触产生响应于所述多个靶分子特征的所述酶中的多个构象变化，其中所述多个构型变化中的每一个调节所述传感器中的电流以产生信号特征。
14.一种方法，所述方法包括：
提供如权利要求1-13中任一项所述的传感器；
使核酸模板与探针接触，其中所述探针偶联至包含所述传感器的一部分的桥分子，并且其中所述探针包含聚合酶；
向传感器施加电势；
提供核苷酸碱基混合物；
通过聚合酶进行纳入事件，包括将来自核苷酸碱基混合物的核苷酸纳入合成的核酸中；
检测由纳入事件产生的信号。
15.如权利要求14所述的方法，还包括在时间段t内执行的一系列纳入事件，其中所述一系列纳入事件产生包括信号特征序列的信号轨迹，每个信号特征对应于所述一系列纳入事件中的一个事件。
16.如权利要求15所述的方法，其中所述方法区分响应于未修饰的模板核苷酸产生的第一信号特征和响应于修饰的模板核苷酸产生的第二信号特征。
17.一种制造生物分子感测装置的方法，包括：
在基材表面上形成第一电极和第二电极，其中所述第一电极和所述第二电极由电极间隙分开；
将第一触件放置在所述第一电极上并且将第二触件放置在所述第二电极上，其中所述第一触件和所述第二触件被触件间隙分开；和
将桥分子附连到所述第一触件和第二触件。
18.如权利要求17所述的方法，其中将所述桥分子附连到所述第一触件和所述第二触件包括自组装步骤。
19.如权利要求17所述的方法，其中所述电极间隙和所述触件间隙在约5nm与约30nm之间。
20.如权利要求17所述的方法，还包括制造电子偶联至所述第一电极和所述第二电极的集成电路。
21.如权利要求20所述的方法，其中所述集成电路、所述第一电极和所述第二电极使用CMOS制造方法来制造。
22.如权利要求17所述的方法，其中所述第一和第二触件使用CMOS制造方法制造。
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