CN103154271A - 单核苷酸多态性的实时pcr检测 - Google Patents
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Abstract
公开了用于实时PCR中的多态性检测的方法和试剂盒。使用PCR引物执行对靶核酸序列的实时PCR扩增,其中,引物退火到与目标的单核苷酸多态性(SNP)侧接的序列。实时PCR反应包括标记的探针,标记的探针包括被设计为退火到在SNP位置处的DNA序列的RNA序列。然后,可以在PCR片段中的SNP和与SNP互补的探针的RNA序列之间形成RNA:DNA异源双链体。RNA酶H对RNA:DNA异源双链中的RNA序列的切割导致由标签产生的信号的强度的增加,这表明在靶核酸中存在SNP。
Description
技术领域
本申请要求在2010年10月4日提交的第61/389,412号美国临时专利申请,在2010年10月7日提交的第61/390,701号美国临时专利申请,以及在2011年6月13日提交的第13/158,593号美国专利申请的优先权,通过引用将这些申请的全部内容包含于此。
本公开描述了使用单核苷酸多态性(SNP)特异性的CataCleaveTM探针对SNP的实时PCR检测。
背景技术
人类基因组计划(HGP)的完成已经为更好地了解在给定人类种群内的基因多样性以及该多样性与基因疾病的起始和诱因如何相关铺平了道路。例如,称为单核苷酸多态性(SNP)的个体之间的单核苷酸差异可能是造成表型的巨大差异的原因,其在某些情况下可以预测谁将患某种疾病或者谁将对这些疾病的特定治疗做出反应。药物基因组学领域正在快速地接近根据病人基因组成定制药物治疗。对病人的DNA中的基因突变的快速和可靠的检测可以指导医师的临床诊断和药物治疗的选择。这在肿瘤学中尤其正确,其中,致癌基因的编码区域内的离散突变的存在可以有力地预测癌症的易感性和预后。
例如,在大多数的医疗实践中,对在BRCA的肿瘤抑制基因中的有害突变的存在的基因检测现在是常规的。有害的BRCA-1突变可以大大增加妇女在早期(更年期之前)患乳房癌和/或卵巢癌的风险以及患宫颈癌、子宫癌、胰腺癌和结肠癌的风险。有害的BRCA-2突变可以另外增加胰腺癌、胃癌、胆囊和胆管癌以及黑色素瘤的风险。在包括TP53、PTEN、STK11/LKB1、CDH1、CHEK2、ATM、MLH1和MSH2的若干其他基因中的突变已经与遗传性乳房和/或卵巢肿瘤有关。
伴随出现核酸扩增,可以将任何DNA序列的低至单个的分子复制足够的次数以允许SNP序列分析。可以通过诸如DNA测序、荧光探针检测、质谱分析法或DNA微阵列杂交(例如,第5,885,775号、第6,368,799号美国专利)的各种技术检测SNP。然而,由于总体差的灵敏度、成本、时间消耗或者对PCR后处理的需要,这些方法中的许多方法仍然不适于高通量应用。此外,现有的SNP检测方法具有不可接受的高水平的假阳性和/或假阴性的结果。
由于上述的原因,现有技术未满足在DNA扩增的同时对SNP进行精确的实时检测的需要。
发明内容
技术问题
描述了用于在实时PCR中使用包括DNA和RNA序列的特异性探针的快速检测SNP的方法和试剂盒。该方法能够有助于以经济和可靠的方式对单个PCR片段进行一个或多个SNP的高通量检测。
在一个实施例中,公开了一种用于靶DNA中的多态性的实时检测的方法,包括以下步骤:提供将被检测具有多态性的靶DNA的存在的样品;提供可以退火到靶DNA的成对的扩增引物,其中,第一扩增引物在多态性的位置的上游退火,第二扩增引物在多态性的位置的下游退火;提供包括可检测的标签以及DNA和RNA核酸序列的探针,其中,探针的RNA核酸序列与包含多态性的靶DNA序列的选择区域完全互补,探针的DNA核酸序列与和靶DNA序列的选择区域相邻的DNA序列基本上互补;在扩增聚合酶活性、扩增缓冲液、RNA酶H活性和探针的存在下,在探针中的RNA序列可以与包含多态性的PCR片段中的互补的DNA序列形成RNA:DNA异源双链体的条件下,扩增第一扩增引物和第二扩增引物之间的PCR片段;以及检测来自探针上的标签的信号发射的实时增加,其中,信号的增加表明靶DNA中存在多态性。
在一个方面中,来自探针上的标签的信号发射的实时增加是由于RNA酶H对在RNA:DNA异源双链体中的探针的RNA序列的切割。
在另一个实施例中,公开了一种用于靶DNA中的多态性的实时检测的方法,所述方法包括以下步骤:提供将被检测具有多态性的靶DNA的存在的样品;提供可以退火到靶DNA的成对的扩增引物,其中,第一扩增引物在多态性的位置的上游退火,第二扩增引物在多态性的位置的下游退火;提供包括可检测的标签以及DNA和RNA核酸序列的探针,其中,探针的RNA核酸序列与在多态性的位置包含野生型DNA序列的靶DNA序列的选择区域完全互补,探针的DNA核酸序列与和靶DNA序列的选择区域相邻的DNA序列基本上互补;在扩增聚合酶活性、扩增缓冲液、RNA酶H活性和探针的存在下,在探针中的RNA序列可以与包含多态性的PCR片段中的互补的DNA序列形成RNA:DNA异源双链体的条件下,扩增第一扩增引物和第二扩增引物之间的PCR片段;以及检测来自探针上的标签的信号发射的实时降低,其中,信号的降低表明靶DNA中存在多态性。
在另一个实施例中,公开了一种用于靶RNA中的多态性的实时检测的方法,所述方法包括以下步骤:提供靶RNA;提供可以退火到靶RNA的cDNA的成对的扩增引物,其中,第一扩增引物在多态性序列的位置的上游退火,第二扩增引物在多态性序列的位置的下游退火;提供包括可检测的标签以及与靶RNA的cDNA基本上互补的DNA和RNA核酸序列的探针,其中,探针的RNA核酸序列包含与在疑似SNP序列的位置处的相应的cDNA序列完全互补的序列;在逆转录酶活性、扩增聚合酶活性、逆转录PCR缓冲液、位点特异性RNA酶H活性和探针的存在下,在探针中的RNA序列可以与RT-PCR DNA片段中的互补序列形成RNA:DNA异源双链体的情况下,扩增第一扩增引物和第二扩增引物之间的逆转录PCR片段;以及检测来自探针上的标签的信号发射的实时增加,其中,信号的增加表明靶RNA的cDNA中存在多态性。
在一个方面中,来自探针上的标签的信号发射的实时增加是由于RNA酶H对在RNA:DNA异源双链体中的探针的RNA序列的切割。
在另一个实施例中,公开了一种用于靶RNA中的多态性的实时检测的方法,所述方法包括以下步骤:提供将被检测具有多态性的靶RNA的存在的样品;提供可以退火到靶RNA的cDNA的成对的扩增引物,其中,第一扩增引物在多态性的位置的上游退火,第二扩增引物在多态性的位置的下游退火;提供包括可检测的标签以及DNA和RNA核酸序列的探针,其中,探针的RNA核酸序列与在多态性的位置包含野生型DNA序列的cDNA的选择区域完全互补,探针的DNA核酸序列与和cDNA的选择区域相邻的DNA序列基本上互补;在逆转录酶活性、扩增聚合酶活性、逆转录PCR缓冲液、RNA酶H活性和探针的存在下,在探针中的RNA序列可以与在多态性的位置包含野生型DNA序列的RT-PCR DNA片段中的互补的序列形成RNA:DNA异源双链体的条件下,扩增第一扩增引物和第二扩增引物之间的逆转录PCR片段;以及检测来自探针上的标签的信号发射的实时降低,其中,信号的降低表明靶RNA中存在多态性。
在另一个实施例中,公开了一种用于靶DNA中的多态性的实时检测的试剂盒,所述试剂盒包含:可以退火到靶DNA的成对的扩增引物,其中,第一扩增引物在多态性的位置的上游退火,第二扩增引物在多态性的位置的下游退火;探针,包含可检测的标签以及DNA和RNA核酸序列,其中,探针的RNA核酸序列与包含多态性的靶DNA序列的选择区域完全互补,探针的DNA核酸序列与和靶DNA序列的选择区域相邻的DNA序列基本上互补;以及扩增聚合酶活性、扩增缓冲液和RNA酶H活性。
在另一个实施例中,公开了一种用于靶DNA中的多态性的实时检测的试剂盒,所述试剂盒包含:可以退火到靶DNA的成对的扩增引物,其中,第一扩增引物在多态性的位置的上游退火,第二扩增引物在多态性的位置的下游退火;探针,包含可检测的标签以及DNA和RNA核酸序列,其中,探针的RNA核酸序列与在多态性的位置处包含野生型DNA序列的靶DNA序列的选择区域完全互补,探针的DNA核酸序列与和靶DNA序列的选择区域相邻的DNA序列基本上互补;以及扩增聚合酶活性、扩增缓冲液和RNA酶H活性。
在另一个实施例中,公开了一种用于靶RNA中的多态性的实时检测的试剂盒,所述试剂盒包含:可以退火到靶RNA的cDNA的成对的扩增引物,其中,第一扩增引物在多态性序列的位置的上游退火,第二扩增引物在多态性序列的位置的下游退火;探针,包含可检测的标签以及DNA和RNA核酸序列,其中,探针的RNA核酸序列与包含多态性的cDNA的选择区域完全互补,探针的DNA核酸序列与和cDNA的选择区域相邻的DNA序列基本上互补;以及反转录酶活性、扩增聚合酶活性、反转录PCR缓冲液和RNA酶H活性。
在另一个实施例中,公开了一种用于靶RNA中的多态性的实时检测的试剂盒,所述试剂盒包含:可以退火到靶RNA的cDNA的成对的扩增引物,其中,第一扩增引物在多态性序列的位置的上游退火,第二扩增引物在多态性序列的位置的下游退火;探针,包含可检测的标签以及DNA和RNA核酸序列,其中,探针的RNA核酸序列与在多态性的位置包含野生型DNA序列的cDNA的选择区域完全互补,探针的DNA核酸序列与和cDNA的选择区域相邻的DNA序列基本上互补;以及反转录酶活性、扩增聚合酶活性、反转录PCR缓冲液和RNA酶H活性。
多态性可以是单核苷酸多态性(SNP)。
靶DNA可以是基因组DNA。靶RNA可以是基因组RNA或转录的mRNA。
探针的DNA序列和RNA序列可以是共价连接的。
探针上的可检测标签可以是诸如FRET对的荧光标签。PCR片段或探针可以连接到固体载体。
扩增聚合酶活性可以是热稳定的DNA聚合酶的活性,位点特异性RNA酶H活性可以是热稳定的RNA酶H的活性或者热启动热稳定的RNA酶H的活性。
在某些实施例中,在相同的分子上发现逆转录酶活性和扩增聚合酶活性。
前述的实施例具有许多优点,包括能够实时检测靶核酸中的SNP的存在。该检测方法快速、准确并适于高通量应用。还描述了用于检测在不同的基因座处的SNP的方便、用户友好和可靠的诊断试剂盒。
技术方案
除非另有说明,否则本发明的实践采用本领域内常规的分子生物学技术。这样的技术对本领域技术人员来讲是公知的,并且在文献中被充分地解释。参见,例如,Ausubel等作者,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley& Sons公司,NY,N.Y.(1987-2008),包括所有增刊;Sambrook等人,MolecularCloning:ALaboratory Manual,第二版,Cold Spring Harbor,N.Y.(1989)。
除非另有定义,否则这里使用的所有技术术语和科学术语具有与本领域技术人员所通常理解的意思相同的意思。本说明书也提供了对术语的定义,以有助于解释本申请的公开内容和权利要求书。如果定义与别处的定义不一致,则将以本申请中所阐述的定义为准。
术语“多态性”是指在不同的基因组或个体之间或之中出现两个或更多的替换的基因组序列或等位基因。
术语“多态的”是指在种群中发现特定的基因组序列的两个或更多的变体的情况。
术语“多态性位点”是变异发生的基因座。多态性位点通常具有至少两个等位基因,每个等位基因在选择的种群中以显著的频率出现。在被称为单核苷酸多态性(SNP)的情况下,多态性基因座可以是小至一个的碱基对。将首先被确定的等位基因形式任意地指定为参考、野生型、常见或主要形式,将其他的等位基因形式指定为替换的、次要的、少见的或变异的等位基因。
术语“基因型”是指对包含在个体或样品中的基因的等位基因的描述。
术语“单核苷酸多态性”(“SNP”)是指在等位基因之间变化的一个核苷酸的位点。单核苷酸可以被改变(取代)、移除(删除)或添加(插入)到多核苷酸序列。插入或删除SNP可以导致翻译移码。单核苷酸多态性可以落入基因的编码序列内、基因的非编码区域内或基因之间的基因间区域内。由于基因编码的简并性,在编码序列内的SNP将不必然改变产生的蛋白质的氨基酸序列。两种形式都导致相同的多肽序列的SNP称作同义的(有时称作沉默突变),但是如果产生不同的多肽序列,则它们是非同义的。非同义的变化可以是错义或者无义,其中,错义变化导致不同的氨基酸,而无义变化导致提前的终止密码。“功能SNP”是在基因表达中或基因产物的表达或功能中产生变化的SNP,因此最能够预测可能的临床表型。由功能SNP导致的基因功能的变化可以包括编码的多肽的变化、mRNA稳定性的变化以及转录和翻译因子与DNA或RNA的结合等。未在蛋白质编码区域内的SNP仍然可以对基因拼接、转录因子结合或非编码RNA序列产生影响。
根据实施例,本领域技术人员理解,SNP具有两种替代的等位基因,每种对应于可以存在于染色体中的核苷酸。因此,SNP由四种核苷酸(A、C、G、T)中的两种核苷酸表征。示例将是SNP在每条染色体上的给定位置处具有等位基因C或等位基因T。这表示为C>T或C/T。更常出现的等位基因首先出现(在这种情况下是C),并被称作主要的、常见的或野生型等位基因。不常出现的取代常见等位基因的替代等位基因(在这种情况下是T)称作次要的、少见的或变异的等位基因。野生型和变异的等位基因可以分别称作常见的或少见的等位基因。由于人类是二倍体生物体(意思是每条染色体有两个拷贝),所以每个个体在SNP处具有两个等位基因。这些等位基因可以是两个拷贝的相同的等位基因(CC或TT),或者它们可以是不同的等位基因(CT)。CC、CT和TT被称作基因型。这些之中,CC和TT由具有两个拷贝的相同的等位基因表征,并称作纯合基因型。基因型CT在每条染色体上具有不同的等位基因,是杂合基因型。具有纯合基因型或杂合基因型的个体分别被称作纯合子和杂合子。
SNP的选择
实施例提供了一种检测任何靶核酸序列中的一个或多个SNP的新型方法。通过参照SNP的生物信息学数据库,极方便确定SNP在目标基因中的位置。dbSNP是来自美国国家生物技术信息中心(National Center forBiotechnology Information,NCBI)的SNP数据库。SNPedia是来自于混合组织的维基-风格的数据库。OMIM数据库以文本的形式描述了多态性和例如疾病之间的联系,而HGVbaseG2P允许用户可视地询问实际的概要水平的相关数据。
还可以在国际单体型图计划(International HapMap Project)找到关于SNP的珍贵的信息,其中,国际单体型图计划在整个人类基因组中寻找大约每5kb一个信息性SNP的基因型。对具有来自尼日利亚、欧洲和中国/日本的祖先的人群进行基因分型,以确定人类DNA序列变异的共同图案(单体型)并使得该信息可以在公共领域内可免费地获得。该信息将有助于发现影响常见疾病和药物响应的序列变异。构建人类单体型图是迈向个体化治疗的重要步骤。
用于基因分型的引物的选择
一旦选择了基因和相关的SNP,制备用于靶核酸序列的基因分型的引物寡核苷酸和探针。
“靶DNA或靶RNA”或“靶核酸”或“靶核酸序列”是指待分析的并包含目标多态性位点的核酸的区域。靶核酸序列在PCR反应或逆转录-PCR反应中用作用于扩增的模板。靶核酸序列可以包括自然产生的分子和合成的分子。示例性靶核酸序列包括但不限于基因组DNA或基因组RNA。
如这里所使用,术语“核酸”是指寡核苷酸或多核苷酸,其中,所述寡核苷酸或多核苷酸可以被修饰或可以包含被修饰的碱基。寡核苷酸是包含2至60个核苷酸的单链核苷酸聚合物。多核苷酸是包含两个或更多的核苷酸的核苷酸聚合物。多核苷酸可以是包括退火的寡核苷酸的双链DNA,其中,第二链是具有第一寡核苷酸的反向互补序列的寡核苷酸,多核苷酸也可以是包含脱氧胸苷的单链核酸聚合物、单链RNA、双链RNA或RNA/DNA异源双链体。核酸包括但不限于基因组DNA、cDNA、hnRNA、snRNA、mRNA、rRNA、tRNA、片段化核酸、从诸如线粒体或叶绿体的亚细胞器获得的核酸以及从可以存在于生物试样上或生物试样中的DNA或RNA病毒或者微生物获得的核酸。核酸可以由单一类型的糖配基组成,例如,如在RNA和DNA的情况下,或者可以由不同的糖配基的混合物组成,例如,如在RNA/DNA嵌合体的情况下。
如这里所使用,术语“寡核苷酸”与“引物”或“多核苷酸”交换地使用。术语“引物”是指在PCR反应中用作DNA合成起始位点的寡核苷酸。引物通常是大约15至大约35个核苷酸长并杂交到与靶序列互补的区域。
可以通过本领域已知的任何合适的方法(例如,化学合成)来合成和制备寡核苷酸。寡核苷酸也可以通过商业来源方便地购得。本领域技术人员将容易地优化并确定在PCR反应中与目标多态性位点侧接的引物。商业购得的引物可以用于扩增特定SNP的目标特定基因。许多计算机程序(例如,Primer-Express)可容易地用于设计理想引物组。对于本领域技术人员来说明显的将是,可以相应地基于提供(或者使用登录号公开地获得)的核酸信息来制备引物和探针。
术语“退火”和“杂交”被交换地使用,并表示一个核酸与另一个核酸的碱基对相互作用,导致形成双链体、三链体或其他更高级的结构。在某些实施例中,初级相互作用是通过沃森/克里克以及胡斯坦型氢键的碱基特异性,例如,A/T和G/C。在某些实施例中,碱基堆积和疏水作用也可以有助于双链体的稳定。基本上互补是指序列上充分互补以退火并形成稳定的双链体的两条核酸链。
本领域技术人员将知道如何设计与目标多态性位点侧接的PCR引物。合成的寡核苷酸的长度通常在20和26个碱基对之间,具有大约55℃的熔点(TM)。可以在由国际单体型图计划创建的分配文件中找到用于引物设计的旁侧序列。这些文件包含大量的关于每个SNP的信息,包括观察的等位基因和每个侧面的1000bp的NCBI-遮蔽序列。
核酸模板的制备
在一些实施例中,样品包括纯化的核酸模板(例如,mRNA、rRNA及其混合物)。从样品提取和纯化RNA的程序在本领域内是公知的。例如,可以使用TRIzolTM试剂(Invitrogen)提取法从细胞分离RNA。然后,使用例如NanodropTM分光光度计和Agilent2100生物分析仪确定RNA的量和质量。
在其他实施例中,样品是细胞裂解液,通过使用pH为大约6至大约9的裂解缓冲液、浓度为大约0.125%至大约2%的两性离子洗涤剂、浓度为大约0.3mg/ml至大约2.5mg/ml的叠氮化物和诸如蛋白酶K(大约1mg/ml)的蛋白酶裂解细胞来产生所述细胞裂解液。在55℃温育15分钟之后,在95℃处理10分钟使蛋白酶K失活,以产生适合于高效PCR或逆转录PCR分析的“基本上无蛋白质”的裂解液。
在一个实施例中,1x裂解试剂包含12.5mM Tris乙酸盐或Tris-HCl或HEPES(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸)(PH=7-8)、0.25%(w/v)CHAPS、0.3125mg/ml叠氮化钠和1mg/ml的蛋白酶K。
这里使用的术语“裂解液”是指具有裂解的细胞碎片和核酸的液相。
如这里所使用,术语基本上无蛋白质是指大部分蛋白质经蛋白酶的水解切割而失活的裂解液。蛋白酶可以包括蛋白酶K。在细胞裂解过程中加入蛋白酶K使核酸酶迅速失活,否则核酸酶会降解靶核酸。可以对“基本上无蛋白质”的裂解液进行除去失活的蛋白质的处理,或者可以不进行该处理。
如这里所使用,术语“细胞”可以指原核细胞或真核细胞。
在一个实施例中,术语“细胞”可以指诸如细菌的微生物,细菌包括但不限于革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌和耐酸细菌等。在某些实施例中,可以使用表面的擦拭取样(swab sampling)来收集待测“细胞”。在其他实施例中,“细胞”可以指病原生物体。
在其他实施例中,试样包括病毒核酸,例如,逆转录病毒核酸。在某些实施例中,试样可以包括慢病毒核酸,例如,HIV-1或HIV-2。
如这里所使用,“两性离子洗涤剂”指表现出两性离子特性(例如,不具有净电荷、无导电性和电泳迁移率、不与离子交换树脂结合、破坏蛋白质-蛋白质相互作用)的洗涤剂,其包括但不限于CHAPS、CHAPSO和三甲铵乙内酯衍生物,例如,三甲铵乙内酯衍生物优选是以商品名Zwittergent(Calbiochem,San Diego,CA)和Anzergent(Anatrace公司,Maumee,OH)出售的磺基三甲铵乙内酯。
在一个实施例中,两性离子洗涤剂是CHAPS(CAS号:75621-03-3;可从SIGMA-ALDRICH购得,产品号为C3023-1G),CHAPS是3-[(3-胆固醇氨丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸的缩写(在第4,372,888号美国专利中被更详细地描述),具有结构:
在另一实施例中,CHAPS以总组合物的大约0.125%至大约2%重量/体积(w/v)的浓度存在。在另一实施例中,CHAPS以总组合物的大约0.25%至大约1%w/v的浓度存在。在又一实施例中,CHAPS以总组合物的大约0.4%至大约7%w/v的浓度存在。
在其他实施例中,裂解缓冲液可以包括其他非离子型洗涤剂,例如,Nonidet、Tween或Triton X-100。
如这里所使用,术语裂解缓冲液是指可以将pH值有效地维持在6和9之间、在25℃具有大约6至大约9的pKa的组合物。这里描述的缓冲液通常是生理兼容的缓冲液,其适于酶活性功能并能使生物大分子保持它们正常的生理和生物化学功能。
加入到裂解缓冲液的缓冲液的示例包括但不限于HEPES(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸)、MOPS(3-(N-吗啉基)-丙磺酸)、N-三(羟甲基)甲基甘氨酸(Tricine)、三(羟甲基)甲胺酸(Tris)、哌嗪-N,N′-二(2-乙磺酸)(PIPES)以及含缓冲液的乙酸或磷酸(K2HPO4、KH2PO4、Na2HPO4、NaH2PO4)等。
这里使用的术语“叠氮化物”由式-N3表示。在一个实施例中,叠氮化物是作为通用杀菌剂的叠氮化钠NaN3(CAS号26628-22-8;可从SIGMA-ALDRICH购得,产品号:S2002-25G)。
如这里使用的术语“蛋白酶”是水解肽键的酶(具有蛋白酶活性)。蛋白酶也称作例如肽酶、蛋白质酶、肽水解酶或蛋白质水解酶。根据本发明使用的蛋白酶可以是内作用于多肽链中的内切型(肽链内切酶)。在一个实施例中,蛋白酶可以是丝氨酸蛋白酶、蛋白酶K(EC3.4.21.64;从Roche AppliedSciences购得,50U/ml重组蛋白酶K(来自毕氏酵母(Pichia pastoris)),Cat.号为03115887001)。
蛋白酶K用于消化蛋白质并从核酸制备物除去污染物。将蛋白酶K加入核酸制备物使核酸酶迅速失活,否则核酸酶会在纯化过程中降解DNA或RNA。因为该酶在使蛋白质变性的化学物质的存在下具有活性并且可以在大约95℃的温度下处理大约10分钟而失活,所以它非常适合于本申请。
在一个实施例中,诸如李斯特菌(Listeria)、沙门氏菌(Salmonella)和大肠杆菌的革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌的裂解也需要包括蛋白酶K(1mg/ml)的裂解试剂。用蛋白酶K在55℃消化细胞裂解液中的蛋白质15分钟,然后在95℃处理10分钟使蛋白酶K失活。冷却后,基本上无蛋白质的裂解液适用于高效PCR扩增。
除了蛋白酶K之外或代替蛋白酶K,裂解试剂可以包括丝氨酸蛋白酶,例如,胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、弹性蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、streptogrisin、嗜热蛋白酶、细胞溶解酶(aqualysin)、血纤维蛋白溶酶、黄瓜素(cucumisin)或者羧肽酶A、D、C或Y。除了丝氨酸蛋白酶之外,裂解溶液还可以包括:半胱氨酸蛋白酶,例如,木瓜蛋白酶、钙蛋白酶或梭菌蛋白酶;酸性蛋白酶,例如,胃蛋白酶、凝乳酶或组织蛋白酶;或者金属蛋白酶,例如,链酶蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、胶原酶、中性蛋白酶、氨基肽酶或者羧肽酶A、B、E/H、M、T或U。蛋白酶K在宽的pH范围(pH4.0-10.0)内稳定并且在具有两性离子洗涤剂的缓冲液中稳定。
靶核酸序列的PCR扩增
一旦制备了引物,可以通过各种方法完成核酸扩增,这些方法包括但不限于聚合酶链式反应(PCR)、基于核酸序列的扩增(NASBA)、连接酶链式反应(LCR)和滚环扩增(RCA)。聚合酶链式反应(PCR)是最常用来扩增特定的靶DNA序列的方法。
“聚合酶链式反应”或“PCR”通常是指用于体外扩增期望的核苷酸序列的方法。通常,PCR工艺包括将摩尔数过量的两种或多种可延伸的寡核苷酸引物引入包含样品的反应混合物,反应混合物具有期望的靶序列,其中,引物与双链靶序列的相反链互补。在DNA聚合酶的存在下,对反应混合物进行热循环程序,导致侧端相接有DNA引物的期望靶序列的扩增。
在许多出版物中描述了PCR技术,包括:PCR:A Practical Approach,M.J.McPherson等人,IRL出版社(1991);PCR Protocols:A Guide to Methodsand Applications,Innis等人,Academic出版社(1990);以及PCR Technology:Principals and Applications for DNA Amplification,H.A.Erlich,Stockton出版社(1989)。在许多美国专利中也描述了PCR,包括第4,683,195号、第4,683,202号、第4,800,159号、第4,965,188号、第4,889,818号、第5,075,216号、第5,079,352号、第5,104,792号、第5,023,171号、第5,091,310号和第5,066,584号美国专利,通过引用将它们中的每个包含于此。
术语“样品”是指包含核酸材料的任何物质。
如这里所使用,术语“PCR片段”或逆转录PCR片段或扩增子指特定的靶核酸扩增之后产生的多核苷酸分子(或多个分子的集合)。PCR片段典型地是但不限于DNA PCR片段。PCR片段可以是单链或双链或者它们任意浓度比的混合物。PCR片段或RT-PCR可以是大约100-大约500nt长或更长。
“缓冲液”是添加到扩增反应中的化合物,它通过调节扩增反应的pH来改变扩增反应的一种或多种组分的稳定性、活性和/或寿命。本发明的缓冲试剂与PCR扩增和位点特异性RNA酶H的切割活性兼容。本领域内公知的某些缓冲试剂包括但不限于Tris、三甲基甘氨酸、MOPS(3-(N-吗啉基)-丙磺酸)和HEPES(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸)。另外,PCR缓冲液通常可包含高达大约70mM KCl和大约1.5mM或更高的MgCl2以及大约50-200μM的dATP、dCTP、dGTP和dTTP中的每一种。本发明的缓冲液可以包含添加剂以优化逆转录PCR或PCR反应的效率。
如这里所使用,术语“核苷酸”是指包含核苷酸碱基的化合物,其中,核苷酸碱基连接到诸如核糖、树胶醛糖、木糖和吡喃糖及其糖类似物的糖的C-1′碳。术语核苷酸也包含核苷酸类似物。糖可以是取代的或未取代的。取代的核糖包括但不限于一个或多个碳原子(例如,2′碳原子)被一个或多个相同或不同的Cl、F、-R、-OR、-NR2或卤素基团取代的这些核糖,其中,每个R独立地为H、C1-C6烷基或C5-C14芳基。示例性核糖包括但不限于:2′-(C1-C6)烷氧基核糖、2′-(C5-C14)芳氧基核糖、2′,3′-二脱氢核糖、2′-脱氧-3′-卤代核糖、2′-脱氧-3′-氟代核糖、2′-脱氧-3′-氯代核糖、2′-脱氧-3′-氨基核糖、2′-脱氧-3′-(C1-C6)烷基核糖、2′-脱氧-3′-(C1-C6)烷氧基核糖和2′-脱氧-3′-(C5-C14)芳氧基核糖、核糖、2′-脱氧核糖、2′,3′-二脱氧核糖、2′-卤代核糖、2′-氟代核糖、2′-氯代核糖和2′-烷基核糖,例如,2′-O-甲基,4′-异头核苷酸、1′-异头核苷酸、2′-4′-和3′-4′-连接及其他“锁(locked)”或“LNA”的二环糖变型(参见,例如,第WO98/22489号、第WO98/39352号和第WO99/14226号PCT公开申请以及第6,268,490号和第6,794,499号美国专利)。
添加剂是加入组合物的化合物,其改变组合物的一种或多种组分的稳定性、活性和/或寿命。在某些实施例中,组合物是扩增反应组合物。在某些实施例中,添加剂使污染物酶失活、稳定蛋白质折叠和/或减少聚集。在扩增反应中可以包含的示例性添加剂包括但不限于三甲铵乙内酯、甲酰胺、KCl、CaCl2、MgOAc、MgCl2、NaCl、NH4OAc、NaI、Na(CO3)2、LiCl、MnOAc、NMP、海藻糖、二甲基亚砜(“DMSO”)、丙三醇、乙二醇、二硫苏糖醇(“DTT”)、焦磷酸酶(包括但不限于嗜酸热原体无机焦磷酸酶(Thermoplasmaacidophilum inorganic pyrophosphatase)(“TAP”))、牛血清白蛋白(“BSA”)、丙二醇、甘氨酰胺、CHES、PercollTM、金精三羧酸、Tween20、Tween21、Tween40、Tween60、Tween85、Brij 30、NP-40、Triton X-100、CHAPS、CHAPSO、Mackernium、LDAO(N-十二烷基-N,N-二甲胺-N-氧化物)、两性洗涤剂3-10、Xwittergent 3-14、Xwittergent SB3-16、Empigen、NDSB-20、T4G32、大肠杆菌SSB、RecA、切口内切酶(nicking endonuclease)、7-deazaG、dUTP、UNG、阴离子洗涤剂、阳离子洗涤剂、非离子洗涤剂、两性洗涤剂、固醇、渗透剂、阳离子以及任何其他可以改变扩增效率的化学制品、蛋白质或辅因子。在某些实施例中,两种或多种添加剂包括在扩增反应中。根据本发明,在添加剂不干扰RNA酶H的活性的情况下,可以添加添加剂以改善引物退火的选择性。
如这里所使用,应用于酶的术语“热稳定”是指在升高的温度下(例如,在55℃或更高)保持其生物活性或者在加热和冷却的重复循环之后保持其生物活性的酶。热稳定的多核苷酸聚合酶特别适用于PCR扩增反应。
如这里所使用,扩增聚合酶活性是指催化脱氧核糖核苷酸的聚合作用的酶活性。通常,酶将在退火到核酸模板序列的引物的3′端开始合成,并将朝着模板链的5′端进行。在某些实施例中,“扩增聚合酶活性”是热稳定的DNA聚合酶。
如这里所使用,热稳定聚合酶是对热相对稳定并且不需要在每个PCR循环之前添加的酶。
热稳定DNA聚合酶的非限制性示例可以包括但不限于从Thermusaquaticus(栖热水生菌)(Taq聚合酶)、Thermus thermophilus(嗜热栖热菌)(Tth聚合酶)、Thermococcus litoralis(嗜热高温球菌)(Tli或VENTTM聚合酶)、Pyrococcus furiosus(Pfu或DEEPVENTTM聚合酶)、Pyrococcus woosii(Pwo聚合酶)和其他火球菌种、Bacillus stearothermophilus(嗜热脂肪芽孢杆菌)(Bst聚合酶)、Sulfolobus acidocaldarius(嗜酸热硫化叶菌)(Sac聚合酶)、Thermoplasma acidophilum(嗜酸热原体)(Tac聚合酶)、Thermus rubber(Tru聚合酶)、Thermus brockianus(DYNAZYMETM聚合酶)(Tne聚合酶)、Thermotoga maritime(海栖热袍菌)(Tma)和Thermotoga属的其他种(Tsp聚合酶)以及Methanobacterium thermoautotrophicum(甲烷杆菌)(Mth聚合酶)的嗜热细菌分离的聚合酶。PCR反应可以包含多于一种的具有互补性质的热稳定聚合酶,以对靶序列进行更有效的扩增。例如,具有高的持续合成能力(复制大核苷酸片段的能力)的核苷酸聚合酶可以与具有校正能力(在靶核酸序列延伸过程中改正错误的能力)的另一种核苷酸聚合酶互补,因此产生能够高保真地复制长的靶序列的PCR反应。热稳定聚合酶可以以其野生型形式使用。可选择地,可以修改聚合酶以包含酶的片段或者包含提供有利于PCR反应的有益性质的突变。在一个实施例中,热稳定聚合酶可以是Taq聚合酶。已知许多性质提高的Taq聚合酶的变异体,这些变异体包括但不限于AmpliTaqTM、AmpliTaqTM、Stoffel片段、SuperTaqTM、SuperTaqTM plus、LA TaqTM、LApro TaqTM和EX TaqTM。在另一个实施例中,在本发明的多重扩增反应中使用的热稳定聚合酶是AmpliTaq Stoffel片段。
RNA靶核酸序列的逆转录-PCR扩增
研究基因表达的被最广泛使用的技术之一采用mRNA序列的第一链cDNA作为模板通过PCR进行扩增。
术语逆转录酶活性和“逆转录”是指特征为依赖RNA的DNA聚合酶的一类聚合酶的酶活性,依赖RNA的DNA聚合酶可以利用RNA链作为模板来合成DNA链(即,互补DNA,cDNA)。
“RNA PCR”的“逆转录-PCR”是PCR反应,其使用RNA模板和逆转录酶或具有逆转录酶活性的酶在依赖DNA的DNA聚合酶引物延长的多个循环之前首先产生单链DNA分子。多重PCR是指在单一反应中产生多于一种的扩增产物的PCR反应,典型地通过在单一反应中包含多于两种的引物。
示例性逆转录酶包括但不限于如第4,943,531号美国专利中描述的莫洛尼鼠白血病病毒(M-MLV)RT、如第5,405,776号美国专利中描述的缺少RNA酶H活性的M-MLV-RT的突变形式、牛白血病病毒(BLV)RT、劳斯氏肉瘤病毒(RSV)RT、禽成髓细胞瘤病毒(AMV)RT和第7,883,871号美国专利中公开的逆转录酶。
被执行为终点测定或实时测定的逆转录-PCR程序包括两个独立的分子合成:(i)从RNA模板合成cDNA;以及(ii)通过PCR扩增复制新合成的cDNA。为试图解决经常与逆转录-PCR相关的技术问题,考虑到该程序的以下三个基本步骤,已经形成了一些操作规程:(a)RNA的变性和反向引物的杂交;(b)cDNA的合成;以及(c)PCR扩增。在所谓的“未结合”逆转录-PCR程序中(例如,两步逆转录-PCR),使用对逆转录酶活性来讲最佳的缓冲液条件,作为单独的步骤来执行逆转录。合成cDNA之后,稀释反应物以将MgCl2和脱氧核苷三磷酸(dNTP)的浓度降低到对Taq DNA聚合酶活性来讲最佳的条件,根据标准条件执行PCR(参见第4,683,195号和第4,683,202号美国专利)。相反,“结合”RT PCR方法使用对于逆转录酶和Taq DNA聚合酶的活性来讲优化的通用缓冲液。在一种情况下,反向引物的退火是加酶之前的单独步骤,然后将酶加到单独的反应器中。在另一种情况下,逆转录酶活性是热稳定Tth DNA聚合酶的组成部分。在Mn2+的存在下执行退火和cDNA合成,然后,在通过螯合剂除去Mn2+之后,在Mg2+的存在下执行PCR。最后,“连续”方法(例如,一步逆转录-PCR)将三个逆转录-PCR步骤整合为单个连续反应,避免了为加入组分或酶而打开反应管。连续逆转录-PCR已经被描述为使用热稳定Taq DNA聚合酶和Tth聚合酶的逆转录酶活性的单一酶体系以及使用AMV RT和Taq DNA聚合酶的二酶体系,其中,可以省略初始的65℃RNA变性的步骤。
在某些实施例中,可以标记一个或多个引物。如这里所使用,在本说明书中可交换地使用的“标签”、“可检测标签”或者“标记”或“可检测标记”是指附着到核苷酸、核苷酸聚合物或核酸结合因子的任何化学配基,其中,附着可以是共价的或非共价的。优选地,标签是可检测的并且使核苷酸或核苷酸聚合物对本发明实施者是可检测的。可检测标签包括发光分子、化学发光分子、荧光染料、荧光淬灭剂、着色分子、放射性同位素或闪烁体。可检测标签还包括任何有用的连接分子(例如,维生素H、抗生物素蛋白、链酶亲和素、HRP、蛋白质A、蛋白质G、抗体或其片段、Grb2、多组氨酸、Ni2+、FLAG标签、myc标签)、重金属、酶(示例包括碱性磷酸酶、过氧化物酶和荧光素酶)、电子供体/受体,吖啶酯、染料和量热物质。还想到,可以将质量改变(change in mass)认为是检测标签,就像表面等离子共振检测的情况。技术人员将容易地识别上面未提到的可以在本发明的操作中使用的有用的可检测标签。
一步逆转录-PCR相比于未结合逆转录-PCR具有几点优点。一步逆转录-PCR对反应混合试剂和核酸产物的处理比未结合逆转录-PCR(例如,在两个反应步骤之间为了加入组分或酶打开反应管)更少,因此劳动强度更小,减少了所需的人时(person hour)数。此外,一步逆转录-PCR需要更少的样品,并且降低了被污染的风险。已经证明一步逆转录-PCR的灵敏度和特异性非常适合研究给定样品中的一个到若干个基因的表达水平或检测病原体RNA。典型地,这种程序已经被限于使用基因特异引物来开始cDNA合成。
结合这些逆转录-PCR技术通过在线检测来测量PCR反应动力学的能力使得能够以高灵敏度准确且精确地对RNA的拷贝数定量。通过在扩增工艺过程中通过荧光双重标记杂交探针技术(例如,下面讨论的5′荧光核酸酶测定(“Taq-Man”)或核酸内切酶测定(“CataCleave”))荧光监测和测量PCR产物来检测逆转录PCR产物使以上技术变得可能。
使用Cata CleaveTM探针的实时PCR
后扩增扩增子的检测费时费力。已经开发了实时方法来对PCR工艺过程中的扩增进行监测。这些方法典型地使用键合到新合成DNA的荧光标记探针或在插入双链DNA时荧光发射增加的染料。实时PCR检测方法对于基因组DNA或基因组RNA中的SNP的PCR检测是适用的。
通常将探针设计成在没有目标的存在下,通过两个发色团之间的荧光共振能量转移(FRET)使供体发射淬灭。当供体发色团和受体发色团非常接近时,处于激发态的供体发色团可以将能量转移给受体发色团。这种转移常常是非辐射的,并通过偶极-偶极结合发生。充分地增加发色团之间的距离的任何过程将降低FRET的效率,从而可以辐射地检测到供体发色团的发射。常见供体发色团包括FAM、TAMRA、VIC、JOE、Cy3、Cy5和德克萨斯红。选择受体发色团使得它们的激发光谱与供体的发射光谱重叠。这样的供体发色团和受体发色团对的示例是FAM-TAMRA。也存在将淬灭宽范围供体的非荧光受体。合适的供体-受体FRET对的其他示例对本领域技术人将是已知的。
能够用于实时PCR检测的FRET探针的常见示例包括分子信标(例如,第5,925,517号美国专利)、TaqManTM探针(例如,第5,210,015号和第5,487,972号美国专利)和CataCleave探针TM(例如,第5,763,181号美国专利)。分子信标是单链寡核苷酸,其被设计成使得在未结合状态下探针形成供体发色团和受体发色团非常接近并且供体发射减少的二级结构。在合适的反应温度下,信标展开并特异性地结合到扩增子。一旦展开,供体发色团和受体发色团之间的距离增加,从而FRET反转并且可以使用专用设备来监测供体的发射。TaqManTM和CataCleaveTM技术与分子信标不同之处在于:使用的FRET探针被切割,从而供体发色团和受体发色团充分分开以使FRET反转。
TaqManTM技术使用5′端标记有供体发色团并且3′端标记有受体发色团的单链寡核苷酸探针。用于扩增的DNA聚合酶必须包含5->3的核酸外切酶活性。TaqManTM探针结合到扩增子的一条链,同时引物结合。随着DNA聚合酶延伸引物,聚合酶将最终与结合的TaqManTM探针相遇。这时,聚合酶的核酸外切酶活性将从5′端开始顺序地降解TaqManTM探针。随着探针被消化,包含探针的单核苷酸被释放到反应缓冲液中。供体扩散离开受体,而FRET被反转。监测来自供体的发射以确定探针的切割。由于TaqManTM的作用方式,对于每个PCR循环,只可以监测到一次特异扩增子。引物通过TaqManTM靶位点的延伸产生了双链产物,其防止了TaqManTM探针的再次结合,直到扩增子在下一个PCR循环中被变性。
第5,763,181号美国专利描述了另一实时检测方法(称作“CataCleaveTM”),通过引用将该美国专利的内容包含于此。CataCleaveTM技术与TaqManTM不同之处在于:由不具有聚合酶活性的第二酶完成探针的切割。例如,CataCleaveTM探针在分子内具有作为诸如限制酶或RNA酶的核酸内切酶的目标的序列。在一个实施例中,CataCleaveTM探针具有嵌合结构,其中,探针的5′端和3′端由DNA构成并且切割位点包含RNA。探针的DNA序列部分在端部或内部标记有FRET对。PCR反应包括将RNA-DNA二聚体的RNA序列部分特异性切割的RNA酶H酶。切割之后,探针的两段在反应温度下从靶扩增子分离下来并扩散到反应缓冲液中。随着供体和受体分开,FRET以与TaqManTM探针相同的方式反转,并可以监测供体的发射。切割和分离再次产生用于CataCleaveTM再次结合的位点。以这种方式,单个扩增子能够用作探针切割的多次循环或目标,直到引物延伸通过CataCleaveTM探针结合位点。
CataCleaveTM探针的标记
术语“探针”包含具有特异部分的多核苷酸,所述特异部分被设计成以序列-特异方式与特定核酸序列(例如,靶核酸序列)的互补区域杂交。在一个实施例中,寡核苷酸探针的长度在15至60个核苷酸的范围内。更优选地,寡核苷酸探针的长度在18至30个核苷酸的范围内。本发明的寡核苷酸探针的精确序列和长度部分取决于其结合的靶多核苷酸的性质。可以改变结合的位置和长度,以获得用于特定实施例的合适的退火和熔解性质。可以在许多描述TaqManTM测定或CataCleaveTM的参考文献中找到用于做出这样的设计选择的指导,第5,763,181号、第6,787,304号和第7,112,422号美国专利中描述了TaqManTM测定或CataCleaveTM,通过引用将它们的内容包含于此。
在某些实施例中,探针与靶核酸序列“基本上互补”。
如这里所使用,术语“基本上互补”是指序列上充分互补以退火并形成稳定的双链的两条核酸链。互补性无需完全;例如,在两个核酸之间可以存在任何数目的碱基对错配。然而,如果错配的数目如此之大,使得即使在最不严格的杂交条件下杂交也不可能发生,则该序列不是基本上互补的序列。这里,当两个序列被称作“基本上互补”时,是指序列互相充分地互补以在选择的反应条件下杂交。本领域内公知核酸互补性与足以获得特异性的杂交的严格性之间的关系。例如,只要杂交条件足以允许例如区分配对序列和非配对序列,则两条基本上互补的链可以是完全互补或者可以包含1至许多个错配。因此,“基本上互补”序列可以指在双链区域内具有百分之100、95、90、80、75、70、60、50或更小或这些数值之间的任何数值的碱基对互补性的序列。
如这里所使用,“选择区域”是指与探针的RNA序列退火的靶DNA或cDNA的多核苷酸序列。在一个实施例中,靶DNA或cDNA的“选择区域”的长度可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或更多个的核苷酸。
如这里所使用,位点特异性RNA酶H切割是指完全与靶DNA序列互补并与靶DNA序列杂交以形成RNA:DNA异源双链体的CataCleaveTM探针的RNA部分的切割。
如果CataCleaveTM探针的RNA部分包括单核苷酸多态性,并且靶DNA序列在多态性的位置包括野生型序列,则CataCleaveTM探针和野生型靶DNA序列之间的RNA:DNA异源双链体的形成导致在多态性位置处的单核苷酸错配,这防止了CataCleaveTM探针的RNA部分被RNA酶H切割。
相似地,如果靶DNA序列包括SNP序列,并且CataCleaveTM探针的RNA部分在多态性的位置包括野生型序列,则CataCleaveTM探针和包含SNP序列的靶DNA序列之间的RNA:DNA异源双链体的形成导致在多态性位置处的单核苷酸错配,这防止了CataCleaveTM探针的RNA部分被RNA酶H切割。
如这里所使用,CataCleaveTM探针的“标签”或“可检测标签”是指包含通过共价或非共价方式附着到探针的荧光染料化合物的任何标签。
如这里所使用,“荧光染料”是指在被波长比发射的光的波长短的光激发时而发光的荧光化合物。术语“荧光的供体”或“荧光供体”是指发射在本发明中描述的测定中被测量的光的荧光染料。更具体地讲,荧光供体提供被荧光受体吸收的能量。术语“荧光的受体”或“荧光受体”是指吸收从荧光供体发射的能量的第二荧光染料或淬灭分子。第二荧光染料吸收从荧光供体发射的能量并发射波长比荧光供体发射的光的波长长的光。淬灭分子吸收由荧光供体发射的能量。
任何发光分子,优选荧光染料和/或荧光淬灭剂,都可以在本发明的实施中使用,包括例如Alexa FluorTM350、Alexa FluorTM430、Alexa FluorTM488、Alexa FluorTM532、Alexa FluorTM546、Alexa FluorTM568、Alexa FluorTM594、Alexa FluorTM633、Alexa FluorTM647、Alexa FluorTM660、Alexa FluorTM680、7-二乙胺基香豆素-3-羧酸、荧光素、Oregon Green488、Oregon Green514、四甲基罗丹明、罗丹明X、德克萨斯红染料(Texas Red dye)、QSY7、QSY33、Dabcyl、BODIPY FL、BODIPY630/650、BODIPY6501665、BODIPY TMR-X、BODIPY TR-X、二烷氨基香豆素、Cy5.5、Cy5、Cy3.5、Cy3、DTPA(Eu3+)-AMCA和TTHA(Eu3+)AMCA。
在一个实施例中,寡核苷酸探针的3′端核苷酸被封闭或被修饰(render)而不能通过核酸聚合酶延伸。通过将报告分子或淬灭分子附着到探针的3′端位置,方便地执行这样的封闭。
在一个实施例中,报告分子是通过连接配基附着到探针的3′端或5′端的衍生的荧光有机染料。优选地,淬灭分子也是有机染料,根据本发明的实施例,其可以是荧光的或可以不是荧光的。例如,在本发明的优选实施例中,淬灭分子是荧光的。通常,无论淬灭分子是荧光的还是仅通过非辐射衰减释放由报告分子传递的能量,淬灭剂的吸收能带应该与报告分子的荧光发射能带基本重叠。吸收来自激发的报告分子的能量但不辐射地释放能量的非荧光淬灭分子在本申请中称为显色分子。
示例性报告-淬灭对可以选自于包括荧光素的呫吨染料和罗丹明染料。这些化合物的许多合适形式可以广泛地购买到,它们苯配基上的取代基可以用作用于结合到寡核苷酸的位点或者可以用作用于附着到寡核苷酸的结合功能。另一组荧光化合物是在α或β位置具有氨基的萘胺。这样的萘胺化合物中所包括的是1-二甲基萘胺-5-磺酸盐、1-苯胺-8-萘磺酸盐和2-对-甲苯胺基-6-萘磺酸盐。其他染料包括3-苯基-7-香豆素异氰酸酯、吖啶(诸如9-吖啶异硫氰酸酯和吖啶橙)、N-(p-(2-苯并恶唑基)苯基)马来酰亚胺、苯并恶二唑、二苯乙烯、嵌二萘等。
在一个实施例中,报告分子和淬灭分子选自于荧光素和罗丹明染料。
有许多用于将报告分子或淬灭分子附着到寡核苷酸的3′端或5′端的连接配基和方法,如下面文献所例举:Eckstein编辑,Oligonucleotides andAnalogues:A Practical Approach(IRL出版社,Oxford,1991);Zuckerman等人,Nucleic Acids Research,15:5305-5321(1987)(寡核苷酸上的3′硫醇基);Sharma等人,Nucleic Acids Research,19:3019(1991)(3′巯基);Giusti等人,PCR Methods and Applications,2:223-227(1993);Fung等人,第4,757,141号美国专利(通过氨基连接臂TM.II(Aminolink.TM.II)的5′磷酸化氨基,从加利福尼亚,福斯特市的Applied Biosystems获得);Stabinsky,第4,739,044号美国专利(3′氨烷基磷酰基);Agrawal等人,Tetrahedron Letters,31:1543-1546(1990)(通过磷酰胺酯键而附着);Sproat等人,Nucleic AcidsResearch,15:4837(1987)(5′巯基);Nelson等人,Nucleic Acids Research,17:7187-7194(1989)(3′氨基);以及等等。
在固相合成完成时,还通过用亚磷酰胺配基衍生的染料来将罗丹明和荧光素染料方便地附着到寡核苷酸的5′羟基,例如,Woo等人的第5,231,191号美国专利和Hobbs,Jr.的第4,997,928号美国专利。
CataCleaveTM探针向固体载体的附着
在一个实施例中,寡核苷酸探针可以附着到固体载体。不同的探针可以附着到固体载体并且可以用于同时检测样品中不同的靶序列。可以在不同的探针上使用具有不同荧光波长的报告分子,因此能够杂交到不同的探针以单独地检测。
用于固定寡核苷酸探针的优选类型的固体载体的示例包括可控孔度玻璃、玻璃板、聚苯乙烯、抗生物素蛋白涂覆聚苯乙烯珠纤维素(avidin coatedpolystyrene beads cellulose)、尼龙、丙烯酰胺凝胶和激活右旋糖酐、可控孔度玻璃(CPG)、玻璃板和高度交联的聚苯乙烯。由于这些固体载体化学稳定、易于功能化且表面积好限定,所以它们优选用于杂交和诊断研究。考虑到它们与寡核苷酸合成的兼容性,特别优选的是诸如可控孔度玻璃 和非膨胀高度交联聚苯乙烯的固体载体。
寡核苷酸探针可以以各种方式附着到固体载体。例如,探针可以通过将探针的3′端或5′端核苷酸附着到固体载体而附着到固体载体。然而,探针可以通过用于使探针远离固体载体的连接物附着到固体载体。连接物最优选地是至少30个原子长,更优选地是至少50个原子长。
固定到固体载体的探针的杂交通常需要探针与固体载体分开至少30个原子,更优选至少50个原子。为了实现这种分开,连接物通常包括位于连接物和3′核苷之间的空间。对于寡核苷酸的合成,通常通过酯键将连接臂附着到3′核苷的3′-OH,可以使用碱性试剂切割酯键以从固体载体释放寡核苷酸。
可以用于将寡核苷酸探针附着到固体载体的各种连接物在本领域内是已知的。连接物可以由不显著干扰靶序列和附着到固体载体的探针的杂交的任何化合物形成。连接物可以由能够通过自动合成而容易地添加到连接物上的同聚物寡核苷酸形成。可选择地,诸如功能化聚乙二醇的聚合物可以被用作连接物。与同聚物寡核苷酸相比,优选这样的聚合物,这是由于它们不显著干扰探针与靶寡核苷酸的杂交。特别优选聚乙二醇,因为其可以购得、在有机介质和水介质中都可溶、易于功能化并且在寡核苷酸合成和合成之后的条件下完全稳定。
固体载体、连接物和探针之间的键优选地在高温下在碱性条件下除去碱基保护基团的过程中不被切割。优选的键的示例包括氨基甲酸酯键和酰胺键。探针的固定在本领域内是公知的,本领域技术人员可以确定固定条件。
根据本方法的一个实施例,将CataCleaveTM探针固定在固体载体上。CataCleaveTM探针包含可检测标签以及DNA和RNA核酸序列,其中,探针的RNA核酸序列与包含多态性的靶DNA序列的选择区域完全互补,探针的DNA核酸序列与和靶DNA序列的选择区域相邻的DNA序列基本上互补。然后,在RNA酶H的存在下以及探针中的RNA序列可以与包含多态性的PCR片段中的互补的DNA序列形成RNA:DNA异源双链体的条件下,将探针与核酸样品接触。RNA:DNA异源双链体内的RNA序列的RNA酶H切割使得来自探针上的标签的信号发射实时增加,其中,信号的增加表明靶DNA中存在多态性。
根据本方法的另一个实施例,固定在固体载体上的CataCleaveTM探针包含可检测标签以及DNA和RNA核酸序列,其中,探针的RNA核酸序列与在多态性的位置包含野生型DNA序列的靶DNA序列的选择的区域完全互补,探针的DNA核酸序列与和靶DNA序列的选择区域相邻的DNA序列基本上互补。然后,在RNA酶H的存在下以及探针中的RNA序列可以与包含多态性的PCR片段中的互补的DNA序列形成RNA:DNA异源双链体的条件下,将探针与核酸样品接触。如果靶DNA序列包含多态性,在RNA:DNA双链体中的多态性位置处的错配防止RNA酶H对在RNA:DNA异源双链体内的RNA序列的切割,这导致来自探针上的标签的信号发射实时减小,其中,信号的减小表明靶DNA中存在多态性。
探针固定到固体载体能够使与探针杂交的靶序列容易地从样品分离。在后面的步骤中,可以将分离出的靶序列与固体载体分开,并且可以基于研究者的具体需求根据本领域公知的方法处理(例如,纯化、扩增)靶序列。
RNA酶H对CataCleaveTM探针的切割
RNA酶H水解RNA-DNA杂交体中的RNA。首先在小牛胸腺中确定了RNA酶H,随后描述了各种生物体中的RNA酶H。实际上,在真核生物和细菌中普遍存在RNA酶H活性。尽管RNA酶H形成了具有不同的分子量和溶核活性的蛋白质家族,但对于各种同种型来讲,底物要求是相似的。例如,至今所研究的大部分RNA酶H用作核酸内切酶,并且需要二价阳离子(例如,Mg2+、Mn2+)以产生具有5′磷酸末端和3′羟基末端的切割产物。
在原核生物中,RNA酶H已经被克隆并被广泛地鉴定(参见,Crooke等人,(1995)Biochem J,312(Pt2),599-608;Lima等人,(1997)J Biol Chem,272,27513-27516;Lima等人,(1997)Biochemistry,36,390-398;Lima等人,(1997)J Biol Chem,272,18191-18199;Lima等人,(2007)MolPharmacol,71,83-91;Lima等人,(2007)Mol Pharmacol,71,73-82;Lima等人,(2003)J Biol Chem,278,14906-14912;Lima等人,(2003)J Biol Chem,278,49860-49867;Itaya M.,Proc.Natl.Acad.Sci.美国,1990,87,8587-8591)。例如,大肠杆菌RNA酶HII是213个氨基酸长,而RNA酶HI是155个氨基酸长。大肠杆菌RNA酶HII表现出与大肠杆菌RNA酶HI仅具有17%的同源性。从鼠伤寒沙门氏菌克隆的RNA酶H与大肠杆菌的RNA酶HI仅在11个位点不同,并且从鼠伤寒沙门氏菌克隆的RNA酶H是155个氨基酸长(ItayaM.和Kondo K.,NucleicAcids Res.,1991,19,4443-4449)。
也已经从许多病毒、其他细菌和酵母中克隆并纯化出表现出RNA酶H活性的蛋白质(Wintersberger,U.Pharmac.Ther.,1990,48,259-280)。在许多情况下,具有RNA酶H活性的蛋白质是融合蛋白,其中,RNA酶H融合到其他酶(通常为DNA聚合酶或RNA聚合酶)的氨基端或羧基端。已发现RNA酶H结构域与大肠杆菌RNA酶HI一直高度同源,但是因为其他结构域有较大改变,所以融合蛋白的分子量和其他特性变化很大。
在高等真核生物中,已基于分子量、二价阳离子的作用、对巯基试剂的敏感性和免疫学交叉反应性的不同定义了两类RNA酶H(Busen等人,Eur.J.Biochem.,1977,74,203-208)。报道了RNA酶HI酶具有范围为68-90kDa的分子量,通过Mn2+或Mg2+活化并且对巯基试剂敏感。相反,已报道RNA酶HII酶具有范围为31-45kDa的分子量,需要Mg2+以对巯基试剂高度敏感并且受Mn2+抑制(Busen W.和Hausen P.,Eur.J.Biochem.,1975,52,179-190;Kane C.M.,Biochemistry,1988,27,3187-3196;Busen,W.,J.Biol.Chem.,1982,257,7106-7108)。
也已经从人类胎盘纯化出具有RNA酶HII特性的近同质性的酶(Frank等人,Nucleic Acids Res.,1994,22,5247-5254)。该蛋白质具有大约33kDa的分子量,在6.5-10的pH范围内(优选pH为8.5-9)具有活性。该酶需要Mg2+并受Mn2+和n-乙基马来酰亚胺抑制。切割反应的产物具有3′羟基末端和5′磷酸末端。
在Ohtani N,Haruki M,Morikawa M,Kanaya S,J Biosci Bioeng,1999;88(1):12-9中报道了来自不同物种的RNA酶的详细对比。
可在实施例中使用的RNA酶H酶的示例还包括但不限于从诸如Pyrococcus furiosus、Pyrococcus horikoshi、Thermococcus litoralis(嗜热高温球菌)或Thermus thermophilus(嗜热栖热菌)的嗜热生物体分离出的热稳定RNA酶H酶。
例如,在Uemori的第7,422,888号美国专利或公开的Walder的第2009/0325169号美国专利申请中描述了在实施例中可以使用的其他RNA酶H酶,通过引用将它们的内容包含于此。
在一个实施例中,RNA酶H酶是与下面示出的Pfu RNA酶HII的氨基酸序列(SEQ ID NO:13)具有40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或99%同源性的热稳定RNA酶H。
MKIGGIDEAG RGPAIGPLVV ATVVVDEKNI EKLRNIGVKDSKQLTPHERK NLFSQITSIA 60
DDYKIVIVSP EEIDNRSGTM NELEVEKFAL ALNSLQIKPALIYADAADVD ANRFASLIER 120
RLNYKAKIIA EHKADAKYPV VSAASILAKV VRDEEIEKLKKQYGDFGSGY PSDPKTKKWL 180
EEYYKKHNSF PPIVRRTWET VRKIEESIKA KKSQLTLDKF FKKP(SEQID:13)
使用例如计算机程序DNASISMac(Takara Shuzo)、计算机算法FASTA(第3.0版;Pearson,W.R.等人,Pro.Natl.Acad.Sci.,85:2444-2448,1988)或计算机算法BLAST(第2.0版,Altschul等人,Nucleic Acids Res,25:3389-3402,1997)可以确定同源性。
在另一实施例中,RNA酶H酶是具有与SEQ ID NO:13的位点5-20、33-44、132-150和158-173对应的同源区域1-4中的至少一个或多个同源区域的热稳定RNA酶H。通过Pyrococcus furiosis、Pyrococcus horikoshi、Thermococcus kodakarensis、Archeoglobus profundus、Archeoglobus fulgidis、Thermococcus celer和Thermococcus ligoralis(嗜热高温球菌)的RNA酶HII多肽序列的序列比对确定这些同源区域。
同源区域1:GIDEAG RGPAIGPLVV(SEQ ID NO:20;对应于SEQ ID NO:13的位点5-20)
同源区域2:LRNIGVKD SKQL(SEQ ID NO:21;对应于SEQ ID NO:13的位点33-44)
同源区域3:HKADAKYPV VSAASILAKV(SEQ ID NO:22;对应于SEQID NO:13的位点132-150)
同源区域4:KLK KQYGDFGSGY PSD(SEQ ID NO:23;对应于SEQ IDNO:13的位点158-173)
在一个实施例中,RNA酶H酶是具有与SEQ ID NO:20、21、22或23的多肽序列有50%、60%、70%、80%、90%序列一致性的至少一个同源区域的热稳定RNA酶H。
在另一实施例中,RNA酶H酶是与下面示出的Thermus thermophilus的RNA酶HI的氨基酸序列(SEQ ID NO:25)具有50%、60%、70%、80%、90%、95%或99%同源性的热稳定RNA酶H。
MNP SPRKRVA LFTDGACLGN PGPGGWAALL RFHAHEKLLSGGEACTTNNR MELKAAIEGL
KALKEPCEVD LYTDSHYLKK AFTEGWLEGW RKRGWRTAEGKPVKNRDLWE ALLLAMAPHR
VRFHFVKGHT GHPENERVDR EARRQAQSQA KTPCPPRAPT LFHEEA(SEQ ID NO:25)
在另一实施例中,RNA酶H酶是具有与SEQ ID NO:25的位点23-48、62-69、117-121和141-152对应的同源区域5-8中的至少一个或更多的同源区域的热稳定RNA酶H。通过Haemophilus influenzae(流感嗜血杆菌)、Thermusthermophilis、Thermus acquaticus、Salmonella enterica(肠道沙门氏菌)和Agrobacterium tumefaciens(根癌农杆菌)的RNA酶HI多肽序列的序列比对确定这些同源区域。
同源区域5:K*V*LFTDG*C*GNPG*GG*ALLRY(SEQ ID NO:29;对应于SEQ ID NO:25的位点23-48)
同源区域6:TTNNRMEL(SEQ ID NO:30;对应于SEQ ID NO:25的位点62-69)
同源区域7:KPVKN(SEQ ID NO:31;对应于SEQ ID NO:25的位点117-121)
同源区域8:FVKGH*GH*ENE(SEQ ID NO:32;对应于SEQ ID NO:25的位点141-152)
在另一实施例中,RNA酶H酶是具有与SEQ ID NO:29、30、31或32的多肽序列有50%、60%、70%、80%、90%序列一致性的同源区域4-8中的至少一个同源区域的热稳定RNA酶H。
这里使用的术语“序列一致性”是指在比较窗口上氨基酸与氨基酸的序列相同或者功能上或结构上相似的程度。因此,例如,通过在比较窗口上比较两个最佳比对序列、确定两个序列中出现相同氨基酸的位点数以得到匹配位点数、用匹配位点数除以比较窗口中的位点总数(即,窗口尺寸)以及将该结果乘以100以得到序列一致性的百分比,可以计算出“序列一致性百分比”。
在某些实施例中,可以改进RNA酶H以产生热启动的“可诱导”RNA酶H。
这里使用的术语“改进的RNA酶H”可以是可逆地结合到或可逆地键合到导致RNA酶H的核酸内切酶活性丧失的抑制因子的RNA酶H。抑制因子从RNA酶H的释放或去结合使RNA酶H的至少一部分或全部的核酸内切酶活性恢复。完整的RNA酶H的活性的大约30%-100%可以是足够的。抑制因子可以是配体或化学修饰。配体可以是抗体、适体、受体、辅因子或螯合剂。配体可以键合到RNA酶H酶的活性位点由此抑制酶活性,或者配体可以键合到远离RNA酶的活性位点的位点。在一些实施例中,配体可诱导构象改变。化学修饰可以是交联(例如,通过甲醛)或酰化。可以通过将含有结合的RNA酶H(无活性)的混合物或样品加热到大约65℃至大约95℃或更高的温度,并且/或者将混合物或样品的pH降低到大约7.0或更低来实现抑制因子从RNA酶H的释放或去结合。
如这里所使用,热启动的“可诱导”RNA酶H活性是指这里描述的改进的RNA酶H,其具有可以通过与配体结合来调节的核酸内切酶催化活性。在允许的条件下,RNA酶H的核酸内切酶催化活性被激活,然而,在不允许的条件下,该催化活性被抑制。在一些实施例中,改进的RNA酶H的催化活性可以在有助于逆转录的温度下被抑制,即,在大约42℃被抑制,并在PCR反应中发现在更高的温度下被激活,即,在大约65℃至95℃被激活。将具有这些特性的改进的RNA酶H称作“热诱导的”。
在其他实施例中,可以通过改变含酶溶液的pH来调节改进的RNA酶H的催化活性。
如这里所使用,“热启动”酶组合物是指具有酶活性的组合物,该酶活性在不允许的温度下,即从大约25℃至大约45℃下被抑制,并在例如大约55℃至大约95℃的与PCR反应匹配的温度下被激活。在某些实施例中,“热启动”酶组合物可以具有本领域已知的“热启动”RNA酶H和/或“热启动”热稳定DNA聚合酶。
可以使用例如甲醛来执行RNA酶H酶的交联。在一个实施例中,使用甲醛对热稳定RNA酶H进行受控和受限交联。通过将包含处于无活性状态的改进的RNA酶H的扩增反应组合物加热到大约95℃或更高的温度长达例如大约15分钟的长时间,使交联逆转(reverse)并使RNA酶H活性恢复。
通常,交联的程度越低,交联逆转之后酶的核酸内切酶活性越高。可以通过改变甲醛的浓度和交联反应的持续时间来控制交联的程度。例如,可以使用大约0.2%(w/v)、大约0.4%(w/v)、大约0.6%(w/v)或大约0.8%(w/v)的甲醛来交联RNA酶H酶。使用0.6%甲醛进行交联反应大约10分钟可以足以使来自Pyrococcus furiosus的RNA酶HII失活。
交联的RNA酶HII在大约37℃未显示出任何可测量的核酸内切酶活性。在一些情况下,交联的RNA酶H的可测量的部分再激活可以发生在大约50℃的温度,该温度低于PCR变性温度。为了避免这种不期望的酶的再激活,可能需要将改进的RNA酶H储存或保持在低于50℃的温度下,直至其再激活。
通常,PCR需要在每一循环将扩增组合物加热到大约95℃以使双链靶序列变性,这也将从RNA酶H释放失活因子,部分或全部恢复酶的活性。
也可以通过使用例如二羧酸的酰化剂对酶进行赖氨酸残基的酰化来改进RNA酶H。可以通过将顺式乌头酸酐加到酰化缓冲液中的RNA酶H溶液中并将得到的混合液在大约1-20℃温育5-30小时来执行RNA酶H的酰化。在一个实施例中,可以在大约3-8℃进行酰化18-24小时。酰化缓冲液的类型不受具体限制。在实施例中,酰化缓冲液具有在大约7.5至大约9.0之间的pH。
可以通过将扩增组合物的pH降低到大约7.0或更小来恢复被酰化RNA酶H的活性。例如,当将Tris缓冲液用作缓冲剂时,可以将组合物加热到大约95℃,导致pH从大约8.7(在25℃)降低到大约6.5(在95℃)。
可以根据改进的RNA酶H、PCR中使用的缓冲液等来改变扩增反应组合物中加热步骤的持续时间。然而,通常,将扩增组合物加热到95℃长达大约30秒至4分钟足以恢复RNA酶H的活性。在一个实施例中,使用市售缓冲液以及一种或更多种非离子型去垢剂,在加热大约2分钟后恢复了Pyrococcus furiosus RNA酶HII的全部活性。
可以使用本领域公知的方法确定RNA酶H的活性。例如,根据第一种方法,在限定的测定条件下以及存在等摩尔多聚胸苷酸的条件下,根据特定摩尔数的放射性标记多聚腺苷酸的酸-增溶来定义单位活性(参见EpicentreHybridase thermostable RNase HI)。在第二种方法中,在限定的测定条件下,根据包含等摩尔量的探针和互补模板DNA的反应的相对荧光强度的特定增加来定义单位活性。
SNP的实时检测
标记的寡核苷酸探针可以用作用于靶核酸中的SNP实时检测的探针。
首先用DNA和RNA序列合成CataCleaveTM寡核苷酸探针,其中,所述DNA和RNA序列与包含单核苷酸多态性(SNP)的PCR扩增子内发现的序列互补。例如,可以用FRET对(例如,在探针一端的荧光素分子和在探针另一端的罗丹明淬灭分子)标记探针。可以将探针合成为与包含所选择SNP位置的靶核酸序列基本上互补。
在某些实施例中,探针的RNA序列可以被设计为具有与野生型序列互补的序列。
在其他实施例中,探针的RNA序列可以被设计为具有与SNP序列互补的序列。
在一个实施例中,在热稳定核酸聚合酶、RNA酶H活性、能够杂交到包含SNP的靶多核苷酸的PCR扩增引物对和标记的CataCleaveTM寡核苷酸探针的存在下,对靶多核苷酸执行实时核酸扩增。在实时PCR反应的过程中,RNA酶H对在CataCleaveTM寡核苷酸探针的RNA部分和存在于PCR扩增子中的SNP之间形成的RNA:DNA异源双链体的切割导致荧光供体与荧光淬灭剂的分离,致使探针的荧光与PCR扩增子即靶DNA中的SNP的实时检测对应地实时增加。
在某些实施例中,探针的RNA部分包含在靶DNA序列中的SNP位置处的野生型序列。因此,当探针与包含SNP的PCR扩增子杂交时,在SNP位置形成具有单核苷酸错配的RNA:DNA异源双链体,其不能被RNA酶H活性切割。
在其他实施例中,探针的RNA部分包含在靶DNA序列中的SNP位置处的互补SNP序列。因此,当探针与包含SNP的PCR扩增子杂交时,在SNP位置处形成不存在错配的RNA:DNA异源双链体,其可以被RNA酶H活性切割。
试剂盒
另外,本公开在此提供了包括封装单元的试剂盒形式,其中,封装单元具有用于靶核酸中的SNP的实时检测的一种或多种试剂。此外,试剂盒可以包含下列项中的一种或多种:缓冲液、说明书以及阳性对照或阴性对照。试剂盒可以包括以合适的比例混合在一起的试剂的容器以执行这里所描述的方法。试剂容器优选地以单位量包含试剂,使得在执行相关方法时省去测量的步骤。
试剂盒还可以包含用于实时PCR的试剂,其包括但不限于热稳定聚合酶、RNA酶H、选择的以扩增包含SNP的位置的区域的引物以及退火到实时PCR产物并允许根据这里描述的方法检测SNP的标记CataCleaveTM寡核苷酸探针。试剂盒可以包括用于检测在单个基因或基因座内的SNP或者在两个以上的基因或基因座之中的SNP的试剂。在另一实施例中,试剂盒试剂还包括用于从生物样品中提取基因组DNA或RNA的试剂。试剂盒试剂还可以包括在适用情况下用于逆转录-PCR分析的试剂。
通过引用将说明书中确定的任何专利、专利申请、公布或其他公开的材料全部包含于此。仅将通过引用包含于此的但与这里阐述的已存在的定义、论述或其他公开材料相冲突的任何材料或其部分包含至在包含的材料与本公开的材料之间不产生冲突的程度。
附图说明
本领域技术人员将理解的是,下面描述的附图仅用于说明的目的。这些图不意图以任何方式限制本教导的范围。
图1描绘了SalmonellainvA基因中的野生型目标的等温检测。对于正确配对(野生型探针:野生型目标)看到了荧光强度的增加,但是对于非正确配对(野生型探针:包含SNP的目标)未看到荧光强度的增加。
图2描绘了SalmonellainvA基因中的SNP目标(T到G的碱基改变)的等温检测。对于正确配对(SNP探针:SNP目标)看到了荧光强度的增加,但是对于非正确配对(SNP探针:野生型目标)未看到荧光强度的增加。
图3描绘了使用野生型感测探针对Salmonella invA基因中的野生型目标的多重实时检测。在纯合的野生型目标或杂合的野生型-SNP目标的存在下,看到了荧光强度的增加。在纯合的SNP目标的存在下,未观察到荧光强度的增加。
图4描绘了使用SNP感测探针对Salmonella invA基因中的SNP目标的多重实时检测。在纯合的SNP目标或杂合的SNP-野生型目标的存在下,看到了荧光强度的增加。在纯合的野生型目标的存在下,未观察到荧光强度的增加。
图5描绘了A1b酪蛋白的等温检测。对于正确配对(A1探针:A1目标)看到了荧光强度的增加,但是对于非正确配对(A1探针:A2目标)未看到荧光强度的增加。
图6描绘了A2b酪蛋白的等温检测。对于正确配对的A2探针:A2目标,观察到了荧光强度的增加,但是对于非正确配对的A2探针:A1目标,未观察到荧光强度的增加。
图7描绘了使用A1感测探针对A1b酪蛋白的多重实时检测。在纯合的A1目标或杂合的A1-A2目标的存在下,看到了荧光强度的增加。在纯合的A2目标的存在下,未观察到荧光强度的增加。
图8描绘了使用A2感测探针对A2b酪蛋白的多重实时检测。在纯合的A2目标或杂合的A1-A2目标的存在下,看到了荧光强度的增加。在纯合的A1目标的存在下,未观察到荧光强度的增加。
具体实施方式
下面的示例阐述了根据本发明的使用RNA酶H酶组合物的方法。理解的是,这些示例中描述的方法的步骤不意图成为限制。通过示例,本发明的除了上述之外的其他目标和优点将变得清楚,示例不意图限制本发明的范围。
示例1:Salmonella invA基因中的合成SNP的等温检测
在Salmonella的invA基因(SEQ ID NO:33)中构建人工单核苷酸多态性(SNP),以测试CataCleaveTM探针区分靶DNA序列中的单核苷酸序列差异的能力。单核苷酸变化在SalmonellainvA编码序列(SEQ ID NO:33)的位点116处产生T到G的颠换。设计两种相似的19个核苷酸的CataCleaveTM探针,其中,每种探针均被二重标记以产生FRET对,使得探针将贯穿包含SNP核苷酸的invA的区域碱基配对。野生型特异性探针inv-CC探针2(SEQ ID NO:1)与invA的野生型序列完全互补,SNP特异性探针inv-CC探针2-2C(SEQ IDNO:2)与invA的突变形式完全互补。设计探针使得CataCleaveTM探针的4个RNA碱基中的第二个(相对于探针的5′端)将在SNP核苷酸的位置处碱基配对。合成两种DNA寡核苷酸,inv2-目标1(SEQ ID NO:3)和inv2-目标8(SEQID NO:4),其中,inv2-目标1与野生型特异性invA探针互补,inv2-目标8与SNP特异性invA探针互补。使用RNA酶HI执行等温处理反应以评价两种探针区分单核苷酸错配的能力。反应物中的每种成分的终浓度如下:200nM探针、0.4nM靶寡核苷酸、pH8.6的10mM Tris乙酸、50mM乙酸钾、2.5mM乙酸镁、1mM DTT和2.5u杂交酶热稳定RNA酶HI(Epicentre)。将反应物在55℃下温育60分钟,每分钟收集荧光数据。图1示出了当inv-CC探针2(SEQ ID NO:1)与inv2-目标1(SEQ ID NO:3)或inv2-目标8(SEQ ID NO:4)反应时产生的荧光信号。当inv-CC探针2与inv2-目标1温育时,荧光信号线性地增加,表明RNA酶HI识别并切割与寡核苷酸完全配对的探针。当inv-CC探针2与inv2-目标8温育时,产生很少的荧光信号,表明错配的寡核苷酸对于RNA酶HI是较差的目标。
图2示出了当inv-CC探针2-2C(SEQ ID NO:2)与inv2-目标1(SEQ IDNO:3)或inv2-目标8(SEQ ID NO:4)反应时产生的荧光信号。当Inv-CC探针2-2C与完全配对的inv2-目标8温育时,荧光的增加表明实现了RNA酶HI对inv-CC探针2-2C的切割。当与野生型invA目标温育时,几乎未实现荧光,表明对错配对差的探针切割。
示例2:Salmonella invA基因中的合成SNP的实时PCR检测
合成包含267个核苷酸的invA序列的质粒DNA,所述invA序列包含野生型或突变碱基(上述的)。将40pg的野生型质粒、突变质粒或两种质粒的混合物用作多重实时PCR反应的模板,其中,多重实时PCR反应包含与野生型序列或突变序列互补的区别标记的探针。反应物中每种组分的终浓度如下:800nM的正向引物Salmonella-F1(SEQ ID NO:5)、800nM的反向引物sal-invR2(SEQ ID NO:6)、200nM野生型特异性探针inv-CC探针2(SEQ IDNO:1)、200nM SNP特异性探针inv-CC探针2-2C(SEQ ID NO:2)、80uM每种dNTP、10mM Tris乙酸(pH8.6)、50mM乙酸钾、2.5mM乙酸镁、1mM DTT、2.5u铂Taq DNA聚合酶(Life Technologies)和2.5u杂交酶热稳定RNA酶HI(Epicentre)。将PCR反应物在95℃下温育2分钟以激活热启动DNA聚合酶,随后进行40个95℃10秒和60℃20秒的循环。图3示出了在PCR期间从FAM标记的inv-CC探针2(SEQ ID NO:1)产生的荧光信号,图4示出了在PCR期间从TYE665标记的inv-CC探针2-2C(SEQ ID NO:2)产生的荧光信号。这些PCR反应的荧光曲线表明探针均能够检测完全互补的目标的扩增,不能检测到包含单个错配的目标的扩增。
示例3:牛b酪蛋白基因的A1和A2等位基因的等温检测
在奶牛的牛奶中存在b酪蛋白的两种完全天然的变异体或形式,称作A2和A1b酪蛋白。A1和A2b酪蛋白之间的区别在于位点67处的单个氨基酸。在A1变异体中,碱基为T,在A2变异体中,碱基为G。牛奶中的A1变异体b酪蛋白在所有哺乳动物b酪蛋白中的独特之处在于在该位置具有组氨酸。包含b酪蛋白的其他物种的牛奶可以被认为是A2类,这是由于在它们的b酪蛋白链中的等同位置具有脯氨酸。水牛、牦牛、山羊以及人类的母乳都包含A2-类形式的b酪蛋白。
在该示例中,设计两种相似的19个核苷酸的CataCleaveTM探针,其中,每种探针均被二重标记以产生FRET对,使得它们将贯穿牛b酪蛋白基因中的A1/A2SNP核苷酸的位置碱基配对。A1-CC探针2-RC(SEQ ID NO:7)与A1等位基因完全碱基配对,A2-CC探针1-RC(SEQ ID NO:8)与A2等位基因完全碱基配对。设计A1-CC探针2-RC使得CataCleaveTM探针的4个RNA碱基中的第二个(相对于探针的5′端)将在SNP核苷酸的位置处碱基配对。设计A2-CC探针1-RC使得CataCleaveTM探针的4个RNA碱基中的第一个(相对于探针的5′端)将在SNP核苷酸的位置处碱基配对。合成两种DNA寡核苷酸,A1-目标-RC(SEQ ID NO:9)代表A1等位基因,A2-目标-RC(SEQ IDNO:10)代表A2等位基因。使用RNA酶HI执行等温处理反应以评价两种探针区分单核苷酸差异的能力。在反应物中的每种成分的终浓度如下:200nM探针、0.4nM靶寡核苷酸、10mM Tris乙酸(pH8.6)、50mM乙酸钾、2.5mM乙酸镁、1mM DTT和2.5u杂交酶热稳定RNA酶HI(Epicentre)。将反应物在55℃下温育60分钟,每分钟收集荧光数据。图5示出了当A1-CC探针2-RC(SEQ ID NO:7)与A1-目标-RC(SEQ ID NO:9)或A2-目标-RC(SEQ IDNO:10)反应时产生的荧光信号。当A1-CC探针2-RC与A1-目标-RC温育时,荧光信号线性地增加,表明RNA酶HI识别并切割完全配对的寡核苷酸。当A1-CC探针2-RC与A2-目标-RC温育时,产生很少的荧光信号,表明错配的寡核苷酸对于RNA酶HI是较差的目标。图6示出了当A2-CC探针1-RC(SEQID NO:8)与A1-目标-RC(SEQ ID NO:9)或A2-目标-RC(SEQ ID NO:10)反应时产生的荧光信号。当A2-CC探针1-RC与A2-目标-RC温育时,实现了RNA酶HI对A2-CC探针1-RC的切割,但当与A1-目标-RC温育时,未发生切割。
示例4:牛的b酪蛋白基因的A1和A2等位基因的实时PCR检测
将三组奶公牛DNA用于使用CataCleaveTM的基于SNP检测的基因分型。之前通过测序对三组DNA进行了基因分型,并已知三组DNA代表b酪蛋白基因的三种可能的基因型,A1/A1、A2/A2和A1/A2。如以前Heyen等人所述,从牛精液中提取DNA。将200ng A1/A1基因型、A2/A2基因型或A1/A2基因型的基因组DNA用作多重实时PCR反应的模板,其中,多重实时PCR反应包含区别地标记的A1-CC探针2-RC(SEQ ID NO:7)和A2-CC探针1-RC(SEQ ID NO:8)两者。反应物中的每种组分的终浓度如下:800nM的正向引物A2D-F(SEQ ID NO:11)、800nM的反向引物A2D-R-150(SEQ ID NO:12)、200nM A1-CC探针2-RC(SEQ ID NO:7)、200nM A2-CC探针1-RC(SEQ IDNO:8)、80uM每种dNTP、10mM Tris乙酸(pH8.6)、50mM乙酸钾、2.5mM乙酸镁、1mM DTT、2.5u铂Taq DNA聚合酶(Life Technologies)和2.5u杂交酶热稳定RNA酶HI(Epicentre)。将PCR反应物在95℃下温育2分钟以激活热启动DNA聚合酶,随后进行40个95℃10秒和60℃30秒的循环。图7示出了在PCR期间从TYE563标记的A1-CC探针2-RC(SEQ ID NO:7)产生的荧光信号,图8示出了在PCR期间从TYE665标记的A2-CC探针1-RC(SEQ ID NO:8)产生的荧光信号。这些PCR反应的荧光曲线表明探针均能够检测完全互补的目标的扩增,不能检测到包含单个错配的目标的扩增。
通过引用将说明书中确定的任何专利、专利申请、公布或其他公开的材料全部包含于此。仅将通过引用包含于此的但与这里阐述的已存在的定义、论述或其他公开材料相冲突的任何材料或其部分包含至在包含的材料与本公开的材料之间不产生冲突的程度。
序列表自由文本
作为序列表提交了SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:33的核苷酸或多核苷酸的序列,序列表的内容全部包含到本申请中。
Claims (37)
1.一种用于靶DNA中的多态性的实时检测的方法,包括以下步骤:
a)提供将被检测具有多态性的靶DNA的存在的样品;
b)提供能够退火到靶DNA的扩增引物对,其中,第一扩增引物在多态性的位置的上游退火,第二扩增引物在多态性的位置的下游退火;
c)提供包括可检测的标签以及DNA和RNA核酸序列的探针,其中,探针的RNA核酸序列与包含多态性的靶DNA序列的选择区域完全互补,探针的DNA核酸序列与和靶DNA序列的选择区域相邻的DNA序列基本上互补;
d)在扩增聚合酶活性、扩增缓冲液、RNA酶H活性和探针的存在下以及探针中的RNA序列能够与包含多态性的PCR片段中的互补的DNA序列形成RNA:DNA异源双链体的条件下,扩增第一扩增引物和第二扩增引物之间的PCR片段;以及
e)检测来自探针上的标签的信号发射的实时增加,
其中,信号的增加表明靶DNA中存在多态性。
2.根据权利要求1所述的方法,其中,来自探针上的标签的信号发射的实时增加是由于RNA酶H对在RNA:DNA异源双链体中的探针的RNA序列的切割。
3.根据权利要求1所述的方法,其中,探针的RNA核酸序列包含与靶DNA中的多态性互补的序列。
4.根据权利要求1所述的方法,其中,多态性是单核苷酸多态性。
5.根据权利要求1所述的方法,其中,探针的DNA和RNA序列是共价连接的。
6.根据权利要求1所述的方法,其中,探针上的可检测标签是荧光标签。
7.根据权利要求6所述的方法,其中,荧光标签包含荧光共振能量转移对。
8.根据权利要求1所述的方法,其中,PCR片段被连接到固体载体。
9.一种用于靶DNA中的多态性的实时检测的方法,所述方法包括以下步骤:
a)提供将被检测具有多态性的靶DNA的存在的样品;
b)提供能够退火到靶DNA的扩增引物对,其中,第一扩增引物在多态性的位置的上游退火,第二扩增引物在多态性的位置的下游退火;
c)提供包括可检测的标签以及DNA和RNA核酸序列的探针,其中,探针的RNA核酸序列与在多态性的位置包含野生型DNA序列的靶DNA序列的选择区域完全互补,探针的DNA核酸序列与和靶DNA序列的选择区域相邻的DNA序列基本上互补;
d)在扩增聚合酶活性、扩增缓冲液、RNA酶H活性和探针的存在下以及探针中的RNA序列能够与包含多态性的PCR片段中的互补的DNA序列形成RNA:DNA异源双链体的条件下,扩增第一扩增引物和第二扩增引物之间的PCR片段;以及
e)检测来自探针上的标签的信号发射的实时减小,
其中,信号的减小表明靶DNA中存在多态性。
10.一种用于靶RNA中的多态性的实时检测的方法,所述方法包括以下步骤:
a)提供将被检测具有多态性的靶RNA的样品;
b)提供能够退火到靶RNA的cDNA的扩增引物对,其中,第一扩增引物在多态性的位置的上游退火,第二扩增引物在多态性的位置的下游退火;
c)提供包括可检测的标签以及DNA和RNA核酸序列的探针,其中,探针的RNA核酸序列与包含多态性的cDNA的选择区域完全互补,探针的DNA核酸序列与和cDNA的选择区域相邻的DNA序列基本上互补;
d)在逆转录酶活性、扩增聚合酶活性、逆转录PCR缓冲液、RNA酶H活性和探针的存在下以及探针中的RNA序列能够与包含多态性的逆转录PCR DNA片段中的互补的序列形成RNA:DNA异源双链体的条件下,扩增第一扩增引物和第二扩增引物之间的逆转录PCR片段;以及
e)检测来自探针上的标签的信号发射的实时增加,
其中,信号的增加表明靶RNA中存在多态性。
11.根据权利要求10所述的方法,其中,来自探针上的标签的信号发射的实时增加是由于RNA酶H对在RNA:DNA异源双链体中的探针的RNA序列的切割。
12.根据权利要求10所述的方法,其中,探针的RNA核酸序列包含与在靶RNA中的多态性的位置处的cDNA互补的RNA序列。
13.根据权利要求10所述的方法,其中,多态性是单核苷酸多态性。
14.根据权利要求10所述的方法,其中,靶RNA是转录的mRNA。
15.根据权利要求10所述的方法,其中,探针的DNA序列和RNA序列是共价连接的。
16.根据权利要求10所述的方法,其中,探针上的可检测标签是荧光标签。
17.根据权利要求16所述的方法,其中,荧光标签包含荧光共振能量转移对。
18.根据权利要求10所述的方法,其中,探针或PCR片段连接到固体载体。
19.根据权利要求10所述的方法,其中,RNA酶H活性是热启动热稳定的RNA酶H的活性。
20.一种用于靶RNA中的多态性的实时检测的方法,所述方法包括以下步骤:
a)提供将被检测具有多态性的靶RNA的样品;
b)提供能够退火到靶RNA的cDNA的扩增引物对,其中,第一扩增引物在多态性的位置的上游退火,第二扩增引物在多态性的位置的下游退火;
c)提供包括可检测的标签以及DNA和RNA核酸序列的探针,其中,探针的RNA核酸序列与在多态性的位置包含野生型DNA序列的cDNA的选择区域完全互补,探针的DNA核酸序列与和cDNA的选择区域相邻的DNA序列基本上互补;
d)在逆转录酶活性、扩增聚合酶活性、逆转录PCR缓冲液、RNA酶H活性和探针的存在下以及探针中的RNA序列能够与包含多态性的逆转录PCR DNA片段中的互补的序列形成RNA:DNA异源双链体的条件下,扩增第一扩增引物和第二扩增引物之间的逆转录PCR片段;以及
e)检测来自探针上的标签的信号发射的实时减小,
其中,信号的减小表明靶RNA中存在多态性。
21.一种用于靶DNA中的多态性的实时检测的试剂盒,所述试剂盒包含:
a)能够退火到靶DNA的扩增引物对,其中,第一扩增引物在多态性的位置的上游退火,第二扩增引物在多态性的位置的下游退火;
b)探针,包含可检测的标签以及DNA和RNA核酸序列,其中,探针的RNA核酸序列与包含多态性的靶DNA序列的选择区域完全互补,探针的DNA核酸序列与和靶DNA序列的选择区域相邻的DNA序列基本上互补;
c)扩增聚合酶活性、扩增缓冲液和RNA酶H活性。
22.根据权利要求21所述的试剂盒,其中,探针的RNA核酸序列包含与在靶DNA中的多态性互补的序列。
23.根据权利要求21所述的试剂盒,其中,多态性是单核苷酸多态性。
24.根据权利要求21所述的试剂盒,其中,探针的DNA序列和RNA序列是共价连接的。
25.根据权利要求21所述的试剂盒,其中,探针上的可检测标签是荧光标签。
26.根据权利要求25所述的试剂盒,其中,荧光标签包含荧光共振能量转移对。
27.根据权利要求21所述的试剂盒,其中,探针或PCR片段连接到固体载体。
28.一种用于靶DNA中的多态性的实时检测的试剂盒,所述试剂盒包含:
a)能够退火到靶DNA的扩增引物对,其中,第一扩增引物在多态性的位置的上游退火,第二扩增引物在多态性的位置的下游退火;
b)探针,包含可检测的标签以及DNA和RNA核酸序列,其中,探针的RNA核酸序列与在多态性的位置处包含野生型DNA序列的靶DNA序列的选择区域完全互补,探针的DNA核酸序列与和靶DNA序列的选择区域相邻的DNA序列基本上互补;
c)扩增聚合酶活性、扩增缓冲液和RNA酶H活性。
29.一种用于靶RNA中的多态性的实时检测的试剂盒,所述试剂盒包含:
a)能够退火到靶RNA的cDNA的扩增引物对,其中,第一扩增引物在多态性序列的位置的上游退火,第二扩增引物在多态性序列的位置的下游退火;
b)探针,包含可检测的标签以及DNA和RNA核酸序列,其中,探针的RNA核酸序列与包含多态性的cDNA的选择区域完全互补,探针的DNA核酸序列与和cDNA的选择区域相邻的DNA序列基本上互补;以及
c)反转录酶活性、扩增聚合酶活性、反转录PCR缓冲液和RNA酶H活性。
30.根据权利要求29所述的试剂盒,其中,探针的RNA核酸序列包含与在靶RNA中的多态性的位置处的cDNA互补的序列。
31.根据权利要求29所述的试剂盒,其中,多态性是单核苷酸多态性。
32.根据权利要求29所述的试剂盒,其中,探针的DNA序列和RNA序列是共价连接的。
33.根据权利要求28所述的试剂盒,其中,探针上的可检测标签是荧光标签。
34.根据权利要求33所述的试剂盒,其中,荧光标签包含荧光共振能量转移对。
35.根据权利要求29所述的试剂盒,其中,探针或逆转录PCR片段连接到固体载体。
36.根据权利要求29所述的试剂盒,其中,在相同的分子上发现逆转录酶活性和扩增聚合酶活性。
37.一种用于靶RNA中的多态性的实时检测的试剂盒,所述试剂盒包括:
a)能够退火到靶RNA的cDNA的扩增引物对,其中,第一扩增引物在多态性序列的位置的上游退火,第二扩增引物在多态性序列的位置的下游退火;
b)探针,包含可检测的标签以及DNA和RNA核酸序列,其中,探针的RNA核酸序列与在多态性的位置包含野生型DNA序列的cDNA的选择区域完全互补,探针的DNA核酸序列与和cDNA的选择区域相邻的DNA序列基本上互补;以及
c)反转录酶活性、扩增聚合酶活性、反转录PCR缓冲液和RNA酶H活性。
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