CN104911265A

CN104911265A - 同时检测番茄抗病基因Ty-3a和Tm-2a的双重PCR方法

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Publication number: CN104911265A
Application number: CN201510300231.9A
Authority: CN
Inventors: 张子君; 邹庆道; 马小青; 王晓峰; 李海涛; 张逸鸣; 朱华
Original assignee: INSTITUTE OF VEGETABLE LIAONING ACADEMY OF AGRICULTURAL SCIENCES
Current assignee: INSTITUTE OF VEGETABLE LIAONING ACADEMY OF AGRICULTURAL SCIENCES
Priority date: 2015-06-03
Filing date: 2015-06-03
Publication date: 2015-09-16

Abstract

一种同时检测番茄抗病基因Ty-3a和Tm-2^a的双重PCR方法，包括如下步骤：1.根据Ty-3a和Tm-2^a两个抗病基因分子标记的引物序列设计引物；2.CTAB法提取基因组DNA；3.将两对引物放入同一PCR反应体系中，进行PCR扩增；4.将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，再用Bio-RAD凝胶系统成像。5.对扩增结果进行分析，明确材料是否含有Ty-3a、Tm-2^a抗病基因。本发明双重PCR技术有以下优点：1.在一个PCR反应体系中同时检测两个抗病基因，所用时间只是分别检测两个抗病基因的一半，提高的基因检测效率。2.能够节约抗病基因检测所需要的药品，降低了试验成本。

Description

同时检测番茄抗病基因Ty-3a和Tm-2a的双重PCR方法

技术领域

本发明属于分子标记辅助育种技术领域，特别是涉及一种同时检测番茄抗病基因Ty-3a和Tm-2^a的双重PCR方法。

背景技术

番茄(Lycopersicon esculentum)是一种世界性蔬菜，营养丰富，适应性广、产量高，深受消费者的喜爱。番茄黄化曲叶病毒病(TYLCVD)和番茄烟草花叶病毒病(ToMVD)是番茄生产上的重要病害，分布广，危害重。选育抗番茄黄化曲叶病毒病和烟草花叶病毒病等病害的多抗性品种，是国内外番茄研究的重要内容。

随着分子生物学技术的发展，利用分子标记辅助选择技术(MAS)选择抗病材料已越来越多的应用于番茄育种中。分子标记辅助选择与传统人工接种鉴定相比，具有效率高、速度快、结果准确等优点，因此建立抗病基因的高效分子标记选择体系，现代育种技术的一项重要内容。

Ty-3a是番茄黄化曲叶病毒病的主效抗病基因，Tm-2^a是烟草花叶病毒病的主效抗病基因，目前，这两个抗病基因已分别建立自己的分子标记辅助选择体系，但尚未建立两个抗病基因同时检测的分子标记辅助检测体系。建立双重PCR检测体系，可以节省人力、物力、节约时间，提高材料的鉴定和选择效率。

发明内容

针对上述存在的技术问题，本发明提供一种同时检测番茄抗病基因Ty-3a和Tm-2^a的双重PCR方法。该方法通过引物设计、基因组DNA的提取、双重PCR反应体系的建立、反应产物的凝胶成像检测等步骤，实现利用同一个分子标记选择体系同时检测Ty-3a和Tm-2^a两个抗病基因的方法，为番茄抗病材料的选择和抗病育种奠定基础。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

本发明一种同时检测番茄抗病基因Ty-3a和Tm-2^a的双重PCR方法，该方法通过引物设计、基因组DNA的提取、双重PCR反应体系的建立、反应产物的凝胶成像检测步骤，确定番茄育种试材对这两个抗病基因的抗性情况，以选择抗病材料和选育抗病品种，具体两个抗病基因的双重PCR鉴定方法包括下列步骤：

(1)根据Ty-3a和Tm-2^a两个抗病基因分子标记的引物序列设计引物，引物序列如下表：

(2)利用CTAB法提取基因组DNA；

(3)将两对引物放入同一PCR反应体系中，进行PCR扩增；

(4)将PCR产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，再用Bio-RAD凝胶系统成像；

(5)对扩增片段进行分析：扩增出650bp片段为含有抗病基因Ty-3a的抗病纯合材料，扩增出650bp和320bp片段为含有抗病基因Ty-3a的抗病杂合材料，扩增出320bp片段为不含抗病基因Ty-3a的纯合感病材料，扩增出472bp片段为含有抗病基因Tm-2^a的抗病材料。

进一步地，所述双重PCR反应总体系为25μL溶液体系，其组分和含量为：模板DNA 2μL，两对引物各1.5μL,10×Buffer 2.5μL，Mgcl₂ 1.5μL，dNTP 0.4μL，Taq酶0.4μL，补充超纯水至25μL；

本发明所述PCR反应体系按照如下程序进行双重PCR反应：94℃预变性5min；然后94℃变性30s，58.5℃复性30s，72℃延伸1.30min，进行30个循环；最后72℃延伸10min。

本发明的有益效果为：

1.本发明在一个PCR反应体系中同时检测两个抗病基因，所用时间只是分别检测两个抗病基因的一半，提高基因的检测效率。

2.本发明能够节约抗病基因检测所需要的药品，降低了试验成本。

附图说明

图1为本发明实施例T y-3a基因引物扩增产物。

图2为本发明实施例Tm-2^a基因引物扩增产物。

图3为本发明实施例Ty-3和Tm-2^a基因的双基因扩增产物。

图4为本发明实施例利用Ty-3a和Tm-2^a基因的引物对19份番茄的双重PCR结果。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明做进一步的详细说明。

实施例：本发明为一种同时检测番茄抗病基因Ty-3a和Tm-2^a的双重PCR方法，该方法通过引物设计、基因组DNA的提取、双重PCR反应体系的建立、反应产物的凝胶成像检测步骤，实现利用同一个分子标记体系同时检测Ty-3a和Tm-2^a两个抗病基因的方法，确定番茄育种试材对这两个抗病基因的抗性情况，以选择抗病材料和选育抗病品种，具体两个抗病基因的双重PCR鉴定方法包括下列步骤：

(2)利用CTAB法提取基因组DNA；

(3)将两对引物放入同一PCR(聚合酶链式反应)反应体系中，进行PCR扩增；

所述双重PCR反应总体系为25μL溶液体系，其组分和含量为：番茄模板DNA 2μL，两对引物各1.5μL,10×Buffer(缓冲液，外购，主要成分是KCL和Tris-HCL)2.5μL，Mgcl₂ 1.5μL，dNTP(脱氧核糖核苷三磷酸)0.4μL，Taq酶(DNA聚合酶)0.4μL，补充超纯水至25μL；

所述PCR反应体系按照如下程序进行双重PCR反应：94℃预变性5min；然后94℃变性30s，58.5℃复性30s，72℃延伸1.30min，进行30个循环；最后72℃延伸10min。

(4)将PCR产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳(Goldview染色)，再用Bio-RAD凝胶系统成像；

以下具体说明本发明的检测过程：

1.番茄材料：本例所用的番茄材料共29份，均为辽宁省农科院蔬菜所提供。其中10份材料用于Ty-3a和Tm-2^a两个抗病基因的单基因PCR检测和双重PCR检测，编号为1-10；另19份材料为未知抗病性的番茄材料，用双重PCR检测方法检测其抗病性。

2.引物设计

鉴定Ty-3a和Tm-2^a抗性基因所使用的引物序列如下表,引物由上海生物工程技术公司合成。

3.番茄基因组DNA的提取

采用改良CTAB法提取基因组DNA，具体步骤如下：

(1)取番茄顶端幼嫩叶片0.5g于2mL离心管中，液氮冰冻，研磨至粉状；

(2)立即加入65℃预热的CTAB裂解液800μL，混匀，65℃水浴1h；

(3)水浴结束后，向离心管中加入等体积的氯仿/异戊醇(24:1)，混匀，10000rpm离心15min；

(4)吸取上清液于另一2mL离心管，向其内加入等体积的氯仿/异戊醇(24:1)，混匀，10000rpm离心10min；

(5)吸取上清于2mL离心管，向其内加入420μL异丙醇，60μL醋酸钠，上下颠倒混匀。置于-20℃ 60min；

(6)取静置结束的离心管离心，10000rpm离心10min，温度为4度最好。

(7)弃上清，加200μL 70％的无水乙醇，离心5min；

(8)弃上清，加200μL 70％无水乙醇，离心5min

(9)弃上清，转移至超净工作台风干；

(10)加入无菌水200μL溶解；-20℃冰箱备用。

4.选用10份材料Ty-3a抗病基因的检测：

反应体系及反应程序：PCR反应总体系为25μL，包括：模板DNA 2μL，引物1.5μL,10×Buffer 2.5μL，Mgcl₂ 1.5μL，dNTP 0.5μL，Taq酶0.5μL，补充超纯水至25μL；PCR反应程序为94℃预变性5min；然后94℃变性30s，58.5℃复性30s，72℃延伸45s，进行35个循环；最后72℃延伸10min。PCR扩增产物在1.5％琼脂糖凝胶上电泳(Goldview染色)，然后用Bio-RAD凝胶成像仪成像。

检测结果：编号为1、9、10的番茄材料扩增出650bp特异片段,为抗病纯合材料；编号为2、3、4号的番茄材料扩增出320bp特异片段，为感病纯合材料；编号为5、6、7、8号的番茄材料扩增出650bp和320bp特异片段，为抗病杂合材料。说明该体系能够检测抗病纯合、抗病杂合和感病纯合材料(如图1所示)。

5.选取10份材料Tm-2^a抗病基因的检测

反应体系及反应程序：反应体系为20μL，包括超纯水15.9μL，10×PCR Buffer 2.0μL，dNTPs 0.5μL，引物1.0μL，Taq DNA聚合酶0.1μL，模板DNA 0.5μL。PCR热循环程序：94℃预变性5min；然后94℃变性1min，58℃复性1min，72℃延伸80s，进行32个循环；最后72℃延伸8min。PCR产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳，然后用Bio-RAD凝胶成像仪成像。

检测结果：材料1、3、4、7、8、9扩增出472bp的片段，表明这6份材料含有Tm-2a抗病基因，2、5、6、10没有扩增出472bp的片段，表明这4份材料不含有Tm-2a抗病基因(如图2所示)

6.利用双重PCR方法同时检测10份材料Ty-3a和Tm-2^a抗病基因

反应体系及反应程序：双重PCR反应总体系为25μL，包括：模板DNA 2μL，两对引物各1.5μL,10×Buffer 2.5μL，Mgcl₂ 1.5μL，dNTP0.4μL，Taq酶0.4μL，补充超纯水25μL。94℃预变性5min；然后94℃变性30s，58.5℃复性30s，72℃延伸1.30min，进行30个循环；最后72℃延伸10min。

PCR扩增产物在1.5％琼脂糖凝胶上电泳，然后用Bio-RAD凝胶成像仪成像。

检测结果：双重PCR对10份材料的鉴定结果，与基因PCR鉴定结果完全一致，说明本双重PCR鉴定方法是可靠的，具体结果如下：编号为1、9的番茄材料扩增出了650bp、472bp的特异片段，同时含有Ty-3a和Tm-2^a基因，为抗黄化曲叶病毒病和抗烟草花叶病毒病的材料；编号为2的番茄材料只扩增出了320bp的特异片段，不含Ty-3a和Tm-2^a基因，为感病纯合材料，不含有两个抗病基因；编号为3、4的番茄材料扩增出了472bp、320bp的特异片段，含有Tm-2^a基因，但不含Ty-3a基因，为抗烟草花叶病、感黄化曲叶病的纯合番茄材料；编号为5、6的番茄材料扩增出了650bp、320bp的特异片段，说明含有Ty-3a抗病基因，不含Tm-2^a抗病基因，为抗黄化曲叶病、感烟草花叶病的番茄材料；编号为7、8的番茄材料扩增出了650bp、472bp、320bp三条特异片段，说明材料含有Ty-3a和Tm-2^a基因，为抗黄化曲叶病和烟草花叶病的番茄材料；编号为10的番茄材料只扩增出了650bp的特异片段，含有Ty-3a不含Tm-2^a基因，为纯合的抗黄化曲叶病、感烟草花叶病的番茄材料，如图3所示。上述结果表明：利用双重PCR技术检测结果与单基因PCR检测结果是一致的，均扩增出各个引物的目标条带，因此可以利用该双重PCR反应体系同时鉴定Ty-3a、Tm-2^a基因。

7.利用双重PCR方法检测19份未知抗病性的番茄材料

利用双重PCR方法对19份番茄材料进行抗性鉴定，结果如图4所示。编号为11、16、17、20、22、23的材料只扩增出320bp的片段。为不含两个抗病基因的感病材料；编号为12、13、18、21、24、25、28的材料扩增出472bp、320bp的片段，说明这些材料含Tm-2^a基因但不含Ty-3a基因；编号为14、15、26、27的材料只扩增650bp的片段，说明材料含有Ty-3a纯合抗病基因而不含Tm-2^a基因；编号为19、29的材料同时检测出650bp、472bp、320bp三个片段，说明这两份材料对两种病害都有抗病性。本试验说明该方法可用于两个抗病基因的检测。

Claims

1.一种同时检测番茄抗病基因Ty-3a和Tm-2^a的双重PCR方法，其特征在于：该方法通过引物设计、基因组DNA的提取、双重PCR反应体系的建立、反应产物的凝胶成像检测步骤，确定番茄育种试材对这两个抗病基因的抗性情况，以选择抗病材料和选育抗病品种，具体两个抗病基因的双重PCR鉴定方法包括下列步骤：

(2)利用CTAB法提取基因组DNA；

(3)将两对引物放入同一PCR反应体系中，进行PCR扩增；

2.根据权利要求1所述同时检测番茄抗病基因Ty-3a和Tm-2^a的双重PCR方法，其特征在于：所述双重PCR反应总体系为25μL溶液体系，其组分和含量为：模板DNA2μL，两对引物各1.5μL,10×Buffer 2.5μL，Mgcl₂1.5μL，dNTP0.4μL，Taq酶(DNA聚合酶)0.4μL，补充超纯水至25μL。

3.根据权利要求1所述同时检测番茄抗病基因Ty-3a和Tm-2^a的双重PCR方法，其特征在于：所述PCR反应体系按照如下程序进行双重PCR反应：94℃预变性5min；然后94℃变性30s，58.5℃复性30s，72℃延伸1.30min，进行30个循环；最后72℃延伸10min。