KR20130138700A - 절단가능한 올리고뉴클레오티드 저해제에 의한 ｄｎａ 폴리머라제의 제어된 저해 및 재활성화 - Google Patents

절단가능한 올리고뉴클레오티드 저해제에 의한 ｄｎａ 폴리머라제의 제어된 저해 및 재활성화 Download PDF

Info

Publication number
KR20130138700A
KR20130138700A KR1020130066791A KR20130066791A KR20130138700A KR 20130138700 A KR20130138700 A KR 20130138700A KR 1020130066791 A KR1020130066791 A KR 1020130066791A KR 20130066791 A KR20130066791 A KR 20130066791A KR 20130138700 A KR20130138700 A KR 20130138700A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
nucleic acid
sequence
rna
dna
probe
Prior art date
Application number
KR1020130066791A
Other languages
English (en)
Inventor
윈덴 쳉
제이슨 에이. 옵다이크
Original Assignee
삼성테크윈 주식회사
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 삼성테크윈 주식회사 filed Critical 삼성테크윈 주식회사
Publication of KR20130138700A publication Critical patent/KR20130138700A/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6848—Nucleic acid amplification reactions characterised by the means for preventing contamination or increasing the specificity or sensitivity of an amplification reaction
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/48—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving transferase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2521/00—Reaction characterised by the enzymatic activity
    • C12Q2521/30—Phosphoric diester hydrolysing, i.e. nuclease
    • C12Q2521/327—RNAse, e.g. RNAseH
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2549/00—Reactions characterised by the features used to influence the efficiency or specificity
    • C12Q2549/10—Reactions characterised by the features used to influence the efficiency or specificity the purpose being that of reducing false positive or false negative signals
    • C12Q2549/101—Hot start

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

핫 스타트 뉴클레아제, 핵산 폴리머라제, 및 올리고뉴클레오티드의 융해 온도보다 낮은 온도에서 핵산 폴리머라제의 촉매 활성을 저해하는 실질적으로 이중-가닥 올리고뉴클레오티드를 포함하는 핫 스타트 효소 조성물이 기재된다.

Description

절단가능한 올리고뉴클레오티드 저해제에 의한 ＤＮＡ 폴리머라제의 제어된 저해 및 재활성화{Controlled inhibition and re-activation of DNA polymerases by cleavable oligonucleotide inhibitors}
표적 핵산 서열의 향상된 실시간 PCR 검출을 위한 핫 스타트(hot start) PCR 조성물을 개시한다.
핵산을 검출하고 정량하는 많은 분석 방법들 중에, PCR은 가장 흔히 사용되는 방법 중 하나로, 그 원리는 미국 특허 제4,683,195호 및 제4,683,202호에 개시되어 있다. PCR 방법론의 명확한 장점에도 불구하고, 적은 카피의 DNA 주형을 몇 자릿수로 증폭하는 능력은 또한 PCR 증폭 반응의 성공이 제1 PCR 사이클 동안에 이미 큰 부분으로 결정된다는 것을 의미하고, 비-특이적 프라이밍은 프라이머 이량체와 같은, 허위 PCR 산물의 증폭을 야기할 수 있다. 일단 반응에 존재하면, 이 비-특이적 PCR 산물은 표적이 된 DNA 서열과 함께 증폭되어 PCR 증폭 반응의 특이성 및 전체 효율을 나쁘게 만든다.
비-특이적 프라이밍을 억제하려는 노력으로, 소위 '핫 스타트' PCR 프로토콜이 폴리머라제 활성이 제1 PCR 사이클 동안에 주형 및 PCR 프라이머의 초기 변성 이전에 억제되는 것으로 고안되었다. 그러므로 이 접근법은 프라이머 이량체 또는 다른 비-특이적 PCR 산물의 형성을 초래할 수 있는 낮은 온도에서 허위 프라이머 연장을 최소화하려고 시도한다. 그러나 낮은 온도에서 폴리머라제 활성을 억제하는 것은 PCR 프라이머 자체가 낮은 온도에서 표적이 된 DNA 서열에 특이적으로 어닐링하는 경우에 문제가 있다.
전술한 이유로, 향상된 핫-스타트 PCR 프로토콜에 대한 당업계의 충족되지 않은 요구가 있다.
핫 스타트 효소 조성물은 핫 스타트 뉴클레아제 및 올리고뉴클레오티드의 융해 온도보다 낮은 온도에서 핵산 폴리머라제의 촉매 활성을 저해하는 실질적으로 이중-가닥 올리고뉴클레오티드를 포함하는 것이 기재된다. 제1 PCR 증폭 사이클의 변성/어닐링 단계의 개시로, 핫 스타트 뉴클레아제의 활성화는 이중-가닥 올리고뉴클레오티드를, 결국, 제1 PCR 증폭 사이클의 신장 단계에서 핵산 폴리머라제의 활성을 야기하는 핵산내부가수분해적 절단에 의해 불활성화시킨다. 실시간 PCR 적용에서, 활성화된 핫 스타트 RNAse H 활성은 또한 PCR 증폭의 제1 사이클 동안 증폭 핵산 폴리머라제의 핫 스타트 활성화 및 증폭된 표적 핵산 서열에 어닐링하는 카타클리브(CATACLEAVE)™ 프로브의 그 다음의 절단 및 형광 검출 모두에 참여하는 것이 개시된다. 그러므로 이 핫 스타트 방법은 고효율 실시간 PCR 적용에 특히 적당하다.
일 구체예에서, 본 발명은 핵산 폴리머라제 활성,
올리고뉴클레오티드의 융해 온도보다 낮은 온도에서 핵산 폴리머라제 활성을 저해하는 실질적으로 이중-가닥 올리고뉴클레오티드, 및
핫 스타트 뉴클레아제 활성을 포함하는 핫 스타트 효소 조성물로서, 핫 스타트 뉴클레아제 활성의 활성화는 핵산 폴리머라제 활성의 저해를 비가역적으로 제거하는 것이다.
특정 구체예에서, 실질적으로 이중-가닥 올리고뉴클레오티드는 활성화된 핫 스타트 뉴클레아제 활성에 의해 절단될 수 있는 1개 이상의 RNA:DNA 염기쌍을 포함한다.
핵산 폴리머라제 활성은 DNA 폴리머라제, RNA 폴리머라제 또는 역전사 효소 또는 호열성 핵산 폴리머라제 활성일 수 있다.
핫 스타트 뉴클레아제 활성은 핫 스타트 열안정성 RNase H의 활성일 수 있다.
실질적으로 이중-가닥 올리고뉴클레오티드의 3'-말단 및/또는 5'-말단은 화학적으로 변형될 수 있다. 올리고뉴클레오티드의 변성은 2개 이상의 단일 가닥 올리고뉴클레오티드를 생성할 수 있다. 다른 사례에서, 실질적으로 이중-가닥 올리고뉴클레오티드는 헤어핀 루프 구조를 갖는다.
일 구체예에서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 핫 스타트 핵산 폴리머라제 활성을 활성화시키는 방법을 개시한다:
핵산 폴리머라제,
1개 이상의 RNA:DNA 염기쌍을 포함하는 실질적으로 이중-가닥 올리고뉴클레오티드로서, 올리고뉴클레오티드는 올리고뉴클레오티드의 융해 온도보다 낮은 온도에서 핵산 폴리머라제 활성을 저해하는 것이고, 및
핫 스타트 RNAse H 활성을 제공하는 단계, 및
핫 스타트 조성물을 활성화시키는 단계로서,
활성화된 핫 스타트 RNAse H 활성은 1개 이상의 RNA:DNA 염기쌍에서 올리고뉴클레오티드를 절단하여 핵산 폴리머라제를 저해하는 올리고뉴클레오티드의 능력을 비가역적으로 제거하기 위한 것인 방법.
다른 구체예에서, 핵산 폴리머라제 활성,
올리고뉴클레오티드의 융해 온도보다 낮은 온도에서 핵산 폴리머라제 활성을 저해하는 실질적으로 이중-가닥 올리고뉴클레오티드, 및
핫 스타트 뉴클레아제 활성을 포함하는 핫 스타트 효소 조성물로서,
핫 스타트 뉴클레아제 활성의 활성화는 올리고뉴클레오티드에 의해 핵산 폴리머라제 활성의 저해를 비가역적으로 제거하는 것인 핫 스타트 효소 조성물을 갖는 키트가 개시된다.
다른 구체예에서, 하기 단계를 포함하는 표적 핵산을 증폭하는 방법이 기재된다:
표적 핵산 서열의 존재가 시험될 시료를 제공하는 단계,
정방향 및 역방향 증폭 프라이머쌍을 제공하는 단계로서, 정방향 증폭 프라이머는 표적 핵산 서열의 5' 말단에 어닐링하고 역방향 증폭 프라이머는 표적 핵산 서열의 3' 말단에 어닐링하는 단계,
핵산 폴리머라제 활성,
올리고뉴클레오티드의 융해 온도보다 낮은 온도에서 핵산 폴리머라제 활성을 저해하는 실질적으로 이중-가닥 올리고뉴클레오티드, 및
핫 스타트 뉴클레아제 활성을 포함하는 핫 스타트 효소 조성물을 제공하는 단계,
표적 DNA 서열, 증폭 버퍼 및 핫 스타트 효소 조성물의 존재에서 1 이상의 증폭 사이클 동안 정방향 및 역방향 증폭 프라이머 간의 PCR 단편을 증폭하는 단계로서, 핫 스타트 뉴클레아제 활성의 활성화는 제1 증폭 사이클 동안 올리고뉴클레오티드에 의한 핵산 폴리머라제 활성의 저해를 비가역적으로 제거하는 것인 방법.
다른 구체예에서, 하기 단계를 포함하는 시료 중 표적 DNA 서열의 실시간 검출 방법이 기재된다:
표적 핵산 서열의 존재가 시험될 시료를 제공하는 단계,
정방향 및 역방향 증폭 프라이머쌍을 제공하는 단계로서, 정방향 증폭 프라이머는 표적 핵산 서열의 5' 말단에 어닐링하고 역방향 증폭 프라이머는 표적 핵산 서열의 3' 말단에 어닐링하는 단계,
검출가능한 표지 및 DNA 및 RNA 핵산 서열을 포함하는 프로브를 제공하는 단계로서, 프로브의 RNA 핵산 서열은 표적 DNA의 선택된 영역에 실질적으로 상보적이고 프로브의 DNA 핵산 서열은 표적 DNA의 선택된 영역에 인접한 서열에 실질적으로 상보적인 것인 단계,
하기 핫 스타트 효소 조성물을 제공하는 단계;
핵산 폴리머라제 활성,
올리고뉴클레오티드의 융해 온도보다 낮은 온도에서 핵산 폴리머라제 활성을 저해하는 실질적으로 이중-가닥 올리고뉴클레오티드, 및
핫 스타트 뉴클레아제 활성을 포함하고, 올리고뉴클레오티드에 의한 핵산 폴리머라제 활성의 저해는 핫 스타트 뉴클레아제 활성의 활성화에 의해 비가역적으로 제거된 것인 조성물,
표적 DNA 서열, 증폭 버퍼, 핫 스타트 효소 조성물 및 프로브의 존재에서 1 이상의 증폭 사이클 동안 실질적으로 이중-가닥 올리고뉴클레오티드가 제1 증폭 사이클 동안 비가역적으로 불활성화되고 프로브 내 RNA 서열이 PCR 단편 중 상보적인 서열과 RNA:DNA 헤테로듀플렉스를 형성할 수 있는 조건 하에서 정방향 및 역방향 증폭 프라이머 간의 PCR 단편을 증폭하는 단계; 및
프로브의 표지로부터 신호 방출의 실시간 증가를 검출하는 단계로서, 신호의 증가는 시료 중 표적 DNA 서열의 존재를 나타내는 것인 방법.
일 측면에서, 프로브의 표지로부터 신호의 방출의 실시간 증가는 RNA:DNA 헤테로듀플렉스 중 프로브의 RNA 서열의 RNAse H 절단으로부터 기인한다.
다른 측면에서, 프로브의 DNA 및 RNA 서열은 공유결합될 수 있다. 프로브의 검출가능한 표지는 FRET 쌍과 같은 형광 표지일 수 있다. PCR 단편 또는 프로브는 고체 지지체에 결합될 수 있다.
다른 구체예에서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 시료 중 RNA 표적 서열의 실시간 검출 방법을 기재한다:
표적 RNA 서열의 존재가 시험될 시료를 제공하는 단계;
정방향 및 역방향 증폭 프라이머 쌍을 제공하는 단계로서, 정방향 증폭 프라이머는 표적 핵산 서열의 5' 말단에 어닐링하고 역방향 증폭 프라이머는 표적 핵산 서열의 3' 말단에 어닐링하는 단계;
검출가능한 표지 및 DNA 및 RNA 핵산 서열을 포함하는 프로브를 제공하는 단계로서, 프로브의 RNA 핵산 서열은 표적 cDNA 서열의 선택된 영역에 실질적으로 상보적이고 프로브의 DNA 핵산 서열은 표적 cDNA 서열의 선택된 영역에 인접한 표적 DNA 서열에 실질적으로 상보적인 것인 단계;
핵산 폴리머라제 활성,
올리고뉴클레오티드의 융해 온도보다 낮은 온도에서 핵산 폴리머라제 활성을 저해하는 실질적으로 이중-가닥 올리고뉴클레오티드, 및
핫 스타트 뉴클레아제 활성을 포함하는 조성물로서, 올리고뉴클레오티드에 의한 핵산 폴리머라제 활성의 저해는 핫 스타트 뉴클레아제 활성의 활성화에 의해 비가역적으로 제거된 것인 핫 스타트 효소 조성물을 제공하는 단계;
역전사 효소 활성 및 역방향 증폭 프라이머의 존재에서 표적 RNA를 역전사하여 표적 cDNA 서열을 생성하는 단계;
표적 cDNA 서열, 핫 스타트 효소 조성물, 증폭 버퍼 및 프로브의 존재에서 1 이상의 증폭 사이클 동안 실질적으로 이중-가닥 올리고뉴클레오티드가 제1 증폭 사이클 동안 비가역적으로 불활성화되고 프로브 내 RNA 서열이 PCR 단편 중 상보적인 서열과 RNA:DNA 헤테로듀플렉스를 형성할 수 있는 조건 하에서 정방향 및 역방향 증폭 프라이머 간의 PCR 단편을 증폭하는 단계; 및
프로브의 표지로부터 신호 방출의 실시간 증가를 검출하는 단계로서, 신호의 증가는 시료 중 표적 RNA 서열의 존재를 나타내는 것인 방법.
일 측면에서, 프로브의 표지로부터 신호 방출의 실시간 증가는 RNA:DNA 헤테로듀플렉스 중 프로브의 RNA 서열의 RNAse H 절단으로부터 기인할 수 있다.
일 구체예에서, 하기 효소 조성물이 개시된다: 핵산 폴리머라제 활성, 및 실질적으로 이중-가닥 올리고뉴클레오티드를 포함하는 효소 조성물로서, 상기 올리고뉴클레오티드는 올리고뉴클레오티의 융해 온도보다 낮은 온도에서 상기 핵산 폴리머라제 활성을 저해하고, 상기 올리고뉴클레오티드에 의한 핵산 폴리머라제 활성의 저해는 뉴클레아제 활성의 첨가에 의해 비가역적으로 제거되는 것인 효소 조성물.
다른 구체예에서, 하기 단계를 포함하는 표적 핵산 서열을 증폭하는 방법이 기재된다:
표적 핵산 서열의 존재가 시험될 시료를 제공하는 단계;
정방향 및 역방향 증폭 프라이머 쌍을 제공하는 단계로서, 정방향 증폭 프라이머는 표적 핵산 서열의 5' 말단에 어닐링하고 역방향 증폭 프라이머는 표적 핵산 서열의 3' 말단에 어닐링하는 단계;
핵산 폴리머라제 활성, 및 실질적으로 이중-가닥 올리고뉴클레오티드를 갖고, 올리고뉴클레오티드는 올리고뉴클레오티의 융해 온도보다 낮은 온도에서 상기 핵산 폴리머라제 활성을 저해하고, 상기 올리고뉴클레오티드에 의한 핵산 폴리머라제 활성의 저해는 뉴클레아제 활성의 첨가에 의해 비가역적으로 제거되는 것인 효소 조성물을 제공하는 단계;
뉴클레아제 활성을 첨가하는 단계;
표적 DNA 서열 및 증폭 버퍼의 존재에서 정방향 및 역방향 증폭 프라이머 간의 PCR 단편을 증폭하는 단계로서,
실질적으로 이중-가닥 올리고뉴클레오티드는 뉴클레아제 활성에 의해 비가역적으로 불활성화되는 것인 방법.
다른 구체예에서, 하기 단계를 포함하는 시료 중 표적 DNA 서열의 실시간 검출 방법이 개시된다:
표적 DNA 서열의 존재가 시험될 시료를 제공하는 단계;
정방향 및 역방향 증폭 프라이머쌍을 제공하는 단계로서, 정방향 증폭 프라이머는 표적 핵산 서열의 5' 말단에 어닐링하고 역방향 증폭 프라이머는 표적 핵산 서열의 3' 말단에 어닐링하는 단계;
검출가능한 표지 및 DNA 및 RNA 핵산 서열을 포함하는 프로브를 제공하는 단계로서, 프로브의 RNA 핵산 서열은 표적 DNA 서열의 선택된 영역에 전부 상보적이고 프로브의 DNA 핵산 서열은 표적 DNA 서열의 선택된 영역에 인접한 서열에 실질적으로 상보적인 것인 단계;
핵산 폴리머라제 활성, 올리고뉴클레오티드의 융해 온도보다 낮은 온도에서 핵산 폴리머라제 활성을 저해하는 실질적으로 이중-가닥 올리고뉴클레오티드, 및 핫 스타트 뉴클레아제 활성을 갖는 효소 조성물을 제공하는 단계로서, 올리고뉴클레오티드에 의한 핵산 폴리머라제 활성의 저해는 핫 스타트 뉴클레아제 활성의 활성화에 의해 비가역적으로 제거된 것인 단계;
뉴클레아제 활성을 첨가하는 단계;
표적 DNA 서열, 증폭 버퍼, 효소 조성물 및 프로브의 존재에서 1 사이클 이상의 증폭 사이클 동안 상기 실질적으로 이중-가닥 올리고뉴클레오티드가 뉴클레아제 활성에 의해 비가역적으로 불활성화되고 프로브 중 RNA 서열이 PCR 단편 중 상보적인 서열과 RNA:DNA 헤테로듀플렉스를 형성할 수 있는 조건 하에서 정방향 및 역방향 증폭 프라이머 간의 PCR 단편을 증폭하는 단계; 및
프로브의 표지로부터 신호 방출의 실시간 증가를 검출하는 단계로서, 신호의 증가는 시료 중 표적 DNA 서열의 존재를 나타내는 것을 포함하는 방법.
또 다른 구체예에서, 시료 중 RNA 표적 서열의 실시간 검출 방법은 하기를 포함한다:
표적 RNA 서열의 존재가 시험될 시료를 제공하는 단계;
정방향 및 역방향 증폭 프라이머쌍을 제공하는 단계로서, 정방향 증폭 프라이머는 표적 핵산 서열의 5' 말단에 어닐링하고 역방향 증폭 프라이머는 표적 핵산 서열의 3' 말단에 어닐링하는 단계;
검출가능한 표지 및 DNA 및 RNA 핵산 서열을 포함하는 프로브를 제공하는 단계로서, 프로브의 RNA 핵산 서열은 표적 cDNA 서열의 선택된 영역에 전부 상보적이고 프로브의 DNA 핵산 서열은 표적 cDNA 서열의 선택된 영역에 인접한 표적 DNA 서열에 실질적으로 상보적인 것인 단계;
핵산 폴리머라제 활성, 및 실질적으로 이중-가닥 올리고뉴클레오티드를 갖는 효소 조성물을 제공하는 단계로서, 올리고뉴클레오티드가 그의 융해 온도보다 낮은 온도에서 핵산 폴리머라제 활성을 저해하는 것이고, 올리고뉴클레오티드에 의한 핵산 폴리머라제 활성의 저해는 뉴크레아제 활성의 첨가에 의해 비가역적으로 제거된 것인 단계;
역전사 효소 활성 및 역방향 증폭 프라이머의 존재에서 표적 RNA를 역전사하여 표적 cDNA 서열을 생성하는 단계;
뉴클레아제 활성을 첨가하는 단계;
표적 cDNA 서열, 효소 조성물, 증폭 버퍼 및 프로브의 존재에서 1 이상의 증폭 사이클 동안 실질적으로 이중-가닥 올리고뉴클레오티드가 뉴클레아제 활성에 의해 비가역적으로 불활성화되고 프로브 중 RNA 서열이 PCR 단편 중 상보적인 서열과 RNA:DNA 헤테로듀플렉스를 형성할 수 있는 조건 하에서 정방향 및 역방향 증폭 프라이머 간의 PCR 단편을 증폭하는 단계; 및
프로브의 표지로부터 신호 방출의 실시간 증가를 검출하는 단계로서, 신호의 증가는 시료 중 표적 RNA 서열의 존재를 나타내는 것인 방법.
전술한 구체예는 PCR 증폭의 개시 이전에 핵산 폴리머라제의 촉매 활성을 저해하는 능력을 포함하는, 많은 장점을 갖는다. 또한, PCR 증폭의 민감도 및 특이도는 PCR 증폭의 제1 사이클 후에 핵산 폴리머라제의 이 저해를 제거함으로써 더욱 증진된다.
특정 구체예에서, 활성화된 핫 스타트 RNAse H 활성 은 PCR 증폭의 제1 사이클 동안 증폭 핵산 폴리머라제의 핫 스타트 활성화에 참여하고, 그 다음으로, 실시간 PCR 적용동안 표적 핵산 서열에 어닐링하는 카타클리브™의 절단 및 형광 검출을 촉진한다. 그러므로 핫 스타트 방법은 고효율 실시간 PCR 적용에 특히 적절하다.
당업자는 하기에 기재된, 도면들이 오직 예시 목적을 위한 것이라는 것을 이해할 것이다. 도면은 어떠한 방법으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것으로 의도되지 않는다.
도 1은 핫스타트 RNase HII이 없거나(검정 막대) 또는 핫스타트 RNase HII의 존재에서(흰색 막대) 및 Taq 폴리머라제의 존재(A), Taq 폴리머라제 + T-Pin 1(서열 번호 2)(B) 또는 Taq 폴리머라제 + T-Pin 4(서열 번호 3)의 존재(C)에서 시험된 PCR 증폭 효율을 나타낸다. T-Pin 1(서열 번호 2)는 핫스타트 RNase HII에 의해 절단되지 않는 반면에 T-Pin 4(서열 번호 3)는 핫스타트 RNase HII에 의해 절단가능하다.
도 2는 (1) T-Pin 4(서열 번호 3)이 존재하나 핫스타트 RNase HII는 없음(점선), (2) T-Pin 4(서열 번호 3)이 존재하나 핫스타트 RNase HII는 존재함(파선), 또는 (3) 항체 매개된 핫스타트를 사용하는 상업적으로 이용가능한 플래티늄 Taq(실선) 중 하나의 존재에서 M13 DNA 주형의 증폭 곡선을 나타낸다.
도 3은 플래티늄 Taq(도 3, A) 또는 Taq + T-Pin 4(서열 번호 3) + 핫스타트 RNase HII(도 3, B)를 갖는 PCR 반응에 대한 Cp 대 log[주형 농도]의 산출된 회귀 곡선을 나타낸다.
도 4는 플래티늄 Taq(도 4, A) 또는 Taq + T-Pin 4(서열 번호 3) + 핫스타트 RNase HII(도 4, B)를 갖는 RT-PCR 반응에 대한 Cp 대 log[카피 수]의 산출된 회귀 곡선을 나타낸다.
도 5는 피로코커스 푸리오시스(서열 번호 10), 피로코커스 호리코시(서열 번호 20), 써모코커스 코다카렌시스(서열 번호 21), 아르케오글로버스 프로판더스(서열 번호 22), 아르케오글로버스 펄기디스(서열 번호 23), 써모코커스 셀레르(서열 번호 24) 및 써모코커스 리토랄리스(서열 번호 25) RNase HII 폴리펩티드 서열들 간의 서열 얼라인먼트를 나타낸다.
도 6은 헤모필러스 인플루엔자(서열 번호 26),, 써머스 써모필리스(서열 번호 15), 써머스 아쿠아티커스(서열 번호 27), 살모넬라 엔테리카(서열 번호 28) 및 아그로박테리움 투메파시엔스(서열 번호 29) RNase HI 폴리펩티드 서열들의서열 얼라인먼트를 나타낸다.
발명의 실시는, 달리 표시되어 있지 않으면, 당업계에서 통상적인 분자 생물학적 기법들을 사용한다. 이러한 기법들은 당업자에게 잘 알려져 있고, 문헌에 충분히 설명되어 있다. 예를 들면, 모든 부록을 포함하는, Ausubel et al., 편집, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., NY, N.Y. (1987-2008); Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2판, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)를 참조한다.
달리 정의되어 있지 않다면, 본 명세서에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 당업자가 일반적으로 이해하는 의미와 동일한 의미를 갖는다. 또한 본 명세서는 본 출원의 개시 및 청구항의 해석을 돕기 위해 용어의 정의를 제공한다. 정의가 다른 정의와 일치하지 않는 경우에는, 본 명세서에 설명되어 있는 정의가 우선할 것이다.
본 명세서에 사용된, 용어 "염기(base)"는 상보적인 염기 또는 염기 유사체와 쌍을 이루는 왓슨-크릭 유형 수소 결합을 형성할 수 있는 질소-함유 헤테로사이클릭 모이어티를 말한다. 다수의 천연 및 합성 (비-천연, 또는 천연이 아닌) 염기, 염기 유사체 및 염기 유도체가 공지된다. 염기의 예는 퓨린, 피리미딘, 및 그의 변형된 형태를 포함한다. 천연으로 존재하는 염기는 아데닌(adenine: A), 구아닌(guanine: G), 시토신(cytosine: C), 우라실(uracil: U) 및 티민(thymine: T)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 본 명세서에 사용된, 천연으로 존재하는 염기에 한정되는 것으로 의도되지 않고, 이것은 본 발명과의 용도를 확인하는 다수의 천연이 아닌(비-천연으로 존재하는) 염기 및 그 각각의 천연이 아닌 뉴클레오티드가 당업자에게 공지되어 있기 때문이다.
용어 "뉴클레오시드(nucleoside)"는 당, 예를 들면, 리보스 또는 데옥시리보스의 C-1' 탄소에 연결된 염기로 이루어진 화합물을 말한다.
용어 "뉴클레오티드(nucleotide)"는 단량체 단위로서 또는 폴리뉴클레오티드 내, 뉴클레오시드의 인산 에스테르를 말한다. 본 명세서에서 사용된, 용어 "뉴클레오티드(nucleotide)"는 리보스, 아라비노스, 자일로스, 및 피라노스와 같은 당, 및 그의 당 유사체의 C-1' 탄소에 결합된 뉴클레오티드 염기를 포함하는 화합물을 말한다. 용어 뉴클레오티드는 또한 뉴클레오티드 유사체를 포함한다. 당은 치환 또는 비치환될 수 있다. 치환된 리보스 당은 1종 이상의 탄소 원자, 예를 들면 2'-탄소 원자가 1종 이상의 동일 또는 상이한 Cl, F, -R, -OR, -NR2 또는 할로겐 기로 치환되고, 각각의 R은 독립적으로 H, C1-C6 알킬 또는 C5-C14 아릴인 리보스를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 예시적인 리보스는 2'-(C1-C6)알콕시리보스, 2'-(C5-C14)아릴옥시리보스, 2',3'-디데히드로리보스, 2'-데옥시-3'-할로리보스, 2'-데옥시-3'-플루오로리보스, 2'-데옥시-3'-클로로리보스, 2'-데옥시-3'-아미노리보스, 2'-데옥시-3'-(C1-C6)알킬리보스, 2'-데옥시-3'-(C1-C6)알콕시리보스 및 2'-데옥시-3'-(C5-C14)아릴옥시리보스, 리보스, 2'-데옥시리보스, 2',3'-디데옥시리보스, 2'-할로리보스, 2'-플루오로리보스, 2'-클로로리보스, 및 2'-알킬리보스, 예를 들면, 2'-O-메틸, 4'-α-아노머 뉴클레오티드, 1'-α-아노머 뉴클레오티드, 2'-4'- 및 3'-4'-결합된 및 다른 "잠긴(locked)" 또는 "LNA", 이중고리 당 변형을 포함하나, 이에 한정되지 않는다(예를 들면, PCT 공개 WO98/22489, WO98/39352, 및 WO99/14226; 및 미국 특허 제6,268,490호 및 제6,794,499호 참조). 변형된 염기 모이어티 및/또는 변형된 당 모이어티를 갖는 추가적인 합성 뉴클레오티드는 예를 들면, Scheit: Nucleotide Analogs (John Wiley New York, 1980); Uhlman 및 Peyman, 1990, Chemical Reviews 90:543-584에 기재된 바와 같다.
본 명세서에서 사용된, 용어 "폴리뉴클레오티드(polynucleotide)", "핵산(nucleic acid)", "올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)", "올리고머(oligomer)", "올리고(oligo)", 프라이머 또는 균등한 용어는 데옥시리보핵산(deoxyribonucleic acid: DNA), 리보핵산(oxyribonucleic acid: RNA), 적절한 위치에서, 포스포티오에이트(phosphothioate) 함유 핵산, 잠긴 핵산(locked nucleic acid: LNA), 펩티드 핵산(peptide nucleic acid: PNA), 또는 다른 유도체 핵산 분자 및 그의 조합과 같은 뉴클레오티드 염기의 서열에 상응할 수 있는 단량체의 중합체성 배열을 말한다.
핵산은 합성 DNA, 플라스미드 DNA, 게놈 DNA, cDNA, hnRNA, 소형 핵 snRNA(small nuclear snRNA), mRNA, rRNA, tRNA, miRNAs, 단편화된 핵산, 미토콘드리아나 엽록체와 같은 세포내 소기관으로부터 수득된 핵산, 및 생물학적 시료 내 또는 생물학적 시료에 존재할 수 있는 미생물 또는 DNA 또는 RNA 바이러스로부터 수득된 핵산을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 핵산은 예를 들면, RNA 및 DNA의 경우에서처럼, 당 모이어티의 단일 유형, 또는 예를 들면 RNA/DNA 키메라의 경우에서처럼 상이한 당 모이어티의 혼합물로 구성될 수 있다.
폴리뉴클레오티드는 2개 이상의 뉴클레오티드를 포함하는 뉴클레오티드의 중합체이다. 폴리뉴클레오티드는 제2 가닥이 제1 올리고뉴클레오티드의 역 상보적인 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드인 것인 어닐링된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 이중-가닥 핵산, 데옥시티미딘을 포함하는 단일-가닥 핵산 중합체, 단일-가닥 RNA, 이중 가닥 RNA 또는 RNA/DNA 헤테로듀플렉스 또는 예를 들면 DNA 헤어핀 루프 및/또는 RNA 헤어핀 루프 및/또는 DNA/RNA 헤어핀 루프인 이중 가닥 영역을 포함하는 단일-가닥 핵산 중합체일 수 있다.
본 명세서에서 사용된, 용어 "올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)"는 짧은 폴리뉴클레오티드를 말한다. 특정 구체예에서, 올리고뉴클레오티드는 길이가 약 10개, 약 20개, 약 30개, 약 40개, 약 50개 또는 60개 뉴클레오티드 이상일 수 있다. 다른 구체예에서, 올리고뉴클레오티드는 약 500개 뉴클레오티드 미만, 약 250개 뉴클레오티드 미만, 약 200개 뉴클레오티드 미만, 약 150개 뉴클레오티드 미만 또는 100개 뉴클레오티드 미만이다.
올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드는 변형되거나 또는 변형된 염기 또는 변형되거나 비-천연적으로 존재하는 당 잔기를 포함할 수 있다. 컨쥬게이트를 포함한, 변형된 올리고뉴클레오티드에 대한 몇몇 보고가 공개되어 있다; 예를 들면, Verma 및 Eckstein Annu. Rev. Biochem. (1998) 67:99-134, Uhlmann 및 Peyman, Chemical Reviews, Vol. 90, pgs. 543-584 (1990), 및 Goodchild, Bioconjugate Chemistry, Vol. 1, pgs 165-187 (1990), Cobb Org Biomol Chem. (2007) 5(20):3260-75, Lyer et al. Curr Opin Mol Ther. (1999) 1(3):344-58), U.S. 특허 제6,172,208호, 제5,872,244호 및 공개된 미국 출원 제2007/0281308호를 참조한다.
용어 "주형 핵산(template nucleic acid)"은 PCR 반응 또는 역전사 효소-PCR 반응에서 증폭을 위한 출발 물질 또는 주형으로 사용된 복수의 핵산 분자를 말한다. 핵산 주형 서열은 천연적으로 존재 및 합성 분자를 둘다 포함할 수 있다. 예시적인 표적 핵산 서열은 게놈 DNA 또는 게놈 RNA를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
"표적 DNA(target DNA)" 또는 "표적 RNA(target RNA)" 또는 "표적 핵산(target nucleic acid)", 또는 "표적 핵산 서열(target nucleic acid sequence)"은 분석되는 주형 핵산의 영역을 말한다.
본 명세서에서 사용된, 용어 "증폭 프라이머(amplification primer)" 또는 " PCR 프라이머(PCR primer)" 또는 "프라이머(primer)"는 표적 핵산 서열의 상보적, 프라이머-특이적 부분과 역평행 방식으로 혼성화하도록 디자인 되도록 정의된 서열을 포함하는 효소적으로 연장가능한 올리고뉴클레오티드를 말한다. 따라서, 일반적으로 그의 표적 폴리뉴클레오티드 서열에 대해 몰 과량인, 프라이머는 주형-의존적 효소적 DNA 합성 및 표적 서열의 증폭을 프라이밍한다. 프라이머 핵산은 일어날 프라이머 신장을 위해 그의 주형 서브시퀀스와 100% 상동성을 가질 필요는 없고; 100% 미만의 상동성을 갖는 프라이머는 프라이머의 3' 말단의 끝에서 두번째의 염기가 표적 핵산과 염기쌍을 이룰 수 있다면 혼성화 및 폴리머라제 신장이 일어나는데 충분할 수 있다. PCR 프라이머는 바람직하게는 합성일 수 있으나 필수적이지 않고, 길이가 대략 약 10개 내지 약 100개 뉴클레오티드일 것이다.
올리고뉴클레오티드는 당업계에 알려진, 적절한 방법(화학적 합성과 같은)에 의해 합성되고 제조될 수 있다. 다수의 컴퓨터 프로그램(예를 들면, Primer-Express)이 최적 프라이머 세트를 디자인하는데 쉽게 이용가능하다. 그러므로 당업자는 대상 표적 핵산 서열에 인접한 프라이머를 쉽게 최적화시키고 확인할 것이다. 예를 들면, 합성된 프라이머는 55 도 부근의 융점(melting point: TM)을 갖는 길이가 20 내지 26 염기쌍일 수 있다. 상업적으로 이용가능한 프라이머가 대상 특정 표적 핵산 서열을 증폭하는 데 또한 사용될 수 있다. 따라서, 제공된 (또는 어세션 번호로 공개적으로 이용가능한) 핵산 정보에 기초한 프라이머 및 프로브가 따라서 제조될 수 있다는 것이 당업자에게 자명할 것이다.
용어 "어닐링(annealing)" 및 "혼성화(hybridization)"는 호환적으로 사용되고 듀플렉스, 트리플렉스, 또는 다른 고차원 구조의 형성을 야기하는 하나의 핵산과 또다른 핵산의 염기쌍 형성(base-pairing) 상호작용을 의미한다. 특정 구체예에서, 일차 상호작용은 왓슨/크릭(Watson/Crick) 및 후그스틴(Hoogsteen)-유형 수소 결합에 의해, 예를 들면 A/T 및 G/C인, 염기 특이적이다. 특정 구체예에서, 염기-스택킹(base-stacking) 및 소수성 상호작용은 또한 듀플렉스 안정성에 기여할 수 있다. "실질적으로 상보적인(substantially complementary)"은 서열에서 충분히 상보적이어서 어닐링하고 안정한 듀플렉스를 형성하는 두 개의 핵산 가닥들을 말한다.
핵산 주형 제조
핵산 주형은 인간, 인간이 아닌 동물, 식물, 박테리아, 균류, 원생동물, 바이러스 및 플라스미드, 파지 또는 바이러스 벡터와 같은 재조합 핵산으로부터 유래될 수 있다.
특정 구체예에서, 주형 핵산은 원핵 또는 진핵 세포, 배양된 세포, 혈액, 침, 객담, 뇨, 대변, 피부 세포, 모낭, 정액, 질액, 골 단편, 골수, 뇌 물질, 뇌척수액, 양수 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는 인간 또는 동물 유체 또는 조직을 포함할 수 있는 시료로부터 정제된다. 또한 시료는 (그람+ 또는 그람-를 포함하는) 박테리아 세포 또는 포자, 및 (DNA-기초 및 RNA-기초를 포함하는) 바이러스를 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 시료는 표면의 스와브(swab) 샘플링을 사용하여 수집될 수 있다.
시료로부터 핵산을 추출 및 정제하기 위한 방법은 당업계에 잘 알려져 있다(Sambrook J et. al. Molecular Cloning, Cold Spring harbor Laboratory Press (1989), Ausubel et al. Short Protocols in Molecular Biology, 5th Ed. (2002) John Wiley & Sons, Inc. New York에 기재된 바와 같음).
또한, 몇몇 상업용 키트가 핵산 정제용으로 이용가능하다. 예시적인 키트는 퓨어젠(Puregene: PG) DNA 정제 키트(Gentra Systems, Inc., Minneapolis, Minn.), 제너레이션 캡쳐 컬럼(Generation Capture Column: GCC) 키트(Gentra Systems, Inc.), 마스터퓨어(MasterPure: MP) DNA 정제 키트(Epicentre Technologies, Madison, Wis.), 이소퀵(IsoQuick: IQ) 핵산 추출 키트(Epoch Pharmaceuticals, Bothell, Wash.), 뉴클리센스(NucliSens: NS) 정제 키트(Organon Teknika Corp., Durham, N.C.), QIAamp DNA 혈액 미니 키트 (Qiagen; Cat. No. 51104), MagNA 퓨어 콤팩트 핵산 정제 키트(Roche Applied Sciences; Cat. No. 03730964001), qPCR용 Stabilized Blood-to-CT™ 핵산 제조 키트(Invitrogen, Cat. No. 4449080) 및 GF-1 바이러스 핵산 추출 키트(GeneOn, Cat. No. RD05)를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
핫 스타트 효소 조성물
본 발명은 핵산 폴리머라제, 핫 스타트 뉴클레아제 및 융해 온도보다 낮은 온도에서 핵산 폴리머라제의 촉매 활성을 저해하지 않는 실질적으로 이중-가닥 올리고뉴클레오티드를 포함하는 핫 스타트 조성물을 개시한다. 바람직한 구체예에서, 실질적으로 이중 가닥 올리고뉴클레오티드는 핫 스타트 RNAse H로 절단가능한 1개 이상의 RNA:DNA 염기쌍을 포함하고 올리고뉴클레오티드의 3' 말단이 프라이머 연장을 못하도록 변형된다.
핫 스타트 방법은 하기와 같이 작동된다. 실온 또는 올리고뉴클레오티드의 융해 온도 아래의 온도에서, 올리고뉴클레오티드는 핵산 폴리머라제의 활성 부위에 결합한다고 생각되는 실질적으로 이중-가닥 구조를 취하고 핵산 폴리머라제의 촉매 활성을 저해한다.
PCR의 제1 사이클의 개시로, PCR 반응은 처음에 약 95℃의 온도로 가온되어 (1) 폴리머라제로부터 올리고뉴클레오티드를 방출시켜 그것을 변성시키고 및 (2) 핫 스타트 RNase H를 활성화시킨다. 올리고뉴클레오티드의 어닐링 온도에 근접하는 온도로 PCR 반응의 냉각이 그 다음 올리고뉴클레오티드 내 재-어닐링된 1개 이상의 RNA:DNA 염기쌍의 위치가 활성화된 핫 스타트 RNase H에 의해 즉시 절단되는 것을 뒤따른다. 올리고뉴클레오티드 중 1개 이상의 RNA:DNA 염기쌍의 위치는 핫 스타트 RNase H에 의해 재-어닐링된 실질적으로 이중-가닥 올리고뉴클레오티드의 절단은 PCR 반응의 어닐링 단계의 온도 훨씬 아래인 Tm을 갖는 단편을 생성하는 방식으로 디자인된다. 따라서, PCR 반응의 어닐링 온도를 항상 유지하거나 초과인 그 다음의 PCR 사이클에서 확인되는 온도에서, 올리고뉴클레오티드 단편은 단일-가닥으로 남아있고 그러므로 이제 활성화된 핵산 폴리머라제의 촉매 활성을 간섭 또는 그렇지 않으면 저해할 수 없다.
기존 항체-기본 핫 스타트 조성물에 비해 본 발명의 핫 스타트 조성물이 갖는 하나의 장점은, 상이한 항체들이 상이한 생물의 DNA 폴리머라제를 저해하는 것이 요구될 수 있는 반면에, 단일 올리고뉴클레오티드 저해제가 모든 생물의 DNA 폴리머라제를 저해할 수 있다는 것이다.
다른 올리고뉴클레오티드 제해제에 비해 본 발명의 핫 스타트 조성물이 갖는 다른 주된 장점은 그것이 비가역적이라는 점이다. 다른 종래의 폴리고뉴클레오티드 저해재의 가역적 특성은 올리고뉴클레오티드 저해제의 Tm 부근인 PCR의 연장 온도를 제한한다. 어닐링 단계 (저해제의 Tm 아래일 수 있는) 동안에 일어나는 중합의 상당한 양이 실제로 있고, 종래 올리고뉴클레오티드 저해제의 사용은 어닐링 단계 동안의 중합을 저해한다. 본 핫 스타트 조성물로, 올리고뉴클레오티드 저해제의 Tm은 50-55℃로 제한되지 않고, 훨씬 높을 수 있다.
핫 스타트 조성물의 성분 각각이 이제 상세히 기재된다.
핵산 폴리머라제
핵산 폴리머라제는 DNA-의존적 DNA 폴리머라제, DNA-의존적 RNA 폴리머라제, RNA-의존적 DNA 폴리머라제 또는 RNA 의존적 RNA 폴리머라제의 활성을 하나 이상 가질 수 있다.
"DNA-의존적 DNA 폴리머라제 활성(DNA-dependent RNA polymerase activity)"는 상보적인 역평행 DNA 가닥의 합성을 위한 주형으로서 데옥시리보핵산(deoxyribonucleic acid: DNA)을 사용하는 DNA 폴리머라제 효소의 활성을 말한다(하기 참조).
"DNA-의존적 RNA 폴리머라제 활성(DNA-dependent RNA polymerase activity)"은 "전사(transcription)"라고 하는 방법에서 RNA 가닥의 합성을 위한 주형으로서 데옥시리보핵산(deoxyribonucleic acid: DNA)을 사용하는 RNA 폴리머라제 효소의 활성을 말한다(예를 들면, Toyobo Life Science Department, 카타로그 번호 TRL-201로부터 상업적으로 이용가능한, 써모(Thermo) T7 RNA 폴리머라제).
"RNA-의존적 DNA 폴리머라제 활성(RNA-dependent DNA polymerase activity)"은 "역전사(reverse transcription)"라고 하는 방법에서 상보적이고 역평행인 DNA 가닥의 합성을 위한 주형으로서 리보핵산(ribonucleic acid: RNA)을 사용하는 DNA 폴리머라제 효소의 활성을 말한다 (하기 참조).
"RNA-의존적 RNA 폴리머라제 활성(RNA-dependent RNA polymerase activity)"은 상보적인 RNA 가닥의 합성을 위한 주형으로서 리보핵산(ribonucleic acid: RNA)을 사용하는 RNA 폴리머라제 효소의 활성을 말한다(예를 들면, Cambio, 카타로그 번호 T90250으로부터 상업적으로 이용가능한, 써머스 써모필러스 RNA 폴리머라제).
특정 구체예에서, 핵산 폴리머라제는 상기-구체화된 촉매 활성 중 둘 이상을 가질 수 있는 열안정성 폴리머라제이다.
본 명세서에서 사용된, 효소에 적용된 용어 "열안정성(thermostable)"은 상승된 온도(예를 들면, 55℃ 이상)에서 그의 생물학적 활성을 보유하거나, 가온 및 냉각의 반복된 사이클 후에 그의 생물학적 활성을 보유하는 효소를 말한다.
본 명세서에서 사용된, "증폭 폴리머라제 활성(amplifying polymerase activity)"은 데옥시뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드의 중합을 촉매하는 효소 활성을 말한다. 일반적으로, 상기 효소는 표적 핵산 주형 서열에 어닐링된 프라이머의 3' 말단에서 합성을 개시하고, 주형 가닥의 5' 말단을 향해 진행할 것이다.
열안정성 DNA 폴리머라제의 비-한정적 예는 호열성 박테리아 써머스 아쿠아티쿠스( Thermus aquaticus )(Taq 폴리머라제), 써머스 써모필러스( Thermus thermophilus)(Tth 폴리머라제), 써모코커스 리토랄리스( Thermococcus litoralis)(Tli 또는 VENT™ 폴리머라제), 피로코커스 푸리오서스( Pyrococcus furiosus)(Pfu 또는 DEEPVENT™ 폴리머라제), 피로코커스 우시( Pyrococcus woosii)(Pwo 폴리머라제) 및 기타 피로코커스 종, 바실러스 스테아로써모필러스( Bacillus stearothermophilus )(Bst 폴리머라제), 설포로버스 아시도칼다리어스( Sulfolobus acidocaldarius )(Sac 폴리머라제), 써모플라스카 아시도필럼( Thermoplasma acidophilum )(Tac 폴리머라제), 써머스 러버( Thermus rubber )(Tru 폴리머라제), 써머스 브로키아너스(Thermus brockianus, DYNAZYME™ 폴리머라제) i (Tne 폴리머라제), 서모토가 마리팀( Thermotoga maritime )(Tma) 및 써모토가 속의 기타 종(Tsp 폴리머라제), 및 메타노박테리움 써모오토트로피컴( Methanobacterium thermoautotrophicum)(Mth 폴리머라제)으로부터 분리된 폴리머라제를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. PCR 반응은 표적 서열의 보다 효율적인 증폭을 가져오는 보완적인 특성을 갖는 둘 이상의 열안정성 폴리머라제 효소를 포함할 수 있다. 예를 들면, 높은 진행성(큰 뉴클레오티드 세그먼트를 카피하는 능력)을 갖는 뉴클레오티드 폴리머라제는 교정 능력(표적 핵산 서열의 신장 동안 오류를 수정하는 능력)을 갖는 다른 뉴클레오티드 폴리머라제로 보완될 수 있고, 따라서 긴 표적 서열을 높은 정확도로 복사할 수 있는 PCR 반응을 생성한다. 열안정성 폴리머라제는 그의 야생형으로 사용될 수 있다. 대안적으로, 폴리머라제는 효소의 단편을 포함하거나 또는PCR 반응을 촉진하는 이로운 특성을 제공하는 돌연변이를 함유하도록 변형될 수 있다.
일 구체예에서, 열안정성 폴리머라제는 Taq DNA 폴리머라제일 수 있다. 증진된 특성을 갖는 Taq 폴리머라제의 많은 변이체가 알려져 있고 AmpliTaq™, AmpliTaq ™, Stoffel 단편, SuperTaq™, SuperTaq™ 플러스(plus), LA Taq™, LApro Taq™, 및 EX Taq™을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 다른 구체예에서, 열안정성 폴리머라제는 AmpliTaq Stoffel 단편이다.
"실질적으로 이중-가닥 올리고뉴클레오티드( substantially double - stranded oligonucleotid )"
"실질적으로 이중-가닥 올리고뉴클레오티드(substantially double-stranded oligonucleotid)"는 하나의 가닥의 영역의 1개 이상의 뉴클레오티드와 상보적인 수소 결합 쌍으로 연결된 1개 이상의 뉴클레오티드를 갖는 가닥을 갖는 1개 이상의 영역을 갖는 올리고뉴클레오티드를 말한다. 실질적으로 이중-가닥 영역에서 염기쌍 형성은 인접하여 염기쌍이 되거나 또는 염기쌍이 되지 않은 1개 이상의 뉴클레오티드 사이에 들어간 인접하여 염기쌍이 된 뉴클레오티드를 하나 이상 포함할 수 있다. 실질적으로 이중-가닥 영역은 1개 이상의 리보뉴클레오티드 또는 데옥시리보뉴클레?드를 포함할 수 있다. 염기쌍이 형성된 뉴클레오티드는 "실질적으로 이중-가닥 올리고뉴클레오티드"의 가닥 중 하나의 5' 말단 또는 3' 말단에 위치되거나 또는 그 사이에 어디에나 위치될 수 있다. 실질적으로 이중-가닥 영역에서 염기쌍 형성은 분자간 또는 분자내일 수 있다. 즉, 염기쌍 형성은 2개 이상의 떨어진 올리고뉴클레오티드 사이거나(예를 들면, 이중-가닥 올리고뉴클레오티드), 또는 스템 및 루프 구조를 형성하는 단일 올리고뉴클레오티드 내(예를 들면, 헤어핀 올리고뉴클레오티드) 일 수 있다. 일 구체예에서 "실질적으로 이중-가닥 올리고뉴클레오티드"는 1, 2, 3, 4, 또는 5개 이상의 스템 구조를 포함할 수 있다. "실질적으로 이중-가닥 올리고뉴클레오티드"는 약 1, 약 2, 약 3, 약 4, 약 5, 약 6, 약 7, 약 8, 약 9, 약 10, 약 15, 약 20, 약 25, 약 50개 또는 그 이상의 염기쌍이 형성된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. "실질적으로 이중-가닥 올리고뉴클레오티드"는 염기쌍이 형성되지 않은 약 1, 약 2, 약 3, 약 4, 약 5, 약 6, 약 7, 약 8, 약 9, 약 10, 약 15, 약 20, 약 25, 약 50개 또는 그 이상의 염기쌍이 형성된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
일부 구체예에서, "실질적으로 이중-가닥 올리고뉴클레오티드"는 서로 10% 상보적인 두 개의 염기쌍이 형성된 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 다른 구체예에서, "실질적으로 이중-가닥 올리고뉴클레오티드"는 서로 약 95%, 약 60%, 약 75%, 약 50%, 또는 그 미만의 상보성을 가질 수 있는 2개의 염기쌍이 형성된 올리고뉴클레오티드를 포함한다.
"실질적으로 이중-가닥 올리고뉴클레오티드" 중 가닥 중 하나의 5' 말단 또는 3' 말단은 올리고뉴클레오티드의 하나의 말단 또는 모두에 5' 또는 3' 오버행(overhang)을 갖거나 또는 올리고뉴클레오티드의 하나 또는 모두의 말단이 염기쌍이 형성되고 블런트-말단(blunt-end)일 수 있다.
이중-가닥 올리고뉴클레오티드의 양은 알려진 올리고뉴클레오티드의 융해 온도 또는 Tm, 즉 올리고뉴클레오티드의 그의 상보 가닥의 약 50%가 듀플렉스인 온도에 의해 추산될 수 있다.
올리고뉴클레오티드의 이중 가닥 영역의 융해 온도(Tm)은 당업계에 잘 알려진 방법을 사용하여 올리고뉴클레오티드 서열로부터 계산될 수 있다.
예를 들면, 올리고뉴클레오티드의 Tm은 (Promega 웹 사이트에 기재된 바와 같은) 식을 사용하여 계산될 수 있다:
Tm = 4℃ x (프라이머 중 G 및 C의 개수) + 2℃ x (프라이머 중 A 및 T의 개수)
이 식은 <14개 염기의 이중 가닥 영역을 갖는 올리고뉴클레오티드에 대해 유효하고 반응이 50 mM 1가 양이온의 존재에서 수행된다는 것을 가정한다.
>14개 염기의 이중 가닥 영역을 갖는 더 긴 올리고뉴클레오티드를 위해서는, 하기 식이 사용될 수 있다:
Tm = 64.9℃ + 41℃ x (프라이머 중 G 및 C의 개수 - 16.4)/N
식에서 N은 프라이머의 길이이다.
다른 흔히 사용된 식은 반응의 염 농도를 고려한다(Rychlik, W. 및 Rhoads, R.E. (1989) Nucl. Acids Res. 17, 8543; PCR Core Systems Technical Bulletin #TB254, Promega Corporation; Sambrook, J., Fritsch, E.F. 및 Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY 및 Mueller, P.R. et al. (1993) In: Current Protocols in Molecular Biology 15.5, Greene Publishing Associates, Inc. 및 John Wiley and Sons, New York 참조).
이 식은 하기와 같다:
Tm = 81.5℃ + 16.6℃ x (log10[Na+] + [K+]) + 0.41℃ x (%GC) - 675/N
식에서 N은 올리고뉴클레오티드 중 뉴클레오티드의 개수이다.
가장 정교한 Tm 계산은 단지 염기 조성이 아니라, 정확한 서열 및 염기 스택킹(stacking) 파라미터를 고려한다(Borer P.N. et al. (1974) J. Mol. Biol. 86, 843; SantaLucia, J. (1998) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 95, 1460; Allawi, H.T. 및 SantaLucia, J. Jr. (1997) Biochemistry 36, 10581 및 von Ahsen N. et al. (1999) Clin. Chem. 45, 2094에 기재된 바와 같음).
사용된 방정식은 다음과 같다:
Figure pat00001
방정식에서, ΔH는 헬릭스 개시 인자를 위해 보정된 염기 스택킹 상호작용의 엔탈피이고, ΔS는 헬릭스 개시 인자 및 시스템의 엔트로피에 대한 염의 기여를 위해 보정된 염기 스택킹의 엔트로피이고 R은 보편 기체 상수이다(1.987 Cal/몰·℃).
이 방정식은, 상기 시행된 바와 같이, 하기 가정이 충족되는 경우라면 유효하다:
● 프라이머는 자가 상보적이지 않다. 자가-상보적인 올리고뉴클레오티드를 위해서, 방정식의 분모는 ΔS + R ln([프라이머]/4)가 된다.
● 프라이머 농도는 표적 농도보다 훨씬 높다. 농도가 거의 같다면, 방정식의 분모는 ΔS + R ln([프라이머]-[표적]/2)가 된다.
● 프라이머는 긴 중합체라기 보다 "올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)"이다. 중합체에 대한 염의 효과는 올리고에 대한 효과와 상당히 상이하다. 완전한 논의를 위해서는 참고 문헌 6을 참조한다.
상이한 올리고뉴클레오티드를 위한 융해 온도는 웹 상에서 자유롭게 이용가능한 웹-기초 계산기, 예를 들면, Promega 웹 사이트에 상의 생물수학(Biomath) 계산기를 사용하여 편리하게 결정될 수 있다.
일 구체예에서, "실질적으로 이중-가닥 올리고뉴클레오티드"는 약 50℃ 내지 약 55℃ 또는 약 60℃의 Tm을 갖는다.
적절한 Tm은 올리고뉴클레오티드가 하기 온도에서 이중-가닥이 확실하도록 선택된다.
(1) 핵산 폴리머라제의 촉매 활성을 저해하는데 바람직한 온도, 즉 약 20℃ 내지 약 50℃까지의 온도, 및
(2) 열-활성화된 핫 스타트 뉴클레아제가 실질적으로 이중-가닥 올리고뉴클레오티드의 2차 구조를 절단하고 파괴하여 핵산 폴리머라제의 촉매 활성의 저해를 충분히 불가능하게 할 수 있는 온도.
일부 구체예에서, "실질적으로 이중-가닥 올리고뉴클레오티드"는 그 3'-말단 및/또는 5'-말단에서 화학적으로 변형된다. 3' 말단에서 올리고뉴클레오티드의 변형은 올리고뉴클레오티드가 프라이머 연장에 참여하는 것을 차단한다.
일 구체예에서, 올리고뉴클레오티드는 3' 말단에서 디데옥시리보뉴클레오티드의 함입을 통해 프라이머 연장에 참여하는 것으로부터 차단된다.
예를 들면, 이중 가닥 올리고뉴클레오티드의 3'-말단은 DNA 폴리머라제 I (Escherichia coli)의 크레나우 단편 돌연변이 (F762Y) 또는 T7 DNA 폴리머라제를 사용하여 디데옥시티민 트리포스페이트로 3' 말단에 캡핑될 수 있다 (Tabor, S. and Richardson, C. C., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 6339-6343). 올리고뉴클레오티드의 3'-OH 말단은 그 후 37℃에서, 30분 동안 50 mM Tris pH 7.5 버퍼 중 2 mM Mg2 +의 존재에서 20 μM ddTTP, 폴리머라제에 의해 ddTTP로 연장된다. 연장한 다음에, 시료는 단백질을 변성시키기 위해 100℃ 수조에 3분 동안 놓인다. 가온 다음에 올리고뉴클레오티드 시료는 듀플렉스 구조의 형성을 가능하게 하기 위해 주변의 온도로 (2-3 시간) 천천히 냉각되었다.
다른 구체예에서, 실질적으로 이중-가닥 올리고뉴클레오티드는 RNase H에 의해 핵산내부가수분해적으로 절단될 수 있는 1개 이상의 RNA:DNA 염기쌍을 함유한다.
1개 이상의 RNA:DNA 염기쌍에서 이중 가닥 올리고뉴클레오티드의 절단에 의해 생산된 임의의 이중 가닥 단편이 PCR 반응의 어닐링 단계의 온도보다 약 5-10℃ 이하인 Tm을 갖는다면 1개 이상의 RNA:DNA 염기쌍의 위치는 특별히 중요하지는 않다. 그러므로, 절단에 의해 생산된 이중-가닥 올리고뉴클레오티드의 임의의 단편은, 55℃ 초과의 온도에서, 단편이 단일-가닥으로 남아있고 핵산 폴리머라제를 저해하거나 또는 DNA 주형에 어닐링 중 어느 하나를 할 수 없고 프라이머 연장을 위한 기질을 제공하기 때문에, 그 다음의 PCR 반응을 간섭할 수 없다.
특정 구체예에서, 올리고뉴클레오티드는 1종 이상의 차단제를 가질 수 있다. 차단제(blocking agent)는 DNase 활성에 의해 그러한 핵산 분자의 분해 또는 절단(digestion)를 막거나 저해하기 위해 본 발명의 핵산 저해제로 함입된 뉴클레오티드(또는 그의 유도체), 변형된 올리고뉴클레오티드 및/또는 1종 이상의 다른 변형을 말한다. 하나 또는 다수의 차단제는 핵산 저해제의 3' 말단 또는 인근 및/또는 5' 말단 또는 인근에, 내적으로 본 발명의 핵산 저해제에 함입될 수 있다. 바람직하게는, 그러한 차단제는 선형 저해제 핵산 분자에 대해, 3' 말단 또는 인근에 및/또는 5' 말단 또는 인근에 및/또는 그러한 분자의 5'-> 3' 엑소뉴클레아제의 바람직한 절단 위치에 위치된다(Lyamichev, V., Brow, M. A. D., and Dahlberg, J. E., (1993) Science, 260, 778-783). 바람직하게는, 그러한 차단제는 폴리머라제 또는 역전사 효소와 연관되거나 합성 반응에 존재할 수 있는 엑소뉴클레아제 활성에 의해 저해제 핵산 분자의 분해 또는 절단을 막거나 저해한다. 예를 들면, 본 발명의 차단제는 폴리머라제(예를 들면, DNA 폴리머라제)와 연관된 3' 엑소뉴클레아제 활성 및/또는 5' 엑소뉴클레아제 활성에 의한 저해제 핵산 분자의 분해 또는 절단을 막는다. 본 발명에 따른 바람직한 차단제는 ddATP, ddCTP, ddGTP, ddITP, 및 ddTTP와 같은 디데옥시뉴클레오티드 및 그의 유도체를 포함한다. 본 발명에 따른 사용을 위한 다른 차단제는 AZT, 포스포아미드 백본 (예를 들면, PNA), 3'-dNTP (예를 들면, 콘디세핀(Condycepin)) 또는 차단기(blocking group)를, 바람직하게는 3' 위치에 함유하는 임의의 뉴클레오티드를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 그러한 차단제는 바람직하게는 엑소뉴클레아제 활성(예를 들면, 3'-엑소뉴클레아제 활성)이 본 발명의 저해성 핵산을 바꾸거나 절단하는 것을 저해하거나 막도록 작용한다. 일부 구체예에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드의 5'-말단은 그들을 5'->3' 엑소뉴클레아제 활성에 대해 저항하도록 만들기 위해 변형될 수 있다. 한가지 그러한 변형은 5'-5'-결합 중 올리고뉴클레오티드의 5'-말단에 추가 뉴클레오티드를 추가하는 것일 수 있다(Koza. M. et al., Journal of Organic Chemistry 56:3757 참조). 이것은 올리고뉴클레오티드의 5'-말단에서 올리고뉴클레오티드의 3'을 갖는 5'-말단을 야기한다. 다른 측면에서, 그러한 차단제는 바람직하게는 폴리머라제의 폴라머라제 활성이 본 발명의 저해성 핵산을 바꾸거나 변화하는 것(예를 들면, 뉴클레오티드의 함입)을 저해하거나 막는다.
다른 구체예에서, 올리고뉴클레오티드는 1개 이상의 헤어핀을 가질 수 있다. 본 명세서에서 사용된, 용어 "헤어핀(hairpin)"은 올리고뉴클레오티드의 1개 이상의 부분이 그 올리고뉴클레오티드의 1개 이상의 다른 부분과 염기쌍을 형성하는 올리고뉴클레오티드의 구조를 나타내는데 사용된다. 두 부분이 염기쌍이 형성되어 올리고뉴클레오티드의 이중 가닥 부분을 형성하면, 이중 가닥 부분은 스템으로 언급될 수 있다. 따라서, 사용된 상보적 부분의 수에 따라, 다수의 스템(바람직하게는 1-10개)이 형성될 수 있다. 또한, 1개 이상의 스템의 형성은 바람직하게는 헤어핀 분자 중 1개 이상의 루프 구조의 형성을 가능하게 한다. 일 측면에서, 임의의 1개 이상의 루프 구조는 루프 또는 루프들 내 1개 이상의 부위에서 잘리거나 패일(nick) 수 있지만 바람직하게는 1개 이상의 루프가 잘리거나 패이지(nick) 않는다. 올리고뉴클레오티드의 서열은 스템을 형성하는 염기쌍인 뉴클레오티드의 수를 약 3 뉴클레오티드 내지 약 100개 이상의 뉴클레오티드, 약 3개 뉴클레오티드 내지 약 50개 뉴클레오티드, 약 3개 뉴클레오티드 내지 약 25개 뉴클레오티드, 및 약 3개 뉴클레오티드 내지 약 10개 뉴클레오티드로 다르게 하기 위해서 선택될 수 있다. 또한, 올리고뉴클레오티드의 서열은 염기쌍을 형성하지 않는 뉴클레오티드의 수를 0개 뉴클레오티드 내지 약 100개 이상의 뉴클레오티드, 0개 뉴클레오티드 내지 약 50개 뉴클레오티드, 0개 뉴클레오티드 내지 약 25개 뉴클레오티드, 및 0개 뉴클레오티드 내지 약 10개 뉴클레오티드로 다르게 하기 위해서 달라질 수 있다. 염기쌍을 형성하는 올리고뉴클레오티드의 2 부분은 올리고뉴클레오티드의 서열 중 어디든지 또는 다수의 위치에 위치할 수 있다. 일부 구체예에서, 올리고뉴클레오티드의 1개의 염기쌍-형성-부분은 올리고뉴클레오티드의 3'-말단을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 1개의 염기쌍-형성-부분은 올리고뉴클레오티드의 5'-말단을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 올리고뉴클레오티드의 하나의 염기쌍-형성-부분은 3'-말단을 포함하는 반면에 다른 염기쌍-형성-부분은 5'-말단을 포함하고, 염기쌍이 형성되면, 올리고뉴클레오티드의 스템은 블런트 엔드가 된다. 다른 구체예에서, 올리고뉴클레오티드의 염기쌍 부분의 위치는 3'-오버행(overhang), 5' 오버행을 형성하도록 선택될 수 있고 및/또는 3'-대부분의 뉴클레오티드 및 5'-대부분의 뉴클레오티드 중 어느 것도 염기쌍에 수반되도록 선택될 수 있다.
핫 스타트 뉴클레아제
본 명세서에서 사용된, "핫 스타트(hot start)" 효소 조성물은 비-허용적 온도, 즉 약 25℃ 내지 약 45℃에서 저해되고 PCR 반응에 적합한 온도, 예를 들면 약 55℃ 내지 약 95℃에서 활성화되거나 또는 '열 유도성'인 효소 활성을 갖는 조성물을 말한다.
본 명세서에서 사용된, "핫 스타트(hot start)" 뉴클레아제 조성물은 활성화된 경우 이중-가닥 올리고뉴클레오티드를 특이적으로 절단할 수 있는 '유도성', 예를 들면 열-유도성, RNA 또는 DNA 엔도뉴클레아제를 포함하는 조성물을 말한다.
바람직한 구체예에서, "핫 스타트" 뉴클레아제는 1개 이상의 RNA:DNA 염기쌍을 포함하는 이중-가닥 올리고뉴클레오티드를 절단할 수 있는 '핫 스타트' RNase H이다.
일부 구체예에서, 올리고뉴클레오티드의 Tm은 SYBR 그린 삽입(intercalating) 염료를 사용하여 결정된다. 낮은 온도에서 본 명세서에 기재된 올리고뉴클레오티드 저해제는 스스로 접혀 이중 가닥 헤어핀 구조를 형성한다. 이 이중 가닥 구조로 삽입되는 경우 SYBR 그린은 497 nM에서 빛을 흡수하고 520 nM에서 방출한다. 520 nM 빛 방출응 시료가 천천히 가온되는 동안에 모니터링된다. 융해점 (Tm) 인근에서 올리고뉴클레오티드는 천천히 풀려 총 형광의 순 손실을 야기하는 유리 SYBR 그린을 방출한다. Tm은 올리고뉴클레오티드의 50%가 융해된 상태에 있는 지점이다.
RNase H는 RNA-DNA 하이브리드 중 RNA를 가수분해한다. 송아지 흉선에서 처음 발견된, RNase H는 그 다음에 여러 생물에서 개시되었다. RNase H 활성은 진핵생물 및 박테리아에 편재한 것으로 보인다. RNase H는 다양한 분자량과 핵산분해 활성을 갖는 단백질의 패밀리를 형성하나, 기질 요구성은 다양한 아형에 대하여 유사한 것으로 보인다. 예를 들면, 현재까지 연구된 대부분의 RNase H는 엔도뉴클레아제로 기능하고 5' 포스페이트 및 3' 히드록실 말단을 갖는 절단 산물을 생성하기 위해 2가 양이온(예를 들면, Mg2 +, Mn2 +)을 요구한다.
원핵생물에서, RNase H가 클로닝되었고 광범위하게 규명되었다(Crooke, et al., (1995) Biochem J, 312 (Pt 2), 599-608; Lima, et al., (1997) J Biol Chem, 272, 27513-27516; Lima, et al., (1997) Biochemistry, 36, 390-398; Lima, et al., (1997) J Biol Chem, 272, 18191-18199; Lima, et al., (2007) Mol Pharmacol, 71, 83-91; Lima, et al., (2007) Mol Pharmacol, 71, 73-82; Lima, et al., (2003) J Biol Chem, 278, 14906-14912; Lima, et al., (2003) J Biol Chem, 278, 49860-49867; Itaya, M., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1990, 87, 8587-8591 참조). 예를 들면, E.coli RNase HⅠ은 길이가 155개의 아미노산이나 E.coli RNase HⅡ는 길이가 213개의 아미노산이다. E.coli RNase HⅡ는 E.coli RNase HⅠ과 겨우 17%의 상동성을 나타낸다. S. typhimurium으로부터 클로닝된 RNase H는 E. coli RNaseHⅠ과 11개의 위치에서만 다르고 길이가 155개의 아미노산이었다(Itaya, M. 및 Kondo K., Nucleic Acids Res., 1991, 19, 4443-4449).
RNase H 활성을 나타내는 단백질들이 또한 수많은 바이러스, 다른 박테리아 및 효모로부터 클로닝되고 정제되었다(Wintersberger, U. Pharmac. Ther., 1990, 48, 259-280). 많은 경우에, RNase H 활성을 갖는 단백질들은 RNase H가 다른 효소, 종종 DNA 또는 RNA 폴리머라제의 아미노 또는 카르복시 말단에 융합된 것인 융합 단백질로 나타난다. RNase H 도메인은 E.coli RNase HⅠ에 상동성이 높은 것으로 일관되게 확인되었지만, 다른 도메인들이 상당히 다르기 때문에, 그 융합 단백질들의 분자량 및 다른 특성들이 폭넓게 다양하다.
고등 진핵생물에서 분자량, 이가 양이온의 효과, 설피드릴 작용제에 대한 민감도 및 면역학적 교차-반응성에서의 차이에 기초하여 두 가지 종류의 RNase H가 정의되었다(Busen et al., Eur. J. Biochem., 1977, 74, 203-208). RNase HⅠ 효소는 68-90 kDa 범위의 분자량을 가지고, Mn2 + 또는 Mg2 + 중 하나에 의하여 활성화되고 및 설피드릴 작용제에 민감하지 않은 것으로 보고되었다. 반면에, RNase HⅡ 효소는 31-45 kDa 범위의 분자량을 가지고, Mg2 +를 요구하고, 설피드릴 작용제에 상당히 민감하고, 및 Mn2 +에 의하여 저해되는 것으로 보고되었다(Busen, W., 및 Hausen, P., Eur. J. Biochem., 1975, 52, 179-190; Kane, C. M., Biochemistry, 1988, 27, 3187-3196; Busen, W., J. Biol. Chem., 1982, 257, 7106-7108).
RNase HⅡ 특성을 가진 효소가 또한 인간 태반으로부터와 거의 동종(homogeneity)으로 분리되었다(Frank et al., Nucleic Acids Res., 1994, 22, 5247-5254). 이 단백질은 대략 33 kDa의 분자량을 갖고, pH 8.5-9의 최적 pH를 갖는, pH 6.5-10의 범위에서 활성이 있다. 효소는 Mg2 +를 요구하고 Mn2 + 및 n-에틸 말레이미드에 의하여 저해된다. 절단 반응의 산물은 3' 히드록실 및 5' 포스페이트 말단을 갖는다.
상이한 종들로부터의 RNAse의 상세한 비교는 Ohtani N, Haruki M, Morikawa M, Kanaya S. J Biosci Bioeng. 1999;88(1):12-9에 보고된다.
구체예에서 사용될 수 있는, RNase H 효소의 예는 피로코커스 푸리오서스( Pyrococcus furiosus ), 피로코커스 호리코시 ( Pyrococcus horikoshi ), 써모코커스 리토랄리스 ( Thermococcus litoralis ), 써모스 써모필러스( thermos thermophilus)과 같은 호열성 생물로부터 분리된 열안정성 RNAse H 효소를 또한 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
구체예에서 사용될 수 있는 다른 RNAse H 효소들은 예를 들면, Uemori의 미국 특허 제7,422,888호 또는 Walder의 공개된 미국 특허 출원 제2009/0325169호에 기재되어 있고 그 내용은 본 명세서에 참조로서 포함된다.
일 구체예에서, RNAse H 효소는 하기에 표시된, Pfu RNase HⅡ의 아미노산 서열(서열 번호 10)과 약 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 상동성을 갖는 열안정성 RNAse H이다.
MKIGGIDEAG RGPAIGPLVV ATVVVDEKNI EKLRNIGVKD SKQLTPHERK NLFSQITSIA 60
DDYKIVIVSP EEIDNRSGTM NELEVEKFAL ALNSLQIKPA LIYADAADVD ANRFASLIER 120
RLNYKAKIIA EHKADAKYPV VSAASILAKV VRDEEIEKLK KQYGDFGSGY PSDPKTKKWL 180
EEYYKKHNSF PPIVRRTWET VRKIEESIKA KKSQLTLDKF FKKP (서열 번호 10)
상동성은, 예를 들면 컴퓨터 프로그램 DNASIS-Mac(Takara Shuzo), 컴퓨터 알고리즘 FASTA(버전 3.0; Pearson, W. R. et al., Pro. Natl. Acad. Sci., 85:2444-2448, 1988) 또는 컴퓨터 알고리즘 BLAST(버전 2.0, Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, 1997)을 사용하여 결정될 수 있다.
다른 구체예에서, RNAse H 효소는 서열 번호 10의 위치 5-20, 33-44, 132-150, 및 158-173에 상응하는 상동성 영역 1-4 중 1개 이상을 갖는 열안정성 RNAse H이다. 이 상동성 영역은 피로코커스 푸리오시스 ( Pyrococcus furiosis ), 피로코커스 호리코시 ( Pyrococcus horikoshi ), 써모코커스 코다카렌시스( Thermococcus kodakarensis), 알케오글로부스 프로펀두스 ( Archeoglobus profundus ), 알케오글로부스 풀기디스 ( Archeoglobus fulgidis ), 써모코커스 세레르 ( Thermococcus celer ) 및 써모코커스 리토랄리스 ( Thermococcus litoralis ) RNase HII 폴리펩티드 서열의 서열 정렬에 의해 정의되었다(도 5 참조).
상동성 영역 1: GIDEAG RGPAIGPLVV (서열 번호 11; 서열 번호 10의 위치 5-20에 해당함)
상동성 영역 2: LRNIGVKD SKQL (서열 번호 12; 서열 번호 10의 위치 33-44에 해당함)
상동성 영역 3: HKADAKYPV VSAASILAKV (서열 번호 13; 서열 번호 10의 위치 132-150에 해당함)
상동성 영역 4: KLK KQYGDFGSGY PSD (서열 번호 14; 서열 번호 10의 위치 158-173에 해당함)
일 구체예에서, RNAse H 효소는 서열 번호 11, 12, 13 또는 14의 폴리펩티드 서열과 약 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 서열 상동성을 갖는 상동성 영역 중 하나 이상을 갖는 열안정성 RNAse H이다.
다른 구체예에서, RNAse H 효소는 하기에 나타난, 써머스 써모필러스 RNase HI (서열 번호 15)의 아미노산 서열과 약 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는99% 상동성을 갖는 열안정성 RNAse H이다.
MNPSPRKRVA LFTDGACLGN PGPGGWAALL RFHAHEKLLS GGEACTTNNR MELKAAIEGL
KALKEPCEVD LYTDSHYLKK AFTEGWLEGW RKRGWRTAEG KPVKNRDLWE ALLLAMAPHR
VRFHFVKGHT GHPENERVDR EARRQAQSQA KTPCPPRAPT LFHEEA (서열 번호 15)
다른 구체예에서, RNAse H 효소는 서열 번호 15의 위치 23-48, 62-69, 117-121 및 141-152에 상응하는 상동성 영역 5-8 중 하나 이상을 갖는 열안정성 RNAse H이다. 이 상동성 영역은 헤모필러스 인플루엔자(Haemophilus influenzae), 써머스 써모필리스(Thermus thermophilis), 써머스 아쿠아티커스(Thermus acquaticus), 살모넬라 엔테리카(Salmonella enterica) 및 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) RNase HI 폴리펩티드 서열의 서열 정렬에 의해 정의된다(도 6 참조).
상동성 영역 5: K*V*LFTDG*C*GNPG*GG*ALLRY (서열 번호 16; 서열 번호 15의 위치 23-48에 상응함), 서열에서 *는 임의의 아미노산을 표시함.
상동성 영역 6: TTNNRMEL (서열 번호 17; 서열 번호 15의 위치 62-69에 상응함)
상동성 영역 7: KPVKN (서열 번호 18; 서열 번호 15의 위치 117-121에 상응함)
상동성 영역 8: FVKGH*GH*ENE (서열 번호 19; 서열 번호 15의 위치 141-152에 상응함)
다른 구체예에서, RNase H 효소는 서열 번호 16, 17, 18 또는 19의 폴리펩티드 서열과 약 50%, 60%. 70%, 80%, 90% 서열 동일성을 갖는 상동성 영역 4-8 중 1개 이상을 갖는 열안정성 RNase H이다.
본 명세서에서 사용된 용어 "서열 동일성(sequence identity)"은 서열이 비교 범위(window of comparison)에서 아미노산 대 아미노산 기준으로 동일하거나 기능적으로 또는 구조적으로 유사한 정도를 말한다. 따라서, "서열 동일성의 백분율(percentage of sequence identity)"은 예를 들면, 비교 범위에서 2개의 최적으로 정렬된 서열을 비교하는 단계, 동일한 아미노산이 두 서열 모두에서 나타나는 위치의 갯수를 결정하여 일치된(matched) 위치의 개수를 수득하는 단계, 일치된 위치의 개수를 비교 범위 내 위치의 총 개수(즉, 범위 크기)로 나누는 단계, 및 그 결과에 100을 곱하여 서열 동일성의 백분율을 수득하는 단계에 의해 계산될 수 있다.
핫 스타트 RNAse H
특정 구체예에서, RNase H는 '핫 스타트(hot start)' RNase H를 생성하도록 변형될 수 있다.
본 명세서에서 사용된, 용어 "변형된 RNase H(modified RNase H)"는 RNase H의 엔도뉴클레아제 활성의 상실을 야기하는 저해 인자에 가역적으로 커플링되거나 또는 가역적으로 결합된 RNase H일 수 있다. RNase H로부터 저해 인자의 방출 또는 분리(decoupling)는 RNase H의 엔도뉴클레아제 활성의 적어도 부분 활성 또는 전체 활성을 회복하게 한다. 온전한(intact) RNase H의 활성의 약 30-100%면 충분할 수 있다. 저해 인자는 리간드 또는 화학적 변형일 수 있다. 리간드는 항체, 앱타머(aptamer), 수용체, 보조인자, 또는 킬레이트제일 수 있다. 리간드는 RNase H 효소의 활성 부위에 결합할 수 있고 이에 의해 효소 활성을 저해하거나 또는 RNase의 활성 부위부터 떨어진 부위에 결합할 수 있다. 일부 구체예에서, 리간드는 구조적 변화(conformational change)를 유도할 수 있다. 화학적 변형은 가교화(예를 들면, 포름알데히드에 의한 가교화) 또는 아실화일 수 있다. RNase H로부터 저해 인자의 방출 또는 분리는 커플링된 RNase H(불활성)를 포함하는 시료 또는 혼합물을 약 65℃ 내지 약 95℃ 또는 더 높은 온도로 가온하고, 및/또는 혼합물 또는 시료의 pH를 약 7.0 이하로 낮춤으로써 이루어질 수 있다.
본 명세서에서 사용된, '핫 스타트' RNase H 활성은 리간드와의 결합에 의해 조절될 수 있는 엔도뉴클레아제 촉매 활성을 갖는 본 명세서에 기재된 변형된 RNase H를 말한다. 허용적 조건 하에서, RNase H 엔도뉴클레아제 촉매 활성이 활성화되나 비-허용적 조건에서, 이 촉매 활성은 저해된다. 일부 구체예에서, 변형된 RNase H의 촉매 활성은 역전사에 적합한 온도, 즉 약 42℃에서 저해되고 PCR 반응에서 확인되는 더욱 상승된 온도, 즉 약 65℃ 내지 95℃에서 활성화될 수 있다. 이 특성을 갖는 변형된 RNase H는 "열 유도성(heat inducible)"인 것이다.
다른 구체예에서, 변형된 RNase H의 촉매 활성은 효소를 함유하는 용액의 pH를 변화시킴으로써 조절될 수 있다.
RNase H의 변형
RNase H 효소의 가교화는 예를 들면, 포름알데히드를 사용하여 수행될 수 있다. 일 구체예에서, 열안정성 RNase H가 포름알데히드를 사용한 제어되고 한정된 가교화에 적용된다. 활성 상태의 변형된 RNase H를 포함하는, 증폭 반응 조성물을 약 95℃ 이상의 온도까지 연장된 시간, 예를 들면 약 15분 동안 가온함으로써, 가교화는 역전되고 RNase H 활성이 회복된다.
일반적으로, 가교화의 정도가 더 낮을수록, 가교화의 역전 후에 효소의 엔도뉴클레아제 활성이 더 높다. 가교화의 정도는 포름알데히드의 농도와 가교화 반응의 지속기간을 달리함으로써 조절될 수 있다. 예를 들면, 약 0.2% (w/v), 약 0.4% (w/v), 약 0.6% (w/v), 또는 약 0.8% (w/v)의 포름알데히드가 RNase H 효소를 가교화시키는데 사용될 수 있다. 0.6% 포름알데히드를 사용한 약 10분의 가교화 반응은 피로코커스 푸리오서스(Pyrococcus furiosus)로부터의 RNase HII를 불활성화시키기에 충분할 수 있다.
가교화된 RNase H는 약 37℃에서 임의의 측정가능한 엔도뉴클레아제 활성을 보이지 않는다. 일부 경우에, 가교화된 RNase H의 측정가능한 부분적 재활성화가 PCR 변성 온도보다 더 낮은, 50℃ 부근의 온도에서 일어날 수 있다. 효소의 그러한 의도되지 않은 재활성화를 피하기 위해, 변형된 RNase H를 재활성화시킬 때까지 50℃ 미만의 온도로 보관 또는 유지하는 것이 요구될 수 있다.
일반적으로, PCR은 이중 가닥 표적 서열을 변성시키기 위해 각 사이클에서 약 95℃로 증폭 조성물을 가온하는 것을 요구하고 이는 또한 RNase H로부터 불활성화 인자들을 방출시켜, 효소의 활성을 부분적으로 또는 완전히 회복시킬 것이다.
RNase H는 또한 효소를 아실화제, 예를 들면, 디카르복실산을 사용한 리신 잔기의 아실화기킴으로써 변형될 수 있다. RNase H의 아실화는 아실화 버퍼 중 RNase H의 용액에 시스-아코니트산 무수물(cis-aconitic anhydride)을 첨가하고 결과인 혼합물을 약 1-20℃에서 5-30 시간 동안 인큐베이션함으로써 수행될 수 있다. 일 구체예에서, 아실화는 약 3-8℃에서 18-24 시간 동안 수행될 수 있다. 아실화 버퍼의 유형은 특별히 한정되지 않는다. 일 구체예에서, 아실화 버퍼는 약 7.5 내지 약 9.0의 pH를 갖는다.
아실화된 RNase H의 활성은 증폭 조성물의 pH를 약 7.0 이하로 낮춤으로써 회복될 수 있다. 예를 들면, Tris 버퍼가 완충제로 사용되는 경우, 조성물을 약 95℃로 가온시켜, 약 8.7(25℃에서) 내지 약 6.5(95℃에서)의 pH 저하를 야기할 수 있다.
증폭 반응 조성물에서 가온 단계의 지속시간은 변형된 RNase H, PCR에 사용된 버퍼 등에 따라 달라질 수 있다. 그러나, 일반적으로, 95℃로 약 30초 내지 4분 동안 증폭 조성물을 가온하는 것은 RNase H 활성을 회복시키기에 충분하다. 일 구체예에서, 상업적으로 이용가능한 버퍼 및 1종 이상의 비-이온성 계면활성제를 사용하여, 피로코커스 푸리오서스 ( Pyrococcus furiosus ) RNase HII의 전체 활성은 약 2 분의 가온 후에 회복된다.
RNase H 활성은 당업계에 잘 알려진 방법을 사용하여 결정될 수 있다. 예를 들면, 제1 방법에 따라, 단위 활성(unit activity)은 정의된 분석 조건 하에서 동일 몰의 폴리티미딜산의 존재 하에 특정 몰 수의 방사성 표지된 폴리아데닐산의 산-가용화(acid-solubilization)에 의해 정의된다(Epicentre Hybridase thermostable RNase HI 참조). 제2 방법에서, 단위 활성은 정의된 분석 조건 하에서 동일 몰 량의 프로브와 상보적인 주형 DNA를 포함하는 반응의 상대적 형광 강도의 특이적 증가의 용어로 정의된다.
다른 '핫 스타트' 뉴클레아제
다른 구체예에서, 핫 스타트 뉴클레아제는 '실질적으로 이중-가닥 올리고뉴클레오티드'은 절단할 수 있지만 증폭된 표적 핵산 서열 중에 발견되는 서열은 절단하지 않는, 유형 II 제한 효소와 같은, 열-유도성 열안정성 서열-특이적 엔도뉴클레아제일 수 있다.
다수의 열안정성 제한 효소가 극한성 미생물로부터 분리되었다. 예를 들면, 열안정성 제한 엔도뉴클레아제, PspGI는 피로코커스 속 스트레인 GI-H로부터 정제되었다. PspGI는 EcoRII의 동일전달제한효소(isoschizomer)이고 서열 5'CCWGG3' (W는 A 또는 T임) 중 최초 C 이전의 DNA를 절단한다. PspGI 절단은 65 내지 85℃에서 수행될 수 있다. 재조합 PspGI는 95℃에서 2 시간의 반감기를 갖는다.
특정 구체예에서, 열안정성 제한 효소는 그것을 비-허용적 온도에서 효소의 촉매 활성의 손실을 야기하는 저해 인자에 가역적으로 커플링하거나 가역적으로 결합시켜 '열 유도성'이 될 수 있다. 저해 인자는 리간드 또는 화학적 변형일 수 있다. 리간드는 항체, 앱타머, 수용체, 보조인자, 또는 킬레이트제일 수 있다. 리간드는 열안정성 제한 효소의 활성 부위에 결합함으로써 효소 활성을 저해할 수 있거나 또는 열안정성 제한 효소의 활성 부위로부터 떨어진 부위에 결합함으로써 촉매 활성을 저해할 수 있다. 일부 구체예에서, 리간드는 구조적(conformational) 변화를 유도할 수 있다. 다른 구체예에서, 제한 효소는 가교화(예를 들면, 포름알데히드에 의해) 또는 아실화에 의해 변형될 수 있다. 열안정성 제한 효소로부터 저해 인자의 방출 또는 분리(decoupling)는 커플링된 열안정성 제한 효소(불활성)를 함유하는 시료 또는 혼합물을 약 65℃ 내지 약 95℃ 이상의 온도로 가온함으로써 수행될 수 있다.
표적 핵산 서열의 PCR 증폭
핵산 증폭은 폴리머라제 연쇄 반응 (polymerase chain reaction: PCR), 핵산 서열 기초 증폭(nucleic acid sequence based amplification: NASBA), 리가제 연쇄 반응(ligase chain reaction: LCR), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification: SDA) 반응, 전사 매개 증폭(transcription mediated amplification: TMA) 반응 및 회전환 증폭(rolling circle amplification: RCA)을 포함하나, 이에 한정되지 않는 다양한 방법으로 수행될 수 있다. 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)이 특이적 표적 DNA 서열을 증폭하는 데 가장 흔히 사용되는 방법이다.
"폴리머라제 연쇄 반응(polymerase chain reaction)" 또는 "PCR"은 일반적으로 인 비트로에서 원하는 뉴클레오티드 서열의 증폭 방법을 말한다. 일반적으로, PCR 방법은 원하는 표적 서열(들)을 갖는 시료를 포함하는 반응 혼합물에 몰 과량의 2종 이상의 신장가능한 올리고뉴클레오티드 프라이머를 도입하는 단계로 구성되고, 이때 프라이머들은 이중 가닥 표적 서열의 반대 가닥에 상보적이다. 반응 혼합물은 DNA 폴리머라제의 존재에서 열 순환 프로그램이 적용되어, DNA 프라이머에 의해 인접된 원하는 표적 서열의 증폭을 야기한다.
PCR 기법은 PCR: A Practical Approach, M. J. McPherson, et al., IRL Press (1991), PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, by Innis, et al., Academic Press (1990), 및 PCR Technology: Principals and Applications for DNA Amplification, H. A. Erlich, Stockton Press (1989)를 포함하는, 수많은 문헌에 기재되어 있다. PCR은 또한 미국 특허 제4,683,195호; 제4,683,202호; 제4,800,159호; 제4,965,188호; 제4,889,818호; 제5,075,216호; 제5,079,352호; 제5,104,792호; 제5,023,171호; 제5,091,310호; 및 제5,066,584호를 포함하는, 많은 미국 특허에 기재되어 있고, 이들 각각은 본 명세서에 참조로서 포함된다.
용어 "시료(sample)"는 핵산 물질을 함유하는 임의의 물질을 말한다.
본 명세서에서 사용된, 용어 "PCR 단편(PCR fragment)" 또는 "역전사 효소-PCR 단편(reverse transcriptase-PCR fragment)" 또는 "앰플리콘(amplicon)"은 특정 표적 핵산의 증폭 다음에 생산된 폴리뉴클레오티드 분자 (또는 총괄적으로 복수의 분자들)를 말한다. PCR 단편은 보통 DNA PCR 단편이지만, 반드시 그런 것은 아니다. PCR 단편은 단일-가닥 또는 이중-가닥, 또는 임의의 농도 비율의 그의 혼합물일 수 있다. PCR 단편 또는 RT-PCR은 길이가 약 100개 내지 약 500개 뉴클레오티드 또는 그 이상일 수 있다.
"버퍼(buffer)"는 증폭 반응의 pH를 조절함으로써 증폭 반응의 1종 이상의 성분의 안정성, 활성, 및/또는 수명을 변형하는 증폭 반응에 첨가된 화합물이다. 본 발명의 완충제는 PCR 증폭 및 부위-특이적 RNase H 절단 활성과 양립가능하다. 특정 완충제가 당업계에 잘 알려져 있고 트리스(Tris), 트리신(Tricine), MOPS (3-(N-모르폴리노)프로판설폰산), 및 HEPES (4-(2-히드록시에틸)-1-피페라진에탄설폰산)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 또한, PCR 버퍼는 약 70 mM까지의 KCl 및 약 1.5 mM 이상의 MgCl2, 약 50 내지 200μM의 dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP 각각을 일반적으로 함유할 수 있다. 본 발명의 버퍼는 효율적인 역전사 효소-PCR 또는 PCR 반응을 최적화하기 위한 첨가제를 함유할 수 있다.
첨가제는 조성물의 1종 이상의 성분의 안정성, 활성, 및/또는 수명을 변형하는 조성물에 첨가된 화합물이다. 특정 구체예에서, 상기 조성물은 증폭 반응 조성물이다. 특정 구체예에서, 첨가제는 오염 효소를 불활성화시키고, 단백질 접힘을 안정화시키고, 및/또는 응집을 감소시킨다. 증폭 반응에 포함될 수 있는 예시적인 첨가제는 베타인, 포름아미드, KCl, CaCl2, MgOAc, MgCl2, NaCl, NH4OAc, NaI, Na(CO3)2, LiCl, MnOAc, NMP, 트레할로스, 디메틸설폭시드(dimethylsulfoxide: "DMSO"), 글리세롤, 에틸렌 글리콜, 디티오트레이톨(dithiothreitol: "DTT"), 피로포스파타제 (써모플라스마 아시도필럼 무기 피로포스파타제(Thermoplasma acidophilum inorganic pyrophosphatase: "TAP")를 포함하나, 이에 한정되지 않음), 소 혈청 알부민(bovine serum albumin: "BSA"), 프로필렌 글리콜, 글리신아미드, CHES, 퍼콜™, 아우린트리카르복실산, 트윈 20, 트윈 21, 트윈 40, 트윈 60, 트윈 85, 브리지(Brij) 30, NP-40, 트리톤 X-100, CHAPS, CHAPSO, 맥커니움(Mackernium), LDAO (N-도데실-N,N-디메틸아민-N-옥시드), Zwittergent 3-10, Xwittergent 3-14, Xwittergent SB 3-16, 엠피겐, NDSB-20, T4G32, 대장균 SSB, RecA, 패임 엔도뉴클레아제(nicking endonucleases), 7-데아자G, dUTP, UNG, 음이온성 디터전트, 양이온성 디터전트, 비-이온성 디터전트, 양쪽 이온성 디터전트(zwittergent), 스테롤, 삼투조절물질(osmolytes), 양이온, 및 증폭의 효율을 변경시킬 수 있는, 임의의 다른 화학물질, 단백질, 또는 보조인자(cofactor)를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 특정 구체예에서, 2종 이상의 첨가제가 증폭 반응에 포함된다. 본 발명에 따르면, 첨가제가 RNase H의 활성을 간섭하지 않는다면 프라이머 어닐링의 선택성을 증가시키기 위해 선택적으로 첨가될 수 있다.
역전사 효소- RNA 표적 핵산 서열의 PCR 증폭
유전자 발현을 연구하기 위해 가장 널리 사용되는 기법들 중 하나는 PCR에 의한 증폭을 위한 주형으로서 mRNA 서열(들)에 대한 제1가닥 cDNA를 사용하는 것이다.
용어 "역전사 효소 활성(reverse transcriptase activity)" 및 "역전사(reverse transcription)"는 RNA 가닥을 주형으로 사용하여 DNA 가닥(즉, 상보적 DNA, cDNA)을 합성할 수 있는 RNA-의존적 DNA 폴리머라제로 규명된 한 종류의 폴리머라제의 효소적 활성을 말한다.
"RNA PCR"의 "역전사 효소-PCR(Reverse transcriptase-PCR)"은 DNA-의존적 DNA 폴리머라제 프라이머 신장의 다수의 사이클 전에 먼저 단일 가닥 DNA 분자를 생성하기 위하여, RNA 주형 및 역전사 효소, 또는 역전사 효소 활성을 갖는 효소를 사용하는 PCR 반응이다. 멀티플렉스 PCR은 보통 단일 반응에서 3종 이상의 프라이머를 포함하여, 단일 반응에서 2종 이상의 증폭된 산물을 생산하는 PCR 반응을 말한다.
예시적인 역전사 효소는 미국 특허 제4,943,531호에 기재된 멀로니 뮤린 백혈병 바이러스 (Moloney murine leukemia virus: M-MLV) RT, 미국 특허 제5,405,776호에 기재된 RNase H 활성이 결여된 M-MLV-RT의 돌연변이 형태, 소 백혈병 바이러스,(bovine leukemia virus: BLV) RT, 라우스 육종 바이러스(Rous sarcoma virus: RSV) RT, 조류 골수아세포종 바이러스(Avian Myeloblastosis virus: AMV) RT 및 미국 특허 제7,883,871호에 개시된 역전사 효소를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
종점 또는 실시간 분석 중 어느 하나로 수행되는, 역전사 효소-PCR 방법은 2개의 분리된 분자 합성을 포함한다: (i) RNA 주형으로부터 cDNA의 합성; 및 (ii) PCR 증폭을 통해 새로 합성된 cDNA의 복제. 역전사 효소-PCR과 흔히 관련된 기술적 문제들을 해결하려고 시도하기 위해, 이 방법의 3개의 기본 단계를 고려하면서 다수의 프로토콜들이 개발되어 왔다: (a) RNA의 변성 및 역방향 프라이머의 혼성화; (b) cDNA의 합성; 및 (c) PCR 증폭. 소위 "연결되지 않은(uncoupled)" 역전사 효소-PCR 방법 (예를 들면, 2 단계 역전사 효소-PCR)에서, 역전사는 역전사 효소 활성을 위한 최적 버퍼 조건을 사용하는 독립적인 단계로 수행된다. cDNA 합성 후에, 반응액을 희석하여 MgCl2, 및 데옥시리보뉴클레오시드 트리포스페이트(dNTP) 농도를 Taq DNA 폴리머라제 활성을 위한 최적 조건까지 감소시키고, 표준 조건에 따라 PCR을 수행한다(U.S. 특허 제4,683,195호 및 제4,683,202호 참조). 대조적으로, "연결된(coupled)" 역전사 효소 PCR 방법은 역전사 효소 및 Taq DNA 폴리머라제 활성을 위해 최적화된 공통의 버퍼를 사용한다. 일 버전에서, 역방향 프라이머의 어닐닝은 효소를 첨가하기 이전의 분리된 단계이고, 그 후 효소는 단일 반응 용기에 첨가된다. 다른 버전에서, 역전사 효소 활성은 열안정성 Tth DNA 폴리머라제의 성분이다. 어닐링 및 cDNA 합성은 Mn2 +의 존재하에 수행되고 그 후 PCR은 킬레이트제로 Mn2 +를 제거한 후에 Mg2 +의 존재에서 실시된다. 마지막으로, "연속적인(continuous)" 방법 (예를 들면, 일 단계 역전사 효소-PCR)은 3개의 역전사 효소-PCR 단계들을 요소 또는 효소를 첨가하려고 반응 튜브를 여는 것을 피하는 단일 연속적인 반응으로 통합시킨다. 연속적인 역전사 효소-PCR은 초기 65℃ RNA 변성 단계가 생략될 수 있는 열안정성 Taq DNA 폴리머라제 Tth 활성을 사용하는 단일 효소 시스템과 AMV 역전사 효소 및 Taq DNA 폴리머라제를 사용한 이 효소 시스템(two enzyme system)으로 기재되어 왔다. RNA 변성 단계는 생략될 수 있다.
특정 구체예에서, 1종 이상의 프라이머가 표지될 수 있다. 본 명세서에서 사용된, "표지(label)", "검출가능한 표지(detectable label)", 또는 "마커(marker)" 또는 "검출가능한 마커(detectable marker)"는 본 명세서에서 호환가능하게 사용되고, 뉴클레오티드, 뉴클레오티드 중합체, 또는 핵산 결합 인자에 부착된 화학적 부분(chemical moiety)을 말하고, 부착은 공유 또는 비공유일 수 있다. 바람직하게는, 표지는 검출 가능하고 클레오티드 또는 뉴클레오티드 중합체가 본 발명의 실시자에게 검출될 수 있게 한다. 검출가능한 표지는 발광 분자, 화학 발광 분자, 형광 색소, 형광 소광제(quenching agents), 유색 분자, 방사성 동위원소 또는 신틸런트(scintillant)를 포함한다. 검출가능한 표지는 또한 (비오틴, 아비딘, 스트렙트아비딘, HRP, 단백질 A, 단백질 G, 항체 또는 그의 단편, Grb2, 폴리히스티딘, Ni2 +, FLAG 태그, myc 태그와 같은) 임의의 유용한 링커 분자, 중금속, 효소(예를 들면 알칼리 포스파타제, 퍼옥시다제 및 루시퍼라제를 포함함), 전자 공여체/수용체, 아크리디늄 에스테르, 염료 및 열량 측정 기질(calorimetric substance)을 포함한다. 또한 표면 플라스몬 공명 검출의 경우와 같이, 질량의 변화가 검출가능한 표지로 간주될 수 있다는 것이 고려된다. 당업자는 전술되지 않은 유용한 검출가능한 표지를 용이하게 인식할 수 있을 것이고, 그들은 본 발명의 실시에 사용될 수 있을 것이다.
일 단계 역전사 효소-PCR은 연결되지 않은 역전사 효소-PCR에 비해 몇가지 장점을 제공한다. 일 단계 역전사 효소-PCR은 연결되지 않은 역전사 효소-PCR보다 반응 혼합물 시약 및 핵산 산물의 조작(예를 들면, 두 개의 반응 단계 사이에서 요소 또는 효소의 첨가를 위해 반응 튜브를 여는 것)을 덜 요구하고, 그러므로 덜 노동집약적이고, 요구되는 인시(person hours)의 수를 감소시킨다. 또한 일 단계 역전사 효소-PCR는 시료를 덜 요구하여, 오염의 위험을 감소시킨다. 일-단계 역전사 효소-PCR의 민감도 및 특이성은 주어진 시료 중 하나 내지 수개의 유전자의 발현 수준 또는 병원균 RNA의 검출을 연구하는데 적합한 것으로 증명되었다. 보통, 이 방법은 cDNA 합성을 개시하기 위한 유전자-특이적 프라이머의 사용에 한정된다.
이러한 역전사 효소-PCR 기법과 조합된 온-라인 검출에 의한 PCR 반응의 반응 속도를 측정하는 능력은 높은 민감도를 갖는 RNA 카피수의 정확하고 정밀한 정량을 가능하게 했다. 이것은 하기에서 논의된, 5' 형광성 뉴클레아제 분석("TaqMan™") 또는 엔도뉴클레아제 분석("CataCleave™")과 같은, 형광 이중-표지 혼성화 프로브 기법에 의한 증폭 과정 동안 형광 모니터링을 통한 역전사 효소-PCR 산물의 검출 및 PCR 산물의 측정에 의해 가능하게 된다.
카타클리브 ( CataCleave )™ 프로브를 사용한 실시간- PCR
증폭 후 앰플리콘 검출은 노동집약적인 힘들면서 시간이 소요된다. 실시간 방법은 PCR 방법 동안 증폭을 모니터링하도록 개발되었다. 이 방법은 보통 새로 합성된 DNA에 결합하는 형광 표지된 프로브 또는 이중 가닥 DNA로 끼어 들어가면 형광 방출(emission)가 증가되는 염료를 사용한다. 실시간 검출 방법론은 게놈 DNA 또는 게놈 RNA 중 표적 핵산 서열의 PCR 검출에 적용가능하다.
프로브는 일반적으로 표적이 없으면 두 개의 발색단 사이의 형광 공명 에너지 이동(fluorescence resonance energy transfer: FRET)에 의하여 공여체 방출가 소광(quench)되도록 디자인된다. 공여체 발색단은 여기 상태(excited state)에서, 그 쌍이 가까운 거리에 있으면 수용체 발색단으로 에너지를 전달할 수 있다. 이러한 전달은 항상 비-방사성이고 쌍극자-쌍극자 결합을 통하여 일어난다. 발색단들 간의 거리를 충분히 증가시키는 임의의 과정은 FRET 효율을 감소시켜서 공여체 발색단 방출가 방사성으로 검출될 수 있다. 일반적인 수용체 발색단은 FAM, TAMRA, VIC, JOE, Cy3, Cy5, 및 텍사스 레드를 포함한다. 수용체 발색단은 그의 여기 스펙트럼이 공여체의 방출 스펙트럼과 겹치도록 선택된다. 이러한 쌍의 예는 FAM-TAMRA이다. 또한 광범위한 공여체를 소광시킬 비 형광 수용체가 있다. 적절한 공여체-수용체 FRET 쌍의 다른 예는 당업자에게 잘 알려져 있을 것이다.
PCR의 실시간 검출에 사용될 수 있는 FRET 프로브들의 일반적인 예는 분자 비콘(molecular beacon)(예를 들면, 미국 특허 제5,925,517호), TaqMan™ 프로브(예를 들면, 미국 특허 제5,210,015호 및 제5,487,972호), 및 카타클리브™ 프로브(예를 들면, 미국 특허 제5,763,181호)를 포함한다. 분자 비콘은 결합하지 않은 상태에서는 프로브가 공여체와 수용체 발색단이 가까이 위치하여 공여체 방출이 감소되는 이차 구조를 형성하도록 디자인된 단일 가닥 올리고뉴클레오티드이다. 적절한 반응 온도에서 비콘은 언폴딩(unfolding)되고 앰플리콘에 특이적으로 결합한다. 언폴딩되면 공여체와 수용체 발색단 사이의 거리가 증가하여 FRET이 역전되고 공여체 방출이 특화된 기기를 사용하여 모니터링될 수 있다. TaqMan™ 및 카타클리브™ 기술은 사용된 FRET 프로브가 절단되어 공여체와 수용체 발색단이 충분히 떨어져 FRET을 역전시킨다는 점에서 분자 비콘과 다르다.
TaqMan™ 기술은 5' 말단이 공여체 발색단으로 표지되고 3' 말단이 수용체 발색단으로 표지된 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용한다. 증폭에 사용된 DNA 폴리머라제는 5'->3' 엑소뉴클레아제 활성을 포함해야 한다. TaqMan™ 프로브는 프라이머가 결합하는 것과 동시에 앰플리콘의 한 가닥에 결합한다. DNA 폴리머라제가 프라이머를 신장시키면 폴리머라제는 결국에는 결합된 TaqMan™ 프로브와 마주치게 될 것이다. 이때 폴리머라제의 엑소뉴클레아제 활성은 TaqMan™ 프로브를 5' 말단에서 시작하여 순차적으로 분해할 것이다. 프로브가 분해되면 상기 프로브를 구성하는 모노뉴클레오티드들은 반응 버퍼로 방출된다. 공여체가 수용체로부터 멀리 확산되고 FRET은 역전된다. 공여체로부터의 방출는 프로브 절단을 확인하기 위해 모니터링된다. TaqMan™이 작용하는 방식 때문에 특정 앰플리콘이 PCR의 매 사이클 마다 한번씩만 검출될 수 있다. TaqMan™ 표적 부위까지 통한 프라이머의 연장은 앰플리콘이 다음 PCR 사이클에서 변성될 때까지 TaqMan™ 프로브의 추가 결합을 막는 이중 가닥 산물을 생성한다.
그 내용이 본 명세서에서 참조로서 포함된, 미국 특허 제5,763,181호는 다른 실시간 검출 방법(본 명세서에서 "카타클리브(CataCleave)™"로 언급됨)을 기재한다. 카타클리브™ 기술은 프로브의 절단이 폴리머라제 활성을 갖지 않는 제2 효소에 의해 수행된다는 점에서 TaqMan™과 다르다. 카타클리브™ 프로브는 예를 들면 제한 효소 또는 RNase와 같은, 엔도뉴클레아제의 표적인 분자 내에 서열을 갖는다. 일 예에서, 카타클리브™ 프로브는 프로브의 5' 및 3' 말단이 DNA로 구성되고 절단 부위가 RNA를 함유하는 키메라 구조를 갖는다. 프로브의 DNA 서열 부분은 양 말단이나 또는 내부에서 FRET 쌍으로 표지된다. PCR 반응은 RNA-DNA 듀플렉스의 RNA 서열 부분을 특이적으로 절단할 수 있는 열안정성 RNase H 효소를 포함한다. 절단 후, 프로브의 두 개의 반쪽은 반응 온도에서 표적 앰플리콘으로부터 해리되고 반응 버퍼로 확산된다. 공여체 및 수용체가 분리되면 FRET은 TaqMan™ 프로브와 같은 방식으로 역전되고 공여체 방출가 모니터링될 수 있다. 절단과 해리는 추가적인 카타클리브™ 결합을 위한 부위를 재생한다. 이러한 방식으로 프라이머가 카타클리브™ 프로브 결합 부위까지 신장될 때까지 단일 앰플리콘이 복수회의 프로브 절단의 표적으로 작용하는 것이 가능하다.
카타클리브 ™ 프로브의 표지화
용어 "프로브(probe)"는 특이적 핵산 서열 예를 들면, 표적 핵산 서열의 상보적인 영역과 서열-특이적인 방식으로 혼성화하도록 디자인된 특이적 부분을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일 구체예에서, 올리고뉴클레오티드 프로브는 길이가 15-60개 뉴클레오티드의 범위이다. 보다 바람직하게는, 올리고뉴클레오티드 프로브는 길이가 18-30개 뉴클레오티드의 범위이다. 본 발명의 올리고뉴클레오티드 프로브의 정확한 서열과 길이는 프로브가 결합하는 표적 폴리뉴클레오티드의 속성에 부분적으로 의존한다. 특정한 구체예에서 적절한 어닐링 및 융해 특성을 달성하기 위해 결합 위치와 길이가 달라질 수 있다. 이러한 디자인 선택을 하기 위한 지침은 미국 특허 제5,763,181호, 제6,787,304호, 및 제7,112,422호에 기재된, Taqman™ 분석 또는 카타클리브™를 기재하는 다수의 참조 문헌에서 확인될 수 있고, 그 내용은 전체로서 본 명세서에 참조로 포함된다.
특정 구체예에서, 프로브는 표적 핵산 서열에 "실질적으로 상보적(substantially complementary)"이다.
본 명세서 사용된, 용어 "실질적으로 상보적인(substantially complementary)"은 서열이 충분히 상보적이어서 어닐링하고 안정한 듀플렉스를 형성하는 두 개의 핵산 가닥들을 말한다. 상보성이 완벽할 필요는 없다; 예를 들면, 두 핵산들 사이에 많은 수의 염기쌍 미스매치(mismatch)가 있을 수 있다. 그러나, 미스매치의 수가 너무 커서 가장 덜 엄격한 혼성화 조건 하에서조차 혼성화가 일어날 수 없다면, 그 서열은 실질적으로 상보적인 서열이 아니다. 본 명세서에서 두 서열들이 "실질적으로 상보적인(substantially complementary)" 것으로 언급되는 경우에는, 서열들이 서로 충분히 상보적이어서 선택된 반응 조건 하에서 혼성화한다는 것을 의미한다. 특이성을 이루기에 충분한 핵산 상보성과 혼성화의 엄격성의 관계는 당업계에 잘 알려져 있다. 두 개의 실질적으로 상보적인 가닥들은 예를 들면, 완벽하게 상보적일 수 있거나 혼성화 조건이 예를 들면, 쌍을 형성하는 서열 및 서열을 형성하지 않는 서열 간의 구별을 가능하게 할 정도로 충분하기만 한다면, 1개 내지 수개의 미스매치까지 포함할 수 있다. 따라서, "실질적으로 상보적인(substantially complementary)" 서열은 이중 가닥 영역에서 100, 95, 90, 80, 75, 70, 60, 50 퍼센트 또는 그 이하, 또는 그 사이의 임의의 수의 염기쌍 상보성을 갖는 서열이라고 말할 수 있다.
본 명세서에서 사용된, "선택된 영역(selected region)"은 프로브의 RNA 서열과 어닐링하는 표적 DNA 또는 cDNA의 폴리뉴클레오티드 서열을 말한다. 일 구체예에서, 표적 DNA 또는 cDNA의 "선택된 영역(selected region)"은 길이가 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25개 또는 그 이상의 뉴클레오티드로 이루어질 수 있다.
본 명세서에서 사용된, 부위-특이적 RNase H 절단은 표적 DNA 서열에 전부 상보적이고 표적화된 DNA 서열과 혼성화하여 RNA:DNA 헤테로듀플렉스를 형성하는 카타클리브™ 프로브의 RNA 부분의 절단을 말한다.
본 명세서에서 사용된, 카타클리브™ 프로브의 "표지(label)" 또는 "검출가능한 표지(detectable label)"는 공유 또는 비공유 수단에 의해 프로브에 부착된 형광 색소 화합물을 포함하는 임의의 표지를 말한다.
본 명세서에서 사용된, "형광 색소(fluorochrome)"는 방출되는 빛보다 더 짧은 파장의 빛에 의한 여기(excitation)로 빛을 방출하는 형광 화합물을 말한다. 용어 "형광 공여체(fluorescent donor 또는 fluorescence donor)"는 본 발명에 기재된 분석에서 측정되는 빛을 방출하는 형광 색소를 말한다. 더 구체적으로, 형광 공여체는 형광 수용체에 의해 흡수되는 빛을 제공한다. 용어 "형광 수용체(fluorescent acceptor 또는 fluorescence acceptor)"는 형광 공여체로부터 방출된 에너지를 흡수하는 제2 형광 색소 또는 소광 분자를 말한다. 제2 형광 색소는 형광 공여체로부터 방출된 에너지를 흡수하고 형광 공여체에 의해 방출된 빛보다 더 긴 파장의 빛을 방출한다. 소광 분자는 형광 공여체에 의해 방출된 에너지를 흡수한다.
임의의 발광 분자, 바람직하게는 형광 색소 및/또는 형광 소광제(quencher)가 본 발명의 실시에 사용될 수 있고, 예를 들면, 알렉사 플루오르(Alexa Fluor)™ 350, 알렉사 플루오르™ 430, 알렉사 플루오르™ 488, 알렉사 플루오르™ 532, 알렉사 플루오르™ 546, 알렉사 플루오르™ 568, 알렉사 플루오르™ 594, 알렉사 플루오르™ 633, 알렉사 플루오르™ 647, 알렉사 플루오르™ 660, 알렉사 플루오르™ 680, 7-디에틸아미노쿠마린-3-카르복실산, 플루오레세인, 오레곤 그린 488, 오레곤 그린 514, 테트라메틸로다민, 로다민 X, 텍사스 레드 염료, QSY 7, QSY33, 댑실(Dabcyl), 보디피(BODIPY) FL, 보디피 630/650, 보디피 650/665, 보디피 TMR-X, 보디피 TR-X, 디알킬아미노쿠마린, Cy5.5, Cy5, Cy3.5, Cy3, DTPA(Eu3 +)-AMCA 및 TTHA(Eu3+)AMCA를 포함한다.
일 구체예에서, 올리고뉴클레오티드 프로브의 3' 터미날 뉴클레오티드는 차단되어 있거나 또는 핵산 폴리머라제에 의해 신장되지 못하도록 되어 있다. 이러한 차단(blocking)은 프로브의 터미날 3' 위치에 리포터 또는 소광제 분자를 부착함으로써 편리하게 실시된다.
일 구체예에서, 리포터 분자는 연결 부분(linking moiety)을 통해 프로브의 터미날 3' 말단 또는 터미날 5' 말단에 부착되도록 유도체화된 형광 유기 염료이다. 바람직하게는, 소광제 분자는 또한 유기 염료이고, 이 유기 염료는 본 발명의 구체예에 따라, 형광일 수 있거나 형광이 아닐 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 바람직한 구체예에서, 소광제 분자는 형광이다. 일반적으로 소광제 분자가 형광이거나 또는 비-방사성 분해에 의하여 리포터로부터 전달된 에너지를 단순히 방출하는지 여부에 관계없이, 소광제의 흡수 밴드가 리포터 분자의 형광 방출 밴드와 실질적으로 중첩되어야 한다. 여기된 리포터 분자로부터 에너지를 흡수하지만, 방사성으로 그 에너지를 방출하지 않는, 비-형광 소광제 분자는 발색성 분자로 본 출원에서 언급된다.
예시적인 리포터-소광제 쌍은 플루오레세인을 포함한 크산텐 염료, 및 로다민 염료들로부터 선택될 수 있다. 이러한 화합물들의 많은 적절한 형태들이 결합 부위로서 또는 올리고뉴클레오티드로의 부착을 위한 결합 관능기(bonding functionality)로 사용될 수 있는 그의 페닐 부분에 치환기를 갖는 것으로 폭넓게 상업적으로 이용가능하다. 형광 화합물의 다른 그룹은 알파 또는 베타 위치에 아미노기를 갖는, 나프틸아민이다. 이러한 나프틸아미노 화합물에 포함되는 것은 1-디메틸아미노나프틸-5-설포네이트, 1-아닐리노-8-나프탈렌 설포네이트 및 2-p-토우이디닐6-나프탈렌 설포네이트이다. 다른 염료는 3-페닐-7-이소시아나토쿠마린, 9-이소티오시아나토아크리딘 및 아크리딘 오렌지와 같은 아크리딘, N-(p-(2-벤즈옥사졸릴)페닐)말레이미드, 벤즈옥사디아졸, 스틸벤, 피렌 등을 포함한다.
일 구체예에서, 리포터 및 소광제 분자는 플루오레세인 및 로다민 염료로부터 선택된다.
하기 참고 문헌에 의하여 예시된 바와 같이, 올리고뉴클레오티드의 5' 또는 3' 터미날에 리포터 또는 소광제 분자를 부착하기 위한 많은 결합 부분(linking moiety) 및 방법론들이 존재한다: Eckstein, 편집자, Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach (IRL Press, Oxford, 1991); Zuckerman et al., Nucleic Acids Research, 15: 5305-5321 (1987) (올리고뉴클레오티드의 3' 티올기); Sharma et al., Nucleic Acids Research, 19: 3019 (1991) (3' 설프히드릴); Giusti et al., PCR Methods and Applications, 2: 223-227 (1993) 및 Fung et al., U.S. Pat. No. 4,757,141 (캘리포니아, 포스터 시, Applied Biosystems로부터 이용가능한 Aminolink™. II를 통한 5' 포스포아미노기) Stabinsky, U.S. Pat. No. 4,739,044 (3' 아미노알킬포스포릴기); Agrawal et al., Tetrahedron Letters, 31: 1543-1546 (1990) (포스포르아미데이트 결합을 통한 부착); Sproat et al., Nucleic Acids Research, 15: 4837 (1987) (5' 머캅토기); Nelson et al., Nucleic Acids Research, 17: 7187-7194 (1989) (3' 아미노 기) 등.
로다민 및 플루오레세인 염료는 또한 예를 들면, Woo et al., 미국 특허 제5,231,191호; 및 Hobbs, Jr., 미국 특허 제4,997,928호에서, 포스포르아미디트 부분에 의해 유도체화된 염료에 의해 고체상 합성의 완료시 올리고뉴클레오티드의 5' 히드록실에 편리하게 부착된다.
고체 지지체에 카타클리브 ™ 프로브의 부착
일 구체예에서, 올리고뉴클레오티드 프로브는 고체 지지체에 부착될 수 있다. 상이한 프로브들이 고체 지지체에 부착될 수 있고 시료 중 다른 표적 서열들을 동시에 검출하는데 사용될 수 있다. 다른 형광 파장을 갖는 리포터 분자들이 상이한 프로브에 사용되어, 상이한 프로브들로의 혼성화가 별개로 검출될 수 있게 한다.
올리고뉴클레오티드 프로브의 고정을 위한 고체 지지체의 바람직한 유형의 예는 유리 판, 폴리스티렌, 아비딘 코팅된 폴리스티렌 비드, 셀룰로오스, 나일론, 아크릴아미드 겔 및 활성화된 덱스트란, 제어된 공극 유리(controlled pore glass, CPG), 유리판 및 고 가교된 폴리스티렌(high cross-linked polystyrene)을 포함한다. 이러한 고체 지지체는 그의 화학적 안정성, 관능화(functionalization)의 용이성 및 잘 정의된 표면적(surface area) 때문에 혼성화 및 진단 연구에 바람직하다. 제어된 공극 유리(500 Å, 1000 Å) 및 비-팽창성(non-swelling) 고 가교된 폴리스티렌(1000 Å)과 같은 고체 지지체가 올리고뉴클레오티드 합성과의 적합성(compatibility)을 고려하면 특히 바람직하다.
올리고뉴클레오티드 프로브는 다양한 방식으로 고체 지지체에 부착할 수 있다. 예를 들면, 프로브는 프로브의 3' 또는 5' 말단 뉴클레오티드의 고체 지지체로의 부착에 의해 고체 지지체에 부착될 수 있다. 그러나, 프로브를 상기 고체 지지체로부터 이격시키는 작용을 하는 링커에 의해 프로브가 고체 지지체에 부착될 수 있다. 링커는 가장 바람직하게는 길이가 30개 이상의 원자이고, 보다 바람직하게는 길이가 50개 이상의 원자이다.
고체 지지체에 고정된 프로브의 혼성화는 일반적으로 프로브가 고체 지지체로부터 30개 이상의 원자, 보다 바람직하게는 50개 이상의 원자만큼 분리될 것을 요구한다. 이러한 분리를 이루기 위해, 링커는 일반적으로 링커와 3' 뉴클레오시드 사이에 위치한 스페이서(spacer)를 포함한다. 올리고뉴클레오티드 합성을 위해, 링커 암(linker arm)은 대개 고체 지지체로부터 올리고뉴클레오티드를 유리시키기 위해 염기성 시약에 의해 절단될 수 있는 에스테르 결합에 의해 3' 뉴클레오시드의 3'-OH에 부착된다.
올리고뉴클레오티드를 고체 지지체에 부착시키는데 사용될 수 있는 광범위하게 다양한 링커들이 당업계에 알려져 있다. 링커는 고체 지지체에 부착된 프로브로의 표적 서열의 혼성화를 현저하게 간섭하지 않는 화합물로 형성될 수 있다. 링커는 자동화된 합성에 의해 링커에 용이하게 첨가될 수 있는 단일 중합체(homopolymeric) 올리고뉴클레오티드로 형성될 수 있다. 대안적으로, 관능화된 (functionalized) 폴리에틸렌 글리콜과 같은 중합체가 링커로 사용될 수 있다. 그러한 중합체는 프로브의 표적 올리고뉴클레오티드로의 혼성화를 현저하게 간섭하지 않기 때문에 단일 중합체(homopolymeric) 올리고뉴클레오티드보다 바람직하다. 폴리에틸렌 글리콜은 상업적으로 이용가능하고, 유성 및 수성 매질에서 용해가능하며, 관능화하기 쉬우며, 올리고뉴클레오티드 합성 및 합성 후(post-synthesis) 조건 하에서 완전히 안정하기 때문에 특히 바람직하다.
고체 지지체, 링커 및 프로브 간의 결합은 바람직하게는 고온에서 염기성 조건 하에서 염기 보호기의 제거 동안 절단되지 않는다. 바람직한 결합의 예는 카르바메이트 및 아미드 결합을 포함한다. 프로브의 고정은 당업계에 잘 알려져 있고 당업자는 고정 조건을 결정할 수 있다.
본 방법의 일 구체예에 따라, 카타클리브™ 프로브가 고체 지지체에 고정된다. 카타클리브™ 프로브는 검출가능한 표지 및 DNA 및 RNA 핵산 서열을 포함하고, 프로브의 RNA 핵산 서열은 표적 DNA 서열의 선택된 영역에 전부 상보적이고 프로브의 DNA 핵산 서열은 표적 DNA 서열의 선택된 영역에 인접한 DNA 서열에 실질적으로 상보적이다. 그 다음 프로브는 RNase H의 존재 및 프로브 내의 RNA 서열이 PCR 단편 중 상보적인 DNA 서열과 RNA:DNA 헤테로듀플렉스를 형성할 수 있는 조건 하에서 핵산의 시료와 접촉된다. RNA:DNA 헤테로듀플렉스 내 RNA 서열의 RNase H 절단은 프로브의 표지로부터 신호 방출의 실시간 증가를 야기하고, 신호의 증가는 표적 DNA 서열의 존재를 나타낸다.
본 방법의 또 다른 구체예에 따라, 고체 지지체에 고정된, 카타클리브™ 프로브는 검출가능한 표지 및 DNA 및 RNA 핵산 서열을 포함하고, 프로브의 RNA 핵산 서열은 표적 DNA 서열의 선택된 영역에 전부 상보적이고 프로브의 DNA 핵산 서열은 표적 DNA 서열의 선택된 영역에 인접한 DNA 서열에 실질적으로 상보적이다. 그 다음 프로브는 RNase H의 존재 및 프로브 중 RNA 서열이 PCR 단편 내 상보적인 DNA 서열과 RNA:DNA 헤테로듀플렉스를 형성할 수 있는 조건 하에서 핵산의 시료와 접촉된다. RNA:DNA 헤테로듀플렉스 내 RNA 서열의 RNase H 절단은 프로브 상의 표지로부터의 신호 방출의 실시간 증가를 야기한다.
프로브의 고체 지지체로의 고정은 프로브에 혼성화된 표적 서열을 시료로부터 용이하게 단리할 수 있게 한다. 이후 단계에서, 단리된 표적 서열은 고체 지지체로부터 분리되고 연구자의 특정한 요구에 따라 당업계에서 잘 알려진 방법으로 가공(예를 들면, 정제, 증폭)된다.
키트
본 명세서의 개시는 또한 고위험 HPV 표적 핵산 서열의 실시간 PCR 검출을 위한 1종 이상의 시약을 갖는 포장 단위를 포함하는 키트 형태(kit format)를 제공한다. 또한 키트는 하기의 품목 중 하나 이상 포함할 수 있다: 버퍼, 설명서, 및 양성 또는 음성 대조군. 키트는 본 명세서에 기재된 방법을 수행하기 위해 적절한 비율로 함께 혼합된 시약들의 용기들을 포함할 수 있다. 시약 용기들은 바람직하게는 본 방법을 수행할 때 측정하는 단계를 제거하는 단위 양의 시약을 포함한다.
또한 키트는 열안정성 핵산 폴리머라제, 핫 스타트 열안정성 RNase H, RNase H에 의해 절단가능한 1개 이상의 RNA:DNA 염기쌍을 포함하는 실질적으로 이중 가닥 올리고뉴클레오티드, 표적 핵산 서열을 증폭하기 위해 선택된 프라이머 및 본 명세서에 기재된 방법론에 따라 실시간 PCR 산물에 어닐링하고 표적 핵산 서열의 정량적 검출을 가능하게 하는 표지된 카타클리브™ 올리고뉴클레오티드 프로브를 포함하나, 이에 한정되지 않는, 실시간 PCR을 위한 시약을 포함할 수 있다.
다른 구체예에서, 키트 시약은 생물학적 시료로부터 게놈 DNA 또는 RNA를 추출하기 위한 시약을 추가로 포함한다. 키트 시약은 또한 적용할 수 있는 경우 역전사 효소-PCR 분석을 위한 시약을 포함할 수 있다.
본 명세서에서 개시한 임의의 특허, 특허 출원, 문헌, 또는 그 외 개시 자료는 그 전체로 본 명세서에 참조로서 포함된다. 본 명세서에서 참조로서 포함되나, 본 명세서에 기재된 정의, 진술 또는 기타 개시 자료와 모순되는 임의의 자료 또는 그의 일부는, 포함된 자료와 본 명세서의 개시 자료가 모순되지 않는 정도로만 포함된다.
실시예
하기의 실시예는 본 발명에 따른 핫 스타트 조성물을 사용하는 방법을 제시한다. 본 실시예에 기재된 방법의 단계들은 한정하는 것으로 의도되지 않은 것으로 이해된다. 전술된 것 이외에 본 발명의 추가적인 목적 및 장점은 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 의도되지 않는 실시예로부터 명백하게 될 것이다.
실시예 1: 절단가능 및 비-절단가능한 올리고뉴클레오티드 저해제를 사용한 폴리머라제 활성
Taq DNA 폴리머라제 활성을 저해하기 위한 핵산 분자의 능력을 프라이머 연장 반응으로 시험하였다. 주형으로 M13 단일 가닥 파지 DNA를 사용하여 M13 특이적 프라이머 UPLong1(서열 번호 1)을 신장하기 위해 Taq DNA 폴리머라제를 사용하였다. 두가지 형태의 올리고뉴클레오티드 저해제를 본 실험에 사용하였다. T-Pin 1(서열 번호 2)는 전부 DNA로 이루어졌고 활성 RNAse HII에 의해 절단가능하지 않다. T-Pin 4(서열 번호 3)은 활성 RNAse HII에 의하여 절단가능한 T-Pin1(서열 번호 2) 올리고뉴클레오티드를 만드는 두 개의 RNA 염기의 치환을 갖는 T-Pin 1과 동일한 염기 서열을 함유하였다. 시험 시료는 Taq 폴리머라제(도 1, A), Taq 폴리머라제 + T-Pin 1(서열 번호 2)(도 1, B) 및 Taq 폴리머라제 + T-Pin 4(서열 번호 3)(도 1, C)를 포함하였다. 핫 스타트 RNase HII이 없는 경우(도 1, 검정 막대) 및 핫 스타트 RNase HII이 존재하는 경우(도 1, 흰색 막대)에 효소 활성을 시험하였다.각 시험 조건은 시간의 경과에 따라 폴리머라제 활성을 모니터링하는데 사용된 7회의 중복 반응물을 구성한다. 25 ㎕의 프라이머 연장 반응물 중 각 성분의 최종 농도는 하기와 같다:
1x PCR 버퍼, 24 nM UpLong 1(서열 번호 1), 200 ng M13 ss DNA, 0.2 mM dATP, 0.2 mM dGTP, 0.2 mM dCTP, 0.4 mM dUTP.
선택된 반응물은 5U RNase HII를 함유하였다. 1x PCR 버퍼 중 20 pmol 올리고뉴클레오티드 저해제/단위 효소를 포함하거나 또는 포함하지 않고 Taq DNA 폴리머라제를 미리 인큐베이션 시켰다. 0.25 U Taq을 첨가하여 프라이머 연장 반응을 개시시켰다. 95℃에서 5분 후 50℃에서 30분 동안 반응물을 인큐베이션시켰다. 반응이 50℃에 도달한 후에, 복제물 중 하나를 2.5 ㎕의 250 mM EDTA를 첨가하여 반응을 정지시킴으로써 총 30분 동안 매 5분에 샘플링하였다. 1:3000 희석의 피코 그린(Pico Green) 50 ㎕를 각 시료에 첨가하고 각 시료의 형광 방출을 10 초/사이클로 10 사이클 동안 Roche LightCycler 480으로 모니터링하였다. 상대적인 Taq 활성은 각 시료 세트에 대해 생성된 회귀 곡선의 기울기로 산출하였다.
도 1에 언급된, T-Pin 1(서열 번호 2; B 검정 막대) 또는 T-Pin 4(서열 번호 3; C 검정 막대) 중 하나를 함유한 반응물은 Taq 폴리머라제 저해의 가역적 성질 때문에 RNase HII가 존재하지 않는 경우에는 가온 후 Taq 폴리머라제의 활성이 감소된 것을 나타내었다.
그러나, 핫 스타트 RNAse HII가 반응물에 첨가된 경우에는 활성 초기 Taq 폴리머라제를 만드는 초기 95℃ 가온 단계 후에 T-Pin 4(서열 번호 3)가 절단되었다(C, 흰색 막대). T-Pin 1은 활성화된 RNase HII에 의해 절단될 수 없었기 때문에 T-Pin 1(서열 번호 2)는 RNase HII가 존재하는 경우에도 Taq 폴리머라제를 계속 저해하였다(B, 흰색 막대).
실시예 2: 절단가능한 올리고뉴클레오티드 저해제의 프라이머 이량체 형성의 억제
핫 스타트 Taq 폴리머라제는 프라이머 이량체 형성을 억제하는 것으로 알려져 있다. 이것은 반응이 이량체 형성에 대부분 민감한 경우 그 폴리머라제가 저온에서 불활성이라는 사실 때문이다. 프라이머 이량체 형성을 저항하는 다양한 형태의 Taq DNA 폴리머라제의 능력을 프라이머 이량체를 형성하는 것으로 알려진 프라이머를 사용하여 DNA 주형 없이 PCR 반응을 수행함으로써 시험하였다. Taq 및 T-Pin 4(서열 번호 3)를 40 pmol 저해제/효소 U의 비율로 미리 혼합하였다. PCR 반응물 중 각 성분의 최종 농도는 하기와 같다:
1x PCR 버퍼, 500 nM Bac-F3(서열 번호 4), 500 nM Bac-R10(서열 번호 5), 200 nM Bac-프로브3(서열 번호 6), 80 μM dATP, 80 μM dGTP, 80 μM dCTP, 160 μM dUTP, 2.5 U Taq 및 1:12500 희석의 SYBR 그린. 선택된 반응은 2.5 U RNase HII를 함유하였다.
하기 사이클링 프로토콜을 사용하여 PCR 반응을 수행하였다:
Figure pat00002
각 시험 조건은 8개의 반복 시료로 수행하였다. 프라이머 이량체의 형성을 나타내는 평균 Cp를 각 시험 조건에 대해 비교하였다. 비-핫스타트 Taq으로의 증폭(표1, A)과 비교하면 T-Pin 4(서열 번호 3)(표 1, C)는 프라이머 이량체 형성을 평균 7 PCR 사이클 지연시켰다(표 1, C). T-Pin 4(서열 번호 3)를 사용한 프라이머 이량체 형성의 지연은 핫스타트 Taq 폴리머라제를 기초한 상업적으로 이용가능한 항체로 달성된 것과 비슷하다(표 1, B 및 C).
Figure pat00003
실시예 3: 절단가능한 올리고뉴클레오티드 저해제를 사용한 PCR 증폭
ripX 유전자 서열의 부분을 함유하는 플라스미드 DNA를 다양한 형태의 핫스타트 Taq 폴리머라제를 비교하는 PCR 반응으로 증폭하였다. 대략 64 ng/㎕의 스톡 플라스미드를 초기에 200 pg/㎕로 희석하였다. 64 pg/㎕로부터 0.64 fg/㎕로 추가로 10배 순차 희석하였다. 2 ㎕의 각 플라스미드 희석을 PCR 주형으로 사용하였다. Taq 및 T-Pin 4(서열 번호 3)을 40 pmol 저해제/U 효소의 비율로 미리 혼합하였다. PCR 반응물 중 각 성분의 최종 농도는 하기와 같다: 1x PCR 버퍼, 500 nM Bac-F3(서열 번호 4), 500 nM Bac-R10(서열 번호 5), 200 nM Bac-프로브3(서열 번호 6), 80 μM dATP, 80 μM dGTP, 80 μM dCTP, 160 μM dUTP, 2.5 U Taq. 선택된 반응은 2.5 U RNase HII를 함유하였다.
하기 사이클링 프로토콜을 사용하여 PCR 반응을 수행하였다:
Figure pat00004
도 2는 400 fg DNA 주형을 사용한 경우에 생성된 증폭 곡선을 나타낸다. 데이터는 핫스타트 RNase HII이 반응에 공급되지 않은 경우 T-Pin 4(서열 번호 3)이 증폭을 억제한다는 것을 증명한다(도 2, 점선). 이것은 T-Pin 4(서열 번호 3)의 저해 효과가 온도 사이클링에 대해 가역적이라는 사실 때문이다. 핫스타트 RNase HII가 반응에 공급된 경우, 증폭곡선의 존재에 의해 증명된 바와 같이 T-Pin 4(서열 번호 3)이 핫스타트 RNase HII 활성화 후에 그 효소에 의해 절단되고 저해가 완화되었다(도 2, 파선). 상업적으로 이용가능한 플래티늄 Taq은, 핫스타트 매개된 항체를 사용하는 것이고, T-Pin 4(서열 번호 3) + RNase HII와 유사한 Cp 값을 만들었다.
도 3은 이 PCR의 희석 범위에 대한 Cp 대 log(표적 농도)의 산출된 회귀 곡선을 나타낸다. 이 반응에 대한 표준 곡선은 플래티늄 Taq(도 3, A) 및 Taq + T-Pin 4(서열 번호 3) + 핫스타트 RNase HII(도 3, B)과 거의 동일하다.
실시예 4: 절단가능한 올리고뉴클레오티드 저해제를 사용한 RT - PCR 증폭
HIV-1 게놈 RNA를 다양한 형태의 핫스타트 Taq 폴리머라제를 비교하는 RT-PCR 반응으로 증폭하였다. 대략 1.2 카피/㎕의 스톡 플라스미드를 초기에 6 x 105 카피/㎕로 희석하였다. 6 x 105 카피/㎕로부터 12 카피/㎕로 추가로 10배 순차 희석하였다. 2 ㎕의 각 RNA 희석을 PCR 주형으로 사용하였다. Taq 및 T-Pin 4(서열 번호 3)을 40 pmol 저해제/U 효소의 비율로 미리 혼합하였다.
PCR 반응물 중 각 성분의 최종 농도는 하기와 같다:
1x PCR 버퍼, 48 nM HIV-Pol-F3(서열 번호 7), 48 nM HIV-Pol-R22(서열 번호 8), 60 nM HIV-CC프로브24(서열 번호 9), 100 μM dTTP, 200 μM dGTP, 200 μM dCTP, 200 μM dUTP, 200 μM dATP, 2.5 U Taq, 2 U 수퍼스크립트 III, 2.5 U RNase HII 및 1 mM DTT.
하기 사이클링 프로토콜을 사용하여 PCR 반응을 수행하였다:
Figure pat00005
도 4는 이 PCR의 희석 범위에 대한 Cp 대 log(표적 농도)의 산출된 회귀 곡선을 나타낸다. 이 반응에 대한 표준 곡선은 플래티늄 Taq(도 4, A) 및 Taq + T-Pin 4(서열 번호 3) + 핫스타트 RNase HII (도 4, B)과 거의 동일하고 이 방법이 RT-PCR 반응에서 잘 수행된다는 것을 증명한다.
Figure pat00006
rA, rG, =RNA 염기, *= 포스포로티오에이트 결합
본 명세서에서 확인되는 임의의 특허, 특허 출원, 공개, 또는 기타 개시 자료는 그 전체로 본 명세서에 참조로서 포함된다. 본 명세서에 참조로서 포함되나, 본 명세서의 정의, 진술 또는 기타 개시 자료와 모순되는 임의의 자료 또는 그의 일부는, 포함된 자료와 본 명세서의 개시 자료가 모순되지 않는 정도까지만 포함된다.
<110> SAMSUNG TECHWIN CO., LTD. <120> CONTROLLED INHIBITION AND RE-ACTIVATION OF DNA POLYMERASES BY CLEAVABLE OLIGONUCLEOTIDE INHIBITORS <130> PN093999 <150> US 61/658,212 <151> 2012-06-11 <160> 29 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> M13 specific primer UPLong1 <400> 1 ttcccagtca cgacgttgta aaacgacggc cagtg 35 <210> 2 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide inhibitor T-Pin 1 <400> 2 acatgtattg atagatcgac aagatctatc aatac 35 <210> 3 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide inhibitor T-Pin 4 <220> <221> misc_RNA <222> (11) <223> RNA <220> <221> misc_RNA <222> (16) <223> RNA <400> 3 acatgtattg atagaucgac aagatctatc aatac 35 <210> 4 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer Bac-F3 <400> 4 atgcttcggc aaaggaag 18 <210> 5 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer Bac-R10 <400> 5 cctgagtgta tgcggagt 18 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe Bac-Probe3 <400> 6 atgccggctt ccaatgcgat 20 <210> 7 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer HIV-Pol-F3 <400> 7 gcagtacaaa tggcagtatt catccacaat t 31 <210> 8 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer HIV-Pol-R22 <400> 8 ctctgctgtc cctgtaataa acccgaaaat tt 32 <210> 9 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe HIV-CCProbe24 <220> <221> misc_RNA <222> (16)..(19) <223> RNA <400> 9 ttaaaagaaa aggggggaut ggggggtaca 30 <210> 10 <211> 224 <212> PRT <213> Pyrococcus furiosis RNase HII <400> 10 Met Lys Ile Gly Gly Ile Asp Glu Ala Gly Arg Gly Pro Ala Ile Gly 1 5 10 15 Pro Leu Val Val Ala Thr Val Val Val Asp Glu Lys Asn Ile Glu Lys 20 25 30 Leu Arg Asn Ile Gly Val Lys Asp Ser Lys Gln Leu Thr Pro His Glu 35 40 45 Arg Lys Asn Leu Phe Ser Gln Ile Thr Ser Ile Ala Asp Asp Tyr Lys 50 55 60 Ile Val Ile Val Ser Pro Glu Glu Ile Asp Asn Arg Ser Gly Thr Met 65 70 75 80 Asn Glu Leu Glu Val Glu Lys Phe Ala Leu Ala Leu Asn Ser Leu Gln 85 90 95 Ile Lys Pro Ala Leu Ile Tyr Ala Asp Ala Ala Asp Val Asp Ala Asn 100 105 110 Arg Phe Ala Ser Leu Ile Glu Arg Arg Leu Asn Tyr Lys Ala Lys Ile 115 120 125 Ile Ala Glu His Lys Ala Asp Ala Lys Tyr Pro Val Val Ser Ala Ala 130 135 140 Ser Ile Leu Ala Lys Val Val Arg Asp Glu Glu Ile Glu Lys Leu Lys 145 150 155 160 Lys Gln Tyr Gly Asp Phe Gly Ser Gly Tyr Pro Ser Asp Pro Lys Thr 165 170 175 Lys Lys Trp Leu Glu Glu Tyr Tyr Lys Lys His Asn Ser Phe Pro Pro 180 185 190 Ile Val Arg Arg Thr Trp Glu Thr Val Arg Lys Ile Glu Glu Ser Ile 195 200 205 Lys Ala Lys Lys Ser Gln Leu Thr Leu Asp Lys Phe Phe Lys Lys Pro 210 215 220 <210> 11 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic consensus region peptide <400> 11 Gly Ile Asp Glu Ala Gly Arg Gly Pro Ala Ile Gly Pro Leu Val Val 1 5 10 15 <210> 12 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic consensus region peptide <400> 12 Leu Arg Asn Ile Gly Val Lys Asp Ser Lys Gln Leu 1 5 10 <210> 13 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic consensus region peptide <400> 13 His Lys Ala Asp Ala Lys Tyr Pro Val Val Ser Ala Ala Ser Ile Leu 1 5 10 15 Ala Lys Val <210> 14 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic consensus region peptide <400> 14 Lys Leu Lys Lys Gln Tyr Gly Asp Phe Gly Ser Gly Tyr Pro Ser Asp 1 5 10 15 <210> 15 <211> 166 <212> PRT <213> Thermus thermophilus RNase HI <400> 15 Met Asn Pro Ser Pro Arg Lys Arg Val Ala Leu Phe Thr Asp Gly Ala 1 5 10 15 Cys Leu Gly Asn Pro Gly Pro Gly Gly Trp Ala Ala Leu Leu Arg Phe 20 25 30 His Ala His Glu Lys Leu Leu Ser Gly Gly Glu Ala Cys Thr Thr Asn 35 40 45 Asn Arg Met Glu Leu Lys Ala Ala Ile Glu Gly Leu Lys Ala Leu Lys 50 55 60 Glu Pro Cys Glu Val Asp Leu Tyr Thr Asp Ser His Tyr Leu Lys Lys 65 70 75 80 Ala Phe Thr Glu Gly Trp Leu Glu Gly Trp Arg Lys Arg Gly Trp Arg 85 90 95 Thr Ala Glu Gly Lys Pro Val Lys Asn Arg Asp Leu Trp Glu Ala Leu 100 105 110 Leu Leu Ala Met Ala Pro His Arg Val Arg Phe His Phe Val Lys Gly 115 120 125 His Thr Gly His Pro Glu Asn Glu Arg Val Asp Arg Glu Ala Arg Arg 130 135 140 Gln Ala Gln Ser Gln Ala Lys Thr Pro Cys Pro Pro Arg Ala Pro Thr 145 150 155 160 Leu Phe His Glu Glu Ala 165 <210> 16 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic consensus region peptide <220> <221> MOD_RES <222> (2) <223> Any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (4) <223> Any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (10) <223> Any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (12) <223> Any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (17) <223> Any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (20) <223> Any amino acid <400> 16 Lys Xaa Val Xaa Leu Phe Thr Asp Gly Xaa Cys Xaa Gly Asn Pro Gly 1 5 10 15 Xaa Gly Gly Xaa Ala Leu Leu Arg Tyr 20 25 <210> 17 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic consensus region peptide <400> 17 Thr Thr Asn Asn Arg Met Glu Leu 1 5 <210> 18 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic consensus region peptide <400> 18 Lys Pro Val Lys Asn 1 5 <210> 19 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic consensus region peptide <220> <221> MOD_RES <222> (6) <223> Any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (9) <223> Any amino acid <400> 19 Phe Val Lys Gly His Xaa Gly His Xaa Glu Asn Glu 1 5 10 <210> 20 <211> 220 <212> PRT <213> Pyrococcus horikoshi RNase HII <400> 20 Met Lys Val Ala Gly Val Asp Glu Ala Gly Arg Gly Pro Val Ile Gly 1 5 10 15 Pro Leu Val Ile Gly Val Ala Val Ile Asp Glu Lys Asn Ile Glu Arg 20 25 30 Leu Arg Asp Ile Gly Val Lys Asp Ser Lys Gln Leu Thr Pro Gly Gln 35 40 45 Arg Glu Lys Leu Phe Ser Lys Leu Ile Asp Ile Leu Asp Asp Tyr Tyr 50 55 60 Val Leu Leu Val Thr Pro Lys Glu Ile Asp Glu Arg His His Ser Met 65 70 75 80 Asn Glu Leu Glu Ala Glu Lys Phe Val Val Ala Leu Asn Ser Leu Arg 85 90 95 Ile Lys Pro Gln Lys Ile Tyr Val Asp Ser Ala Asp Val Asp Pro Lys 100 105 110 Arg Phe Ala Ser Leu Ile Lys Ala Gly Leu Lys Tyr Glu Ala Thr Val 115 120 125 Ile Ala Glu His Lys Ala Asp Ala Lys Tyr Glu Ile Val Ser Ala Ala 130 135 140 Ser Ile Ile Ala Lys Val Thr Arg Asp Arg Glu Ile Glu Lys Leu Lys 145 150 155 160 Gln Lys Tyr Gly Glu Phe Gly Ser Gly Tyr Pro Ser Asp Pro Arg Thr 165 170 175 Lys Glu Trp Leu Glu Glu Tyr Tyr Lys Gln Tyr Gly Asp Phe Pro Pro 180 185 190 Ile Val Arg Arg Thr Trp Glu Thr Ala Arg Lys Ile Glu Glu Arg Phe 195 200 205 Arg Lys Asn Gln Leu Thr Leu Asp Lys Phe Leu Lys 210 215 220 <210> 21 <211> 228 <212> PRT <213> Thermococcus kodakarensis RNase HII <400> 21 Met Lys Ile Ala Gly Ile Asp Glu Ala Gly Arg Gly Pro Val Ile Gly 1 5 10 15 Pro Met Val Ile Ala Ala Val Val Val Asp Glu Asn Ser Leu Pro Lys 20 25 30 Leu Glu Glu Leu Lys Val Arg Asp Ser Lys Lys Leu Thr Pro Lys Arg 35 40 45 Arg Glu Lys Leu Phe Asn Glu Ile Leu Gly Val Leu Asp Asp Tyr Val 50 55 60 Ile Leu Glu Leu Pro Pro Asp Val Ile Gly Ser Arg Glu Gly Thr Leu 65 70 75 80 Asn Glu Phe Glu Val Glu Asn Phe Ala Lys Ala Leu Asn Ser Leu Lys 85 90 95 Val Lys Pro Asp Val Ile Tyr Ala Asp Ala Ala Asp Val Asp Glu Glu 100 105 110 Arg Phe Ala Arg Glu Leu Gly Glu Arg Leu Asn Phe Glu Ala Glu Val 115 120 125 Val Ala Lys His Lys Ala Asp Asp Ile Phe Pro Val Val Ser Ala Ala 130 135 140 Ser Ile Leu Ala Lys Val Thr Arg Asp Arg Ala Val Glu Lys Leu Lys 145 150 155 160 Glu Glu Tyr Gly Glu Ile Gly Ser Gly Tyr Pro Ser Asp Pro Arg Thr 165 170 175 Arg Ala Phe Leu Glu Asn Tyr Tyr Arg Glu His Gly Glu Phe Pro Pro 180 185 190 Ile Val Arg Lys Gly Trp Lys Thr Leu Lys Lys Ile Ala Glu Lys Val 195 200 205 Glu Ser Glu Lys Lys Ala Glu Glu Arg Gln Ala Thr Leu Asp Arg Tyr 210 215 220 Phe Arg Lys Val 225 <210> 22 <211> 211 <212> PRT <213> Archeoglobus profundus RNase HII <400> 22 Met Ile Ala Gly Ile Asp Glu Ala Gly Lys Gly Pro Val Ile Gly Pro 1 5 10 15 Leu Val Ile Cys Gly Val Leu Cys Asp Glu Glu Thr Val Glu Tyr Leu 20 25 30 Lys Ser Val Gly Val Lys Asp Ser Lys Lys Leu Asp Arg Arg Lys Arg 35 40 45 Glu Glu Leu Tyr Asn Ile Ile Lys Ser Leu Cys Lys Val Lys Val Leu 50 55 60 Lys Ile Ser Val Glu Asp Leu Asn Arg Leu Met Glu Tyr Met Ser Ile 65 70 75 80 Asn Glu Ile Leu Lys Arg Ala Tyr Val Glu Ile Ile Arg Ser Leu Met 85 90 95 Pro Lys Val Val Tyr Ile Asp Cys Pro Asp Ile Asn Val Glu Arg Phe 100 105 110 Lys His Glu Ile Glu Glu Arg Thr Gly Val Glu Val Phe Ala Ser His 115 120 125 Lys Ala Asp Glu Ile Tyr Pro Ile Val Ser Ile Ala Ser Ile Val Ala 130 135 140 Lys Val Glu Arg Asp Phe Glu Ile Asp Lys Leu Lys Lys Ile Tyr Gly 145 150 155 160 Asp Phe Gly Ser Gly Tyr Pro Ser Asp Leu Arg Thr Ile Glu Phe Leu 165 170 175 Arg Ser Tyr Leu Arg Glu His Lys Ser Phe Pro Pro Ile Val Arg Lys 180 185 190 Arg Trp Lys Thr Leu Lys Arg Leu Thr Thr His Thr Leu Ser Asp Phe 195 200 205 Phe Glu Val 210 <210> 23 <211> 205 <212> PRT <213> Archeoglobus fulgidis RNase HII <400> 23 Met Lys Ala Gly Ile Asp Glu Ala Gly Lys Gly Cys Val Ile Gly Pro 1 5 10 15 Leu Val Val Ala Gly Val Ala Cys Ser Asp Glu Asp Arg Leu Arg Lys 20 25 30 Leu Gly Val Lys Asp Ser Lys Lys Leu Ser Gln Gly Arg Arg Glu Glu 35 40 45 Leu Ala Glu Glu Ile Arg Lys Ile Cys Arg Thr Glu Val Leu Lys Val 50 55 60 Ser Pro Glu Asn Leu Asp Glu Arg Met Ala Ala Lys Thr Ile Asn Glu 65 70 75 80 Ile Leu Lys Glu Cys Tyr Ala Glu Ile Ile Leu Arg Leu Lys Pro Glu 85 90 95 Ile Ala Tyr Val Asp Ser Pro Asp Val Ile Pro Glu Arg Leu Ser Arg 100 105 110 Glu Leu Glu Glu Ile Thr Gly Leu Arg Val Val Ala Glu His Lys Ala 115 120 125 Asp Glu Lys Tyr Pro Leu Val Ala Ala Ala Ser Ile Ile Ala Lys Val 130 135 140 Glu Arg Glu Arg Glu Ile Glu Arg Leu Lys Glu Lys Phe Gly Asp Phe 145 150 155 160 Gly Ser Gly Tyr Ala Ser Asp Pro Arg Thr Arg Glu Val Leu Lys Glu 165 170 175 Trp Ile Ala Ser Gly Arg Ile Pro Ser Cys Val Arg Met Arg Trp Lys 180 185 190 Thr Val Ser Asn Leu Arg Gln Lys Thr Leu Asp Asp Phe 195 200 205 <210> 24 <211> 233 <212> PRT <213> Thermococcus celer RNase HII <400> 24 Leu Lys Leu Ala Gly Ile Asp Glu Ala Gly Arg Gly Pro Val Ile Gly 1 5 10 15 Pro Met Val Ile Ala Ala Val Val Leu Asp Glu Lys Asn Val Pro Lys 20 25 30 Leu Arg Asp Leu Gly Val Arg Asp Ser Lys Lys Leu Thr Pro Lys Arg 35 40 45 Arg Glu Arg Leu Phe Asn Asp Ile Ile Lys Leu Leu Asp Asp Tyr Val 50 55 60 Ile Leu Glu Leu Trp Pro Glu Glu Ile Asp Ser Arg Gly Gly Thr Leu 65 70 75 80 Asn Glu Leu Glu Val Glu Arg Phe Val Glu Ala Leu Asn Ser Leu Lys 85 90 95 Val Lys Pro Asp Val Val Tyr Ile Asp Ala Ala Asp Val Lys Glu Gly 100 105 110 Arg Phe Gly Glu Glu Ile Lys Glu Arg Leu Asn Phe Glu Ala Lys Ile 115 120 125 Val Ser Glu His Arg Ala Asp Asp Lys Phe Leu Pro Val Ser Ser Ala 130 135 140 Ser Ile Leu Ala Lys Val Thr Arg Asp Arg Ala Ile Glu Lys Leu Lys 145 150 155 160 Glu Lys Tyr Gly Glu Ile Gly Ser Gly Tyr Pro Ser Asp Pro Arg Thr 165 170 175 Arg Glu Phe Leu Glu Asn Tyr Tyr Arg Gln His Gly Glu Phe Pro Pro 180 185 190 Val Val Arg Arg Ser Trp Lys Thr Leu Arg Lys Ile Glu Glu Lys Leu 195 200 205 Arg Lys Glu Ala Gly Ser Lys Asn Pro Glu Asn Ser Lys Glu Lys Gly 210 215 220 Gln Ile Ser Leu Asp Val Phe Leu Arg 225 230 <210> 25 <211> 224 <212> PRT <213> Thermococcus litoralis RNase HII <400> 25 Met Lys Leu Gly Gly Ile Asp Glu Ala Gly Arg Gly Pro Val Ile Gly 1 5 10 15 Pro Leu Val Ile Ala Ala Val Val Val Asp Glu Ser Arg Met Gln Glu 20 25 30 Leu Glu Ala Leu Gly Val Lys Asp Ser Lys Lys Leu Thr Pro Lys Arg 35 40 45 Arg Glu Glu Leu Phe Glu Glu Ile Val Gln Ile Val Asp Asp His Val 50 55 60 Ile Ile Gln Leu Ser Pro Glu Glu Ile Asp Gly Arg Asp Gly Thr Met 65 70 75 80 Asn Glu Leu Glu Ile Glu Asn Phe Ala Lys Ala Leu Asn Ser Leu Lys 85 90 95 Val Lys Pro Asp Val Leu Tyr Ile Asp Ala Ala Asp Val Lys Glu Lys 100 105 110 Arg Phe Gly Asp Ile Ile Gly Glu Arg Leu Ser Phe Ser Pro Lys Ile 115 120 125 Ile Ala Glu His Lys Ala Asp Ser Lys Tyr Ile Pro Val Ala Ala Ala 130 135 140 Ser Ile Leu Ala Lys Val Thr Arg Asp Arg Ala Ile Glu Lys Leu Lys 145 150 155 160 Glu Leu Tyr Gly Glu Ile Gly Ser Gly Tyr Pro Ser Asp Pro Asn Thr 165 170 175 Arg Arg Phe Leu Glu Glu Tyr Tyr Lys Ala His Gly Glu Phe Pro Pro 180 185 190 Ile Val Arg Lys Ser Trp Lys Thr Leu Arg Lys Ile Glu Glu Lys Leu 195 200 205 Lys Ala Lys Lys Thr Gln Pro Thr Ile Leu Asp Phe Leu Lys Lys Pro 210 215 220 <210> 26 <211> 174 <212> PRT <213> Haemophilus influenzae RNase HI <400> 26 Met Phe Asn Leu Ser Leu Ser Ile Lys Ile Pro Ala Ile Leu His Asn 1 5 10 15 Asn Leu Phe Val Met Gln Lys Gln Ile Glu Ile Phe Thr Asp Gly Ser 20 25 30 Cys Leu Gly Asn Pro Gly Ala Gly Gly Ile Gly Ala Val Leu Arg Tyr 35 40 45 Lys Gln His Glu Lys Met Leu Ser Lys Gly Tyr Phe Lys Thr Thr Asn 50 55 60 Asn Arg Met Glu Leu Arg Ala Val Ile Glu Ala Leu Asn Thr Leu Lys 65 70 75 80 Glu Pro Cys Leu Ile Thr Leu Tyr Ser Asp Ser Gln Tyr Met Lys Asn 85 90 95 Gly Ile Thr Lys Trp Ile Phe Asn Trp Lys Lys Asn Asn Trp Lys Ala 100 105 110 Ser Ser Gly Lys Pro Val Lys Asn Gln Asp Leu Trp Ile Ala Leu Asp 115 120 125 Glu Ser Ile Gln Arg His Lys Ile Asn Trp Gln Trp Val Lys Gly His 130 135 140 Ala Gly His Arg Glu Asn Glu Ile Cys Asp Glu Leu Ala Lys Lys Gly 145 150 155 160 Ala Glu Asn Pro Thr Leu Glu Asp Met Gly Tyr Phe Glu Glu 165 170 <210> 27 <211> 161 <212> PRT <213> Thermus aquaticus RNase HI <400> 27 Met Ser Leu Pro Leu Lys Arg Val Asp Leu Phe Thr Asp Gly Ala Cys 1 5 10 15 Leu Gly Asn Pro Gly Pro Gly Gly Trp Ala Ala Leu Leu Arg Tyr Gly 20 25 30 Ser Gln Glu Lys Leu Leu Ser Gly Gly Glu Pro Cys Thr Thr Asn Asn 35 40 45 Arg Met Glu Leu Arg Ala Ala Leu Glu Gly Leu Leu Ala Leu Arg Glu 50 55 60 Pro Cys Gln Val His Leu His Thr Asp Ser Gln Tyr Leu Lys Arg Ala 65 70 75 80 Phe Ala Glu Gly Trp Val Glu Arg Trp Gln Arg Asn Gly Trp Arg Thr 85 90 95 Ala Glu Gly Lys Pro Val Lys Asn Gln Asp Leu Trp Gln Ala Leu Leu 100 105 110 Lys Ala Met Glu Gly His Glu Val Ala Phe His Phe Val Glu Gly His 115 120 125 Ser Gly His Pro Glu Asn Glu Arg Val Asp Arg Glu Ala Arg Arg Gln 130 135 140 Ala Lys Ala Gln Pro Gln Val Pro Cys Pro Pro Lys Glu Ala Thr Leu 145 150 155 160 Phe <210> 28 <211> 146 <212> PRT <213> Salmonella enterica RNase HI <400> 28 Met Leu Lys Gln Val Glu Ile Phe Thr Asp Gly Ser Cys Leu Gly Asn 1 5 10 15 Pro Gly Pro Gly Gly Tyr Gly Ala Ile Leu Arg Tyr Arg Gly His Glu 20 25 30 Lys Thr Phe Ser Glu Gly Tyr Thr Leu Thr Thr Asn Asn Arg Met Glu 35 40 45 Leu Met Ala Ala Ile Val Ala Leu Glu Ala Leu Lys Glu His Cys Glu 50 55 60 Val Thr Leu Ser Thr Asp Ser Gln Tyr Val Arg Gln Gly Ile Thr Gln 65 70 75 80 Trp Ile His Asn Trp Lys Lys Arg Gly Trp Lys Thr Ala Glu Lys Lys 85 90 95 Pro Val Lys Asn Val Asp Leu Trp Lys Arg Leu Asp Ala Ala Leu Gly 100 105 110 Gln His Gln Ile Lys Trp Val Trp Val Lys Gly His Ala Gly His Pro 115 120 125 Glu Asn Glu Arg Cys Asp Glu Leu Ala Arg Ala Ala Ala Met Asn Pro 130 135 140 Thr Gln 145 <210> 29 <211> 146 <212> PRT <213> Agrobacterium tumefaciens RNase HI <400> 29 Met Lys His Val Asp Ile Phe Thr Asp Gly Ala Cys Ser Gly Asn Pro 1 5 10 15 Gly Pro Gly Gly Trp Gly Ala Val Leu Arg Tyr Gly Glu Thr Glu Lys 20 25 30 Glu Leu Ser Gly Gly Glu Ala Asp Thr Thr Asn Asn Arg Met Glu Leu 35 40 45 Leu Ala Ala Ile Ser Ala Leu Asn Ala Leu Lys Ser Pro Cys Glu Val 50 55 60 Asp Leu Tyr Thr Asp Ser Ala Tyr Val Lys Asp Gly Ile Thr Lys Trp 65 70 75 80 Ile Phe Gly Trp Lys Lys Lys Gly Trp Lys Thr Ala Asp Asn Lys Pro 85 90 95 Val Lys Asn Val Glu Leu Trp Gln Ala Leu Glu Ala Ala Gln Glu Arg 100 105 110 His Lys Val Thr Leu His Trp Val Lys Gly His Ala Gly His Pro Glu 115 120 125 Asn Glu Arg Ala Asp Glu Leu Ala Arg Lys Gly Met Glu Pro Phe Lys 130 135 140 Arg Arg 145

Claims (32)

  1. 핵산 폴리머라제 활성;
    실질적으로 이중-가닥 올리고뉴클레오티드로서, 상기 올리고뉴클레오티드는 상기 올리고뉴클레오티드의 융해 온도보다 낮은 온도에서 상기 핵산 폴리머라제 활성을 저해하고, 및
    핫 스타트(hot start) 뉴클레아제 활성을 포함하는 핫 스타트 효소 조성물로서,
    상기 올리고뉴클레오티드에 의한 핵산 폴리머라제 활성의 저해는 상기 핫 스타트 뉴클레아제 활성의 활성화에 의해 비가역적으로 제거되는 것인 핫 스타트 효소 조성물.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 실질적으로 이중-가닥 올리고뉴클레오티드는 1개 이상의 RNA:DNA 염기쌍을 포함하는 것인 핫 스타트 효소 조성물.
  3. 청구항 2에 있어서, 상기 활성화된 핫 스타트 뉴클레아제 활성은 상기 실질적으로 이중-가닥 올리고뉴클레오티드를 상기 1개 이상의 RNA:DNA 염기쌍에서 절단하는 것인 핫 스타트 효소 조성물.
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 핵산 폴리머라제 활성은 DNA 폴리머라제, RNA 폴리머라제, 역전사 효소의 활성인 것인 핫 스타트 효소 조성물.
  5. 청구항 1에 있어서, 상기 핵산 폴리머라제 활성은 호열성(thermophilic) 핵산 폴리머라제 활성인 것인 핫 스타트 효소 조성물.
  6. 청구항 1에 있어서, 상기 핫 스타트 뉴클레아제 활성은 핫 스타트 열안정성 RNase H의 활성인 것인 핫 스타트 효소 조성물.
  7. 청구항 1에 있어서, 상기 실질적으로 이중-가닥 올리고뉴클레오티드는 3'-말단 및/또는 5'-말단에서 화학적으로 변형된 것인 핫 스타트 효소 조성물.
  8. 청구항 1에 있어서, 상기 실질적으로 이중-가닥 올리고뉴크레오티드는 헤어핀 루프(hairpin loop)를 포함하는 것인 핫 스타트 효소 조성물.
  9. 청구항 1에 있어서, 상기 실질적으로 이중-가닥 올리고뉴클레오티드의 변성(denaturation)은 2개 이상의 단일-가닥 올리고뉴클레오티드를 생성하는 것인 핫 스타트 효소 조성물.
  10. 하기 단계를 포함하는 핫 스타트 핵산 폴리머라제 활성을 활성화시키는 방법으로서,
    하기를 포함하는 핫 스타트 조성물을 제공하는 단계:
    핵산 폴리머라제;
    1개 이상의 RNA:DNA 염기쌍을 포함하는 실질적으로 이중-가닥 올리고뉴클레오티드로서, 상기 올리고뉴클레오티드는 상기 올리고뉴클레오티드의 융해 온도보다 낮은 온도에서 상기 핵산 폴리머라제 활성을 저해하고, 및
    핫 스타트 RNAse H 활성, 및
    상기 핫 스타트 조성물을 활성화시키는 단계를 포함하고,
    활성화된 핫 스타트 RNAse H 활성은 상기 올리고뉴클레오티드를 상기 1개 이상의 RNA:DNA 염기쌍에서 절단함으로써 상기 올리고뉴클레오티드의 능력을 비가역적으로 제거하는 상기 핵산 폴리머라제를 저해하기 위한 것인 방법.
  11. 청구항 1의 핫 스타트 효소 조성물을 포함하는 표적 핵산 서열의 실시간 검출용 키트.
  12. 하기 단계를 포함하는 표적 핵산 서열을 증폭하는 방법으로서,
    표적 핵산 서열의 존재가 시험될 시료를 제공하는 단계;
    정방향 및 역방향 증폭 프라이머쌍을 제공하는 단계로서, 상기 정방향 증폭 프라이머는 표적 핵산 서열의 5' 말단에 어닐링하고 상기 역방향 증폭 프라이머는 표적 핵산 서열의 3' 말단에 어닐링하고;
    청구항 1의 핫 스타트 효소 조성물을 제공하는 단계;
    표적 DNA 서열, 증폭 버퍼 및 핫 스타트 효소 조성물의 존재에서 1 이상의 증폭 사이클 동안 정방향 및 역방향 증폭 프라이머 간의 PCR 단편을 증폭하는 단계를 포함하고,
    상기 실질적으로 이중-가닥 올리고뉴클레오티드는 제1 증폭 사이클 동안 비가역적으로 불활성화되는 것인 방법.
  13. 하기 단계를 포함하는 시료 중 표적 DNA 서열의 실시간 검출 방법으로서,
    표적 핵산 서열의 존재가 시험될 시료를 제공하는 단계;
    정방향 및 역방향 증폭 프라이머쌍을 제공하는 단계로서, 상기 정방향 증폭 프라이머는 표적 핵산 서열의 5' 말단에 어닐링하고 상기 역방향 증폭 프라이머는 표적 핵산 서열의 3' 말단에 어닐링하는 단계;
    검출가능한 표지 및 DNA 및 RNA 핵산 서열을 포함하는 프로브를 제공하는 단계로서, 상기 프로브의 RNA 핵산 서열은 상기 표적 DNA의 선택된 영역에 실질적으로 상보적이고 상기 프로브의 DNA 핵산 서열은 상기 표적 DNA의 선택된 영역에 인접한 서열에 실질적으로 상보적인 것인 단계;
    청구항 4의 핫 스타트 효소 조성물을 제공하는 단계;
    표적 DNA 서열, 증폭 버퍼, 핫 스타트 효소 조성물 및 프로브의 존재에서 하나 사이클 이상의 증폭 사이클 동안 상기 실질적으로 이중-가닥 올리고뉴클레오티드가 제1 증폭 사이클 동안 비가역적으로 불활성화되고 프로브 중 RNA 서열이 PCR 단편 중 상보적인 서열과 RNA:DNA 헤테로듀플렉스를 형성할 수 있는 조건 하에서 정방향 및 역방향 증폭 프라이머 간의 PCR 단편을 증폭하는 단계; 및
    프로브의 표지로부터 신호 방출의 실시간 증가를 검출하는 단계로서, 신호의 증가는 시료 중 표적 DNA 서열의 존재를 나타내는 것인 방법.
  14. 청구항 11에 있어서, 프로브의 표지로부터 신호의 방출의 실시간 증가는 RNA:DNA 헤테로듀플렉스 중 프로브의 RNA 서열의 RNAse H 절단으로부터 기인하는 것인 방법.
  15. 청구항 11에 있어서, 프로브의 DNA 및 RNA 서열은 공유결합으로 연결된 것인 방법.
  16. 청구항 11에 있어서, 프로브의 검출가능한 표지는 형광 표지인 것인 방법.
  17. 청구항 11에 있어서, 프로브는 FRET 쌍으로 표지된 것인 방법.
  18. 청구항 11에 있어서, PCR 단편 또는 프로브는 고체 지지체에 연결된 것인 방법.
  19. 하기 단계를 포함하는 시료 중 RNA 표적 서열의 실시간 검출 방법으로서,
    표적 RNA 서열의 존재가 시험될 시료를 제공하는 단계;
    정방향 및 역방향 증폭 프라이머 쌍을 제공하는 단계로서, 정방향 증폭 프라이머는 표적 핵산 서열의 5' 말단에 어닐링하고 역방향 증폭 프라이머는 표적 핵산 서열의 3' 말단에 어닐링하는 단계;
    검출가능한 표지 및 DNA 및 RNA 핵산 서열을 포함하는 프로브를 제공하는 단계로서, 프로브의 RNA 핵산 서열은 표적 cDNA 서열의 선택된 영역에 전부(entirely) 실질적으로 상보적이고 프로브의 DNA 핵산 서열은 표적 cDNA 서열의 선택된 영역에 인접한 표적 DNA 서열에 실질적으로 상보적인 것인 단계;
    청구항 1의 핫 스타트 효소 조성물을 제공하는 단계;
    역전사 효소 활성 및 역방향 증폭 프라이머의 존재에서 표적 RNA를 역전사하여 표적 cDNA 서열을 생성하는 단계;
    표적 cDNA 서열, 상기 핫 스타트 효소 조성물, 증폭 버퍼 및 프로브의 존재에서 1 이상의 증폭 사이클 동안 상기 실질적으로 이중-가닥 올리고뉴클레오티드가 제1 증폭 사이클 동안 비가역적으로 불활성화되고 프로브 내 RNA 서열이 PCR 단편 중 상보적인 서열과 RNA:DNA 헤테로듀플렉스를 형성할 수 있는 조건 하에서 정방향 및 역방향 증폭 프라이머 간의 PCR 단편을 증폭하는 단계; 및
    프로브의 표지로부터 신호 방출의 실시간 증가를 검출하는 단계로서, 신호의 증가는 시료 중 표적 DNA 서열의 존재를 나타내는 것인 방법.
  20. 청구항 19에 있어서, 프로브의 표지로부터 신호의 방출의 실시간 증가는 RNA:DNA 헤테로듀플렉스 중 프로브의 RNA 서열의 RNAse H 절단으로부터 기인하는 것인 방법.
  21. 핵산 폴리머라제 활성, 및
    실질적으로 이중-가닥 올리고뉴클레오티드로서, 상기 올리고뉴클레오티드는 상기 올리고뉴클레오티의 융해 온도보다 낮은 온도에서 상기 핵산 폴리머라제 활성을 저해하는 실질적으로 이중-가닥 올리고뉴클레오티드를 포함하고,
    상기 올리고뉴클레오티드에 의한 핵산 폴리머라제 활성의 저해는 뉴클레아제 활성의 첨가에 의해 비가역적으로 제거되는 것인 효소 조성물.
  22. 청구항 21에 있어서, 상기 실질적으로 이중-가닥 올리고뉴클레오티드는 1개 이상의 RNA:DNA 염기쌍을 포함하는 것인 효소 조성물.
  23. 청구항 22에 있어서, 뉴클레아제 활성은 상기 실질적으로 이중-가닥 올리고뉴클레오티드를 상기 1개 이상의 RNA:DNA 염기쌍에서 절단하는 것인 효소 조성물.
  24. 청구항 21에 있어서, 상기 핵산 폴리머라제 활성은 DNA 폴리머라제, RNA 폴리머라제 또는 역전사 효소의 활성인 것인 효소 조성물.
  25. 청구항 21에 있어서, 상기 핵산 폴리머라제 활성은 호열성 핵산 폴리머라제 활성인 것인 효소 조성물.
  26. 청구항 21에 있어서, 상기 뉴클레아제 활성은 RNase H의 활성인 것인 효소 조성물.
  27. 청구항 21에 있어서, 상기 실질적으로 이중-가닥 올리고뉴클레오티드는 3'-말단 및/또는 5'-말단에서 화학적으로 변형된 것인 효소 조성물.
  28. 청구항 21에 있어서, 상기 실질적으로 이중-가닥 올리고뉴크레오티드는 헤어핀 루프를 포함하는 것인 조성물.
  29. 청구항 21에 있어서, 상기 실질적으로 이중-가닥 올리고뉴클레오티드의 변성은 2개 이상의 단일-가닥 올리고뉴클레오티드를 생성하는 것인 조성물.
  30. 하기 단계를 포함하는 표적 핵산 서열을 증폭하는 방법으로서,
    표적 핵산 서열의 존재가 시험될 시료를 제공하는 단계;
    정방향 및 역방향 증폭 프라이머 쌍을 제공하는 단계로서, 상기 정방향 증폭 프라이머는 상기 표적 핵산 서열의 5' 말단에 어닐링하고 상기 역방향 증폭 프라이머는 표적 핵산 서열의 3' 말단에 어닐링하는 단계;
    청구항 21의 효소 조성물을 제공하는 단계;
    뉴클레아제 활성을 첨가하는 단계;
    표적 DNA 서열 및 증폭 버퍼의 존재에서 정방향 및 역방향 증폭 프라이머 간의 PCR 단편을 증폭하는 단계를 포함하고,
    상기 실질적으로 이중-가닥 올리고뉴클레오티드는 상기 뉴클레아제 활성에 의해 비가역적으로 불활성화되는 것인 방법.
  31. 하기 단계를 포함하는 시료 중 표적 DNA 서열의 실시간 검출 방법으로서,
    표적 DNA 서열의 존재가 시험될 시료를 제공하는 단계;
    정방향 및 역방향 증폭 프라이머쌍을 제공하는 단계로서, 정방향 증폭 프라이머는 표적 핵산 서열의 5' 말단에 어닐링하고 역방향 증폭 프라이머는 표적 핵산 서열의 3' 말단에 어닐링하는 단계;
    검출가능한 표지 및 DNA 및 RNA 핵산 서열을 포함하는 프로브를 제공하는 단계로서, 프로브의 RNA 핵산 서열은 표적 DNA 서열의 선택된 영역에 전부 상보적이고 프로브의 DNA 핵산 서열은 표적 DNA 서열의 선택된 영역에 인접한 서열에 실질적으로 상보적인 것인 단계;
    청구항 21의 효소 조성물을 제공하는 단계;
    뉴클레아제 활성을 첨가하는 단계;
    표적 DNA 서열, 증폭 버퍼, 효소 조성물 및 프로브의 존재에서 1 사이클 이상의 증폭 사이클 동안 상기 실질적으로 이중-가닥 올리고뉴클레오티드가 뉴클레아제 활성에 의해 비가역적으로 불활성화되고 프로브 중 RNA 서열이 PCR 단편 중 상보적인 서열과 RNA:DNA 헤테로듀플렉스를 형성할 수 있는 조건 하에서 정방향 및 역방향 증폭 프라이머 간의 PCR 단편을 증폭하는 단계; 및
    프로브의 표지로부터 신호 방출의 실시간 증가를 검출하는 단계로서, 신호의 증가는 시료 중 표적 DNA 서열의 존재를 나타내는 것을 포함하는 방법.
  32. 하기 단계를 포함하는 시료 중 RNA 표적 서열의 실시간 검출 방법으로서,
    표적 RNA 서열의 존재가 시험될 시료를 제공하는 단계;
    정방향 및 역방향 증폭 프라이머쌍을 제공하는 단계로서, 정방향 증폭 프라이머는 표적 핵산 서열의 5' 말단에 어닐링하고 역방향 증폭 프라이머는 표적 핵산 서열의 3' 말단에 어닐링하는 단계;
    검출가능한 표지 및 DNA 및 RNA 핵산 서열을 포함하는 프로브를 제공하는 단계로서, 프로브의 RNA 핵산 서열은 표적 cDNA 서열의 선택된 영역에 전부 상보적이고 프로브의 DNA 핵산 서열은 표적 cDNA 서열의 선택된 영역에 인접한 표적 DNA 서열에 실질적으로 상보적인 것인 단계;
    청구항 21의 효소 조성물을 제공하는 단계;
    역전사 효소 활성 및 역방향 증폭 프라이머의 존재에서 표적 RNA를 역전사하여 표적 cDNA 서열을 생성하는 단계;
    뉴클레아제 활성을 첨가하는 단계;
    표적 cDNA 서열, 효소 조성물, 증폭 버퍼 및 프로브의 존재에서 1 사이클 이상의 증폭 사이클 동안 상기 실질적으로 이중-가닥 올리고뉴클레오티드가 뉴클레아제 활성에 의해 비가역적으로 불활성화되고 프로브 중 RNA 서열이 PCR 단편 중 상보적인 서열과 RNA:DNA 헤테로듀플렉스를 형성할 수 있는 조건 하에서 정방향 및 역방향 증폭 프라이머 간의 PCR 단편을 증폭하는 단계; 및
    프로브의 표지로부터 신호 방출의 실시간 증가를 검출하는 단계로서, 신호의 증가는 시료 중 표적 RNA 서열의 존재를 나타내는 것을 포함하는 방법.
KR1020130066791A 2012-06-11 2013-06-11 절단가능한 올리고뉴클레오티드 저해제에 의한 ｄｎａ 폴리머라제의 제어된 저해 및 재활성화 KR20130138700A (ko)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201261658212P 2012-06-11 2012-06-11
US61/658,212 2012-06-11

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20130138700A true KR20130138700A (ko) 2013-12-19

Family

ID=49715567

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020130066791A KR20130138700A (ko) 2012-06-11 2013-06-11 절단가능한 올리고뉴클레오티드 저해제에 의한 ｄｎａ 폴리머라제의 제어된 저해 및 재활성화

Country Status (2)

Country Link
US (1) US9637780B2 (ko)
KR (1) KR20130138700A (ko)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2021118288A1 (ko) 2019-12-11 2021-06-17 (주)제노텍 대립 유전자의 구분성을 높이는 pcr 방법 및 pcr 킷트

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6183967B1 (en) * 1995-06-07 2001-02-06 Nexstar Pharmaceuticals Nucleic acid ligand inhibitors to DNA polymerases
US6830902B1 (en) * 1999-07-02 2004-12-14 Invitrogen Corporation Compositions and methods for enhanced sensitivity and specificity of nucleic acid synthesis
US20140255925A9 (en) * 2008-04-30 2014-09-11 Integrated Dna Technologies Modified rnase h enzymes and their uses

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2021118288A1 (ko) 2019-12-11 2021-06-17 (주)제노텍 대립 유전자의 구분성을 높이는 pcr 방법 및 pcr 킷트
KR20210073947A (ko) 2019-12-11 2021-06-21 (주) 제노텍 대립 유전자의 구분성을 높이는 pcr 방법 및 pcr 킷트

Also Published As

Publication number Publication date
US20130330734A1 (en) 2013-12-12
US9637780B2 (en) 2017-05-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6510695B2 (ja) 修飾されたｒｎａ単量体を用いるｒｎアーゼｈを基礎とするアッセイ
JP6008846B2 (ja) 修飾されたＲＮａｓｅＨ及び核酸増幅の検出
US20160130673A1 (en) Nucleic acid detection by oligonucleotide probes cleaved by both exonuclease and endonuclease
JP2013528384A5 (ko)
US20120052501A1 (en) Kit for detecting htlv strains and use thereof
KR20120046018A (ko) 단일 뉴클레오티드 다형성의 실시간 ｐｃｒ 검출
JP2008529528A (ja) ポリヌクレオチドの検出用のキープローブ組成物および方法
KR20120084320A (ko) Ｔｈｄ 프라이머 타겟 검출
JP2016510601A (ja) 修飾ＲＮＡモノマーを用いたＲＮａｓｅＨ系アッセイ
US20130273547A1 (en) Method to determine and correct baseline and to characterize pcr amplification kinetics
US20120219945A1 (en) Use of single-stranded binding protein in amplifying target nucleic acid
JP2015522292A (ja) 協働的プライマー、プローブ、およびそれらの用途
US20120045747A1 (en) Kit for detecting hepatitis b virus and method for detecting hepatitis b virus using the same
KR20120021262A (ko) 안정화된 프로브를 이용한 실시간 ｐｃｒ 검출
KR102146523B1 (ko) 표적 핵산의 향상된 증폭
US20120088246A1 (en) Real time pcr detection of single nucleotide polymorphisms
US9637780B2 (en) Controlled inhibition and re-activation of DNA polymerases by cleavable oligonucleotide inhibitors
US20130029316A1 (en) Method for real-time detection of west nile virus using a cleavable chimeric probe
KR101954860B1 (ko) 인간 파필로마바이러스 검출용 올리고뉴클레오티드 세트
US9163289B2 (en) Kit for detecting HIV-1 and method for detecting HIV-1 using the same
KR20120021261A (ko) 살모넬라 종 및 대장균 ０１５７：ｈ７의 표적 서열을 동시에 증폭하는 방법 및 그를 위한 키트
US20120052500A1 (en) Kit for detecting chlamydia trachomatis strains and method for detecting chlamydia trachomatis strains using the same

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right