CN109735626A - 一种从基因水平鉴定中国人群上皮细胞类体液斑迹组织来源的方法和系统 - Google Patents
一种从基因水平鉴定中国人群上皮细胞类体液斑迹组织来源的方法和系统 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供一种从基因水平鉴定中国人群上皮细胞类体液斑迹组织来源的方法和系统，方法包括利用第一PCR扩增引物组对体液斑迹的DNA进行第一扩增，获得第一扩增PCR产物，所述第一PCR扩增引物组由与CYP2B7P1、MUC4、L.cri、HTN3、STATH、MUC7、LCE2B、DCD和CCL27九个基因一一对应的九对扩增引物组成；根据所述第一扩增PCR产物中的基因表达情况，判断所述体液斑迹是否含有阴道分泌物、唾液和皮肤中的至少一种。本发明提供的方案能有效从基因水平确定中国人群体液的组织来源，大大简化了鉴定刑侦现场体液或其斑迹的组织来源的步骤，能为明确案件性质以及定罪量刑等提供准确的科学依据。
Description
技术领域
本发明涉及一种人群类体液组织来源的方法和系统，尤其涉及一种从基因水平鉴定中国人群上皮细胞类体液斑迹组织来源的方法和系统。
背景技术
体液斑迹是犯罪现场常见的生物物证，利用脱氧核糖核酸 (deoxyribonucleicacid，简称：DNA)鉴定技术可以对其进行分析，以达到认定或排除嫌疑人的目的。近年随着诉讼体制改革的深入，仅仅从生物物证上获取DNA分型以确定个体来源越来越不满足证据的完整性需求，且这种单一的结果指向也引起了一定的争议，而体液斑迹的鉴定恰恰是引起争议的一个重要环节。传统的体液斑迹检测方法，如唾液淀粉酶试验，主要是通过颜色的变化来判定目标产物的存在，这种方法受外界影响较大，且判定主要依靠人眼的主观判断，因而存在一定的误判可能，不能作为确证试验，而对于阴道分泌物、月经血等体液斑迹，传统方法并不能进行有效的识别，因而亟需新的检测手段对法医工作中常见的体液斑迹进行识别与鉴定。
自1999年M.Bauer报道发表第一篇相关研究文章以来[1]，利用信使核糖核酸(messenger ribonucleic acid，简称：mRNA)对体液斑迹进行识别的研究已经有了十余年的历史，研究者们发现并验证了一系列具有组织特异性和体液斑迹识别价值的mRNA标记。与学界曾普遍认为的mRNA极易降解不同，mRNA被发现在干燥载体上具有良好的稳定性，结合DNA和RNA共同提取技术，DNA和RNA分析可以平行进行，大大提高了法医工作的效率。体液斑迹的准确推断将大大提高生物物证的证据价值和证明力，例如：在某些刑事案件中，我们需确认现场某些体液斑迹是属于正常的唾液斑迹，还是女性的阴道分泌物斑迹；以及犯罪现场中存在的多种体液或其斑迹混合出现的情况，例如皮肤与唾液，阴道分泌物与唾液，阴道分泌物与皮肤等混合出现的情况，如何有效的区分这些混合体液中含有的体液的组织来源，成为明确案件性质、确定犯罪嫌疑人、以及定罪量刑等的重要依据。
具体地，唾液斑迹主要见于现场烟头、饮料瓶口等，传统检验方法主要是通过唾液淀粉酶的显色反应进行识别，这种方法在唾液量较少或原始物证为深色的情形下效果较差。阴道分泌物也是强奸案中常见的体液斑迹物证，利用传统的方法不能有效地对其进行识别，而且阴道分泌物中可能存在与唾液等体液斑迹的交叉反应。嫌疑人与现场物证或受害者的皮肤接触可能会留下皮肤表面的物质，从而形成皮肤接触类斑迹，这类“接触性物证”的DNA 检验技术已经日趋成熟，但对于此类物证的DNA来源的确认仍有一定的难度。
上述的唾液、阴道分泌物、皮肤接触类斑迹是本研究所关注的重点，这三种体液斑迹具有一定的共性：均含有上皮来源的细胞，细胞功能相似，表达蛋白也具备一定的相似性；另外，相关研究也证明部分特异mRNA标记可同时检出于上述2-3种体液斑迹中，因此可能造成假阳性结果，从而影响鉴定结果的判读。因此如何对三种体液斑迹进行正确识别，成为一个有待解决的问题。
发明内容
本发明提供一种从基因水平鉴定中国人群上皮细胞类体液斑迹组织来源的方法和系统，所述方法能快速通过确定待检测体液斑迹中特定基因的表达状况来确定该体液的组织来源，为明确案件性质、确定犯罪嫌疑人、以及定罪量刑等提供准确的科学依据。
本发明提供一种从基因水平鉴定中国人群上皮细胞类体液斑迹组织来源的方法，包括：
利用第一PCR扩增引物组对体液斑迹的DNA进行第一扩增，获得第一扩增PCR产物，所述第一PCR扩增引物组由与CYP2B7P1、MUC4、L.cri、 HTN3、STATH、MUC7、LCE2B、DCD和CCL27九个基因一一对应的九对扩增引物组成；
根据所述第一扩增PCR产物中的基因表达情况，判断所述体液斑迹是否含有阴道分泌物、唾液和皮肤中的至少一种。
进一步地，所述方法包括：若所述第一扩增PCR产物中具有CYP2B7P1、 MUC4和L.cri三种基因表达，则所述体液斑迹为含有阴道分泌物的体液斑迹；
若所述第一扩增PCR产物中具有HTN3、STATH和MUC7三种基因表达，则所述体液斑迹为含有唾液斑迹的体液斑迹。
进一步地，所述方法包括：若所述第一扩增PCR产物中具有LCE2B、 DCD和CCL27至少一种基因表达，则同时利用第二PCR扩增引物组和第三 PCR扩增引物组对所述体液斑迹的DNA分别进行第二扩增和第三扩增，分别获得第二扩增PCR产物和第三扩增PCR产物，
其中，所述第二PCR扩增引物组由与LCE1C、LCE2B、CDSN(71)和 LOR四个基因一一对应的四对扩增引物组成，所述第三PCR扩增引物组由与 DCD、CDSN(86)、KRT2和CCL27四个基因一一对应的四对扩增引物组成；
根据所述第二扩增PCR产物和第三扩增PCR产物中的基因表达情况，判断所述体液斑迹是否含有皮肤。
进一步地，若所述第二扩增PCR产物和第三扩增PCR产物共具有 LCE1C、LCE2B、CDSN(71)、LOR、DCD、CDSN(86)、KRT2和CCL27 基因中至少五种基因表达，则所述体液斑迹为含有皮肤斑迹的体液斑迹。
更进一步地，所述第一PCR扩增引物组中的所述扩增引物为序列表中 SEQ IDNo.1至SEQ ID No.18的核苷酸序列，所述第二PCR扩增引物组中的所述扩增引物为序列表中SEQ ID No.19至SEQ ID No.26的核苷酸序列，所述第三PCR扩增引物组中的所述扩增引物为序列表中SEQ ID No.27至SEQ ID No.34的核苷酸序列。
更进一步地，所述体液斑迹的DNA通过如下方法获得：
从所述体液斑迹中提取RNA；
将提取的RNA逆转录为所述体液斑迹的DNA。
在本发明的一个实施方式中，所述第一PCR扩增引物组、第二PCR扩增引物组以及第三PCR扩增引物组为具有荧光的PCR扩增引物组，通过遗传分析仪确定各自PCR产物中的特定基因的扩增产物是否存在。在本发明的方案中，所述遗传分析仪可以是本领域技术人员常规使用的遗传分析仪，例如ABI3130或ABI3500型遗传分析仪，通过ID-X 1.4软件或其他GeneMapper软件等分析各自PCR产物中的特定基因的扩增产物是否存在。在本发明的实施方式中，将实际扩增出的产物长度、产物颜色与表4-6 中记载的引物要扩增的长度、产物颜色进行比对，实际扩增出的产物长度只要与表4-6记载的扩增长度相等或相近即可，二者可以存在偏差，只要在本领域技术人员可以接受的范围内即可，或者通过测序确认是所要扩增的片段即可。
在本发明的方案中，能够检测出体液斑迹中是否含有唾液、阴道分泌物和皮肤中的一种或多种。
由于刑事案件现场存在的各种体液的斑迹中RNA的含量往往是pg级的，而该量不能满足先进行定量，后进行组织来源分析的需要，因此实际操作中是要将从斑迹提取的全部RNA直接用于进行组织来源分析，在本申请的方案中，各种体液斑迹样本RNA的量仅通过体积来表示，这对本领域技术人员来说是可以理解的，并且能够实施本申请的方案。在本发明的一个具体实施方式中，上述3种体液被制成类似于刑事案件现场出现的体液斑迹样本，以获得更符合实际情况的结果。在本发明的具体实施方式中，所述3种体液可以是单独存在，也可以是混合存在的(例如，体液斑迹样本的RNA按照1：1：1 的体积比混合存在，或者由RNA逆转录获得的DNA按照1：1：1的体积比混合存在)。
在本发明的方案中，唾液是唾液腺的分泌物。
阴道分泌物是由阴道粘膜渗出物、前庭腺、宫颈腺、子宫内膜等的分泌液与脱落上皮细胞、阴道正常菌群及其代谢产物组成的混合物。
皮肤指身体表面包在肌肉外面的组织。
本发明还提供一种从基因水平鉴定中国人群上皮细胞类体液斑迹组织来源的系统，包括：PCR扩增体系和检测扩增产物体系，
所述PCR扩增体系用于利用第一PCR扩增引物组对体液斑迹的DNA进行第一扩增，获得第一扩增PCR产物，所述第一PCR扩增引物组由与 CYP2B7P1、MUC4、L.cri、HTN3、STATH、MUC7、LCE2B、DCD和CCL27 九个基因一一对应的九对扩增引物组成；
所述检测扩增产物体系用户根据所述第一扩增PCR产物中的基因表达情况，判断所述体液斑迹是否含有阴道分泌物、唾液和皮肤中的至少一种。
进一步地，若所述检测扩增产物体系检测出所述第一扩增PCR产物中具有CYP2B7P1、MUC4和L.cri三种基因表达，则所述体液斑迹为含有阴道分泌物的体液斑迹；
若所述检测扩增产物体系检测出所述第一扩增PCR产物中具有HTN3、 STATH和MUC7三种基因表达，则所述体液斑迹为含有唾液斑迹的体液斑迹。
进一步地，若所述检测扩增产物体系检测出所述第一扩增PCR产物中具有LCE2B、DCD和CCL27至少一种基因表达，则所述PCR扩增体系同时利用第二PCR扩增引物组和第三PCR扩增引物组对所述体液斑迹的DNA分别进行第二扩增和第三扩增，分别获得第二扩增PCR产物和第三扩增PCR产物，
其中，所述第二PCR扩增引物组由与LCE1C、LCE2B、CDSN(71)和 LOR四个基因一一对应的四对扩增引物组成，所述第三PCR扩增引物组由与 DCD、CDSN(86)、KRT2和CCL27四个基因一一对应的四对扩增引物组成；
所述检测扩增产物体系根据所述第二扩增PCR产物和第三扩增PCR产物中的基因表达情况，判断所述体液斑迹是否含有皮肤。
进一步地，若所述检测扩增产物体系检测出所述第二扩增PCR产物和第三扩增PCR产物共具有LCE1C、LCE2B、CDSN(71)、LOR、DCD、CDSN (86)、KRT2和CCL27基因中至少五种基因表达，则所述体液斑迹为含有皮肤斑迹的体液斑迹。
更进一步的，所述系统还包括RNA提取体系，逆转录体系，
所述RNA提取体系用于从体液斑迹中提取RNA；
所述逆转录体系用于将提取的RNA逆转录为所述体液斑迹的DNA。
更进一步的，在本发明的系统中，所述第一PCR扩增引物组中的所述扩增引物为序列表中SEQ ID No.1至SEQ ID No.18的核苷酸序列，所述第二 PCR扩增引物组中的所述扩增引物为序列表中SEQ ID No.19至SEQ ID No.26的核苷酸序列，所述第三PCR扩增引物组中的所述扩增引物为序列表中SEQ ID No.27至SEQ ID No.34的核苷酸序列。
在本发明的另一个具体实施方式中，所述第一PCR扩增引物组、第二PCR 扩增引物组和第三PCR扩增引物组皆为具有荧光的PCR扩增引物组，检测扩增产物体系具体可以通过遗传分析仪确定第一扩增PCR产物、第二扩增 PCR产物和第三扩增PCR产物中是否存在对应基因的扩增产物。
在本发明的方案中，第一PCR扩增引物组中包括：CYP2B7P1、MUC4、 L.cri、HTN3、STATH、MUC7、LCE2B、DCD和CCL27，共九个基因；第二PCR扩增引物组中包括：LCE1C、LCE2B、CDSN(71)和LOR，共四个基因；第三PCR扩增引物组中包括：DCD、CDSN(86)、KRT2和CCL27，共四个基因。
上述基因是申请人经过大量实验和生物信息学分析筛选出在中国人群的体液包括唾液、阴道分泌物和皮肤中的一种或多种中存在的复合扩增效率好、特异性较高的基因。
容易想到的是，三组PCR扩增引物中还包括B2M管家基因。
本发明提供的第一PCR扩增引物组中，九对扩增引物及其相对应的基因如表1所示，PCRU代表上游引物，PCRL代表下游引物；本发明提供的第二 PCR扩增引物组中，四对扩增引物及其相对应的基因如表2所示，PCRU代表上游引物，PCRL代表下游引物；本发明提供的第三PCR扩增引物组中，四对扩增引物及其相对应的基因如表3所示，PCRU代表上游引物，PCRL代表下游引物。
表1
表2
表3
其中，表2中的LCE2B基因与表1中的LCE2B基因相同，表3中的CCL27 基因与表1中的CCL27基因相同。
本发明方案中的具有荧光的第一PCR扩增引物组如表4所示，具有荧光的第二PCR扩增引物组如表5所示，具有荧光的第三PCR扩增引物组如表6 所示。
表4
表5
表6
本发明方案具有以下优点：
1、通过本发明的方法和系统，可以同时进行包括唾液、阴道分泌物、皮肤等体液或其斑迹组织来源的鉴定，可实现形态学相似的多种体液混合的复杂斑迹的鉴定，实现样本的高效利用；
2、本发明的方法可以实现上述斑迹中的一种、两种，或两种以上混合物的组织来源的鉴定。
3、克服了现有的体液斑迹来源的检测方法通常利用抗人血红蛋白抗体与血红蛋白的交叉反应形成复合物来检测，容易受温度、PH、以及血液质量等的影响，检测结果极易出现假阳性或假阴性的缺陷。
4、克服了现有技术中检测唾液斑主要依赖于检测是否存在淀粉酶，因此仅依靠测出斑迹中有淀粉酶，不能确证唾液，由此使得唾液斑迹检材不能得到有效的利用的问题。
5、通过荧光标记，利用常规的遗传分析仪，根据所要扩增的基因的分子量和荧光颜色的不同，获得直观的检测结果，并且该结果经过测序验证，准确性为100％。
6、本发明提供的方案能有效从基因水平确定中国人群体液的组织来源，大大简化了鉴定刑侦现场体液斑迹的组织来源的步骤，能为明确案件性质、确定犯罪嫌疑人、以及定罪量刑等提供准确的科学依据。
附图说明
图1-1为3种体液样本混合存在时的第一扩增PCR产物的检测结果；
图1-2为3种体液样本混合存在时的第一扩增PCR产物的检测结果；
图2为3种体液样本混合存在时的第二扩增PCR产物的检测结果；
图3为3种体液样本混合存在时的第三扩增PCR产物的检测结果。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明实施例中使用的样本均来自无关个体，其中皮肤擦拭物和唾液样本采自北京某高校，涵盖学生及教师，志愿者中男女比例为1:1，阴道分泌物样本采集自某医院妇产科。分别将采集的上述体液样本制作为类似于刑事案件现场出现的体液样本，简称模拟体液样本，使用本发明的方法进行检测，以获得更符合实际情况的结果。本实施例采用的模拟体液样本中：
皮肤擦拭物样本使用公安部物证鉴定中心研发的生物物证采集棉签采集，分干湿两步法采集于志愿者手部皮肤；
阴道分泌物样本通过医用阴道拭子采集，选取非血性分泌物进行后续实验；
唾液采用Oragene公司生产的唾液RNA收集管(型号RE-100)采集。
各个样本采集数量为：唾液样本78份、阴道分泌物样本72份、皮肤擦拭物样本83份。
验证本发明的系统和方法的准确性
本实施例将上述3种模拟体液样本在混合存在的情况下，分别使用本发明的方法和系统进行检测。
1、预处理
1)用无菌剪刀剪取皮肤棉签以及阴道拭子上的棉花，将其全部置于装有唾液的1.5ml离心管中；
2)加入350μl预先按1:100混入β-巯基乙醇的Buffer(具体裂解液视使用试剂盒的情形而定)，震荡混匀；
3)加入5μl Carrier RNA工作液，混匀；
4)置于56℃加热模块，300rpm加热混匀1小时；
5)4℃孵育过夜待提取。
2、提取DNA
利用所述系统中的RNA提取体系从上述预处理后的待检测体液中提取 RNA，其中，利用Qiagen RNeasy Micro试剂盒：
1)用枪头将预处理后的液体从离心管管中吸出，置于一个新的1.5ml离心管中；
2)于其中加入350μl的70％乙醇，混匀；
3)将上述液体转移至置有RNeasy MinElute spin column的2ml收集管，关闭盖子，10,000rpm离心1min，倾掉废液；
4)在置有RNeasy MinElute spin column的2ml收集管加入350μl RW1，关闭盖子，10,000rpm离心1min，倾掉废液，收集管中的液体转移至2ml离心管中备用；
5)取一0.6ml的离心管，加入70μl RDD和10μl DNase I储存液，充分混匀，配成DNase工作液；
6)将上述DNase工作液滴加至RNeasy MinElute spin column纯化管的膜上，室温下(20-30℃)孵育15min；
7)在置有RNeasy MinElute spin column的2ml收集管加入350μl RW1，轻轻关闭盖子，10,000rpm离心1min，倾掉废液和收集管；
8)将RNeasy MinElute spin column放入新的2ml收集管中，加入500μl BufferRPE。轻轻关闭盖子，10,000rpm离心1min，倾掉废液；
9)在置有RNeasy MinElute spin column的2ml收集管加入500μl 80％乙醇，轻轻关闭盖子，10,000rpm离心2min，倾掉废液和收集管；
10)将RNeasy MinElute spin column放入新的2ml收集管中，打开管盖， 10,000rpm离心5min，倾掉废液和收集管；
11)将RNeasy MinElute spin column放入新的1.5ml离心管中，加入14μl RNase-free water，关闭盖子，室温静置1min，10,000rpm离心3min，获得RNA。
3、逆转录
利用所述系统中的逆转录体系将提取的RNA逆转录为DNA，使用由 InvitrogenTM公司生产的III第一链合成系统进行逆转录过程，其具体的操作流程如下：
1)取8μl提取的RNA，加入1μl随机六聚体引物(Random hexmaers) 和1μl dNTP；
2)65℃孵育5分钟，取出置于冰上降温1分钟；
3)按表7加入反应试剂：
表7
*先混合，在65℃孵育5min，冰上降温1min
4)混匀试剂，25℃孵育10min，50℃孵育50min，85℃孵育5min终止反应；
5)冰上降温至室温；
6)加入1μl RNase H消化剩余RNA，37℃孵育20min；
7)置于-20℃保存。
4、第一扩增反应
利用所述系统中的PCR扩增体系对DNA针对第一PCR扩增引物组中的 CYP2B7P1、MUC4、L.cri、HTN3、STATH、MUC7、LCE2B、DCD和CCL27 九个基因进行第一扩增，使用表4所示的荧光第一PCR扩增引物组，扩增体系如表8所示：
表8
PCR反应在9700型PCR仪上进行，反应条件为95℃15min；95℃20s， 60℃30s，72℃40s，40循环；72℃10min作最后延伸，扩增产物立刻进行电泳检测或置于4℃保存。
5、第一扩增产物的检测
利用所述系统中的检测扩增产物体系检测该第一PCR产物中所述九个基因的扩增产物是否存在。
在实施例中将第一PCR扩增获得的第一产物通过3500XL型遗传分析仪上进行检测，GeneMapper ID-X 1.4软件根据所要扩增的基因的分子量和荧光颜色的不同分析所述九个基因的扩增产物是否存在。
3种模拟体液样本在混合存在的情况下获得的结果如图1-1以及图1-2所示。图1-1为3种体液样本混合存在时的第一扩增PCR产物的检测结果，图 1-2为3种体液样本混合存在时的第一扩增PCR产物的检测结果。图1-1和图1-2皆为第一扩增PCR产物的检测结果。
在上述图1-1和图1-2中，峰的高度代表产物的丰度，峰的颜色为荧光经激发后产生的颜色，在不同的分析仪中，荧光染料经激发后产生的光可能与其本身带有的颜色不同，这对本领域技术人员来说是可以理解的。在图1-1 和图1-2中，从左到右的四组峰分别呈蓝色、绿色、黑色、红色(此处需要说明的是，从左到右的第三组峰在系统显示的颜色为荧光黄，为了使在图中能够明显显示，将其改为黑色)。
图1-1可以看出，阴道分泌物特异性CYP2B7P1、MUC4和L.cri均检测到有表达，图1-2可以看出，唾液特异性HTN3、STATH和MUC7均检测到有表达，图1-1可以看出，皮肤特异性LCE2B检测到有表达。其中，B2M为管家基因。
6、第二扩增反应和第三扩增反应
由于第一扩增PCR产物中检测到LCE2B，因此再次利用本发明系统中的PCR扩增体系同时对DNA针对第二PCR扩增引物组中的LCE1C、LCE2B、CDSN(71)和LOR四个基因进行第二扩增，第三PCR扩增引物组中的DCD、 CDSN(86)、KRT2和CCL27四个基因进行第三扩增，使用表5、表6所示的荧光第二PCR扩增引物组和第三PCR扩增引物组，扩增体系如表9和表 10所示：
表9
| 试剂 | 加入量(μl) | 终浓度 |
| cDNA模板 | 5.0 | |
| 引物LCE1C(10μM) | 0.25 | 0.1μM |
| 引物LCE2B(10μM) | 0.15 | 0.06μM |
| 引物CDSN(71)(10μM) | 0.25 | 0.1μM |
| 引物LOR(10μM) | 0.15 | 0.06μM |
| 引物B2M(10μM) | 0.25 | 0.1μM |
| 10×PCR Buffer(含15mMMg<sup>2+</sup>) | 2.5 | 1× |
| Mg<sup>2+</sup>(25mM) | 1.0 | 共2.5mM |
| dNTP(2.5mM each) | 2.0 | 0.2mM each |
| Qiagen Hotstar Taq Polymerase(5U/μl) | 0.3 | 1.5U |
| ddH<sub>2</sub>O | 13.15 | |
| 总体积 | 25.0 |
表10
7、第二扩增产物和第三扩增产物的检测
利用所述系统中的检测扩增产物体系检测该第二PCR产物中所述 LCE1C、LCE2B、CDSN(71)和LOR四个基因的存在情况以及第三PCR 产物中所述DCD、CDSN(86)、KRT2和CCL27四个基因的存在情况。
获得的结果如图2-图3所示。图2为3种体液样本混合存在时的第二扩增PCR产物的检测结果，图3为3种体液样本混合存在时的第三扩增PCR 产物的检测结果。
在上述图2和图3中，峰的高度代表产物的丰度，峰的颜色为荧光经激发后产生的颜色，在不同的分析仪中，荧光染料经激发后产生的光可能与其本身带有的颜色不同，这对本领域技术人员来说是可以理解的。在图2-3中，从左到右的的四组峰分别呈蓝色、绿色、黑色、红色(此处需要说明的是，从左到右的第三组峰在系统显示的颜色为荧光黄，为了使在图中能够明显显示，将其改为黑色)。
图2可以看出，皮肤特异性LCE1C、LCE2B、CDSN(71)和LOR均检测到有表达，图3可以看出，皮肤特异性DCD、CDSN(86)、KRT2和CCL27 均检测到有表达。其中，B2M为管家基因。
即，第二扩增PCR产物和第三扩增PCR产物共具有LCE1C、LCE2B、 CDSN(71)、LOR、DCD、CDSN(86)、KRT2和CCL27基因中的全部表达 (大于五种基因)。
利用本发明的方法和系统经过三次扩增及检测，结果为样本中含有阴道分泌物、唾液和皮肤。
为了验证上述结果的准确性，将以上3种模拟体液样本的混合物使用表 1-3中没有荧光的引物进行扩增，通过测序分析是否存在SEQ ID NO.1-34中的全部基因的扩增产物，测序结果与上述结果一致性达到100％。
此结果证实本发明的系统和方法在分析唾液、阴道分泌物和皮肤中的一种或多种的组织来源结果准确，能够为明确案件性质、确定犯罪嫌疑人、以及定罪量刑等提供准确的科学依据。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
序列表
<110> 公安部物证鉴定中心
<120> 一种从基因水平鉴定中国人群上皮细胞类体液斑迹组织来源的方法和系统
<141> 2017-10-30
<160> 34
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
agtctaccag ggatatggca tg 22
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
ctatcagaca ctgagcctcg tcc 23
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
ggaccacatt ttatcaggaa 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
tagagaaaca gggcatagga 20
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 5
cagagcaagc ggaagcaca 19
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 6
catctctgca ttgggttccc 20
<210> 7
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 7
tgtttttgct ttaatcttgg ctct 24
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 8
atgccccgtg attactgaag 20
<210> 9
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 9
ttggagctga ttcatctgaa gag 23
<210> 10
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 10
gccaatcaag cctcaataat cat 23
<210> 11
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 11
gtttgtgtgc atctgtgcac tgagtg 26
<210> 12
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 12
gcctacagcg tttgtgcaga catttatagg 30
<210> 13
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 13
cgtgtgacca gggttgacta a 21
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 14
gcaggcattt agggggacac 20
<210> 15
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 15
ctggctggtc tcctcctg 18
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<211> 20
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
<400> 17
agcactgcct gctgtactca 20
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 18
ttcagcccat tttccttagc 20
<210> 19
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 19
tgtgaccccg ctcctgaatc cg 22
<210> 20
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 20
cttgggaggg cacttggggg tg 22
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<213> Artificial Sequence
<400> 21
cgtgtgacca gggttgacta a 21
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gcaggcattt agggggacac 20
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<211> 21
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<400> 28
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<400> 30
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 34
ttcagcccat tttccttagc 20
Claims (10)
1.一种从基因水平鉴定中国人群上皮细胞类体液斑迹组织来源的方法，其特征在于，包括：
利用第一PCR扩增引物组对体液斑迹的DNA进行第一扩增，获得第一扩增PCR产物，所述第一PCR扩增引物组由与CYP2B7P1、MUC4、L.cri、HTN3、STATH、MUC7、LCE2B、DCD和CCL27九个基因一一对应的九对扩增引物组成；
根据所述第一扩增PCR产物中的基因表达情况，判断所述体液斑迹是否含有阴道分泌物、唾液和皮肤中的至少一种。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，
若所述第一扩增PCR产物中具有CYP2B7P1、MUC4和L.cri三种基因表达，则所述体液斑迹为含有阴道分泌物的体液斑迹；
若所述第一扩增PCR产物中具有HTN3、STATH和MUC7三种基因表达，则所述体液斑迹为含有唾液斑迹的体液斑迹。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，
若所述第一扩增PCR产物中具有LCE2B、DCD和CCL27至少一种基因表达，则同时利用第二PCR扩增引物组和第三PCR扩增引物组对所述体液斑迹的DNA分别进行第二扩增和第三扩增，分别获得第二扩增PCR产物和第三扩增PCR产物，
其中，所述第二PCR扩增引物组由与LCE1C、LCE2B、CDSN(71)和LOR四个基因一一对应的四对扩增引物组成，所述第三PCR扩增引物组由与DCD、CDSN(86)、KRT2和CCL27四个基因一一对应的四对扩增引物组成；
根据所述第二扩增PCR产物和第三扩增PCR产物中的基因表达情况，判断所述体液斑迹是否含有皮肤。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，若所述第二扩增PCR产物和第三扩增PCR产物共具有LCE1C、LCE2B、CDSN(71)、LOR、DCD、CDSN(86)、KRT2和CCL27基因中至少五种基因表达，则所述体液斑迹为含有皮肤斑迹的体液斑迹。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述第一PCR扩增引物组中的所述扩增引物为序列表中SEQ ID No.1至SEQ ID No.18的核苷酸序列，所述第二PCR扩增引物组中的所述扩增引物为序列表中SEQ ID No.19至SEQ ID No.26的核苷酸序列，所述第三PCR扩增引物组中的所述扩增引物为序列表中SEQ ID No.27至SEQ ID No.34的核苷酸序列。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述体液斑迹的DNA通过如下方法获得：
从所述体液斑迹中提取RNA；
将提取的RNA逆转录为所述体液斑迹的DNA。
7.一种从基因水平鉴定中国人群上皮细胞类体液斑迹组织来源的系统，其特征在于，包括：PCR扩增体系和检测扩增产物体系，
所述PCR扩增体系用于利用第一PCR扩增引物组对体液斑迹的DNA进行第一扩增，获得第一扩增PCR产物，所述第一PCR扩增引物组由与CYP2B7P1、MUC4、L.cri、HTN3、STATH、MUC7、LCE2B、DCD和CCL27九个基因一一对应的九对扩增引物组成；
所述检测扩增产物体系用户根据所述第一扩增PCR产物中的基因表达情况，判断所述体液斑迹是否含有阴道分泌物、唾液和皮肤中的至少一种。
8.根据权利要求7所述的系统，其特征在于，
若所述检测扩增产物体系检测出所述第一扩增PCR产物中具有CYP2B7P1、MUC4和L.cri三种基因表达，则所述体液斑迹为含有阴道分泌物的体液斑迹；
若所述检测扩增产物体系检测出所述第一扩增PCR产物中具有HTN3、STATH和MUC7三种基因表达，则所述体液斑迹为含有唾液斑迹的体液斑迹。
9.根据权利要求7所述的系统，其特征在于，
若所述检测扩增产物体系检测出所述第一扩增PCR产物中具有LCE2B、DCD和CCL27至少一种基因表达，则所述PCR扩增体系同时利用第二PCR扩增引物组和第三PCR扩增引物组对所述体液斑迹的DNA分别进行第二扩增和第三扩增，分别获得第二扩增PCR产物和第三扩增PCR产物，
其中，所述第二PCR扩增引物组由与LCE1C、LCE2B、CDSN(71)和LOR四个基因一一对应的四对扩增引物组成，所述第三PCR扩增引物组由与DCD、CDSN(86)、KRT2和CCL27四个基因一一对应的四对扩增引物组成；
所述检测扩增产物体系根据所述第二扩增PCR产物和第三扩增PCR产物中的基因表达情况，判断所述体液斑迹是否含有皮肤。
10.根据权利要求9所述的系统，其特征在于，若所述检测扩增产物体系检测出所述第二扩增PCR产物和第三扩增PCR产物共具有LCE1C、LCE2B、CDSN(71)、LOR、DCD、CDSN(86)、KRT2和CCL27基因中至少五种基因表达，则所述体液斑迹为含有皮肤斑迹的体液斑迹。
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Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110358846A (zh) * | 2019-08-29 | 2019-10-22 | 四川大学 | 一种鉴别微量体液斑的组织来源的方法 |
| CN114672576A (zh) * | 2022-04-20 | 2022-06-28 | 山西医科大学 | 一种基于rt-rpa-lfd技术快速检测体液斑的方法 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2011014740A2 (en) * | 2009-07-31 | 2011-02-03 | Chromocell Corporation | Methods and composition for identifying and validating modulators of cell fate |
| CN102203620A (zh) * | 2008-12-24 | 2011-09-28 | 株式会社芳珂 | 对由紫外线导致的皮肤晒斑的抗性的评价方法 |
| CN104419753A (zh) * | 2013-08-29 | 2015-03-18 | 公安部物证鉴定中心 | 一种从基因水平鉴定中国人群体液的组织来源的方法和系统 |
| CA2957538A1 (en) * | 2014-08-08 | 2016-02-11 | Nanostring Technologies, Inc. | Methods for deconvolution of mixed cell populations using gene expression data |
-
2017
- 2017-10-30 CN CN201711035970.5A patent/CN109735626A/zh active Pending
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102203620A (zh) * | 2008-12-24 | 2011-09-28 | 株式会社芳珂 | 对由紫外线导致的皮肤晒斑的抗性的评价方法 |
| WO2011014740A2 (en) * | 2009-07-31 | 2011-02-03 | Chromocell Corporation | Methods and composition for identifying and validating modulators of cell fate |
| US20120276572A1 (en) * | 2009-07-31 | 2012-11-01 | Chromocell Corporation | Methods and compositions for identifying and validating modulators of cell fate |
| CN104419753A (zh) * | 2013-08-29 | 2015-03-18 | 公安部物证鉴定中心 | 一种从基因水平鉴定中国人群体液的组织来源的方法和系统 |
| CA2957538A1 (en) * | 2014-08-08 | 2016-02-11 | Nanostring Technologies, Inc. | Methods for deconvolution of mixed cell populations using gene expression data |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| BRYAN BHOELAI等: ""Can mRNA markers distinguish traces generated by different types of contact?"", 《FORENSIC SCIENCE INTERNATIONAL: GENETICS SUPPLEMENT SERIES》 * |
| DE KONING等: ""Expression profile of cornified envelope structural proteins and keratinocyte differentiation-regulating proteins during skin barrier repair"", 《BRITISH JOURNAL OF DERMATOLOGY》 * |
| FENG SONG等: ""Developed and evaluated a multiplex mRNA profiling system for body fluid identification in Chinese Han population"", 《JOURNAL OF FORENSIC AND LEGAL MEDICINE》 * |
| 赵禾苗等: ""mRNA在体液斑迹鉴定与组织来源推断中的应用"", 《中国法医学杂志》 * |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110358846A (zh) * | 2019-08-29 | 2019-10-22 | 四川大学 | 一种鉴别微量体液斑的组织来源的方法 |
| CN114672576A (zh) * | 2022-04-20 | 2022-06-28 | 山西医科大学 | 一种基于rt-rpa-lfd技术快速检测体液斑的方法 |
| CN114672576B (zh) * | 2022-04-20 | 2023-10-13 | 山西医科大学 | 一种基于rt-rpa-lfd技术快速检测体液斑的方法 |
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