CN109295241A - 一种区别山羊与绵羊肉的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种区别山羊与绵羊肉的方法：（1）提取待测样本基因组DNA；（2）以SEQ ID No:1所示序列为上游引物、以SEQ ID No:2所示序列为下游引物对步骤（1）中的DNA进行PCR扩增，退火温度为58℃，得到不同样品的扩增产物；（3）将不同样品的扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳；（4）结果判断：仅扩增出1条条带的样品为绵羊肉，山羊肉或其他样品扩增出多条条带，或无条带。本发明采用的引物对以绵羊线粒体COI基因为模板，专一性好、特异性高。采用此引物对区分山羊肉与绵羊肉的方法，仅使用一对引物，还可以通过凝胶电泳的结果进行区分，无需测序，不受其他成分的影响，检测成本低，步骤简单、时间短，适合大量供试样品检验。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学检测领域，具体涉及一种山羊肉与绵羊肉的分子鉴定方法。
背景技术
DNA条形码（DNA barcode）技术是一种易于统一、便于掌握、操作标准化的物种鉴定的分子诊断新技术，在消费品检测方面有着很好的应用前景。由于研究发现线粒体COI基因能够对动物界的一万三千多个物种，包括鱼类、鸟类等进行准确鉴定区分。在肉类产品中，也有研究者利用DNA条形码技术对肉制品掺伪中非定向筛选技术进行探索，认为其电泳条带通过基因测序能正确识别多种动物源成分。如专利申请CN 105755149 A中公开了利用COI基因检验羊肉的引物对，但是由于扩增片段短通过电泳会有二聚体等影响不能直观区分，只能再通过测序检测不同物种，增加了试验步骤与流程。而且没有考虑山羊与绵羊肉的检出效果，因此有必要进行DNA条形码技术在山羊肉与绵羊肉鉴定中的应用研究，以提高DNA条码技术在羊肉掺伪中的检出效率。
发明内容
针对目前采用COI区分山羊肉与绵羊肉不直观、试验繁琐的问题，本发明提供一种区别山羊与绵羊肉的引物对，能够通过扩增线粒体COI基因特异性区分山羊肉与绵羊肉。
本发明还提供了一种基于上述引物对的区别山羊与绵羊肉的方法，试验过程简单，检测时间短。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案。
一种区别山羊与绵羊肉的引物对，其序列如SEQ ID No: 1和SEQ ID No: 2所示。
所述引物对以绵羊线粒体COI基因为模板，目的片段的长度为292bp，其序列SEQID No: 3所示。
一种区别山羊与绵羊肉的方法，包括以下步骤：
（1）提取待测样本基因组DNA；
（2）以SEQ ID No: 1所示序列为上游引物、以SEQ ID No: 2所示序列为下游引物对步骤（1）中的DNA进行PCR扩增，退火温度为58℃，得到不同样品的扩增产物；
（3）将不同样品的扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳；
（4）结果判断：电泳结果仅1条条带（阳性结果+）的样品为绵羊肉，山羊肉或其他样品的电泳出现多重条带（多重阳性++），或无条带（阴性结果-）。
优选的，步骤（2）中的PCR条件为：94℃，3-5min；94℃，30s，58℃，30-45s，72℃，1min，25-35个循环；72℃，5-10min。
优选的，步骤（2）中的PCR体系为：
。
优选的，琼脂糖凝胶的浓度为0.8-1.2%。
本发明具有以下有益效果：
本发明采用的引物对以绵羊线粒体COI基因为模板，专一性好、特异性高。采用此引物对区分山羊肉与绵羊肉的方法，仅使用一对引物，还可以通过凝胶电泳的结果进行区分，无需测序，同时能够不受其他成分的影响，检测成本低，步骤简单、时间短，适合大量供试样品检验。
附图说明
图1为实施例1中电泳照片；
图2为实施例2中单一样品特异性检验的电泳照片；
图3为实施例2中混合样品特异性检验的电泳照片。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明，但本发明不受下述实施例的限制。
实施例1 引物对合成
根据GenBank上公布的山羊与绵羊线粒体DNA COI基因序列，经BLAST比对分析，针对各物种特异性碱基位点利用Primer Premier 5.0软件筛选出针对绵羊的特异性引物对，序列如SEQ ID No: 1和SEQ ID No: 2所示，进行商业合成。将获得的引物分别稀释成10 μmol/L浓度后分装，于-20℃下保存、备用；
SEQ ID No: 1 5’-cttgtttgtatgatctgtac-3’；
SEQ ID No: 2 5’-aatatgtggtgggctcatac-3’。
实施例1 山羊肉与绵羊肉的鉴别
（1）将山羊肉与绵羊肉利用动物基因组DNA抽提试剂盒（上海生工B518251）,提取样品基因组DNA，具体方法按照厂家说明书进行，得到DNA样品，稀释浓度到100μg/mL备用；
（2）以SEQ ID No: 1所示序列为上游引物、以SEQ ID No: 2所示序列为下游引物对步骤（1）中的绵羊或山羊样品的DNA进行PCR扩增，扩增体系（25 μL）与条件如下：
94℃，5min；94℃，30s，58℃，30s，72℃，1min，35个循环；72℃，10min；
（3）将获得的目的基因进行琼脂糖凝胶（1%）电泳，电泳照片如图1所示，其中1为DNAMarker（DL2000），2为山羊扩增产物条带，3为绵羊扩增产物条带；
由图1可知，绵羊的扩增产物仅有一条明亮的条带，而山羊的扩增产物有三条条带。将绵羊的条带切胶、提取目的基因然后测序，其序列如SEQ ID No: 3所示。经过BLAST分析，其与绵羊MZ10细胞色素C氧化酶亚基I（COXI）基因（Sequnce ID：KY452706.1）同源性高达99%。
实施例2 特异性验证
2.1 单一样品
为了检测引物对的特异性，取山羊、绵羊、鸡、鸭、猪的样品用于检测。测定方法如实施例1所述，凝胶电泳结果如图2所示，其中1为DNA Marker（DL2000），2为山羊肉扩增产物条带，3为绵羊肉扩增产物条带，4为鸡肉扩增产物条带，5为鸭肉扩增产物条带，6为猪肉扩增产物条带。由图2可知，仅有绵羊肉具有一条明亮条带，其他样品的条带均与其不同。该引物能够准确、特异的区分出绵羊肉。
2.2 混合样品
为检测出引物的特异性，将山羊肉、绵羊肉、鸭肉、鸡肉、猪肉分别与绵羊肉按重量比为1:1混合后，提取基因组DNA，按照实施例1中所述方法进行检测，结果如图3所示，其中1为DNA Marker（DL2000），2为山羊、绵羊混合肉扩增产物条带，3为绵羊肉扩增产物条带，4为鸭肉与绵羊肉混合样品扩增产物条带，5为鸡肉与绵羊肉扩增产物条带，6为猪肉与绵羊肉混合样品扩增产物条带。由图3可知，仅有绵羊肉具有一条明亮条带，其他样品的条带均与其不同。该引物能够准确、特异的区分出绵羊肉。
序列表
<110> 山东省农业科学院农产品研究所
<120> 一种区别山羊与绵羊肉的方法
<130> 20181114
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 1
cttgtttgta tgatctgtac 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 2
aatatgtggt gggctcatac 20
<210> 3
<211> 292
<212> DNA
<213> Ovis aries
<400> 3
ctcttctctc cttcctgtat tagcagctgg tatcacaata ctactaacgg accgaaacct 60
gaatacaacc ttttttgacc cagcaggagg aggagaccct atcctatatc aacacctatt 120
ctgattcttt gggcaccctg aagtatatat tcttatttta cctgggtttg ggataatctc 180
ccatattgtg acctactatt caggaaaaaa agaaccattc ggatatatag gaatagtatg 240
agccataata tcaattgggt tcctaggatt cattgtatga gccaccacat at 292
Claims (6)
1.一种区别山羊与绵羊肉的引物对，其序列如SEQ ID No: 1和SEQ ID No: 2所示。
2. 根据权利要求1所述的引物对，其特征在于，所述引物对以绵羊线粒体COI基因为模板，扩增的目的片段的长度为292bp，其序列SEQ ID No: 3所示。
3.一种区别山羊与绵羊肉的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）提取待测样本基因组DNA；
（2）以SEQ ID No: 1所示序列为上游引物、以SEQ ID No: 2所示序列为下游引物对步骤（1）中的DNA进行PCR扩增，退火温度为58℃，得到不同样品的扩增产物；
（3）将不同样品的扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳；
（4）结果判断：PCR产物电泳结果仅1条条带（阳性结果+）的样品为绵羊肉，山羊肉或其他样品PCR产物出现多重条带（多重阳性++），或无条带（阴性结果-）。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤（2）中的PCR条件为：94℃，3-5min；94℃，30s，58℃，30-45s，72℃，1min，25-35个循环；72℃，5-10min。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤（2）中的PCR体系为：
。
6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤（3）中，琼脂糖凝胶的浓度为0.8-1.2%。
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