CN115927665A - 基于实时荧光pcr的非靶向8种动物源性检测的引物探针组合及试剂盒 - Google Patents

基于实时荧光pcr的非靶向8种动物源性检测的引物探针组合及试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于实时荧光PCR的非靶向8种动物源性检测的引物探针组合及试剂盒包含：正向引物1序列为如SEQ ID No.1所示；反向引物1序列如SEQ ID No.2所示；探针1序列如SEQ ID No.3所示；正向引物2序列如SEQ ID No.4所示；反向引物2序列如SEQ ID No.5所示；探针2序列如SEQ ID No.6所示。本发明的引物探针及试剂盒的特异性强、灵敏度高，实现非靶向8种动物源性成分检测，可以进行马、驴、单峰骆驼、双峰骆驼、猪、鸡、鸭、鹅等8种物种同时检测，提升检测效率，缩短检测时间，降低了成本。尤其对于不明源性成分的动物样品，可以同时检测上述8种常见动物源性。

Description

基于实时荧光PCR的非靶向8种动物源性检测的引物探针组合及试剂盒
技术领域
本发明属于食品检测技术领域，尤其涉及非靶向动物源性检测领域。
背景技术
动物产品是人们赖以生存的物质基础。不同动物产品价格的巨大差异驱使一些不法商贩和企业在生产、加工、流通及餐饮中造假掺假。动物产品真实性分析的国家、行业以及地方标准集中在实时荧光PCR技术。然而，目前基于实时荧光PCR技术的动物产品真实性分析技术都是靶向分析。广泛存在的动物产品造假掺假的欺诈违法行为以及不明源性成分的快速检测需求期待非靶向分析技术。目前，非靶向分析技术只集中在DNA测序技术。但是，检测时间长、试剂耗材成本高以及测序仪普及程度低等原因成为测序技术在食品安全检测中广泛应用的掣肘。
发明内容
本发明所要解决的技术问题为：如何提供一种高效且特异性强的8种常见动物源性的非靶向检测引物探针组合及试剂盒，解决动物产品中非靶向动物源性检测的技术瓶颈，实现不确定成分的样品源性检测。
本发明的技术方案为：非靶向8种动物源性检测的引物探针组合，包含：
正向引物1序列为：TAAATAGGHGAVGGTTTHGAAGA(如SEQ ID No.1)所示；
反向引物1序列为：TCATTRRKGTTCTTRTAGTTGAA(如SEQ ID No.2)所示；
探针1序列为：TGACATGAAAAATCATCGTTGTA(如SEQ ID No.3)所示；
正向引物2序列为：CAAAAGGCTTAAGCCCTTT(如SEQ ID No.4)所示；
反向引物2序列为：ACGGCRATYARGATKGG(如SEQ ID No.5)所示；
探针2序列为：CCAGAGGTTCAAATCCTCTC(如SEQ ID No.6)所示。
进一步地，探针1和2序列的5'端修饰有报告基团，3'端修饰有淬灭基团，报告基团为FAM、HEX、ROX或CY5中的任意一种，淬灭基团为MGB。
进一步地，探针1的5'端修饰有HEX，3'端修饰有MGB，探针2的5'端修饰有ROX，3'端修饰有MGB。
非靶向8种动物源性检测的试剂盒，试剂盒含有SEQ ID No.1～SEQ ID No.6所示的引物和探针。
进一步地，所述试剂盒还含有以下a或b中的一种或多种：
a、Probe qPCR预混液；
b、马、驴、单峰骆驼、双峰骆驼、猪、鸡、鸭、鹅阳性标准品。
动物产品中8种常见动物源性的非靶向检测的方法，步骤如下：
(1)提取动物产品(肉制品和乳制品)的DNA；
(2)以步骤(1)的DNA为模板，利用SEQ ID No.1～SEQ ID No.6的引物和探针进行荧光定量PCR扩增，利用马、驴、单峰骆驼、双峰骆驼、猪、鸡、鸭、鹅阳性标准品做阳性对照，利用灭菌的去离子水做阴性对照，利用DNA提取的空白对照做提取方法的对照组；
(3)Real-time PCR反应结束后，设置Threshold为自动，读取探针的Ct值以及阳性对照、阴性对照和空白对照的Ct；只有当阳性对照Ct≤35，阴性对照和空白对照Ct为0时才可以进行相应探针源性结果的判定；当相应探针的Ct≤35，结果判定为具有相应复合源性。
进一步地，Real-time PCR反应体系为：Probe qPCR预混液10μL、SEQ ID No.1所示的正向引物1 0.5μL，浓度为10μmol/L；SEQ ID No.2所示的反向引物1 0.5μL，浓度为10μmol/L；SEQ ID No.3所示的探针1 0.5μL，浓度为10μmol/L；SEQ ID No.4所示的正向引物20.5μL，浓度为10μmol/L；SEQ ID No.5所示的反向引物2 0.5μL，浓度为10μmol/L；SEQ IDNo.6所示的探针2 0.5μL，浓度为10μmol/L；DNA模板2μL，灭菌的去离子水5μL，总体积20μL。
进一步地，Real-time PCR反应程序为：94℃预变性30s，94℃变性5s，60℃退火延伸31s，40个循环。
本发明通过比对马、驴、单峰骆驼、双峰骆驼、猪、鸡、鸭、鹅、绵羊、山羊、牛、水牛、牦牛、梅花鹿、马鹿、兔及狗等17种动物的线粒体基因组，每种动物选取10个品种或品系的线粒体基因组序列。通过生物信息软件比对上述120条序列，筛选出马、驴、单峰骆驼、双峰骆驼、猪、鸡、鸭、鹅等8种物种之间的保守和序列，利用引物设计软件进行引物和探针的设计。设计的创新性在于需要在100-150bp的序列上筛选出两端保守和中间特异的序列，并且中间特异序列在上述8个物种之间是保守的。两端保守的位置设计引物(兼并引物)，中间特异的位置设计马、驴、单峰骆驼、双峰骆驼、猪等5种物种以及鸡、鸭、鹅等3种物种的复合探针1和2。引物和探针的退火温度控制在55-60℃和65-70℃，并且没有影响退火效率的二级结构，而且要保证引物和探针在线粒体基因上具有高度的特异性，上述设计保证引物和探针可以用于后续的源性检测。
本发明研发了基于实时荧光PCR的非靶向8种动物源性检测的引物和探针及试剂盒。在此过程中实现了同一PCR反应体系同时检测8种动物源性成分。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明的引物、探针及试剂盒的特异性强、灵敏度高，可以实现非靶向8种动物源性成分检测，可以进行马、驴、单峰骆驼、双峰骆驼、猪、鸡、鸭、鹅等8种物种同时检测，提升检测效率，缩短检测时间，降低了成本。尤其对于不明源性成分的动物样品，可以同时检测上述8种常见动物源性。
附图说明
图1利用引物对和HEX和TAMRA修饰探针对马肉、驴肉、单峰骆驼乳、双峰骆驼肉、猪肉、鸡肉、鸭肉、鹅肉、绵羊肉、山羊肉、山羊乳、牛肉、牛奶、牦牛肉、水牛肉、梅花鹿肉、马鹿肉、兔肉以及狗肉等19种动物肌肉和生乳进行的实时荧光定量PCR的检测，马肉出现扩增曲线，其它样品都没有出现扩增曲线，说明引物和探针可以检出马源性。
图2利用引物对和HEX和TAMRA修饰探针对马肉、驴肉、单峰骆驼乳、双峰骆驼肉、猪肉、鸡肉、鸭肉、鹅肉、绵羊肉、山羊肉、山羊乳、牛肉、牛奶、牦牛肉、水牛肉、梅花鹿肉、马鹿肉、兔肉以及狗肉等19种动物肌肉和生乳进行的实时荧光定量PCR的检测，驴肉出现扩增曲线，其它样品都没有出现扩增曲线，说明引物和探针可以检出驴源性。
图3利用引物对和HEX和TAMRA修饰探针对马肉、驴肉、单峰骆驼乳、双峰骆驼肉、猪肉、鸡肉、鸭肉、鹅肉、绵羊肉、山羊肉、山羊乳、牛肉、牛奶、牦牛肉、水牛肉、梅花鹿肉、马鹿肉、兔肉以及狗肉等19种动物肌肉和生乳进行的实时荧光定量PCR的检测，单峰骆驼乳出现扩增曲线，其它样品都没有出现扩增曲线，说明引物和探针可以检出单峰骆驼源性。
图4利用引物对和HEX和TAMRA修饰探针对马肉、驴肉、单峰骆驼乳、双峰骆驼肉、猪肉、鸡肉、鸭肉、鹅肉、绵羊肉、山羊肉、山羊乳、牛肉、牛奶、牦牛肉、水牛肉、梅花鹿肉、马鹿肉、兔肉以及狗肉等19种动物肌肉和生乳进行的实时荧光定量PCR的检测，双峰骆驼肉出现扩增曲线，其它样品都没有出现扩增曲线，说明引物和探针可以检出双峰骆驼源性。
图5利用引物对和HEX和TAMRA修饰探针对马肉、驴肉、单峰骆驼乳、双峰骆驼肉、猪肉、鸡肉、鸭肉、鹅肉、绵羊肉、山羊肉、山羊乳、牛肉、牛奶、牦牛肉、水牛肉、梅花鹿肉、马鹿肉、兔肉以及狗肉等19种动物肌肉和生乳进行的实时荧光定量PCR的检测，猪肉出现扩增曲线，其它样品都没有出现扩增曲线，说明引物和探针可以检出猪源性。
图6利用引物对和ROX和TAMRA修饰探针对马肉、驴肉、单峰骆驼乳、双峰骆驼肉、猪肉、鸡肉、鸭肉、鹅肉、绵羊肉、山羊肉、山羊乳、牛肉、牛奶、牦牛肉、水牛肉、梅花鹿肉、马鹿肉、兔肉以及狗肉等19种动物肌肉和生乳进行的实时荧光定量PCR的检测，鸡肉出现扩增曲线，其它样品都没有出现扩增曲线，说明引物和探针可以检出鸡源性。
图7利用引物对和ROX和TAMRA修饰探针对马肉、驴肉、单峰骆驼乳、双峰骆驼肉、猪肉、鸡肉、鸭肉、鹅肉、绵羊肉、山羊肉、山羊乳、牛肉、牛奶、牦牛肉、水牛肉、梅花鹿肉、马鹿肉、兔肉以及狗肉等19种动物肌肉和生乳进行的实时荧光定量PCR的检测，鸭肉出现扩增曲线，其它样品都没有出现扩增曲线，说明引物和探针可以检出鸭源性。
图8利用引物对和ROX和TAMRA修饰探针对马肉、驴肉、单峰骆驼乳、双峰骆驼肉、猪肉、鸡肉、鸭肉、鹅肉、绵羊肉、山羊肉、山羊乳、牛肉、牛奶、牦牛肉、水牛肉、梅花鹿肉、马鹿肉、兔肉以及狗肉等19种动物肌肉和生乳进行的实时荧光定量PCR的检测，鹅肉出现扩增曲线，其它样品都没有出现扩增曲线，说明引物和探针可以检出鹅源性。
具体实施方式
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为从商业渠道购买得到的。
1、检测方法：
(1)提取肉制品或乳制品的DNA，设立提取空白对照(后续做提取方法的对照组)。
(2)检测DNA的浓度和质量，并将浓度稀释至100-200ng/μL。
(3)利用多重荧光定量PCR引物和探针对稀释DNA进行扩增检测，利用对应的阳性标准品做阳性对照，利用灭菌的去离子水做阴性对照，利用DNA提取的空白对照做提取方法的对照组，Real-time PCR反应体系如表1所示，Real-time PCR扩增参数如表4所示。
表1 Real-time PCR反应体系
Figure BDA0003935055700000041
Figure BDA0003935055700000051
表2 Real-time PCR扩增参数
Figure BDA0003935055700000052
(4)Real-time PCR反应结束后，设置Threshold为自动，读取相应探针的Ct值以及阳性对照、阴性对照和空白对照的Ct；只有当阳性对照Ct≤35，阴性对照和空白对照Ct为0时才可以进行相应探针源性结果的判定；当相应探针的Ct≤35，结果判定为具有相应源性，同时有多个探针的Ct≤35，结果判定为具有相应复合源性。
(5)利用阳性标准品(稀释101到107倍)做引物和探针的绝对检出能力评价。
2、引物和探针序列的设计
由于线粒体在组织中的拷贝数高，而且在动物制品中相对稳定，所以选择线粒体基因设计引物和探针。引物和探针的合成方法：委托北京睿博兴科生物公司按照发明的序列进行合成和纯化。
正向引物1：5'TAAATAGGHGAVGGTTTHGAAGA 3'(SEQ ID No.1)，
反向引物1：5'TCATTRRKGTTCTTRTAGTTGAA 3'(SEQ ID No.2)，
探针1：5'TGACATGAAAAATCATCGTTGTA 3'(SEQ ID No.3)；
正向引物2：5'CAAAAGGCTTAAGCCCTTT 3'(SEQ ID No.1)，
反向引物2：5'ACGGCRATYARGATKGG 3'(SEQ ID No.2)，
探针2：5'CCAGAGGTTCAAATCCTCTC 3'(SEQ ID No.3)；
探针序列的5'端修饰有报告基团，3'端修饰有淬灭基团，其中所述报告基团为FAM、HEX、ROX或CY5中的任意一种，所述淬灭基团为MGB。
利用HEX、ROX和MGB修饰探针对马肉、驴肉、单峰骆驼乳、双峰骆驼肉、猪肉、鸡肉、鸭肉、鹅肉、绵羊肉、山羊肉、山羊乳、牛肉、牛奶、牦牛肉、水牛肉、梅花鹿肉、马鹿肉、兔肉以及狗肉等19种动物肌肉和生乳进行的实时荧光定量PCR的检测。
检测结果如下：
Figure BDA0003935055700000061
结果说明：Ct小于35(不为0)说明样品中有相应源性。对马肉、驴肉、单峰骆驼乳、双峰骆驼肉、猪肉、鸡肉、鸭肉、鹅肉样品中检测出复合源性，而绵羊肉、山羊肉、山羊乳、牛肉、牛奶、牦牛肉、水牛肉、梅花鹿肉、马鹿肉、兔肉以及狗肉样品中没有检测出复合源性。
将马肉、驴肉、单峰骆驼乳、双峰骆驼肉、猪肉、鸡肉、鸭肉、鹅肉样品的基因组DNA分别稀释101到107倍(共8个模板浓度梯度)进行引物和探针的检测限度评价实验。由以下结果可知，探针可以检测到样品中0.005ng的马源性DNA、0.005ng的驴源性DNA、0.1ng单峰骆驼源性DNA、0.05ng双峰骆驼源性DNA、0.05ng猪源性DNA、0.00025ng鸡源性DNA、0.0005ng鸭鹿源性DNA、0.00001ng鹅源性DNA。以上结果说明自主研发的非靶向性检测引物和探针可以对马、驴、单峰骆驼、双峰骆驼、猪、鸡、鸭、鹅等8种物种同时检测，具有较好的灵敏度，理论上相对灵敏度可以达到0.1％。
Figure BDA0003935055700000071
Figure BDA0003935055700000072
Figure BDA0003935055700000073
Figure BDA0003935055700000074
Figure BDA0003935055700000081
Figure BDA0003935055700000082
Figure BDA0003935055700000083
Figure BDA0003935055700000084
Figure BDA0003935055700000091
Figure BDA0003935055700000092
试剂盒制作
非靶向8种动物源性检测试剂盒试剂如下表所示：
Figure BDA0003935055700000093
Figure BDA0003935055700000101

Claims (8)

1.非靶向8种动物源性检测的引物探针组合，其特征在于，包含：
正向引物1序列为如SEQ ID No.1所示；
反向引物1序列如SEQ ID No.2所示；
探针1序列如SEQ ID No.3所示；
正向引物2序列如SEQ ID No.4所示；
反向引物2序列如SEQ ID No.5所示；
探针2序列如SEQ ID No.6所示。
2.根据权利要求1所述的引物探针组合，其特征在于，探针1和2序列的5'端修饰有报告基团，3'端修饰有淬灭基团，报告基团为FAM、HEX、ROX或CY5中的任意一种，淬灭基团为MGB。
3.根据权利要求1所述的引物探针组合，其特征在于，探针1的5'端修饰有HEX，3'端修饰有MGB，探针2的5'端修饰有ROX，3'端修饰有MGB。
4.非靶向8种动物源性检测的试剂盒，其特征在于，试剂盒含有SEQ ID No.1～SEQ IDNo.6所示的引物和探针。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还含有以下a或b中的一种或多种：
a、Probe qPCR预混液；
b、马、驴、单峰骆驼、双峰骆驼、猪、鸡、鸭、鹅阳性标准品。
6.动物产品中8种常见动物源性的非靶向检测的方法，其特征在于，步骤如下：
(1)提取动物产品(肉制品和乳制品)的DNA；
(2)以步骤(1)的DNA为模板，利用SEQ ID No.1～SEQ ID No.6的引物和探针进行荧光定量PCR扩增，利用马、驴、单峰骆驼、双峰骆驼、猪、鸡、鸭、鹅阳性标准品做阳性对照，利用灭菌的去离子水做阴性对照，利用DNA提取的空白对照做提取方法的对照组；
(3)Real-time PCR反应结束后，设置Threshold为自动，读取探针的Ct值以及阳性对照、阴性对照和空白对照的Ct；只有当阳性对照Ct≤35，阴性对照和空白对照Ct为0时才可以进行相应探针源性结果的判定；当相应探针的Ct≤35，结果判定为具有相应复合源性。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，Real-time PCR反应体系为：Probe qPCR预混液10μL、SEQ ID No.1所示的正向引物1 0.5μL，浓度为10μmol/L；SEQ ID No.2所示的反向引物1 0.5μL，浓度为10μmol/L；SEQ ID No.3所示的探针1 0.5μL，浓度为10μmol/L；SEQID No.4所示的正向引物2 0.5μL，浓度为10μmol/L；SEQ ID No.5所示的反向引物2 0.5μL，浓度为10μmol/L；SEQ ID No.6所示的探针2 0.5μL，浓度为10μmol/L；DNA模板2μL，灭菌的去离子水5μL，总体积20μL。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，Real-time PCR反应程序为：94℃预变性30s，94℃变性5s，60℃退火延伸31s，40个循环。
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