CN115807105A - 7种常见动物源性的非靶向检测引物探针组合及试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了7种常见动物源性的非靶向检测引物探针组合及试剂盒，序列如下：正向引物序列如SEQ ID No.1所示；反向引物序列如SEQ ID No.2所示；探针序列如SEQ IDNo.3所示。本发明的引物探针组合及试剂盒的特异性强、灵敏度高，可以实现非靶向7种动物源性成分检测，可以进行绵羊、山羊、牛、水牛、牦牛、梅花鹿、马鹿等7种物种同时检测，提升检测效率，缩短检测时间，降低了成本。尤其对于不明源性成分的动物样品，可以同时检测上述7种常见动物源性。
Description
技术领域
本发明属于食品检测技术领域，尤其涉及非靶向动物源性检测领域。
背景技术
动物产品是人们赖以生存的物质基础。不同动物产品价格的巨大差异驱使一些不法商贩和企业在生产、加工、流通及餐饮中造假掺假。动物产品真实性分析的国家、行业以及地方标准集中在实时荧光PCR技术。然而，目前基于实时荧光PCR技术的动物产品真实性分析技术都是靶向分析。广泛存在的动物产品造假掺假的欺诈违法行为以及不明源性成分的快速检测需求期待非靶向分析技术。目前，非靶向分析技术只集中在DNA测序技术。但是，检测时间长、试剂耗材成本高以及测序仪普及程度低等原因成为测序技术在食品安全检测中广泛应用的掣肘。
发明内容
本发明所要解决的技术问题为：如何提供一种高效且特异性强的7种常见动物源性的非靶向检测引物探针组合及试剂盒，解决动物产品中非靶向动物源性检测的技术瓶颈，实现不确定动物源性的样品源性检测。
本发明的技术方案为：7种常见动物源性的非靶向检测引物探针组合，序列如下：
正向引物序列如SEQ ID No.1(TAAATAGGHGAVGGTTTHGAAGA)所示；
反向引物序列如SEQ ID No.2(TCATTRRKGTTCTTRTAGTTGAA)所示；
探针序列如SEQ ID No.3(TGATATGAAAAACCATCGTTGTC)所示。
进一步地，探针序列的5'端修饰有报告基团，3'端修饰有淬灭基团，报告基团为FAM、HEX、ROX或CY5中的任意一种，淬灭基团为MGB。
作为本发明的另一目的，提供了一种动物产品中7种常见动物源性的非靶向检测试剂盒，该试剂盒中含有：
SEQ ID No.1所示的正向引物，
SEQ ID No.2所示的反向引物，
SEQ ID No.3所示的探针。
进一步地，所述试剂盒中还含有以下a或b的一种或多种：
a、Probe qPCR预混液，
b、绵羊、山羊、黄牛、水牛、牦牛、梅花鹿、马鹿阳性标准品。
动物产品中7种常见动物源性的非靶向检测的方法，步骤如下：
(1)提取待检测动物产品(肉制品和乳制品)的DNA；
(2)以步骤(1)的DNA为模板，利用SEQ ID No.1～SEQ ID No.3的引物和探针进行荧光定量PCR扩增，利用绵羊、山羊、黄牛、水牛、牦牛、梅花鹿、马鹿阳性标准品做阳性对照，利用灭菌的去离子水做阴性对照，利用DNA提取的空白对照做提取方法的对照组；
(3)Real-time PCR反应结束后，设置Threshold为自动，读取探针的Ct值以及阳性对照、阴性对照和空白对照的Ct；只有当阳性对照Ct≤35，阴性对照和空白对照Ct为0时才可以进行相应探针源性结果的判定；当探针的Ct≤35，结果判定为具有相应复合源性。
进一步地，Real-time PCR反应体系为：Probe qPCR预混液10μL、SEQ ID No.1所示的正向引物1μL，浓度为10μmol/L；SEQ ID No.2所示的反向引物1μL，浓度为10μmol/L；SEQID No.3所示的探针1μL，浓度为10μmol/L；DNA模板2μL，灭菌的去离子水5μL，总体积20μL。
进一步地，Real-time PCR反应程序为：94℃预变性30s，94℃变性5s，60℃退火延伸31s，40个循环。
本发明通过比对绵羊、山羊、牛、水牛、牦牛、梅花鹿、马鹿、骆驼、驴、马、猪、兔、狗、鸡、鸭及鹅等16种动物的线粒体基因组，每种动物选取10个品种或品系的线粒体基因组序列。通过生物信息软件比对上述120条序列，筛选出绵羊、山羊、牛、水牛、牦牛、梅花鹿、马鹿等7种物种之间的保守序列，利用引物设计软件进行引物和探针的设计。设计的创新性在于需要在100-150bp的序列上筛选出两端保守和中间特异的序列，并且中间特异序列在上述7个物种之间是保守的。两端保守的位置设计引物(为了保证PCR反应系统中引物可以匹配7种物种的线粒体特征基因设计简并引物，中间特异的位置设计绵羊、山羊、牛、水牛、牦牛、梅花鹿、马鹿等7种物种的复合探针。引物和探针的退火温度控制在55-60℃和65-70℃，并且没有影响退火效率的二级结构，而且要保证引物和探针在线粒体基因上具有高度的特异性，上述设计保证引物和探针可以用于后续的源性检测。
本发明研发了基于实时荧光PCR的非靶向7种动物源性检测的引物探针组合及试剂盒。在此过程中实现了同一PCR反应体系同时检测7种动物源性成分。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明的引物探针组合及试剂盒的特异性强、灵敏度高，可以实现非靶向7种动物源性成分检测，可以进行绵羊、山羊、牛、水牛、牦牛、梅花鹿、马鹿等7种物种同时检测，提升检测效率，缩短检测时间，降低了成本。尤其对于不明源性成分的动物样品，可以同时检测上述7种常见动物源性。
附图说明
图1利用引物对和FAM和TAMRA修饰探针对绵羊肉、山羊肉、山羊乳、牛肉、牛奶、牦牛肉、水牛肉、梅花鹿肉、马鹿肉、马肉、驴肉、骆驼肉、猪肉、兔肉、狗肉、鸡肉、鸭肉及鹅肉等18种动物肌肉和生乳进行的实时荧光定量PCR的检测，绵羊肉出现扩增曲线，其它样品都没有出现扩增曲线，说明引物和探针可以检出绵羊源性。
图2利用引物对和FAM和TAMRA修饰探针对绵羊肉、山羊肉、山羊乳、牛肉、牛奶、牦牛肉、水牛肉、梅花鹿肉、马鹿肉、马肉、驴肉、骆驼肉、猪肉、兔肉、狗肉、鸡肉、鸭肉及鹅肉等18种动物肌肉和生乳进行的实时荧光定量PCR的检测，山羊肉出现扩增曲线，其它样品都没有出现扩增曲线，说明引物和探针可以检出山羊源性。
图3利用引物对和FAM和TAMRA修饰探针对绵羊肉、山羊肉、山羊乳、牛肉、牛奶、牦牛肉、水牛肉、梅花鹿肉、马鹿肉、马肉、驴肉、骆驼肉、猪肉、兔肉、狗肉、鸡肉、鸭肉及鹅肉等18种动物肌肉和生乳进行的实时荧光定量PCR的检测，山羊乳出现扩增曲线，其它样品都没有出现扩增曲线，说明引物和探针可以检出山羊源性。
图4利用引物对和FAM和TAMRA修饰探针对绵羊肉、山羊肉、山羊乳、牛肉、牛奶、牦牛肉、水牛肉、梅花鹿肉、马鹿肉、马肉、驴肉、骆驼肉、猪肉、兔肉、狗肉、鸡肉、鸭肉及鹅肉等18种动物肌肉和生乳进行的实时荧光定量PCR的检测，牛肉出现扩增曲线，其它样品都没有出现扩增曲线，说明引物和探针可以检出牛源性。
图5利用引物对和FAM和TAMRA修饰探针对绵羊肉、山羊肉、山羊乳、牛肉、牛奶、牦牛肉、水牛肉、梅花鹿肉、马鹿肉、马肉、驴肉、骆驼肉、猪肉、兔肉、狗肉、鸡肉、鸭肉及鹅肉等18种动物肌肉和生乳进行的实时荧光定量PCR的检测，牛奶出现扩增曲线，其它样品都没有出现扩增曲线，说明引物和探针可以检出牛源性。
图6利用引物对和FAM和TAMRA修饰探针对绵羊肉、山羊肉、山羊乳、牛肉、牛奶、牦牛肉、水牛肉、梅花鹿肉、马鹿肉、马肉、驴肉、骆驼肉、猪肉、兔肉、狗肉、鸡肉、鸭肉及鹅肉等18种动物肌肉和生乳进行的实时荧光定量PCR的检测，牦牛肉出现扩增曲线，其它样品都没有出现扩增曲线，说明引物和探针可以检出牦牛源性。
图7利用引物对和FAM和TAMRA修饰探针对绵羊肉、山羊肉、山羊乳、牛肉、牛奶、牦牛肉、水牛肉、梅花鹿肉、马鹿肉、马肉、驴肉、骆驼肉、猪肉、兔肉、狗肉、鸡肉、鸭肉及鹅肉等18种动物肌肉和生乳进行的实时荧光定量PCR的检测，水牛肉出现扩增曲线，其它样品都没有出现扩增曲线，说明引物和探针可以检出水牛源性。
图8利用引物对和FAM和TAMRA修饰探针对绵羊肉、山羊肉、山羊乳、牛肉、牛奶、牦牛肉、水牛肉、梅花鹿肉、马鹿肉、马肉、驴肉、骆驼肉、猪肉、兔肉、狗肉、鸡肉、鸭肉及鹅肉等18种动物肌肉和生乳进行的实时荧光定量PCR的检测，梅花鹿肉出现扩增曲线，其它样品都没有出现扩增曲线，说明引物和探针可以检出梅花鹿源性。
图9利用引物对和FAM和TAMRA修饰探针对绵羊肉、山羊肉、山羊乳、牛肉、牛奶、牦牛肉、水牛肉、梅花鹿肉、马鹿肉、马肉、驴肉、骆驼肉、猪肉、兔肉、狗肉、鸡肉、鸭肉及鹅肉等18种动物肌肉和生乳进行的实时荧光定量PCR的检测，马鹿肉出现扩增曲线，其它样品都没有出现扩增曲线，说明引物和探针可以检出马鹿源性。
具体实施方式
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为从商业渠道购买得到的。
1、检测方法：
(1)提取肉制品或乳制品的DNA，设立提取空白对照(后续做提取方法的对照组)。
(2)检测DNA的浓度和质量，并将浓度稀释至100-200ng/μL。
(3)利用多重荧光定量PCR引物和探针对稀释DNA进行扩增检测，利用对应的阳性标准品做阳性对照，利用灭菌的去离子水做阴性对照，利用DNA提取的空白对照做提取方法的对照组，Real-time PCR反应体系如表1所示，Real-time PCR扩增参数如表4所示。
表1Real-time PCR反应体系
| 成分 | 体积(微升) |
| Probe qPCR预混液 | 10 |
| 正向引物 | 1 |
| 反向引物 | 1 |
| 探针 | 1 |
| DNA | 2 |
| 灭菌的去离子水 | 5 |
| 总体积 | 20 |
表2 Real-time PCR扩增参数
(4)Real-time PCR反应结束后，设置Threshold为自动，读取相应探针的Ct值以及阳性对照、阴性对照和空白对照的Ct；只有当阳性对照Ct≤35，阴性对照和空白对照Ct为0时才可以进行相应探针源性结果的判定；当相应探针的Ct≤35，结果判定为具有相应源性，同时有多个探针的Ct≤35，结果判定为具有相应复合源性。
(5)利用阳性标准品(稀释101到107倍)做引物和探针的绝对检出能力评价。
2、引物和探针序列的设计
由于线粒体在组织中的拷贝数高，而且在动物制品中相对稳定，所以选择线粒体基因设计引物和探针。引物和探针的合成方法：委托北京睿博兴科生物公司按照发明的序列进行合成和纯化。
正向引物：5'TAAATAGGHGAVGGTTTHGAAGA 3'(SEQ ID No.1)，
反向引物：5'TCATTRRKGTTCTTRTAGTTGAA 3'(SEQ ID No.2)，
探针：5'TGATATGAAAAACCATCGTTGTC 3'(SEQ ID No.3)；
探针序列的5'端修饰有报告基团，3'端修饰有淬灭基团，其中所述报告基团为FAM、HEX、ROX或CY5中的任意一种，所述淬灭基团为MGB。
利用FAM和MGB修饰探针对绵羊肉、山羊肉、山羊乳、牛肉、牛奶、牦牛肉、水牛肉、梅花鹿肉、马鹿肉、马肉、驴肉、骆驼肉、猪肉、兔肉、狗肉、鸡肉、鸭肉及鹅肉等18种动物肌肉和生乳进行的实时荧光定量PCR的检测。
检测结果如下：
结果说明：Ct小于35(不为0)说明样品中有相应源性。绵羊肉、山羊肉、山羊乳、牛肉、牛奶、牦牛肉、水牛肉、梅花鹿肉、马鹿肉样品中检测出复合源性，而马肉、驴肉、骆驼肉、猪肉、兔肉、狗肉、鸡肉、鸭肉及鹅肉样品中没有检测出复合源性。
将绵羊肉、山羊肉、牛肉、牦牛肉、水牛肉、梅花鹿肉、马鹿肉样品的基因组DNA分别稀释101到107倍(共8个模板浓度梯度)进行引物和探针的检测限度评价实验。由以下结果可知，探针可以检测到样品中1ng的绵羊源性DNA、0.00025ng的山羊源性DNA、0.00025ng牛源性DNA、0.1ng牦牛源性DNA、0.1ng水牛源性DNA、0.0001ng梅花鹿源性DNA、0.0005ng马鹿源性DNA。以上结果说明自主研发的非靶向性检测引物和探针可以对绵羊、山羊、牛、水牛、牦牛、梅花鹿、马鹿等7种物种同时检测，具有较好的灵敏度，理论上相对灵敏度可以达到0.1％。
试剂盒制作
非靶向7种动物源性检测试剂盒试剂如下表所示：
| 试剂 | 说明 |
| Probe qPCR预混液 | 反应体系(酶、dNTP、Mg<sup>2+</sup>) |
| 正向引物 | 浓度为10μmol/L |
| 反向引物 | 浓度为10μmol/L |
| 探针 | 浓度为10μmol/L |
| 绵羊阳性标准品 | 浓度为100ng/μL，用于阳性对照 |
| 山羊阳性标准品 | 浓度为100ng/μL，用于阳性对照 |
| 牛阳性标准品 | 浓度为100ng/μL，用于阳性对照 |
| 水牛阳性标准品 | 浓度为100ng/μL，用于阳性对照 |
| 牦牛阳性标准品 | 浓度为100ng/μL，用于阳性对照 |
| 梅花鹿阳性标准品 | 浓度为100ng/μL，用于阳性对照 |
| 马鹿阳性标准品 | 浓度为100ng/μL，用于阳性对照 |
| 灭菌的去离子水 | 补充反应体系 |
Claims (7)
1.7种常见动物源性的非靶向检测引物探针组合，其特征在于，序列如下：
正向引物序列如SEQ ID No.1所示；
反向引物序列如SEQ ID No.2所示；
探针序列如SEQ ID No.3所示。
2.根据权利要求1所述的引物探针组合，其特征在于，探针序列的5'端修饰有报告基团，3'端修饰有淬灭基团，报告基团为FAM、HEX、ROX或CY5中的任意一种，淬灭基团为MGB。
3.动物产品中7种常见动物源性的非靶向检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒中含有：
SEQ ID No.1所示的正向引物，
SEQ ID No.2所示的反向引物，
SEQ ID No.3所示的探针。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还含有以下a或b的一种或多种：
a、Probe qPCR预混液，
b、绵羊、山羊、黄牛、水牛、牦牛、梅花鹿、马鹿阳性标准品。
5.动物产品中7种常见动物源性的非靶向检测的方法，其特征在于，步骤如下：
(1)提取待检测动物产品的DNA；
(2)以步骤(1)的DNA为模板，利用SEQ ID No.1～SEQ ID No.3的引物和探针进行荧光定量PCR扩增，利用绵羊、山羊、黄牛、水牛、牦牛、梅花鹿、马鹿阳性标准品做阳性对照，利用灭菌的去离子水做阴性对照，利用DNA提取的空白对照做提取方法的对照组；
(3)Real-time PCR反应结束后，设置Threshold为自动，读取探针的Ct值以及阳性对照、阴性对照和空白对照的Ct；只有当阳性对照Ct≤35，阴性对照和空白对照Ct为0时才可以进行相应探针源性结果的判定；当探针的Ct≤35，结果判定为具有相应复合源性。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，Real-time PCR反应体系为：Probe qPCR预混液10μL、SEQ ID No.1所示的正向引物1μL，浓度为10μmol/L；SEQ ID No.2所示的反向引物1μL，浓度为10μmol/L；SEQ ID No.3所示的探针1μL，浓度为10μmol/L；DNA模板2μL，灭菌的去离子水5μL，总体积20μL。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，Real-time PCR反应程序为：94℃预变性30s，94℃变性5s，60℃退火延伸31s，40个循环。
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