CN115851974A - 用于山鸡肉源成分的多重pcr鉴定引物、试剂盒及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了用于山鸡肉源成分的多重PCR特异性鉴定引物，包括山鸡特异性引物，其核苷酸序列为5’‑GTAAAGTAGGACCATGCCTCT‑3’。本发明还公开了包含所述多重PCR特异性鉴定引物的试剂盒，以及山鸡肉源成分的多重PCR鉴定方法。本发明提供的山鸡特异性引物对12S rRNA进行PCR扩增，扩增效果稳定，能够出现151bp特异性条带，有效地鉴定山鸡肉源。
Description
技术领域
本发明涉及多重PCR，具体涉及用于山鸡肉源成分的多重PCR特异性鉴定引物。
背景技术
山鸡，是鸡形目雉科的一种走禽，学名为雉鸡(Phasianuscolchicus)，是经人工长期驯化而来的重要经济禽类。早在2011年出版的《中国畜禽遗传资源志-特种畜禽志》，就已收录左家山、天峨六画山鸡、中国山鸡、美国七彩山鸡等雉鸡品种。2020年农业农村部公布的《国家畜禽遗传资源目录》也包括雉鸡等特种禽类。山鸡性情活泼，善于奔走，喜欢游走觅食，高飞能力不强。由于食量小，食性杂，适应能力强、生产性能高、繁殖快，并且山鸡肉的蛋白质含量高，氨基酸种类丰富，且脂肪含量低，具有较高的肉用价值。近年来我国山鸡养殖业发展迅猛，但假冒山鸡肉的情况也时常发生。因此，研发山鸡肉源成分快速检测技术，对我国山鸡产业的发展具有重要的意义。
对于肉源性成分的鉴定，普遍使用的是实时荧光定量PCR方法。该方法有较高的灵敏度，适合加工食品微量肉源成分检测，且能相对定量，因此该方法被广泛使用。然而，荧光定量PCR的特异性引物设计要求较高，并不一定适应所有物种。使用通用引物和测序的方法，也可对多种肉源性成分进行检测，但这种方法需DNA测序，工作量大、成本高、准确性不高。
发明内容
本发明的目的在于提供用于山鸡肉源成分的多重PCR特异性鉴定引物，对山鸡肉源具有较高特异性，可进行有效鉴定。
实现本发明的技术方案为：用于山鸡肉源成分的多重PCR特异性鉴定引物，包括山鸡特异性引物，其核苷酸序列为5’-GTAAAGTAGGACCATGCCTCT-3’。
进一步地，本发明提供的鉴定引物包括：
山鸡特异引物：5’-GTAAAGTAGGACCATGCCTCT-3’
通用上游引物：5’-GCAAGACAGGTCAAGGTATAGC-3’
通用下游引物：5’-GTACGCTTACCTTGTTACGACT-3’。
本发明的另一个目的是提供包含上述用于山鸡肉源成分的多重PCR特异性鉴定引物的试剂盒。
具体地，试剂盒中至少包括山鸡特异引物：
5’-GTAAAGTAGGACCATGCCTCT-3’。
进一步地，本发明的试剂盒还包括：
通用上游引物：5’-GCAAGACAGGTCAAGGTATAGC-3’
通用下游引物：5’-GTACGCTTACCTTGTTACGACT-3’。
本发明的第三个目的是提供基于上述特异性鉴定引物的山鸡肉源成分的多重PCR鉴定方法。
具体地，山鸡肉源成分的多重PCR鉴定方法，取待鉴定肉源样品，置于裂解液中裂解后，提取基因组DNA，PCR扩增，电泳；当电泳结果中，扩增产物只出现一条约261bp共有扩增条带时，判定样品为非山鸡；当扩增产物同时出现261bp共有扩增条带和151bp山鸡特异条带时，判定样品为山鸡；所述多重PCR扩增采用的引物如下：
通用上游引物：5’-GCAAGACAGGTCAAGGTATAGC-3’
通用下游引物：5’-GTACGCTTACCTTGTTACGACT-3’
山鸡特异引物：5’-GTAAAGTAGGACCATGCCTCT-3’。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明提供山鸡特异性引物对12S rRNA进行常规PCR扩增，不需荧光定量PCR仪等昂贵设备，且扩增效果稳定，能够出现151bp特异性条带，有效地鉴定山鸡肉源；而提供的通用引物，则可以有效避免假阴性。
附图说明
图1为本发明以山鸡胸肌肉为样品的肉源成分鉴定结果；
泳道1-2为山鸡样品，M为DNA marker DL 2000。
图2为10种常见市售肉样品PCR扩增产物的电泳图；
泳道1-2为鸡，3-4为鸭，5-6为鹅，7-8为鸽，9-10为鹌鹑，11-12为兔，13-14为狗、15-16为羊，17-18为牛，19-20为猪，21-22为山鸡，M为DNA marker DL 2000。
图3山鸡引物灵敏度PCR检测电泳图；
泳道1-3为1ng/μL(山鸡肉DNA)，4-6为0.1ng/μL，7-9为0.01ng/μL，10-12为0.001ng/μL，13-15为0.0001ng/μL，16-18为空白对照，M为DNA marker DL2000。
图4为山鸡肉样品PCR扩增产物的电泳图。
图5为鸡肉样品PCR扩增产物的电泳图。
图6为鸭肉样品PCR扩增产物的电泳图。
图7为鹅肉样品PCR扩增产物的电泳图。
图8为鸽肉样品PCR扩增产物的电泳图。
图9为鹌鹑肉样品PCR扩增产物的电泳图。
图10为兔肉样品PCR扩增产物的电泳图。
图11为狗肉样品PCR扩增产物的电泳图。
图12为羊肉样品PCR扩增产物的电泳图。
图13为牛肉样品PCR扩增产物的电泳图。
图14为猪肉样品PCR扩增产物的电泳图。
具体实施方式
下面将更详细地描述本申请的具体实施例。提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本申请，并且能够将本申请的范围完整的传达给本领域的技术人员。
1检测技术的建立
1.1样品来源
从山鸡养殖场取美国七彩山鸡和左家山鸡屠宰个体少许胸肌肉(0.5g)，两个品种数量为公母各30只，装入盛有95％酒精的1.5mL离心管。样品在冷冻环境下运输，-20℃保存备用。
同时，在农贸市场选取鸡、鸭、鹅、鸽、鹌鹑、兔、猪、牛、羊、狗等物种冷冻/新鲜肉样品作为对照。其中，鸡、鸭、鹅、鹌鹑、鸽样品为确认活体后屠宰取得，兔、猪、牛、羊、狗样品为已确定来源屠宰后取得。
1.2引物设计
从GenBank下载山鸡、鸡、鸭、鹅、鸽、鹌鹑、兔、猪、牛、羊、狗的线粒体DNA基因组序列，经生物软件MEGA 7.0序列比对后，寻找山鸡特异位点，然后在山鸡特异位点两侧设计通用引物。最后确定12S rRNA为引物设计区域。
通用上游引物：5’-GCAAGACAGGTCAAGGTATAGC-3’；
通用下游引物：5’-GTACGCTTACCTTGTTACGACT-3’；
山鸡特异引物：5’-GTAAAGTAGGACCATGCCTCT-3’；
其中引物组合1(通用上游引物+通用下游引物)为扩增待检样品的共有片段，引物组合2(山鸡特异引物+通用下游引物)为扩增山鸡特异片段。
1.3基因组DNA提取
剪取少许肌肉，加入预装有100μL裂解液的0.2mL 96孔PCR管板中，剪碎肌肉，加入4μL蛋白酶K，轻微涡旋混匀数秒，短暂离心。在PCR仪中65℃孵育10min，然后95℃处理5min，最后降至12℃。短暂离心后，吸取上清液至新的0.2mL 96孔PCR管板中，可作为直接用于PCR扩增的模板。
裂解液来自成都福际生物的“动物组织直接PCR试剂盒”(http://www.foregene.com/scientific_detail.aspx？t＝19&pid＝5&cid＝68)。
1.4PCR扩增
反应体系为：在200μL的PCR薄壁管中，加入1μL上述制备的模板DNA、15μL扩增缓冲液、0.9μL混合引物(20μmol/L)和13.1μL灭菌水，PCR的反应体系为30μL，加样后短暂离心。PCR反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，33个循环；72℃延伸5min。
混合引物：
通用上游引物：5’-GCAAGACAGGTCAAGGTATAGC-3’；
通用下游引物：5’-GTACGCTTACCTTGTTACGACT-3’；
山鸡特异引物：5’-GTAAAGTAGGACCATGCCTCT-3’。
扩增缓冲液来自成都福际生物的“动物组织直接PCR试剂盒”(http://www.foregene.com/scientific_detail.aspx？t＝19&pid＝5&cid＝68)。
1.5琼脂糖凝胶电泳
将1.5％琼脂糖凝胶置(预混GelRed染料)于1×TAE电泳缓冲液中。取3μL反应产物点样于凝胶孔中。室温下，150V、150mA电泳30min。在凝胶成像系统中成像并拍摄照片。
1.6结果判读
当扩增产物只出现一条约261bp共有扩增条带时，说明PCR扩增良好，判定样品为非山鸡；当扩增产物同时出现261bp共有扩增条带和151bp山鸡特异条带时，说明PCR扩增良好，样品判定为山鸡。若未出现任何条带，则不能判定检测样品的来源。
2可行性验证
运用本发明建立的方法对通过活体鉴定来源的200日龄山鸡雌雄各6只进行肉源鉴定。对每个个体采取少许胸肌肉样品，通过本发明提供的肉源鉴定结果与活体鉴定的结果完全吻合。具体方法参见下述第5部分的实施例。
3特异性验证
随机选取经过活体或外形验证鸡、鸭、鹅、鸽、鹌鹑、兔、猪、牛、羊、狗肌肉样品各10份，经“动物组织直接PCR试剂盒”裂解液(成都福际生物)提取基因组DNA后，直接用本发明设计的引物组进行PCR扩增。结果如图2所示，山鸡样品可扩增出两条带(261bp，151bp)，而其他检测样品则只能扩增出一条带(253-266bp)。
为进一步验证本发明建立的山鸡肉源检测技术的特异性，将本发明的任意两条引物输入NCBI的引物设计界面Primer-BLAST(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi)进行电子PCR试验，数据库选择为“nr”(核苷酸片段)，目标生物选为“vertebrata(taxid:7742)”(脊椎动物门)，其他选项为默认参数。组合1(通用上游引物+通用下游引物)返回993条结果，覆盖了本发明所使用的所有物种，目标基因是12SrRNA，目标条带在253-266bp左右。组合2(山鸡特异引物+通用引物下游)返回8条结果，扩增目标均为雉属，且目标基因和扩增长度完成吻合。组合3(通用上游引物+山鸡特异引物)未找到特异扩增目标(没有返回结果)。
4灵敏度验证
用超纯水将山鸡DNA稀释为1ng/μL、0.1ng/μL、0.01ng/μL、0.001ng/μL、0.0001ng/μL，按上述1中所述的方法进行PCR。结果如图3所示，0.01ng/μL肉样DNA浓度仍有较清晰信号，可知该引物的灵敏度可达0.01ng/μL纯山鸡肉DNA样品。
5实施例
选取经过活体或外形验证山鸡、鸡、鸭、鹅、鸽、鹌鹑、兔、猪、牛、羊、狗新鲜/冷冻肌肉样品进行单盲测试。即样品编号后，交由不知样品来源的试验人员进行肉源成分检测工作。样品数量如下表所示，经“动物组织直接PCR试剂盒”裂解液(成都福际生物)提取基因组DNA后，直接用本发明设计的引物组进行PCR扩增。结果如图4-14所示，所有山鸡样品均可扩增两条带(261bp，151bp)，而其他检测样品则只能扩增出一条带(253-266bp)。样品总数为705，成功鉴定数为703，成功率99.7％。
| 物种 | 样品类型 | 品种数量 | 样品数量 | 鉴定成功数量 |
| 山鸡 | 新鲜肌肉 | 2 | 120 | 120 |
| 鸡 | 新鲜肌肉 | 4 | 96 | 96 |
| 鸭 | 冷冻肌肉 | 2 | 48 | 48 |
| 鹅 | 新鲜肌肉 | 3 | 75 | 75 |
| 鸽 | 冷冻肌肉 | 3 | 74 | 74 |
| 鹌鹑 | 冷冻肌肉 | 1 | 49 | 49 |
| 兔 | 冷冻肌肉 | 1 | 50 | 50 |
| 猪 | 新鲜肌肉 | 2 | 48 | 47 |
| 牛 | 冷冻肌肉 | 2 | 49 | 49 |
| 羊 | 冷冻肌肉 | 2 | 48 | 48 |
| 狗 | 冷冻肌肉 | 1 | 48 | 47 |
Claims (4)
1.用于山鸡肉源成分的多重PCR特异性鉴定引物，其特征是，包括山鸡特异性引物，其核苷酸序列为5’-GTAAAGTAGGACCATGCCTCT-3’。
2.根据权利要求1所述的用于山鸡肉源成分的多重PCR特异性鉴定引物，其特征是，还包括以下通用引物：
通用上游引物：5’-GCAAGACAGGTCAAGGTATAGC-3’；
通用下游引物：5’-GTACGCTTACCTTGTTACGACT-3’。
3.包含权利要求1或2所述的用于山鸡肉源成分的多重PCR特异性鉴定引物的试剂盒。
4.山鸡肉源成分的多重PCR鉴定方法，其特征是，取待鉴定肉源样品，置于裂解液中裂解后，提取基因组DNA，PCR扩增，电泳；当电泳结果中，扩增产物只出现一条约261bp共有扩增条带时，判定样品为非山鸡；当扩增产物同时出现261bp共有扩增条带和151bp山鸡特异条带时，判定样品为山鸡；所述多重PCR扩增采用的引物如下：
通用上游引物：5’-GCAAGACAGGTCAAGGTATAGC-3’
通用下游引物：5’-GTACGCTTACCTTGTTACGACT-3’
山鸡特异引物：5’-GTAAAGTAGGACCATGCCTCT-3’。
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