CN115820867A - 用于鹧鸪肉源成分的多重pcr鉴定引物、试剂盒及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了用于鹧鸪肉源成分的多重PCR特异性鉴定引物，包括鹧鸪特异性引物，其核苷酸序列为5’‑GGCCCACCTATGTAAATCATCT‑3’。本发明还公开了包含所述多重PCR特异性鉴定引物的试剂盒，以及鹧鸪肉源成分的多重PCR鉴定方法。本发明提供的鹧鸪特异性引物对16S rRNA进行PCR扩增，扩增效果稳定，能够出现167bp特异性条带，有效地鉴定鹧鸪肉源。
Description
技术领域
本发明涉及多重PCR，具体涉及用于鹧鸪肉源成分的多重PCR特异性鉴定引物。
背景技术
鹧鸪，又名为美国鹧鸪，学名为石鸡(Alectoris chukar)。鹧鸪肉蛋白质含量高、脂肪含量低，具有极高的营养价值，素有“一鸪顶九鸡”的民间说法。我国早在上世纪八十年代就开始从国外引进饲养，已被国家畜禽遗传资源委员会列为特禽，全国年出栏量近亿只，在禽类市场已有一定的影响力。随着生活水平的不断提高，人们对肉类的需求已由数量向质量转变。随着活禽市场的逐渐取消和饲养成本的不断增加，冰鲜肉/冷冻肉及分割肉的市场份额不断提升，以次充好的现象层出不穷。因此，研究动物源性食品安全检测技术，对食品动物源性成分进行准确鉴定，显得尤为重要。
对于肉源性成分的鉴定，普遍使用的是实时荧光定量PCR方法。该方法有较高的灵敏度，适合加工食品微量肉源成分检测，且能相对定量，因此该方法被广泛使用。公开号CN102337335A、公开日2012年2月1日的中国发明专利申请公开了家养鹧鸪(石鸡)源性成分实时荧光PCR检测引物与探针，但该方法对假阴性无法辨别，且无法鉴定部分物种肉源成分。公开号CN102337336A、公开日2012年2月1日的中国发明专利申请公开了一对家养鹧鸪(石鸡)源性成分PCR检测用引物，但该方法无法鉴别假阴性样品，且无法鉴定部分物种肉源成分。然而，荧光定量PCR对有些物种的特异性探针和引物难以设计，且一套探针、引物仅对应某特定的单一的物种成分。也有使用通用引物和克隆测序的方法，对多种肉源性成分进行检测。但这种方法需筛选阳性克隆，工作量大、成本高、还存在漏检的情况。
发明内容
本发明的目的在于提供用于鹧鸪肉源成分的多重PCR特异性鉴定引物，对鹧鸪肉源具有较高特异性，可进行有效鉴定。
实现本发明的技术方案为：用于鹧鸪肉源成分的多重PCR特异性鉴定引物，包括鹧鸪特异性引物，其核苷酸序列为5’-ggcccacctatgtaaatcatct-3’。
进一步地，本发明提供的鉴定引物包括：
鹧鸪特异引物：5’-GGCCCACCTATGTAAATCATCT-3’
通用上游引物：5’-CGCGGTATCCTAACCGTGC-3’
通用下游引物：5’-CTGGGGTAGCTTGGTCCATT-3’。
本发明的另一个目的是提供包含上述用于鹧鸪肉源成分的多重PCR特异性鉴定引物的试剂盒。
具体地，试剂盒中至少包括鹧鸪特异引物：
5’-GGCCCACCTATGTAAATCATCT-3’。
进一步地，本发明的试剂盒还包括：
通用上游引物：5’-CGCGGTATCCTAACCGTGC-3’
通用下游引物：5’-CTGGGGTAGCTTGGTCCATT-3’。
本发明的第三个目的是提供基于上述特异性鉴定引物的鹧鸪肉源成分的多重PCR鉴定方法。
具体地，鹧鸪肉源成分的多重PCR鉴定方法，取待鉴定肉源样品，置于裂解液中裂解后，提取基因组DNA，PCR扩增，电泳；当电泳结果中，扩增产物只出现一条377bp共有扩增条带时，判定样品为非鹧鸪；当扩增产物同时出现377bp共有扩增条带和167bp鹧鸪特异条带时，判定样品为鹧鸪；所述多重PCR扩增采用的引物如下：
通用上游引物：5’-CGCGGTATCCTAACCGTGC-3’
通用下游引物：5’-CTGGGGTAGCTTGGTCCATT-3’
鹧鸪特异引物：5’-GGCCCACCTATGTAAATCATCT-3’。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明提供鹧鸪特异性引物对16S rRNA进行常规PCR扩增，不需荧光定量PCR仪等昂贵设备，且扩增效果稳定，能够出现167bp特异性条带，有效地鉴定鹧鸪肉源；而提供的通用引物，则可以有效避免假阴性。
附图说明
图1为本发明以鹧鸪胸肌肉为样品的肉源成分鉴定结果；
泳道1-6为雄性，7-12为雌性，M为DNA marker DL 2000。
图2为10种常见市售肉样品PCR扩增产物的电泳图；
泳道1-2为鸡，3-4为鸭，5-6为鹅，7-8为鸽，9-10为鹌鹑，11-12为兔，13-14为狗、15-16为羊，17-18为牛，19-20为猪，21-22为鹧鸪，M为DNA marker DL 2000。
图3为CN102337335A的引物PCR扩增常见市售肉样品的电泳图；
泳道1-3为鹧鸪，4-6为猪，7-9为羊，10-12为牛，13-15为狗，16-18为兔，19-21为番鸭、22-24为鸭，25-27为鹅，28-30为鹌鹑，31-33为鸽，34-36为鸡，37-39为空白对照，M为DNAmarker DL 2000。
图4为CN102337336A的引物PCR扩增常见市售肉样品的电泳图；
泳道1-3为鹧鸪，4-6为猪，7-9为羊，10-12为牛，13-15为狗，16-18为兔，19-21为番鸭、22-24为鸭，25-27为鹅，28-30为鹌鹑，31-33为鸽，34-36为鸡，37-39为空白对照，M为DNAmarker DL 2000。
图5鹧鸪引物灵敏度PCR检测电泳图；
泳道1-3为10ng/μL(鹧鸪肉DNA)，4-6为1ng/μL，7-9为0.1ng/μL，10-12为0.01ng/μL，13-15为0.001ng/μL，16-18为空白对照，M为DNA marker DL 2000。
图6为鹧鸪肉样品PCR扩增产物的电泳图。
图7为鸡肉样品PCR扩增产物的电泳图。
图8为鸭肉样品PCR扩增产物的电泳图。
图9为鹅肉样品PCR扩增产物的电泳图。
图10为鸽肉样品PCR扩增产物的电泳图。
图11为鹌鹑肉样品PCR扩增产物的电泳图。
图12为兔肉样品PCR扩增产物的电泳图。
图13为狗肉样品PCR扩增产物的电泳图。
图14为羊肉样品PCR扩增产物的电泳图。
图15为牛肉样品PCR扩增产物的电泳图。
图16为猪肉样品PCR扩增产物的电泳图。
具体实施方式
下面将更详细地描述本申请的具体实施例。提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本申请，并且能够将本申请的范围完整的传达给本领域的技术人员。
1检测技术的建立
1.1样品来源
从鹧鸪养殖场剪取屠宰个体少许胸肌肉(1g)，数量为公母各60只，装入盛有95％酒精的1.5mL离心管。样品在冷冻环境下运输，-20℃保存备用。
同时，在农贸市场选取鸡、鸭、鹅、鸽、鹌鹑、兔、猪、牛、羊、狗等物种冷冻/新鲜肉样品作为对照。其中，鸡、鸭、鹅、鹌鹑、鸽样品为确认活体后屠宰取得，兔、猪、牛、羊、狗样品为已确定来源屠宰后取得。
1.2引物设计
从GenBank下载鹧鸪(石鸡)、鸡、鸭、鹅、鸽、鹌鹑、兔、猪、牛、羊、狗的线粒体DNA基因组序列，经生物软件MEGA 7.0序列比对后，寻找鹧鸪特异位点，然后在鹧鸪特异位点两侧设计通用引物。最后确定16S rRNA为引物设计区域。
通用上游引物：5’-CGCGGTATCCTAACCGTGC-3’；
通用下游引物：5’-CTGGGGTAGCTTGGTCCATT-3’；
鹧鸪特异引物：5’-GGCCCACCTATGTAAATCATCT-3’；
其中引物组合1(通用上游引物+通用下游引物)为扩增待检样品的共有片段，引物组合2(鹧鸪特异引物+通用下游引物)为扩增鹧鸪特异片段。
1.3基因组DNA提取
剪取少许肌肉，加入预装有100μL裂解液的0.2mL 96孔PCR管板中，剪碎肌肉，加入4μL蛋白酶K，轻微涡旋混匀数秒，短暂离心。在PCR仪中65℃孵育10min，然后95℃处理5min，最后降至12℃。短暂离心后，吸取上清液至新的0.2mL 96孔PCR管板中，可作为直接用于PCR扩增的模板。
裂解液来自成都福际生物的“动物组织直接PCR试剂盒”(http://www.foregene.com/scientific_detail.aspx？t＝19&pid＝5&cid＝68)。
1.4 PCR扩增
反应体系为：在200μL的PCR薄壁管中，加入1μL上述制备的模板DNA、15μL扩增缓冲液、0.9μL 混合引物(20μmol/L)和13.1μL灭菌水，PCR的反应体系为30μL，加样后短暂离心。PCR反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，59℃退火30s，72℃延伸50s，33个循环；72℃延伸5min。
混合引物：
通用上游引物：5’-CGCGGTATCCTAACCGTGC-3’；
通用下游引物：5’-CTGGGGTAGCTTGGTCCATT-3’；
鹧鸪特异引物：5’-GGCCCACCTATGTAAATCATCT-3’。
扩增缓冲液来自成都福际生物的“动物组织直接PCR试剂盒”(http://www.foregene.com/scientific_detail.aspx？t＝19&pid＝5&cid＝68)。
1.5琼脂糖凝胶电泳
将1.5％琼脂糖凝胶置(预混GelRed染料)于1×TAE电泳缓冲液中。取3μL 反应产物点样于凝胶孔中。室温下，150V、150mA电泳30min。在凝胶成像系统中成像并拍摄照片。
1.6结果判读
当扩增产物只出现一条377bp共有扩增条带时，说明PCR扩增良好，判定样品为非鹧鸪；当扩增产物同时出现377bp共有扩增条带和167bp鹧鸪特异条带时，说明PCR扩增良好，样品判定为鹧鸪。若未出现任何条带，则不能判定检测样品的来源。
2可行性验证
运用本发明建立的方法对通过活体鉴定来源的200日龄美国鹧鸪雌雄各6只进行肉源鉴定。对每个个体采取少许胸肌肉样品，通过本发明提供的肉源鉴定结果与活体鉴定的结果完全吻合。具体方法参见下述第5部分的实施例。
3特异性验证
随机选取经过活体或外形验证鸡、鸭、鹅、鸽、鹌鹑、兔、猪、牛、羊、狗肌肉样品各10份，经“动物组织直接PCR试剂盒”裂解液(成都福际生物)提取基因组DNA后，直接用本发明设计的引物组进行PCR扩增。结果如图2所示，鹧鸪样品可扩增出两条带(377bp，167bp)，而其他检测样品则只能扩增出一条带(377bp)。
为进一步验证本发明建立的鹧鸪肉源检测技术的特异性，将本发明的任意两条引物输入NCBI的引物设计界面Primer-BLAST(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi)进行电子PCR试验，数据库选择为“nr”(核苷酸片段)，目标生物为“Vertebrata(taxid:7742)”(脊椎动物门)，其他选项为默认参数。组合1(通用上游引物+通用下游引物)返回981条结果，除了猪、牛、狗、羊特异性较差些(在本专利中PCR扩增效果良好)，其余物种尤其是鸟纲引物序列基本完全匹配，目标条带在377bp左右，目标基因是16S rRNA。组合2(鹧鸪特异引物+通用引物下游)返回5条结果，扩增目标均为鹧鸪属，且目标基因和扩增长度完成吻合。组合3(通用上游引物+鹧鸪特异引物)未找到特异扩增目标。
选用CN102337335A的引物5’-AGCACACTTCGGAGTTATGTTTGT-3’和5’-AGTATCGGCGAGGTATGCCG-3’，PCR反应程序：94℃预变性5min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸5min。结果如图3所示，鹧鸪样品可扩增出一条带(89bp)，部分猪、鸡样品也可扩增出微弱的89bp条带。Primer-BLAST结果显示，除鹧鸪外，还可扩增出灰背斑鸠、血鸡、鹦鹉、啄木鸟、丝光椋鸟、金丝燕等野生鸟类样品。此外，该方法对假阴性检测样品无法辨别。
选用CN102337336A的引物5’-GCCCCGGCTAAAGACGAGGTAA-3’和5’-GAATTTTTGATATTTAGGGTGAG-3’，PCR反应程序：94℃预变性5min；94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸5min。结果如图4所示，鹧鸪样品可扩增出一条带(184bp)，部分番鸭样品也可扩增出微弱的184bp条带。此外，该方法无法辨别假阴性的检测样品。
4灵敏度验证
用超纯水将鹧鸪DNA稀释为10ng/μL、1ng/μL、0.1ng/μL、0.01ng/μL、0.001ng/μL，按上述1中所述的方法进行PCR。结果如图5所示，0.01ng/μL肉样DNA浓度仍有微弱信号，可知该引物的灵敏度可达0.01ng/μL纯鹧鸪肉DNA样品。
5实施例
选取经过活体或外形验证鹧鸪、鸡、鸭、鹅、鸽、鹌鹑、兔、猪、牛、羊、狗新鲜/冷冻肌肉样品进行单盲测试。即样品编号后，交由不知样品来源的试验人员进行肉源成分检测工作。样品数量如下表所示，经“动物组织直接PCR试剂盒”裂解液(成都福际生物)提取基因组DNA后，直接用本发明设计的引物组进行PCR扩增。结果如图6-16所示，所有鹧鸪样品均可扩增两条带(377bp，167bp)，而其他检测样品则只能扩增出一条带(377bp)。样品总数为731，成功鉴定数为730，成功率接近100％。
Claims (4)
1.用于鹧鸪肉源成分的多重PCR特异性鉴定引物，其特征是，包括鹧鸪特异性引物，其核苷酸序列为5’-GGCCCACCTATGTAAATCATCT-3’。
2.根据权利要求1所述的用于鹧鸪肉源成分的多重PCR特异性鉴定引物，其特征是，还包括以下通用引物：
通用上游引物：5’-CGCGGTATCCTAACCGTGC-3’；
通用下游引物：5’-CTGGGGTAGCTTGGTCCATT-3’。
3.包含权利要求1或2所述的用于鹧鸪肉源成分的多重PCR特异性鉴定引物的试剂盒。
4.鹧鸪肉源成分的多重PCR鉴定方法，其特征是，取待鉴定肉源样品，置于裂解液中裂解后，提取基因组DNA，PCR扩增，电泳；当电泳结果中，扩增产物只出现一条377bp共有扩增条带时，判定样品为非鹧鸪；当扩增产物同时出现377bp共有扩增条带和167bp鹧鸪特异条带时，判定样品为鹧鸪；所述多重PCR扩增采用的引物如下：
通用上游引物：5’-CGCGGTATCCTAACCGTGC-3’
通用下游引物：5’-CTGGGGTAGCTTGGTCCATT-3’
鹧鸪特异引物：5’-GGCCCACCTATGTAAATCATCT-3’。
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