JP2000279197A - Ｈｉｖの変異の検出方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【課題】HIVの逆転写酵素並びにプロテアーゼ領域にお
ける変異の検出のための簡便かつ迅速な方法、並びに当
該方法に使用するためのキットの提供。 【解決手段】 HIVの逆転写酵素コード領域の特定の５
カ所のコドン並びにプロテアーゼコード領域の特定の７
カ所のコドンの少なくとも一カ所の変異を検出するため
の方法であり、以下の工程：遺伝子変異の近傍に3'末端
が位置するように設定された固相化プローブに、遺伝子
増幅された検体サンプルをハイブリダイズさせ、DNAポ
リメラーゼを加えてプローブの3'末端を伸長合成する
が、その際、プローブの特徴に従い適宜選択された標識
基質を取込ませ、そして取込まれた標識基質の有無を検
出することからなる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、HIVの薬剤耐性に
主に関与する点変異の検出に関する。特定すれば、本発
明は、HIVの点変異の検出において、点変異部位近傍を
3'末端とする新規なプローブを用い、検体サンプルとハ
イブリダイズさせた後、DNAポリメラーゼを用いた基質
取込み反応を行うことで、特異的に点変異を検出するこ
とを特徴とする。

【０００２】

【従来の技術】ヒト免疫不全ウイルス（Human Immunode
ficiency Virus：HIV）に対する化学療法は、新たな薬
剤の開発により大きく進歩した。

【０００３】現在もっとも良く知られている化学療法剤
であるジドプシン（3'-azido-2',3'-dideoxythymidin
e：AZT）は制ガン剤の開発を目指して合成されたが、の
ちにウイルス増殖抑制作用が見いだされて、HIVの化学
療法剤として使用されるに至った。さらに、AZTの類似
の薬剤として、ジダノシン（2',3'-dideoxyinosine：dd
I）、ザルシタビン（2',3'-dideoxycytidine：ddC）、
ラミブジン（2'-deoxy-3'-Thiacytidine：3TC）、スタ
ブジン（2',3'-dideoxy-2',3'-didehydrothymidine：d4
T）等が臨床において用いられるに至った。これらの薬
剤は、何れも逆転写酵素（Reverse-Transcriptase：R
T）の阻害剤であり、3'部分にOH基を有さないダイデオ
キシヌクレオシド誘導体であるため、RTによるDNA鎖の
伸長合成において基質として取り込まれると、DNA鎖の
伸長合成が停止する。

【０００４】しかしながら、1989年、AZTを投与された
患者において、数十倍から数百倍AZTに対して感受性の
低下した変異株、即ちAZT耐性変異株が分離された（Lar
derら、Science，243：1731-1734，1989)。AZT耐性変異
株の塩基配列を決定したところ、コドン41（Met→Le
u）、67（Asp→Asn）、70（Lys→Arg）、215（Thr→Tyr
又はPhe）及び219（Lys→Gln）等に点変異が検出された
（Smithら、Clin．Invest．Med.，Vol.17，226-243，19
94）。そしてその後も、ラミブジン耐性株からコドン18
4（Met→Val）における点変異が高頻度に検出されるな
ど（Tisdaleら、Proc．Natl．Acad．Sci．90．5653-565
6，1993）、ddI及びddC等の他のRT阻害剤に耐性を付与
する、RTコード遺伝子（pol）上のアミノ酸置換が相次
いで報告された（De Clarcq，J．Med．Chem.，38：2491
-2517，1995）。報告されたアミノ酸置換における特徴
は、鋳型RNAプライマーがRTと結合する溝に沿って分布
することである。即ち、正当な基質であるdNTPとddNTP
を厳密に認識することにより、耐性を獲得すると推測さ
れている。

【０００５】しかしながら、驚くことに、このようなAZ
T耐性の発現はAZTと3TCを組み合わせて投与することに
より遅延し得ることが見いだされた。即ち、AZT単独投
与により出現するAZT耐性株に、新たに3TC耐性変異であ
るコドン184の変異（Met→Val）が加わると、再びAZT感
受性になることがわかった（Larderら、Science，269：
696-699，1995）。この現象は、AZT/ddC及びAZT/ddIの
長期併用投与においても報告されている（木村ら、診断
と治療, Vol.86, 549-555, 1998参照）。

【０００６】レトロウイルスの多くは、酵素や構成蛋白
質を各々別々に合成するのではなく、複合蛋白質（poly
protein）として合成した後に、プロテアーゼの作用に
より各々の蛋白質に分断する。HIVによりコードされる
プロテアーゼは、99アミノ酸からなり、RTのすぐ上流に
位置する。即ち、プロテアーゼ蛋白質とRT蛋白質は複合
蛋白質として産生されて、プロテアーゼの作用により各
々の蛋白質に切断される。プロテアーゼ阻害剤はこの切
断を阻害する。プロテアーゼ阻害剤としては、サキナビ
ル（saquinavir）、リトナビル（ritonavir）、インジ
ナビル（indinavir）、ネルフィナビル（nelfinavir）
等が知られているが、これらに対しても耐性変異が同定
された。現在までに、コドン10（Leu→Ile）、コドン30
（Asp→Asn）、コドン48（Gly→Val）、コドン71（Ala
→Val）、コドン82（Val→Ala）、コドン84（Ile→Va
l）、及びコドン90（Leu→Met）等における変異が報告
されているが、変異部位は何れもプロテアーゼ基質結合
部位周辺である（Candraら、Nature，Vol．374，569-57
1，1995）。これらの耐性変異の特徴として、１個のア
ミノ酸置換のみでは強い耐性にはならないこと、及び、
これらの変異部位は阻害剤特異的ではなく、異なる阻害
剤が１種類から数種類の共通のアミノ酸変異に関与する
ことが挙げられる。

【０００７】現在、HIV耐性変異を検出するために用い
られている方法を以下に挙げる。 １．シークエンス法 最も一般的なのは、HIVのゲノムRNA等、目的とする遺伝
子又はそのPCR増幅産物をプラスミドにクローニング
し、そしてダイデオキシ法によりシークエンスする方法
である（例えば、Sangerら、Proc. Natl. Acad. Sci. 7
4, 5463-5467, 1977参照)。シークエンス法は操作が非
常に煩雑であり、またHIVは非常に変異性が高いため、
多様な変異を持つクアジスピーシズ（quasi species）
な状態で存在する可能性が高い。よって、正確な情報を
得るためには非常に多くのクローンに関してシークエン
スを行う必要があり、解析もより複雑になる。

【０００８】２．ダイレクトシークエンス法 ダイレクトシークエンス法は、HIVのゲノム遺伝子等、
目的とする遺伝子のPCR増幅産物をダイデオキシ法によ
り直接シークエンスし、解析して点変異を確認する方法
である。シークエンス法に比べてクローニングの必要が
なく、手技的な煩雑さは多少低減される。しかしなが
ら、解析の段階で数種類のピークが検出された場合、ク
アジスピーシズなのか、それともノイズなのかの判定が
難しい。

【０００９】３．PCR-SSO法 SSOとは、Sequence Specific Oligonucleotideの略であ
る。固相化したプローブに対するハイブリダイゼーショ
ンの効率により判定する方法である。即ち、薬剤耐性に
関係する各々の変異に対応するプローブを担体に固相化
し、遺伝子増幅した産物をハイブリダイズさせ、ミスマ
ッチの有無によるハイブリダイゼーションの効率の差を
利用して判定する。Murex社は、担体にメンブレンを使
用し、複数のプローブを平行線上に固相化して判定する
ラインプローブアッセイ法により逆転写酵素領域の７ケ
所の変異を判定する方法を製品化している。しかしなが
ら、ハイブリダイゼーションのみにより１塩基の変異を
検出するためには温度条件を厳密にする必要があり、ま
た、耐性とは無関係の変異が高頻度で生じやすいためハ
イブリダイゼーション効率に影響する場合もあるので、
安定した結果を得ることが難しい。

【００１０】４．PCR-SSP法 SSPとは、Sequence Specific Primerの略である。点変
異に対応する塩基を3'末端に有する遺伝子増幅用プライ
マーを用い、プライマーの3'末端が相補的であるか否か
によってPCRによる増幅効率に著しく差が生じることを
利用して、点変異の有無を検出する方法である。プライ
マー領域に薬剤耐性とは無関係の変異が存在した場合、
それが原因で増幅効率が低下する場合があり、所望の効
果が得られない場合がある。

【００１１】５．PCR-SSCP法 SSCPとは、single strand conformation polymorphism
（一本鎖配座多型）の略である。PCR産物を一本鎖とし
てから非変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動して、移
動度の差異により変異の有無を検出する。しかしなが
ら、クアジスピーシズの影響により、非常に多数の移動
度の異なるバンドが検出されてしまうことがあり、安定
した結果が得られ難い。

【００１２】６．PCR-RFLP法 RFLPとは、restirction fragment length polymorphism
（制限断片長多型）の略であり、PCR産物の制限酵素切
断の有無に基づき変異を検出する。しかしながら、薬剤
耐性とは無関係の変異が存在した場合、その変異の影響
で制限酵素が認識できない可能性があり、本来の性能を
発揮できない場合がある。

【００１３】変異性の高いHIVに薬剤を投与して治療を
行う場合、遺伝子の変異による耐性ウイルスは比較的早
期に出現すると考えられている。そのため、治療中の変
異型の出現を簡便かつ正確に把握することは、薬剤の投
与方法や使用すべき薬剤の変更などの指標として非常に
有用である。

【００１４】

【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の目的
は、従来のHIV変異型検出方法の問題点である手法の煩
雑さを軽減又は解消し、そして簡便かつ正確な点変異検
出のための方法及び試薬を提供することである。

【００１５】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、HIVの薬
剤に対する耐性を主に決定する遺伝子上の点変異を簡便
かつ正確に検出するために、HIVのゲノム遺伝子もしく
はヒトゲノムに組込まれたプロウイルス遺伝子の増幅産
物について、プローブの3'末端を点変異部位近傍に設定
すること、そしてプローブを用いてハイブリダイズ反応
を実施した後に、プローブをプライマーとして伸長合成
反応を行うことで、検出精度が高まることを見いだし
て、本発明を完成するに至った。

【００１６】本発明は、一つの側面において、HIV遺伝
子の変異を検出する方法であって、検出する変異が、逆
転写酵素コード領域（配列番号：38）のコドン41、67、
70、184及び215並びにプロテアーゼコード領域（配列番
号：37）のコドン10、30、48、71、82、84及び90の少な
くとも一カ所であり、以下の工程：遺伝子変異の近傍に
3'末端が位置するように設定された固相化プローブに、
遺伝子増幅された検体サンプルをハイブリダイズさせ、
DNAポリメラーゼを加えてプローブの3'末端を伸長合成
するが、その際、標識基質を取込ませ、そして取込まれ
た標識基質の有無を検出することからなる、変異検出方
法を提供する。

【００１７】好ましい態様によれば、変異を検出するた
めの検体サンプルの遺伝子増幅用プライマーとして、配
列番号：１〜配列番号：13の13種類のプライマーの中か
ら、目的の変異の上流側及び下流側に位置するフォワー
ドプライマー及びリバースプライマーを選択してプライ
マーセットとして用いる（表１参照）。

【００１８】最も好ましい態様によれば、変異を検出す
るためのプローブは、配列番号：14〜配列番号：36の23
種類のプローブから選択される（表２参照）。本発明
は、別の側面において、上記プライマーセットを含むPC
R反応用試薬；上記プローブが固相化された固相支持
体；DNAポリメラーゼ；及び標識基質を含有する緩衝液
を含む、HIV遺伝子の変異を検出するためのキットを提
供する。

【００１９】本発明は、さらに別の側面において、HIV
遺伝子の変異を検出するための上記の特定のプライマー
及びプローブも提供する。

【００２０】

【発明の実施の形態】本発明の変異検出方法について、
以下に詳細に説明する。HIVの薬剤耐性を主に決定する
変異を効率良く判定するためには、それを含む領域を遺
伝子増幅する必要がある。そのための鋳型としては、HI
VのゲノムRNA並びにヒトゲノムに組み込まれた状態のプ
ロウイルスが最も一般的と考えられるが、これらに限定
されない。遺伝子は、ウイルスのゲノムであればウイル
スのエンベロープとカプシドに含まれており、またプロ
ウイルスを含むヒトゲノムであれば細胞膜や核膜に包ま
れている。これらを含む検体としては血液が主であるた
め、これらの材料を単離して、そこから遺伝子を抽出し
精製する必要がある。

【００２１】抽出した遺伝子を鋳型として、遺伝子増幅
を行う際に使用するプライマーは、変異が存在する、ウ
イルスの逆転写酵素領域及びプロテアーゼ領域におよそ
20〜30塩基の長さで設定することが望ましい。プライマ
ーの長さや設定する位置は、得られている情報を基に、
遺伝子増幅の標的とする遺伝子の配列やその周辺で確認
もしくは報告されている変異等を充分に考慮する必要が
ある。また、これらの方法で得られる増幅産物は、野生
型、変異型に関わらず均等に増幅されることが望まし
い。さらに、マイクロプレートでの検出段階で良好な結
果を得るためには、増幅産物は50〜300bpであることが
望ましい。

【００２２】HIVのゲノムRNAを遺伝子増幅するにはいく
つかの方法が考えられる。最も基本的な方法は、検体サ
ンプルからウイルスのゲノムRNAを抽出及び精製した
後、逆転写酵素を使用してcDNAを作製し、それを鋳型と
して遺伝子増幅を行う。cDNAを作製する段階で配列特異
的なプライマーを用いることにより作製するcDNAを特定
してもよいし、またランダムプライマーを使用して不特
定なcDNAを作製してもよい。

【００２３】逆転写活性を有するDNAポリメラーゼを用
いることにより、抽出・精製したHIVゲノムRNAを直接遺
伝子増幅してもよい。プロウイルスとしてヒトゲノムに
組み込まれたウイルスの場合は、ウイルスの遺伝子が組
み込まれたヒトゲノム（リンパ球由来）を抽出及び精製
した後、遺伝子増幅を行うことにより、本発明に使用可
能となる。

【００２４】本発明のHIV変異検出方法のための遺伝子
増幅においては、配列番号：１〜13のプライマーを使用
することが好ましい。増幅産物は加温もしくはアルカリ
性にすることで一本鎖DNAとし、マイクロプレート等の
担体に固相化したプローブとハイブリダイズさせる。

【００２５】本発明の方法において使用するプローブ
は、25〜50塩基程度の合成オリゴマーが好ましく、特開
平９−257798号に記載されたような合成の際に5'末端に
付加された強疎水性基を介してプレートに固相化、ある
いは各種の官能基を用いて固相化されていることが好ま
しい。

【００２６】本発明の点変異検出方法においては、プロ
ーブの設定が非常に重要である。本発明の方法において
使用するプローブは、その3'末端を、検出目的である点
変異の近傍に設定する。プローブ設定の態様は以下の２
通りがある。

【００２７】第１の設定法は、プローブの3'末端を変異
部位中に設定する。この方法は、野生型プローブと変異
型プローブの２種類のプローブを用い、ハイブリダイズ
しているプローブの3'からの伸長合成（取込み）反応に
際して野生型と変異型に共通な１種類の標識塩基のみを
用いるように、プローブの3'末端の位置を適宜設定す
る。良好な結果を得るためには、プローブの3'末端又は
その１塩基上流が点変異部位となることが望ましい。

【００２８】例えば、逆転写酵素コード領域のコドン18
4のMet（ATG）からVal（GTG）への変異には、下記配列
中の右端のコドンの第１塩基（A又はG）を3'末端とする
下線の２種類のプローブ（配列番号：20（野生型）；配
列番号：21（変異型））：AAAATCCAGA CATAGTTATC TATCAATACA TG（Met：野生型）AAAATCCAGA CATAGTTATC TATCAATACG TG（Val：変異型） を用いて、取込み反応における標識基質として、両コド
ンに共通な第２塩基Tの相補性塩基A（dATP）を用いる。
即ち、各々のプローブに関する標識基質の取込みの有無
又は取込み量の差は、野生型と変異型の有無又は混合比
を反映する。

【００２９】第２の設定法は、プローブの3'末端を変異
部位外の上流側に設定する。即ち、１種類のプローブの
みを変異部位のすぐ上流に設定して、野生型と変異型と
で別々の標識基質を用いて、取込み反応における差異を
検出する。

【００３０】例えば、逆転写酵素コード領域のコドン21
5のThr（ACC）からTyr（TAC）又はPhe（TTC）への変異
には、コドンACCの１塩基上流を3'末端とする１種類の
プローブ（下線部：配列番号：22）： CTGAGACAAC ATCTGTTGAG GTGGGGATTTACC（Thr：野生型） TAC（Tyr：変異型） TTC（Phe：変異型） を用いて、取込み反応における標識基質として、コドン
ACC（Thr）の第１塩基Aの相補性塩基T（dTTP、但し、修
飾体の結合位置によってはdUTPとなる）並びにTAC（Ty
r）及びTTC（Phe）の第１塩基Tの相補性塩基A（dATP）
を用いる。即ち、２種類の標識基質の取込みの有無又は
取込み量の差は、野生型と変異型の有無又は混合比を反
映する。

【００３１】本明細書においては、便宜上、前者の方法
を「２プローブ法」と呼び、後者を「１プローブ法」と
呼ぶ。尚、プローブの設定は、センス側及びアンチセン
ス側の何れでも可能である。変異の多いHIVではデータ
ベース等で情報を確認し、目的とする点変異以外には変
異の少ない側に設定することが望ましい。

【００３２】本発明のHIV変異検出方法においては、配
列番号：14〜36のプローブを用いることが好ましい。こ
れらのうち、配列番号：22は１プローブ法用であり、そ
の他は２プローブ法用である。

【００３３】ハイブリダイゼーション条件は、反応温
度、反応時間、溶液の組成等を考慮の上、検討する必要
がある。溶液の組成は塩濃度やTm値を降下させる物質
（ホルムアミド、尿素など）の濃度の検討を行い、反応
温度や反応時間と合せて最適な反応条件を設定する。こ
の過程により、増幅段階で非特異的に増幅した目的領域
以外の増幅産物はハイブリダイズすることができず、選
択的に排除される。

【００３４】プローブを担体に固相化するための好まし
い方法としては、特開平09-257798に記載されている疎
水性保護基を介する固相化法、あるいはプローブの末端
に修飾体、例えばビオチンを結合させ、ビオチンに特異
的に結合する物質、例えばストレプトアビジンを予め固
相化した担体と反応させることで固相化する方法等があ
るが、これらに限定されない。

【００３５】特開平09-257798に記載されている方法
は、合成オリゴヌクレオチドの合成過程において得られ
る疎水性保護基を末端に有する合成オリゴマーが疎水性
担体に強固に結合することを利用する固相化法並びに遺
伝子検出方法である。即ち、ホスホアミダイト法により
合成されたオリゴマーはアミダイトの5'末端保護基であ
るジメトキシトリチル基（DMT）、モノメトキシトリチ
ル基（MMT）、トリチル基等の強疎水性基を酸処理によ
り脱離させて使用するのが普通であるが、この疎水性基
を残して疎水性担体に固相化された核酸が脱落しにく
く、また、ハイブリダイゼーション効率においてより確
実な結果をもたらすことが確認されている。本発明の好
ましい態様においては、この疎水性基を残して疎水性担
体に固相化されたプローブを目的遺伝子とハイブリダイ
ズさせたのちに、基質取込み反応を利用して標識を導入
して検出を行う。

【００３６】固相化する濃度に関しては濃度を変更して
検討を行い、最適な量を選択することが望ましい。担体
としては、マイクロプレート、チューブ、ビーズ等が挙
げられるが、使用の簡便さではマイクロプレートが最も
適当であると考えられる。本明細書においては、特に断
らない限り、マイクロプレートを使用する場合を例示す
る。

【００３７】２プローブ法及び１プローブ法共に、１ケ
所のコドンの点変異（野生型と変異型）を判定するため
には、２ウェルが必要である。検体サンプルの増幅産物
とプローブのハイブリダイズ反応の終了後、プレートを
洗浄し、次の段階の反応を行う。

【００３８】洗浄後のプレートは、固相化されたプロー
ブに増幅産物がハイブリダイズしている状態である。２
プローブ法及び１プローブ法共に、遺伝子増幅産物であ
る検体中のウイルスゲノムが野生型と変異型の両方の混
在する混合型の場合、野生型と変異型の両方で取込みが
生じ、プローブの3'末端に標識体が結合することにな
る。この場合、取込まれる標識体の量の差は混合量比を
反映する。

【００３９】標識体としてはビオチン、ジニトロフェニ
ル(DNP)、ジゴキシゲニン(Dig)及び蛍光標識物質などが
有用であるが、これらに限定されない。基質にはdATP、
dCTP、dGTP及びdTTP(dUTP)が有用であるが、ダイデオキ
シの基質を使用してもよい。

【００４０】取込み反応に試用するDNAポリメラーゼ
は、特に限定されない。但し、２プローブ法の場合は、
反応温度を高くして分子運動を高めることで特異性が向
上するため、耐熱性のポリメラーゼを使用することが望
ましい。

【００４１】標識基質の取込み反応は、本発明の方法全
体の精度を左右する段階であるから、使用するDNAポリ
メラーゼの反応温度が重要な要因のひとつとなる。１プ
ローブ法は基質の相補性を認識するポリメラーゼの特異
性が重要であるため、ポリメラーゼの至適温度にするこ
とが必要である。一方、２プローブ法の特異性は、プロ
ーブの3'末端近傍と遺伝子増幅産物の目的とする点変異
部位の配列がマッチしているか否かに依存する。即ち、
ミスマッチの場合、温度を適正に保つことでプローブと
遺伝子増幅産物の間に物理的な距離を生じさせ、基質の
取込みを生じさせなくする。この時の温度が高すぎれ
ば、マッチ／ミスマッチに関係無く、プローブと遺伝子
増幅産物が離れてしまう。反対に温度が低すぎれば、マ
ッチ／ミスマッチに関係なく取込みが生じてしまう。こ
の段階での温度は、数℃の差により結果が大きく変わる
可能性があるため、注意が必要である。反応させる溶液
にグリセロール、尿素、ホルムアミド等を加えることに
より、遺伝子のTm値を調整することも可能である。

【００４２】反応終了後、プレートを洗浄し、次の段階
の反応を行う。洗浄後のプレートは、上記の反応により
固相化したプローブの3'末端に標識体が結合しているウ
ェルと、結合していないウェルが存在する。上記の反応
により結合させた標識体がビオチンの場合はストレプト
アビジン（アビジン）、DNP及びDiG等の場合には各々の
抗体等の標識体に対して特異性の高い物質に、ペルオキ
シダーゼやアルカリフォスファターゼ等の酵素を結合さ
せた物質を使用し、標識体に酵素を結合させる。ストレ
プトアビジン-ビオチンや抗原抗体反応は非常に特異性
が高く、本発明の点変異検出法の反応で取込ませた標識
体に対し、特異的に酵素を標識することができる。ま
た、この段階で酵素の代わりに蛍光物質を取込ませるこ
とで、蛍光により検出を行うことも可能である。

【００４３】反応終了後、プレートを洗浄し、次の段階
の反応を行う。好ましくは、上記の反応で取込ませた酵
素の作用により発色もしくは化学発光するような基質を
加えて反応させ、酵素の有無を検出する。発色反応であ
ればその発色に適した波長での吸光度を測定することで
発色の度合いを数値データとすることができる。化学発
光の場合はルミノメーター等を使用することで検出する
ことができる。酵素の有無はDNAポリメラーゼによる標
識基質の取込みに反映され、よって、遺伝子増幅産物の
変異の種類を示すことになる。

【００４４】これら蛍光、発色、化学発光として検出さ
れたデータからカットオフ値に従って陽性と陰性を判定
し、野生型と変異型を判定する。検出に発色を採用した
場合は、充分な発色が得られれば目視での判定も可能で
ある。

【００４５】以下、本発明を実施例により具体的に説明
するが、下記実施例は例示であり、本発明を限定するた
めのものではない。

【００４６】

【実施例】本実施例はHIVの薬剤耐性に関与すると考え
られている遺伝子変異のうち、逆転写酵素阻害剤に対す
る耐性に関与すると考えられている、逆転写酵素領域の
コドン41（Met→Leu）、67（Asp→Asn）、70（Lys→Ar
g）、184（Met→Val）及び215（Thr→Tyr/Phe）、並び
にプロテアーゼ阻害剤に対する耐性に関与すると考えら
れている、プロテアーゼ領域のコドン10（Leu→Ile）、
30（Asp→Asn）、48（Gly→Val）、71（Ala→Val）、82
（Val→Ala）、84（Ile→Val）及び90（Leu→Met）の、
合計12ケ所の野生型と変異型を判定した。逆転写酵素コ
ード領域を配列番号：38として、またプロテアーゼコー
ド領域を配列番号：37として配列表に記載するが、配列
番号：38は逆転写酵素のコドン１−239のみを含む。

【００４７】１．遺伝子増幅 検体は、血液中のHIVウイルスから抽出したゲノム遺伝
子の逆転写により生成したcDNA、並びにHIVウイルスが
感染したリンパ球から抽出した、ウイルスがプロウイル
スとして組み込まれたヒトゲノムウイルスを使用した。
これらを鋳型として７組（〜）のプライマーセット
を用いて遺伝子増幅を行った。プライマーセットは逆
転写酵素のコドン41（配列番号：１及び２）、はコド
ン67と70（配列番号：１及び３）、はコドン184（配
列番号：４及び５)、はコドン215（配列番号：６及び
７）、はプロテアーゼのコドン10と30（配列番号：８
及び９)、はコドン48と71（配列番号：10及び11）、
そして、はコドン82と84と90（配列番号：12及び13）
に対応する。

【００４８】各々のコドンとプライマー設定位置の関係
を以下の表１に記載する。

【００４９】

【表１】逆転写酵素 コドン（ヌクレオチド番号） プライマー配列番号（ヌクレオチド番号） 41(2250-2252) 配列番号：１（2190-2211）及び 配列番号：２（2997-2276） 67(2328-2330)及び70(2337-2339) 配列番号：１（2190-2211）及び 配列番号：３（2401-2380） 184(2679-2681) 配列番号：４（2616-2638）及び 配列番号：５（2714-2691） 215(2772-2774） 配列番号：６（2717-2739）及び 配列番号：７（2841-2820）プロテアーゼ コドン（ヌクレオチド番号） プライマー配列番号（ヌクレオチド番号） 10(1860-1862)及び30(1920-1922) 配列番号：８（1804-1823）及び 配列番号：９（1945-1923) 48(1974-1976)及び71(2043-4045) 配列番号：10（1946-1965）及び 配列番号：11（2072-2053） 82(2076-2078)及び84(2082-2084) 配列番号：12（2016-2035）及び 及び90(2100-2102） 配列番号：13（2131-2110） 溶液の組成と反応条件は、以下のとおりである。

【００５０】 10×反応バッファー 2.5μｌ 1mM dNTPs 5.0μｌ 0.1mM フォワードプライマー 0.25μｌ 0.1mM リバースプライマー 0.25μｌ Taq.ポリメラーゼ 0.125μｌ 蒸留水 7.0μｌ 鋳型DNA 10.0μｌ 25μｌスケールにおいて、〜は１サンプルずつ、そ
してのみ２サンプル増幅した。

【００５１】反応条件は、Perkin Elmer社のGeneAmp960
0を使用する場合、95℃／30秒 → 60℃／30秒 → 7
2℃／30秒：40サイクル行った。 ２．プレートの作製 マイクロプレートに23種類（配列番号：14〜36）のプロ
ーブを固相化して、検出用プレートを作製した。後述す
るミニシークエンスの段階で１プローブ法を使用する逆
転写酵素のコドン215を除く11種類に関しては、野生型
と変異型の各々のプローブを固相化した。逆転写酵素の
コドン215に関しては、同じプローブを２ウェルに固相
化した。プローブは、特開平09-257798に準じて固相化
した。即ち、合成の段階で5'末端にジメトキシトリチル
(DMT)を残して精製し、このプローブを１ng/μｌになる
ように2M NaCl水溶液に加え、100μｌ/ウェルで加えて
１時間以上室温に放置し、1% BSAを含むPBSで室温30分
以上ブロッキングを行った後、洗浄して使用した。１検
体12種類の点変異を検出するために24ウェルが必要であ
るから、96ウェルプレートでは同時に４検体の判定が可
能である。

【００５２】３．ハイブリダイゼーション 増幅が終了した遺伝子増幅産物に対して当量の25μｌの
0.4M NaOHを加えて一本鎖に変性させた後、ハイブリダ
イゼーション液（6× SSPE、1% Tween-20、0.03M 塩
酸）を100μｌずつ加えた検出用プレートに10μｌずつ
加えた。の産物は、逆転写酵素のコドン41（配列番
号：14及び15）、はコドン67（配列番号：16及び17）
と70（配列番号：18及び19）、はコドン184（配列番
号：20及び21）、はコドン215（配列番号：22）、
はプロテアーゼのコドン10（配列番号：23及び24）と30
（配列番号：25及び26）、はコドン48（配列番号：27
及び28）と71（配列番号：29及び30）、はコドン82
（配列番号：31及び32）と84（配列番号：33及び34）と
90（配列番号：35及び36）に加えた。各々のコドンには
野生型と変異型の2ウェルがあるので、その各々に加え
る必要がある。変性させるために加えたNaOHはハイブリ
ダイゼーション液中の塩酸で中和される。このプレート
を55℃で30分間インキュベートした。

【００５３】各々のコドンとプローブ設定位置の関係を
以下の表２に示す。

【００５４】

【表２】 逆転写酵素変異 （１）コドン41変異（Met→Leu）検出用 ATG（Met） 配列番号：14： TAAAAGCATT AGTAGAAATT TGTACAGAAA（センス鎖） 配列番号：15： TAAAAGCATT AGTAGAAATT TGTACAGAA(C/T)（センス鎖） (C/T)TG（Leu） （２）コドン67変異（Asp→Asn）検出用 GAC（Asp） 配列番号：16： ATACTCCAGT GTTTGCCATA AAGAAAAA(A/G)G（センス鎖） 配列番号：17： ATACTCCAGT GTTTGCCATA AAGAAAAA(A/G)A（センス鎖） AAC（Asn） （３）コドン70変異（Lys→Arg）検出用 （Lys）AAA 配列番号：18： GTTCTCTGAA ATCTACTAAT TTTCTCCATT（アンチセンス鎖） 配列番号：19： GTTCTCTGAA ATCTACTAAT TTTCTCCATC（アンチセンス鎖） （Arg）AGA （４）コドン184変異（Met→Val）検出用 ATG（Met） 配列番号：20： AAAATCCAGA CATAGTTATC TATCAATACA（センス鎖） 配列番号：21： AAAATCCAGA CATAGTTATC TATCAATACG（センス鎖） GTG（Val） （５）コドン215変異（Thr→Tyr/Phe）検出用 ACC（Thr） 配列番号：22： CTGAGACAAC ATCTGTTGAG GTGGGGATTT（センス鎖） TAC（Tyr） TTC（Phe） プロテアーゼ変異 （１）コドン10変異（Leu→Ile）検出用 CTC（Leu) 配列番号：23： TCCCTCAGAT CACTCTTTGG CAACGACCCC（センス鎖） 配列番号：24： TCCCTCAGAT CACTCTTTGG CAACGACCCA（センス鎖） ATC（Ile） （２）コドン30変異（Asp→Asn）検出用 GAT（Asp) 配列番号：25： AGGAAGCTCT ATTAGATACA GGAGCAGATG（センス鎖） 配列番号：26： AGGAAGCTCT ATTAGATACA GGAGCAGATA（センス鎖） AAT（Asn） （３）コドン48変異（Gly→Val）検出用 （Gly）GGG 配列番号：27： TCTTACTTTG ATAAAACCTC CAATTCCCCC（アンチセンス鎖） 配列番号：28： TCTTACTTTG ATAAAACCTC CAATTCCCAC（アンチセンス鎖） （Val）GTG （４）コドン71変異（Ala→Val）検出用 GCT（Ala） 配列番号：29： GATACCCATA GAAATCTGTG GACATAAAGC（センス鎖） 配列番号：30： GATACCCATA GAAATCTGTG GACATAAAGT（センス鎖） GTT（Val） （５）コドン82変異（Val→Ala）検出用 GTC（Val） 配列番号：31： GGTACAGTAT TAGTAGGACC TACACCTGTC（センス鎖） 配列番号：32： GGTACAGTAT TAGTAGGACC TACACCTGCC（センス鎖） GCC（Ala） （６）コドン84変異（Ile→Val）検出用 ATA（Ile） 配列番号：33： CAGTATTAGT AGGACCTACA CCTGTCAA(C/T)A（センス鎖） 配列番号：34： CAGTATTAGT AGGACCTACA CCTGTCAA(C/T)G（センス鎖） GTA（Val） （７）コドン90変異（Leu→Met）検出用 TTG（Leu） 配列番号：35： CACCTGTCAA CATAATTGGA AGAAATCTGT（センス鎖） 配列番号：36： CACCTGTCAA CATAATTGGA AGAAATCTGA（センス鎖） ATG（Met） ４．ミニシークエンス プレートを洗浄した後、Taqポリメラーゼ用反応バッフ
ァーに40% グリセロールと１U/μｌのTaqポリメラーゼ
を加え、そしてビオチン標識したdATPもしくはdUTPを加
えて反応させた。１プローブ法を使用する逆転写酵素の
コドン215は野生型のウェルにdATP、変異型のウェルにd
UTPを100μｌずつ加えた。２プローブ法を使用する場合
の逆転写酵素のコドン67並びにプロテアーゼのコドン30
と82の３種類は、dATPを加えた溶液を100μｌずつ加
え、そしてその他はdUTPを加えた溶液を100μｌずつ加
えた。２プローブ法に関しては各々のコドンに関して適
した（相補的な）基質を、野生型と変異型の両方のウェ
ルに加えることになる。このプレートを55℃で30分間イ
ンキュベートした。

【００５５】５．酵素標識 プレートを洗浄した後、ビオチンに特異的に結合するス
トレプトアビジンで標識したペルオキシダーゼを含む溶
液を各ウェルに100μｌずつ加え、55℃において30分間
インキュベートした。

【００５６】６．発色反応 プレートを洗浄した後、テトラメチルベンジジンを含む
発色基質を各ウェルに100μｌずつ加え、ペルオキシダ
ーゼの作用で青色に発色させた。室温にて30分間発色さ
せた後に発色停止液を加えて黄色に変色させた、そして
吸光度計を使用して450nmの吸光度を測定した。

【００５７】＜判定＞各コドンに関して野生型と変異型
を吸光度の数値から陽性と陰性を判定した。各コドンに
関しての判定は以下に示す４パターンが存在した。

【００５８】野生型 変異型 判定 陽性 陰性 野生型 陰性 陽性 変異型 陽性 陽性 混合型 陰性 陰性 判定不能 野生型もしくは変異型が陽性であり、各々もう一方が陰
性である場合、野生型もしくは変異型であると判定し
た。

【００５９】混合型に関しては野生型、変異型とも陽性
値を示すが、両者の混合比によって吸光度に差が生じ
た。実際には混合型であってもメジャーな型とマイナー
な型で大きく差がある場合はマイナーな型はバックグラ
ウンドと同程度となり、陰性と判定される。

【００６０】判定不能はHIVの高い変異性が関与してい
る場合が多かった。本発明の方法では、１つのコドンの
判定を行うために２ケ所のプライマー領域と１ケ所のプ
ローブ領域が必要である。もしもプライマー領域に多く
の変異が局在していれば、遺伝子増幅反応が不良とな
る。また、プローブ領域に多くの変異が局在すればハイ
ブリダイゼーションやミニシークエンスの反応が阻害さ
れる可能性がある。いずれの場合も最終的な判定として
は判定不能もしくは保留となる。

【００６１】＜結果＞シークエンス法により既に配列が
確認されている検体に関して試験を行ったところ、シー
クエンスの結果と本発明の方法による結果との間で乖離
はなかった。ただし、前述したように、プライマー及び
／又はプローブの領域に変異が存在する検体に関して
は、判定不能や吸光度低値による判定保留が散見され
た。

【００６２】

【発明の効果】本発明によれば、簡便かつ迅速にHIVの
変異を検出することができる。従来、遺伝子の解析まで
を含めば１週間程度必要であった変異の判定が、1日で
可能となる。これは、今後HIVの治療に逆転写酵素阻害
剤やプロテアーゼ阻害剤等の抗ウイルス薬を単剤もしく
は多剤にて併用するにあたり、薬剤耐性株の出現を速や
かに確認することが可能となるため、薬剤投与や変更の
指針として有用である。

【００６３】

【配列表】 ＜１１０＞ 住友金属工業株式会社 ＜１２０＞ ＨＩＶの変異の検出方法 ＜１３０＞ ９９０１７８ ＜１６０＞ ３８ ＜２１０＞ １ ＜２１１＞ ２３ ＜２１２＞ DNA ＜２１３＞ Human Immunodeficiency Virus ＜４００＞ gttaaacaat ggccattgac aga 23 ＜２１０＞ ２ ＜２１１＞ ２２ ＜２１２＞ DNA ＜２１３＞ Human Immunodeficiency Virus ＜４００＞ gtatggattt tcaggcccaa tt 22 ＜２１０＞ ３ ＜２１１＞ ２２ ＜２１２＞ DNA ＜２１３＞ Human Immunodeficiency Virus ＜４００＞ tgaacttccc agaagtcttg ag 22 ＜２１０＞ ４ ＜２１１＞ ２３ ＜２１２＞ DNA ＜２１３＞ Human Immunodeficiency Virus ＜４００＞ agcatgacaa aaatcttaga gcc 23 ＜２１０＞ ５ ＜２１１＞ ２４ ＜２１２＞ DNA ＜２１３＞ Human Immunodeficiency Virus ＜４００＞ tatttctaag tcagatccta cata 24 ＜２１０＞ ６ ＜２１１＞ ２３ ＜２１２＞ DNA ＜２１３＞ Human Immunodeficiency Virus ＜４００＞ gcagcataga acaaaaatag agg 23 ＜２１０＞ ７ ＜２１１＞ ２２ ＜２１２＞ DNA ＜２１３＞ Human Immunodeficiency Virus ＜４００＞ tatcaggatg gagttcataa cc 22 ＜２１０＞ ８ ＜２１１＞ ２０ ＜２１２＞ DNA ＜２１３＞ Human Immunodeficiency Virus ＜４００＞ atagacaagg aactgtatcc 20 ＜２１０＞ ９ ＜２１１＞ ２３ ＜２１２＞ DNA ＜２１３＞ Human Immunodeficiency Virus ＜４００＞ aaattcattt cttctaatac tgt 23 ＜２１０＞ １０ ＜２１１＞ ２０ ＜２１２＞ DNA ＜２１３＞ Human Immunodeficiency Virus ＜４００＞ gccaggaaga tggaaaccaa 20 ＜２１０＞ １１ ＜２１１＞ ２０ ＜２１２＞ DNA ＜２１３＞ Human Immunodeficiency Virus ＜４００＞ tgtaggtcct actaatactg 20 ＜２１０＞ １２ ＜２１１＞ ２０ ＜２１２＞ DNA ＜２１３＞ Human Immunodeficiency Virus ＜４００＞ atacccatag aaatctgtgg 20 ＜２１０＞ １３ ＜２１１＞ ２２ ＜２１２＞ DNA ＜２１３＞ Human Immunodeficiency Virus ＜４００＞ ggaaaattta aagtgcaacc aa 22 ＜２１０＞ １４ ＜２１１＞ ３０ ＜２１２＞ DNA ＜２１３＞ Human Immunodeficiency Virus ＜４００＞ taaaagcatt agtagaaatt tgtacagaaa 30 ＜２１０＞ １５ ＜２１１＞ ３０ ＜２１２＞ DNA ＜２１３＞ Human Immunodeficiency Virus ＜４００＞ taaaagcatt agtagaaatt tgtacagaa(c/t) 30 ＜２１０＞ １６ ＜２１１＞ ３０ ＜２１２＞ DNA ＜２１３＞ Human Immunodeficiency Virus ＜４００＞ atactccagt gtttgccata aagaaaaa(a/g)g 30 ＜２１０＞ １７ ＜２１１＞ ３０ ＜２１２＞ DNA ＜２１３＞ Human Immunodeficiency Virus ＜４００＞ atactccagt gtttgccata aagaaaaa(a/g)a 30 ＜２１０＞ １８ ＜２１１＞ ３０ ＜２１２＞ DNA ＜２１３＞ Human Immunodeficiency Virus ＜４００＞ gttctctgaa atctactaat tttctccatt 30 ＜２１０＞ １９ ＜２１１＞ ３０ ＜２１２＞ DNA ＜２１３＞ Human Immunodeficiency Virus ＜４００＞ gttctctgaa atctactaat tttctccatc 30 ＜２１０＞ ２０ ＜２１１＞ ３０ ＜２１２＞ DNA ＜２１３＞ Human Immunodeficiency Virus ＜４００＞ aaaatccaga catagttatc tatcaataca 30 ＜２１０＞ ２１ ＜２１１＞ ３０ ＜２１２＞ DNA ＜２１３＞ Human Immunodeficiency Virus ＜４００＞ aaaatccaga catagttatc tatcaatacg 30 ＜２１０＞ ２２ ＜２１１＞ ３０ ＜２１２＞ DNA ＜２１３＞ Human Immunodeficiency Virus ＜４００＞ ctgagacaac atctgttgag gtggggattt 30 ＜２１０＞ ２３ ＜２１１＞ ３０ ＜２１２＞ DNA ＜２１３＞ Human Immunodeficiency Virus ＜４００＞ tccctcagat cactctttgg caacgacccc 30 ＜２１０＞ ２４ ＜２１１＞ ３０ ＜２１２＞ DNA ＜２１３＞ Human Immunodeficiency Virus ＜４００＞ tccctcagat cactctttgg caacgaccca 30 ＜２１０＞ ２５ ＜２１１＞ ３０ ＜２１２＞ DNA ＜２１３＞ Human Immunodeficiency Virus ＜４００＞ aggaagctct attagataca ggagcagatg 30 ＜２１０＞ ２６ ＜２１１＞ ３０ ＜２１２＞ DNA ＜２１３＞ Human Immunodeficiency Virus ＜４００＞ aggaagctct attagataca ggagcagata 30 ＜２１０＞ ２７ ＜２１１＞ ３０ ＜２１２＞ DNA ＜２１３＞ Human Immunodeficiency Virus ＜４００＞ tcttactttg ataaaacctc caattccccc 30 ＜２１０＞ ２８ ＜２１１＞ ３０ ＜２１２＞ DNA ＜２１３＞ Human Immunodeficiency Virus ＜４００＞ tcttactttg ataaaacctc caattcccac 30 ＜２１０＞ ２９ ＜２１１＞ ３０ ＜２１２＞ DNA ＜２１３＞ Human Immunodeficiency Virus ＜４００＞ gatacccata gaaatctgtg gacataaagc 30 ＜２１０＞ ３０ ＜２１１＞ ３０ ＜２１２＞ DNA ＜２１３＞ Human Immunodeficiency Virus ＜４００＞ gatacccata gaaatctgtg gacataaagt 30 ＜２１０＞ ３１ ＜２１１＞ ３０ ＜２１２＞ DNA ＜２１３＞ Human Immunodeficiency Virus ＜４００＞ ggtacagtat tagtaggacc tacacctgtc 30 ＜２１０＞ ３２ ＜２１１＞ ３０ ＜２１２＞ DNA ＜２１３＞ Human Immunodeficiency Virus ＜４００＞ ggtacagtat tagtaggacc tacacctgcc 30 ＜２１０＞ ３３ ＜２１１＞ ３０ ＜２１２＞ DNA ＜２１３＞ Human Immunodeficiency Virus ＜４００＞ cagtattagt aggacctaca cctgtcaa(c/t)a 30 ＜２１０＞ ３４ ＜２１１＞ ３０ ＜２１２＞ DNA ＜２１３＞ Human Immunodeficiency Virus ＜４００＞ cagtattagt aggacctaca cctgtcaa(c/t)g 30 ＜２１０＞ ３５ ＜２１１＞ ３０ ＜２１２＞ DNA ＜２１３＞ Human Immunodeficiency Virus ＜４００＞ cacctgtcaa cataattgga agaaatctgt 30 ＜２１０＞ ３６ ＜２１１＞ ３０ ＜２１２＞ DNA ＜２１３＞ Human Immunodeficiency Virus ＜４００＞ cacctgtcaa cataattgga agaaatctga 30 ＜２１０＞ ３７ ＜２１１＞ ３２９ ＜２１２＞ DNA ＜２１３＞ Human Immunodeficiency Virus ＜４００＞ ccgatagaca aggaactgta tcctttaact tc cct cag atc act ctt tgg 1850 Pro Gln Ile Thr Leu Trp 1 5 caa cga ccc ctc gtc aca ata aag ata ggg ggg caa cta aag gaa 1895 Gln Arg Pro Leu Val Thr Ile Lys Ile Gly Gly Gln Leu Lys Glu 10 15 20 gct cta tta gat aca gga gca gat gat aca gta tta gaa gaa atg 1940 Ala Leu Leu Asp Thr Gly Ala Asp Asp Thr Val Leu Glu Glu Met 25 30 35 aat ttg cca gga aga tgg aaa cca aaa atg ata ggg gga att gga 1985 Asn Leu Pro Gly Arg Trp Lys Pro Lys Met Ile Gly Gly Ile Gly 40 45 50 ggt ttt atc aaa gta aga cag tat gat cag ata ccc ata gaa atc 2030 Gly Phe Ile Lys Val Arg Gln Tyr Asp Gln Ile Pro Ile Glu Ile 55 60 65 tgt gga cat aaa gct ata ggt aca gta tta gta gga cct aca cct 2075 Cys Gly His Lys Ala Ile Gly Thr Val Leu Val Gly Pro Thr Pro 70 75 80 gtc aac ata att gga aga aat ctg ttg act cag att ggt tgc act 2120 Val Asn Ile Ile Gly Arg Asn Leu Leu Thr Gln Ile Gly Cys Thr 85 90 95 tta aat ttt 2129 Leu Asn Phe ＜２１０＞ ３８ ＜２１１＞ ７１７ ＜２１２＞ DNA ＜２１３＞ Human Immunodeficiency Virus ＜４００＞ ccc att agc cct att gag act gta cca gta aaa tta aag cca gga 2174 Pro Ile Ser Pro Ile Glu Thr Val Pro Val Lys Leu Lys Pro Gly 1 5 10 15 atg gat ggc cca aaa gtt aaa caa tgg cca ttg aca gaa gaa aaa 2219 Met Asp Gly Pro Lys Val Lys Gln Trp Pro Leu Thr Glu Glu Lys 20 25 30 ata aaa gca tta gta gaa att tgt aca gaa atg gaa aag gaa ggg 2264 Ile Lys Ala Leu Val Glu Ile Cys Thr Glu Met Glu Lys Glu Gly 35 40 45 aaa att tca aaa att ggg cct gaa aat cca tac aat act cca gtg 2309 Lys Ile Ser Lys Ile Gly Pro Glu Asn Pro Tyr Asn Thr Pro Val 50 55 60 ttt gcc ata aag aaa aaa gac agt act aaa tgg aga aaa tta gta 2354 Phe Ala Ile Lys Lys Lys Asp Ser Thr Lys Trp Arg Lys Leu Val 65 70 75 gat ttc aga gaa ctt aat aag aga act caa gac ttc tgg gaa gtt 2399 Asp Phe Arg Glu Leu Asn Lys Arg Thr Gln Asp Phe Trp Glu Val 80 85 90 caa tta gga ata cca cat ccc gca ggg tta aaa aag aaa aaa tca 2444 Gln Leu Gly Ile Pro His Pro Ala Gly Leu Lys Lys Lys Lys Ser 95 100 105 gta aca gta ctg gat gtg ggt gat gca tat ttt tca gtt ccc tta 2489 Val Thr Val Leu Asp Val Gly Asp Ala Tyr Phe Ser Val Pro Leu 110 115 120 gat gaa gac tta agg aag tat act gca ttt acc ata cct agt ata 2534 Asp Glu Asp Phe Arg Lys Tyr Thr Ala Phe Thr Ile Pro Ser Ile 125 130 135 aac aat gag aca cca ggg att aga tat cag tac aat gtg ctt cca 2579 Asn Asn Glu Thr Pro Gly Ile Arg Tyr Gln Tyr Asn Val Leu Pro 140 145 150 cag gga tgg aaa gga tca cca gca ata ttc caa agt agc atg aca 2624 Gln Gly Trp Lys Gly Ser Pro Ala Ile Phe Gln Ser Ser Met Thr 155 160 165 aaa atc tta gag cct ttt aaa aaa caa aat cca gac ata gtt atc 2669 Lys Ile Leu Glu Pro Phe Lys Lys Gln Asn Pro Asp Ile Val Ile 170 175 180 tat caa tac atg gat gat ttg tat gta gga tct gac tta gaa ata 2714 Tyr Gln Tyr Met Asp Asp Leu Tyr Val Gly Ser Asp Leu Glu Ile 185 190 195 ggg cag cat aga aca aaa ata gag gag ctg aga caa cat ctg ttg 2759 Gly Gln His Arg Thr Lys Ile Glu Glu Leu Arg Gln His Leu Leu 200 205 210 agg tgg gga ttt acc aca cca gac aaa aaa cat cag aaa gaa cct 2804 Arg Trp Gly Phe Thr Thr Pro Asp Lys Lys His Gln Lys Glu Pro 215 220 225 cca ttc ctt tgg atg ggt tat gaa ctc cat cct gat aaa tgg 2846 Pro Phe Leu Trp Met Gly Tyr Glu Leu His Pro Asp Lys Trp 230 235

【図面の簡単な説明】

【図１】逆転写酵素コード領域中の変異アミノ酸の位置
並びに対応コドンと、該領域中のプライマー並びにプロ
ーブの設定位置を示す。ａの図は全体のおおよその位置
関係を示し、そしてｂの図は配列との対応関係を具体的
に示す。矢印に付した番号は配列番号に相当する。右向
きの矢印はセンス鎖と同一であり、そして左向きの矢印
はアンチセンス鎖と同一であることを意味する。

【図２】プロテアーゼコード領域中の変異アミノ酸の位
置並びに対応コドンと、該領域周辺のプライマー並びに
プローブの設定位置を示す。ａの図は全体のおおよその
位置関係を示し、そしてｂの図は配列との対応関係を具
体的に示す。矢印に付した番号は配列番号に相当する。
右向きの矢印はセンス鎖と同一であり、そして左向きの
矢印はアンチセンス鎖と同一であることを意味する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き Ｆターム(参考） 4B024 AA14 CA04 CA09 CA11 DA03 HA08 HA11 HA12 HA14 4B063 QA17 QA19 QQ03 QQ10 QQ44 QQ52 QR02 QR08 QR41 QR56 QR57 QR62 QR66 QR82 QS25 QS34 QX01

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 HIV遺伝子の変異を検出する方法であっ
   て、検出する変異が、逆転写酵素コード領域のコドン4
   1、67、70、184及び215並びにプロテアーゼコード領域
   のコドン10、30、48、71、82、84及び90の少なくとも一
   カ所であり、以下の工程：遺伝子変異の近傍に3'末端が
   位置するように設定された固相化プローブに、遺伝子増
   幅された検体サンプルをハイブリダイズさせ、 DNAポリメラーゼを加えてプローブの3'末端を伸長合成
   するが、その際、標識基質を取込ませ、そして取込まれ
   た標識基質の有無を検出することからなる、変異検出方
   法。
2. 【請求項２】 以下のプライマーセット（a）〜（g）： （a）配列番号：１のプライマー及び配列番号：２のプ
   ライマー； （b）配列番号：１のプライマー及び配列番号：３のプ
   ライマー； （c）配列番号：４のプライマー及び配列番号：５のプ
   ライマー； （d）配列番号：６のプライマー及び配列番号：７のプ
   ライマー； （e）配列番号：８のプライマー及び配列番号：９のプ
   ライマー； （f）配列番号：10のプライマー及び配列番号：11のプ
   ライマー；及び （g）配列番号：12のプライマー及び配列番号：13のプ
   ライマー；の何れかからなる、請求項１記載の方法にお
   ける検体サンプルの遺伝子増幅に使用するためのPCR用
   プライマーセット。
3. 【請求項３】 請求項１記載の方法において用いる、配
   列番号：14乃至36の何れかの配列を有するプローブ。
4. 【請求項４】 検出する変異が逆転写酵素コード領域の
   コドン41、67、70、184及び215であり、検体サンプルの
   遺伝子増幅を請求項２記載のプライマーセット(a)，
   (b)，(c)及び(d)を用いたPCR法により行い、そして固相
   化プローブが配列番号：14〜22のそれぞれを有する９種
   類のプローブである、請求項１記載のHIV遺伝子の変異
   の検出方法。
5. 【請求項５】 検出する変異がプロテアーゼコード領域
   のコドン10，30，48，71，82，84及び90であり、検体サ
   ンプルの遺伝子増幅を請求項２記載のプライマーセット
   (e)，(f)及び(g)を用いたPCRにより行い、そして固相化
   プローブが配列番号：23〜36のそれぞれを有する14種類
   のプローブである、請求項１記載のHIV遺伝子の変異の
   検出方法。
6. 【請求項６】 検出する変異が逆転写酵素コード領域の
   コドン41，67，70，184及び215、並びにプロテアーゼコ
   ード領域のコドン10，30，48，71，82，84及び90であ
   り、検体サンプルの遺伝子増幅を請求項２記載のプライ
   マーセット(a)，(b)，(c)，(d)，(e)，(f)及び(g)を用
   いたPCRにより行い、そして固相化プローブが配列番
   号：14〜36のそれぞれを有する23種類のプローブであ
   る、請求項１記載のHIV遺伝子の変異の検出方法。
7. 【請求項７】 請求項２記載の(a)，(b)，(c)及び(d)の
   プライマーセットを含むPCR反応用試薬、 請求項３記載の配列番号：14〜22のそれぞれを有する９
   種類のプローブが固相化された固相支持体、 DNAポリメラーゼ、及び標識基質を含有する緩衝液を含
   む、HIV遺伝子の変異を検出するためのキット。
8. 【請求項８】 請求項２記載の(e)，(f)及び(g)のプラ
   イマーセットを含むPCR反応用試薬、 請求項３記載の配列番号：23〜36のそれぞれを有する14
   種類のプローブが固相化された固相支持体、 DNAポリメラーゼ、及び標識基質を含有する緩衝液を含
   む、HIV遺伝子の変異を検出するためのキット。
9. 【請求項９】 請求項２記載の(a)，(b)，(c)，(d)，
   (e)，(f)及び(g)のプライマーセットを含むPCR反応用試
   薬、 請求項３記載の配列番号：14〜36のそれぞれを有する23
   種類のプローブが固相化された固相支持体、 ＤＮＡポリメラーゼ、及び標識基質を含有する緩衝液を
   含む、HIV遺伝子の変異を検出するためのキット。