ES2336581T3 - Polimorfismos en el gen nod2/card15. - Google Patents
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Abstract
Procedimiento para la predicción y/o el diagnóstico de enfermedades asociadas a, al menos, uno de los polimorfismos SS 2978536, alelo T (Nod2-SNP8), SS 2978537, alelo C (Nod2-SNP12), SS 2978539, alelo inserción C (Nod2-SNP13) en el gen NOD2/CARD15, mediante la comprobación de, al menos, uno de los polimorfismos Nod2-SNP8, Nod2-SNP12, Nod2-SNP13 en el gen NOD2/CARD15, asimismo, en el caso de las enfermedades asociadas a los polimorfismos Nod2-SNP8, Nod2-SNP12, Nod2-SNP13 en el gen NOD2/CARD se trata de reacciones de rechazo en trasplantes, enfermedades de Graft-versus-Host, (GVHD, o enfermedad de injerto contra huésped, EICH), enfermedades de Host-versus-Graft (HVFD, o enfermedad de huésped contra injerto, EHCI) y bronquiolitis obliterante.
Description
Polimorfismos en el gen NOD2/CARD15.
La presente invención comprende el procedimiento
así como las secuencias de nucleótidos utilizadas en este
procedimiento, para la predicción y/o diagnóstico de enfermedades
asociadas a, al menos, uno de los polimorfismos
Nod2-SNP8, Nod2-SNP12,
Nod2-SNP13 en el gen NOD2/CARD15 y, especialmente,
la selección de pares adecuados de donador-receptor
para los trasplantes a partir de los polimorfismos
Nod2-SNP8 (8), Nod2-SNP12 (12),
Nod2-SNP13 (13) detectados en el gen
NOD2/CARD15.
Los polimorfismos en un sólo nucleótido (SNP:
single nucleotide polymorphism) 8, 12, 13 en el gen
NOD2/
CARD15 son los responsables del surgimiento de la enfermedad de Crohn (Hugot JP, Chamaillard M, Zouali H, Nature 2001, 411, 599-603; Ogura Y, Bonen DK, Inohara N Nature 2001, 411, 603-606). En el caso de la enfermedad de Crohn, se trata de una inflamación del tracto digestivo que, pese a ser muy rara, es crónica y hereditaria, y que afecta sobre todo al intestino delgado y al grueso. Se produce un engrosamiento de la pared intestinal y una formación de úlceras.
CARD15 son los responsables del surgimiento de la enfermedad de Crohn (Hugot JP, Chamaillard M, Zouali H, Nature 2001, 411, 599-603; Ogura Y, Bonen DK, Inohara N Nature 2001, 411, 603-606). En el caso de la enfermedad de Crohn, se trata de una inflamación del tracto digestivo que, pese a ser muy rara, es crónica y hereditaria, y que afecta sobre todo al intestino delgado y al grueso. Se produce un engrosamiento de la pared intestinal y una formación de úlceras.
La memoria WO 02/44426 A describe una
posibilidad para la predicción y/o el diagnóstico de pacientes con
un factor de riesgo para la enfermedad de Crohn mediante la
detección de la presencia de, al menos, un polimorfismo en el gen
NOD2/CARD15. La memoria WO 03/060468 A publica la posibilidad de
determinar la probabilidad de una reacción de rechazo en el caso de
trasplantes a través de la detección de la presencia de, al menos,
un polimorfismo en el gen promotor humano Mif. En Schürmann et
al., European Respiratory Journal 2003, 22(5),
748-754 se publica la predicción y/o el diagnóstico
de sarcoidosis mediante la detección de la presencia de un
polimorfismo NOD2-SNP12 en el gen NOD2/CARD15. Sin
embargo, ninguno de los documentos mencionados publica,
individualmente o en combinación, la presente invención.
El objeto de la presente invención es presentar
procedimientos para la predicción y el diagnóstico de enfermedades
que son originadas o indicadas por las variantes de mutación
Nod2-SNP8, Nod2-SNP12,
Nod2-SNP13 en el gen NOD2/CARD15. El objeto
consiste, especialmente, en presentar procedimientos para la
predicción de la probabilidad del surgimiento de reacciones del
injerto contra el huésped, y otras afecciones que surgen tras
trasplantes, que sirven para la selección de pares adecuados de
donantes y receptores.
Este objeto se logra presentando procedimientos
acorde a la reivindicación 1. Otros acondicionamientos, aspectos y
detalles ventajosos de la invención se desprenden de las demás
reivindicaciones, de los ejemplos y de las figuras.
La presente invención comprende el procedimiento
para la predicción y/o diagnóstico de enfermedades asociadas a, al
menos, uno de los polimorfismos Nod2-SNP8,
Nod2-SNP12, Nod2-SNP13 en el gen
NOD2/CARD15 y la detección de, al menos, uno de los polimorfismos
Nod2-SNP8 (8), Nod2-SNP12 (12),
Nod2-SNP13 (13) en el gen NOD2/CARD15.
Dicho de otro modo, la presente invención
comprende el procedimiento para detectar, al menos, uno de los
polimorfismos Nod2-SNP8 (8),
Nod2-SNP12 (12), Nod2-SNP13 (13) en
el gen NOD2/CARD15, para la predicción y/o el diagnóstico de
enfermedades asociadas a, defectos genéticos o una mutación o una
variación genética.
El gen NOD2/CARD15 tiene el siguiente número de
acceso a la base de datos (Gene Bank Accession Number): AC007728 y
AQ534686. La secuencia de nucleótidos se puede obtener bajo el
número de acceso (Accession Number) indicado del banco de datos
NCBI, en http: //www.ncbi.nlm.nih.gov/.
El gen NOD2 tiene una longitud de 3123
nucleótidos (1040 aminoácidos, Gene Bank Accession Number
NM022162), (NOD: Nucleotide Oligomerisation Domain) y se encuentra en la región del cromosoma 16 (16p12-q21). Entre tanto, la nomenclatura del gen NOD2 se ha modificado a CARD15 (CARD: Caspase Activating Recruitment Domain). Las caspasas juegan un papel importante en la apoptosis. Además de los dominios CARD, el NOD2/CARD15 posee un dominio de unión ATB. El NOD2/CARD15 sirve como receptor intracelular para productos bacteriales y transduce la señal para la activación de NFkappaB (NF-\kappaB).
NM022162), (NOD: Nucleotide Oligomerisation Domain) y se encuentra en la región del cromosoma 16 (16p12-q21). Entre tanto, la nomenclatura del gen NOD2 se ha modificado a CARD15 (CARD: Caspase Activating Recruitment Domain). Las caspasas juegan un papel importante en la apoptosis. Además de los dominios CARD, el NOD2/CARD15 posee un dominio de unión ATB. El NOD2/CARD15 sirve como receptor intracelular para productos bacteriales y transduce la señal para la activación de NFkappaB (NF-\kappaB).
En el análisis del gen NOD2/CARD15 se pueden
presentar, entre otros, los polimorfismos en un sólo nucleótido
(SNP) Nod2-SNP8, Nod2-SNP12,
Nod2-SNP13. Los SNP se originan por el intercambio
de bases o la inserción de una base adicional en la secuencia de
ADN.
SNP8 (banco de datos SNP
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/index.html, Accession Number
ss2978536) es la denominación de un polimorfismo en el gen
NOD2/CARD15 que se origina por el intercambio de la posición del
nucleótido (Nucleotids Position) 2209 (NM 022162) C \rightarrow T.
Como resultado, en la proteína se lleva a cabo el intercambio de
R702W. En el cromosoma 16, el SNP8 se encuentra en la posición de
cromosoma (Chromosomenposition) 50523959 (gen NOD2/CARD15 - Exon 5).
Hugot JP et al., Association of NOD2
leucine-rich repeat variants with susceptibility to
Crohn's disease. Nature 2001, 411, 599-603.
SNP12 (banco de datos SNP, Accession Number
ss2978537) es la denominación de un polimorfismo en el
gen NOD2/CARD15 que se origina por el intercambio de la posición del nucleótido (Nucleotids Position) 2827
(NM 022162) G \rightarrow T. Como resultado, en la proteína se lleva a cabo el intercambio de G908R. En el cromosoma 16, el SNP 12 se encuentra en la posición de cromosoma (Chromosomenposition) 50534573 (gen NOD2/CARD15 - Exon
9). Hugot JP et al., Association of NOD2 leucine-rich repeat variants with susceptibility to Crohn's disease. Nature 2001, 411, 599-603.
gen NOD2/CARD15 que se origina por el intercambio de la posición del nucleótido (Nucleotids Position) 2827
(NM 022162) G \rightarrow T. Como resultado, en la proteína se lleva a cabo el intercambio de G908R. En el cromosoma 16, el SNP 12 se encuentra en la posición de cromosoma (Chromosomenposition) 50534573 (gen NOD2/CARD15 - Exon
9). Hugot JP et al., Association of NOD2 leucine-rich repeat variants with susceptibility to Crohn's disease. Nature 2001, 411, 599-603.
SNP13 (banco de datos SNP, Accession Number
ss2978539) es la denominación de un polimorfismo en el gen
NOD2/CARD15, que se origina por una inserción de base del nucleótido
C en la posición de nucleótico (Nucleotids Position) 3124 (NM
022162). En el cromosoma 16, el SNP13 se encuentra en la posición de
cromosoma
50541811^50541812. Por la inserción se origina un frameshift (cambio en la fase de lectura), que determina un NOD2 acortado con 1007 aminoácidos (Ogura et al., Nature 2001, 411, 603-606).
50541811^50541812. Por la inserción se origina un frameshift (cambio en la fase de lectura), que determina un NOD2 acortado con 1007 aminoácidos (Ogura et al., Nature 2001, 411, 603-606).
Debido a los polimorfismos mencionados
anteriormente Nod2-SNP8, Nod2-SNP12,
Nod2-SNP13 se originan los siguientes 7
mutantes/variantes, a saber: mutante 1: mutación por SNP8, mutante
2: mutación por SNP 12, mutante 3: mutación por SNP13, mutante 4:
mutación por SNP8 y 12, mutante 5: mutación e inserción por SNP8 y
13, mutante 6: mutación e inserción por SNP12 y 13, mutante 7:
mutación e inserción por SNP8 y 12 y 13.
Sorprendentemente, se pudo comprobar que ya una
de las mutaciones mencionadas son suficientes para desencadenar
diversas enfermedades. Las mutaciones mencionadas están vinculadas,
por ejemplo, a reacciones de rechazo en la medicina de trasplantes,
enfermedades de Graft-versus-Host,
(GVHD, o enfermedad de injerto contra huésped, EICH), enfermedades
de Host-versus-Graft (HVFD, o
enfermedad de huésped contra injerto, EHCI) y bronquiolitis
obliterante.
Entre las reacciones de rechazo en trasplantes
se hallan, especialmente, reacciones inmunológicas del receptor
contra el órgano de donación, como así también reacciones del
injerto contra el huésped (GvHD: Graft versus Host Disease). Tales
consecuencias se presentan relativamente tarde tras un trasplante y
pueden provocar complicaciones mortales.
Esta problemática será explicada con un ejemplo
de trasplante de células madre de la sangre, conocida originalmente
como trasplante de médula ósea. Ejemplos de trasplantes son,
especialmente, trasplante de médula espinal, de médula ósea, de
células madre o de células madre de la sangre, así como trasplantes
de órganos sólidos, por ejemplo, corazón, pulmones, hígado,
riñones, páncreas, piel, glándulas endócrinas, así como glándulas
germinales.
El trasplante de células madre de la sangre
puede ser implementado para la terapia de diferentes fallas en la
formación de la sangre y del sistema inmune provocadas, por ejemplo,
tras quimioterapias u otras terapias que destruyen la formación de
la sangre. Pero las fallas del sistema inmune o en la formación de
la sangre también pueden ser hereditarias o adquiridas. Los
problemas durante el trasplante de células madre de la sangre
pueden presentarse, especialmente, en el caso en que el donante no
sea genéticamente idéntico (donante alógeno), dado que, en ese
caso, se debe superar una barrera inmunológica doble. Ya que al
posible rechazo de las células trasplantadas por el sistema inmune
del receptor (reacción HvG) también se le suma la posibilidad del
surgimiento de reacciones inmunológicas del injerto contra el
receptor (reacción GvH).
Un factor que determina, conjuntamente y de
manera importante, la probabilidad de reacciones de rechazo es la
coincidencia de los haplotipos HLA (Human Leukocyte Antigens o
antígenos leucocitarios humanos) entre donante y receptor.
La presente invención publica, entre otros, otro
factor fundamental de la probabilidad del surgimiento de reacciones
de rechazo, a saber, la presencia de, al menos, uno de los
polimorfismos SNP8, SNP12 o SNP13 en el gen NOD2/CARD15. Es
especialmente desventajosa la presencia de, al menos, uno de estos
polimorfismos en el donante y en el receptor.
La reacción
Graft-versus-Host (GvHR),
desencadenada por los linfocitos T presentes en el injerto del
donante, puede provocar una GvHD. En el caso de la GvHD se
diferencia entre una forma aguda y una forma crónica. Por
definición, la GvHD aguda se presenta dentro de los primeros 100
días tras el trasplante y en hasta un 50% de los trasplantados. La
GvHD crónica se presenta tras el día 100, en, aproximadamente,
30-50% de los trasplantados alógenos. Acorde a la
sintomatología y los valores de laboratorios clínicos, la GvHD puede
ser dividida en cuatro estadios (GvHD-I,
GvHD-II, GvHD-III,
GvHD-IV) con diferentes pronósticos.
Otra enfermedad grave, frecuentemente mortal,
tras un trasplante es la septicemia, que puede ser provocada, por
ejemplo, por bacterias transmitidas con el injerto. En Alemania,
aproximadamente 100.000 personas sufren anualmente de septicemia,
40.000 de ellas mueren por esa causa. En una septicemia los gérmenes
invaden todo el organismo y envenenan la sangre, por lo cual pueden
fallar los riñones, el hígado y los pulmones. La septicemia es una
enfermedad mortal provocada por bacterias, hongos o virus y que
puede afectar repentinamente a cualquiera.
Es especialmente ventajosa la utilización del
procedimiento acorde a la invención para el diagnóstico previo al
trasplante. Los procedimientos acorde a la invención posibilitan la
predicción de reacciones de rechazo del receptor respecto del
donante así como reacciones del injerto contra el huésped (GvHD) y
por ello sirven para seleccionar un órgano de donación adecuado
para un receptor determinado. Las reacciones de rechazo se
presentan, especialmente, si tanto el receptor como así también el
donante presentan una de las mutaciones 1-7
descritas, como se detallará a continuación.
Los procedimientos acorde a la invención
comprenden la presentación de una muestra que contiene el gen
NOD2/
CARD15 y el posterior análisis del gen NOD2/CARD15 para descubrir la presencia de, al menos, una de las mutaciones 1-7 descritas. Preferentemente, se utiliza para los análisis el ADN genómico, el cADN o el ARN.
CARD15 y el posterior análisis del gen NOD2/CARD15 para descubrir la presencia de, al menos, una de las mutaciones 1-7 descritas. Preferentemente, se utiliza para los análisis el ADN genómico, el cADN o el ARN.
Como muestra pueden utilizarse sangre, saliva,
células de la mucosa bucal, médula ósea, sedimento de orina,
líquido de punción, muestras celulares y de tejidos, siendo
preferidas, sobre todo, las muestras de sangre.
En cuanto al diagnóstico previo al trasplante se
prefiere, además, analizar una muestra del receptor y, por
separado, también una muestra del donante. De modo especialmente
preferido, un procedimiento de diagnóstico que sirve para la
estimación de la probabilidad del surgimiento de reacciones del
injerto contra el huésped, comprende los siguientes pasos:
- a)
- preparación de una muestra del donador que contiene el gen NOD2/CARD15, así como una muestra del receptor que contiene el gen NOD2/CARD15,
- b)
- Detección, en ambas muestras, de la presencia de uno o múltiples polimorfismos Nod2- SNP8, Nod2-SNP12, Nod2-SNP13.
La posterior selección de pares de
donante-receptor se lleva a cabo acorde al principio
de la minimización del riesgo en lo tocante a la probabilidad del
surgimiento de reacciones de injerto contra huésped. Si el receptor
ya presenta más de un polimorfismo, es decir,
El receptor presenta una de las mutaciones nº 4,
5, 6 o 7, entonces el donante no debería presentar ningún
polimorfismo, es decir, ninguna de las mutaciones nº
1-7. Un riesgo especialmente elevado de GvHD existe
si tanto el donante como el receptor presentan un polimorfismo y el
riesgo se incrementa aún más si el donante y el receptor presentan
más de dos polimorfismos, por ejemplo, si el donante presenta la
mutación 5 y el receptor, la mutación 1, o el donante la mutación 4
y el receptor, la mutación 6.
El procedimiento mencionado comprende, en un
modo de ejecución preferido, los pasos:
- a)
- Preparación de una muestra que contiene el gen NOD2/CARD15, tanto del donante así como del receptor,
- b)
- aislamiento del ADN y/o del ARN de ambas muestras,
- c)
- realización de una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) con primers (cebadores) específicos para el gen NOD2/CARD15, para ADN y/o ARN aislado del donante como así también para el ADN y/o ARN aislado del receptor,
- d)
- Análisis del gen NOD2/CARD15 del donante como así también del gen NOD2/CARD15 del receptor, para descubrir, al menos, uno de los polimorfismos Nod2- SNP8, Nod2-SNP12, Nod2-SNP13.
Un modo de ejecución preferido de la presente
invención comprende un procedimiento para la estimación o predicción
de reacciones de rechazo en el receptor tras la realización del
trasplante de células o de un órgano. En este procedimiento se
presenta una muestra del receptor y una muestra del donante. El
término "muestra" ha sido definido anteriormente y se refiere,
especialmente, a una muestra de sangre. La muestra del donante como
así también la muestra del receptor son analizadas buscando la
presencia de los polimorfismos SNP8, SNP12, SNP13. Preferentemente,
este análisis se lleva a cabo mediante aislamiento de ADN y/o ARN,
preferentemente, ADN de ambas muestras. El ADN y/o ARN aislado de
las muestras del donante es multiplicado mediante PCR y,
posteriormente, para hallar los polimorfismos, mezclado con
oligonucleótidos que presentan una secuencia complementaria al
polimorfismo SNP8 o SNP12 o SNP13 y son aptos para la hibridación
con el área del gen NOD2/CARD15 que contiene el polimorfismo Nod2-
SNP8 o Nod2-SNP12 o Nod2-SNP13. Los
oligonucleótidos presentan, preferentemente, entre 10 y 50
componentes de oligonucleótidos (nucleobases). Se utilizan tres
tipos de oligonucleótidos, a saber, aquellos con una secuencia
complementaria al segmento del gen NOD2/CARD15 que contiene el
polimorfismo SNP8 así como aquellos con una secuencia
complementaria al segmento del gen NOD2/CARD15 que contiene el
polimorfismo SNP12, y aquellos con una secuencia complementaria al
segmento del gen NOD2 /CARD15 que contiene el polimorfismo SNP13.
El surgimiento de la hibridación confirma la presencia de un
polimorfismo. El tipo de oligonucleótido hibridizado nos da
información acerca de qué polimorfismo se encuentra presente y de si
hay múltiples polimorfismos. La PCR se realiza con el primer
específico para el gen NOD2/CARD15.
La muestra del receptor también se somete a una
PCR para multiplicar el ADN y/o ARN que contiene y se mezcla con los
mismos oligonucleótidos para comprobar la presencia de
polimorfismos.
El procedimiento acorde a la invención nos
brinda información acerca de si el donante o el receptor presentan
polimorfismos. Además, se puede determinar qué y cuántos de los tres
polimorfismos se presentan. Según el resultado se puede estimar la
probabilidad de reacciones de rechazo en el receptor del injerto,
por lo cual se genera la posibilidad de seleccionar pares adecuados
de donante y receptor y minimizar la probabilidad de enfermedades a
consecuencia del trasplante.
Se entiende por enfermedades como consecuencia
del trasplante, o reacciones de rechazo tras el trasplante, la
enfermedad Graft-versus-Host,
enfermedad Host-versus-Graft y
bronquiolitis obliterante.
En estudios experimentales se pudo demostrar que
la presencia de un polimorfismo es correlativa con el surgimiento
de reacciones de rechazo tras el trasplante, la enfermedad
Graft-versus-Host, enfermedad
Host-versus-Graft y bronquiolitis
obliterante. Los procedimientos acordes a la invención conducen a
resultados que permiten enunciar una afirmación de la probabilidad
del surgimiento de las afecciones mencionadas. Especialmente, la
probabilidad del surgimiento de una o múltiples afecciones
mencionadas en el receptor tras trasplantes.
Como ya hemos mencionado, tras la preparación de
una muestra que contiene el gen NOD2/CARD15, se lleva a cabo el
análisis del gen en lo referente a la presencia de, al menos, una de
las mutaciones mencionadas anteriormente 1-7 o de,
al menos, uno de los polimorfismos 8, 12, 13. Estos análisis se
llevan a cabo mediante diferentes métodos, que, preferentemente,
comprenden el aislamiento del ADN de la muestra con la posterior
realización de una PCR (Polymerase Chain Reaction o reacción en
cadena de la polimerasa) con primers específicos para el gen
NOD2/CARD15.
Como primers pueden utilizarse, por ejemplo,
aquellos descritos en THE LANCET 2002, 359,
1661-1665.
Los nucleótidos obtenidos a través de la PCR
pueden ser analizados luego utilizando diversos métodos para hallar
mutaciones. Entre estos métodos se encuentran, por ejemplo:
Procedimientos de extensión de primers, hibridación específica de
mutación, tecnologías ARMS, tecnologías de array, tecnologías de
chip, análisis de secuencias de ADN, análisis de restricción
(RFLP), polimorfismo de conformación de cadena única (SSCP),
electroforesis en gel con gradiente de desnaturalización, con
gradiente de temperatura, HPLC de desnaturalización, procedimientos
de comprobación electroquímicos. Se prefiere especialmente la
medición de señales de hibridación marcadas.
\vskip1.000000\baselineskip
Un procedimiento para comprobar SNP o mutaciones
conocidos, que se utiliza en el diagnóstico de rutina, es la
hibridación específica de alelos de sondas de ADN marcadas con
fluorescencia (hibridación de oligonucleidos específicos de alelos
o ASO). En esta técnica se le agrega a la PCR una sonda wild type
(de alelo normal) y una sonda de mutación específica, cuya
fluorescencia es visible sólo después de que la sonda unida
específicamente haya sido desintegrada por la polimerasa de ADN
durante la elongación del filamento (el denominado análisis
exonucleasa). Según si se trata de wild type o SNP/mutación, se
obtienen diferentes señales de color, detectadas por estimulación
por luz láser en una fotocélula. La ventaja de este procedimiento se
encuentra en la automatización parcial, por lo cual se pueden
procesar más rápido mayores cantidades de pruebas.
Un procedimiento nuevo desarrollado en Suecia
para detectar mutaciones conocidas o SNP es el Pyrosequencing
(pirosecuenciación). De manera similar al análisis clásico de ADN
con el procedimiento Sanger (ver más adelante), mediante
Pyrosequencing se puede analizar directamente la secuencia de
ADN. Sin embargo, la reacción no se basa en la detección de señales
de fluorescencia de nucleótidos stop (de detención) incorporados,
sino en una liberación mensurable de luz si se incorpora el
nucleótido respectivamente adecuado en la elongación de la fibra en
el ADN. Se utilizan especialmente para comprobar la presencia de una
mutación de secuencias de hibridación, es decir, oligonucleótidos
con secuencias complementarias, que, preferentemente, portan
marcadores de detección.
Otro método para analizar polimorfismos
conocidos o SNP es la comprobación de sondas específicas de
secuencia mediante LightCycler. En ese caso, a un patrón de
ADN se le agrega una mezcla especial de reacción que, entre otros,
contiene primers y sondas específicas. Para la detección de un SNP
se requiere, en cada caso, un par de sondas que consiste en una
sonda de anclaje y una sonda sensora. Ambas sondas se unen en
proximidad directa entre sí a la secuencia por analizar. Tras la
excitación de la molécula de fluoresceína en la sonda de anclaje se
produce la transferencia de energía a la molécula de LC Red en la
sonda sensora (transferencia de resonancia de la fluorescencia,
análisis FRET). La luz emitida por la sonda sensora se mide y
significa que las sondas fueron unidas correctamente a la secuencia
diana. La determinación del genotipo se lleva a cabo a través de un
análisis de curva de fusión.
Un procedimiento especialmente adecuado para
comprobar simultáneamente múltiples mutaciones conocidas (los
denominados análisis multiplex), es el
Oligonucleotide-Ligation-Assay
(OLA) o análisis de ligación de oligonucleótidos. El OLA se
utiliza predominantemente en el nivel II (análisis de las 31
mutaciones más frecuentes) del diagnóstico CFTR. En una reacción PCR
multiplex se amplifican 15 regiones destino del gen CFTR. Los
productos de la PCR de la PCR multiplex sirven como molécula inicial
para la reacción de ligación, iniciada por adición de un reactivo
OLA. El reactivo OLA contiene oligonucleótidos parcialmente marcados
por fluorescencia y una ligasa de ADN. En la reacción se utilizan 3
tipos de sondas:
- a)
- una sonda común ("common"), marcada en el extremo 3' con un colorante de fluorescencia (azul, verde o amarillo),
- b)
- 29 sondas específicas wild type y c) 31 sondas de mutación específicas. La sonda común se une a la secuencia diana, independientemente de si se trata de una secuencia wild type o mutante. Las sondas wild type y de mutación sólo se diferencian por un nucleótido en el extremo 3'. En el extremo 5' de la sonda wild type y de mutación está unida, respectivamente, una denominada molécula PEO, cuyo largo es específico para cada secuencia diana comprobable. Las sondas wild type y de mutación compiten por el punto de unión en la secuencia diana, asimismo, sólo se une la sonda que es exactamente complementaria con la secuencia diana. Si no se encuentran ninguna de las 31 mutaciones por analizar, sólo se unen las sondas wild type. Si se encuentra una mutación homocigota, sólo se une la sonda de mutación. En el caso de heterocigosis, a la secuencia diana se unen tanto la sonda wild type como así también la sonda de mutación. La ligasa de ADN une la sonda común y la sonda wild type o de mutación, tras la hibridación, a la secuencia diana. Cada producto de ligación puede ser comprobado ahora a través de su largo específico y las diferentes marcas de fluorescencia de la sonda común, de modo electroforético capilar.
De esta manera, la presente invención también
hacer referencia a oligonucleótidos que consisten en, al menos, 10
componentes de nucleótidos, presentan una secuencia complementaria a
la mutación SNP8 y/o SNP12 y/o SNP13 y son aptos para la hibridación
con el área del gen NOD2/CARD15 que contiene el polimorfismo
Nod2-SNP8 y/o Nod2-SNP12 y/o
Nod2-SNP13.
Es decir, la presente invención comprende
oligonucleótidos que consisten en, al menos, 10 nucleótidos, en
donde los oligonucleótidos poseen una secuencia complementaria al
gen NOD2/CARD15 y que presentan nucleótidos complementarios para la
mutación SNP8 y/o SNP12 y/o la inserción de nucleótidos SNP13.
Dichos oligonucleótidos portan, preferentemente,
marcadores de detección para el análisis espectroscópico, es decir,
análisis basado en fluorescencia o quimioluminescencia. Además, los
oligonucleótidos están conformados, preferentemente, por
15-50 componentes de nucleótidos y, preferentemente,
sobre todo, por 18-22 componentes de
nucleótidos.
El objeto de la presente invención es, asimismo,
un dispositivo para el diagnóstico de polimorfismos o mutaciones
del gen NOD2/CARD15. En el caso de este dispositivo se trata,
preferentemente, de un chip de diagnóstico o un microchip que
contiene, al menos, uno de los oligonucleótidos mencionados. En el
caso de esta tecnología de microarray o microchip se aplican,
mediante robots, sobre portadores especiales que, en general son de
vidrio o nailon, y con una densidad elevada, miles de genes
diferentes en forma de fragmentos de cADN u oligonucleótidos
específicos del gen (= chips de ADN).
En lugar de la implementación de muestras de ADN
también pueden utilizarse muestras de ARN para comprobar la
presencia de polimorfismos. Los procedimientos basados en ARN
requieren, sin embargo, de muestras de células que también expresen
el gen NOD2/CARD15.
La figura 1 muestra una incidencia acumulativa
de GvHD agudas graves (grado III/OV) en relación con SNP de
NOD2/CARD15: R = receptor, D = donante; R&D wt = SNP no mutante,
wild type en R y D (n = 119); R mut, D
mut = SNP mutantes, sólo en el receptor (n = 22); R wt, D mut = SNP mutantes, sólo en el donante (n = 16), R & D mut = SNP mutantes en donante y receptor (n = 12). Las diferencias fueron muy significativas: p 0,001 para todo el grupo; p 0,02 para R mut D wt; p 0,004 para R wt/Dmut y p 0,001 para R & D mut si se comparó con R & D no mutante.
mut = SNP mutantes, sólo en el receptor (n = 22); R wt, D mut = SNP mutantes, sólo en el donante (n = 16), R & D mut = SNP mutantes en donante y receptor (n = 12). Las diferencias fueron muy significativas: p 0,001 para todo el grupo; p 0,02 para R mut D wt; p 0,004 para R wt/Dmut y p 0,001 para R & D mut si se comparó con R & D no mutante.
Figuras 2+3: muestran la incidencia acumulativa
de TRM tras un año en relación con SNP de NOD2/CARD15: wt =
SNP no mutantes tanto en receptores como en donantes; mut =
cualquier SNP mutante en donantes o receptores o en ambos.
La figura 2 muestra los injertos de hermanas de
HLA idénticos; wt: n = 55, mut n = 23
La figura 3 muestra los HLA de injertos de
donadores no emparentados; wt: n= 61, mut; n = 25
Se analizaron 169 pacientes sucesivos admitidos
para un trasplante alógeno de células madre. Se realizó un
acondicionamiento y una supresión inmunológica profiláctica acorde a
los protocolos estándar. Acondicionamiento con intensidad reducida
(RIC) de fludarabina, BCNU y melfalano. 78 pacientes recibieron
injertos de hermanos de HLA idénticos (MRD, matched related donors
o donantes emparentados compatibles), 87 pacientes, de donantes no
emparentados (URD, unrelated donors), y en el caso de 4 pacientes
fue donante un pariente que se diferenciaba en un antígeno HLA
(RD). En el grupo de los donantes no emparentados coincidieron pares
de donante/receptor para HLA A, B, DRB1 y DQB1, como fijados por la
tipificación realizada por baja resolución para clase 1 y por
tipificación por elevada resolución para clase II. Por el contrario,
en los 23 pares restante se aceptaron una o dos desviaciones de
alelo para DRB1 y DQB1. El grado de GvHD se determinó acorde a los
criterios de Glucksberg (Glucksberg H et al. Trasplantation
1974, 18, 295-304). Las variables principales como
la mortalidad ocasionada por el injerto (TRM = treatment related
mortality o mortalidad relacionada con los transplantes) y las
causas del fallecimiento se recogieron en una base de datos
actualizada mensualmente. El tiempo de observación medio para
pacientes sobrevivientes o de un paciente de fallecimiento por
recidiva fue de 450 días (rango 30-1767 días), el
tiempo de observación medio de pacientes que mueren por TRM, de 172
días (rango 14-1065 días).
El ADN de 169 pacientes (receptores) y de 168
donantes se preparó en el momento del trasplante de células madre,
a partir de las muestras de sangre y acorde a los métodos estándar,
se congelaron y se analizaron retrospectivamente para evaluar el
rol de las mutaciones de NOD2/CARD15.
Discriminación alélica del gen NOD2/CARD15:
Los polimorfismos de un solo nucleótido
NOD2-SNP8, NOD2-SNP12 y
NOD2-SNP13 se determinaron mediante un protocolo
TaqMan como descrito en Hampe et al. The Lancet, 2002, 359,
1661-1665.
Las muestras de control verificadas por la
secuenciación de ADN, se incorporaron en cada recorrido TaqMan. Las
sondas se acoplaron de manera covalente con un colorante Reporter
6-FAM o TET en el extremo 5' y el colorante
inhibidor de la fluorescencia (Quencher) TAMRA se acopló al extremo
3' de la sonda. Los primers y las sondas fueron sintetizadas por
MWG Biotech (Ebersberg, Alemania). Se utilizaron los siguientes
primers y sondas:
\vskip1.000000\baselineskip
Primer: 1) 5' TTCCTGGCAGGGCTGTTGTC 3' (en
foward, avance)
2) 5' AGTGGAAGTGCTTGCGGAGG 3' (en reverse,
retroceso)
\vskip1.000000\baselineskip
Sonda: 1)
5'FAM-CCTGCTCCGGCGCCAGGC-TAMRA
3'
2) 5'
TET-CCTGCTCTGGCGCCAGGC-TAMRA 3'
\vskip1.000000\baselineskip
Primer: 1) 5' ACTCACTGACACTGTCTGTTGACTCT 3'
(avance)
2) 5' AGCCACCTCAAGCTCTGGTG 3' (retroceso)
\vskip1.000000\baselineskip
Sonda: 1)
5'FAM-TTTTCAGATTCTGGGGCAACAGAGTGGGT-TAMRA3'
2) 5'
TET-TTCAGATTCTGGCGCAACAGAGTGGGT-TAMRA
3'
\vskip1.000000\baselineskip
Primer: 1) 5' GTCCAATAACTGCATCACCTACCTAG 3'
(avance)
2) 5' CTTACCAGACTTCCAGGATGGTGT 3'
(retroceso)
\vskip1.000000\baselineskip
Sonda: 1) 5'
FAM-CCCTCCTGCAGGCCCTTGAAAT-TAMRA
3'
2) 5'
TET-CCTCCTGCAGGCCCCTTGAAA-TAMRA
3'
\vskip1.000000\baselineskip
El mix de reacción optimizado con un volumen
final de 10 \mul, consistente en Universal Master Mix (PE Applied
Biosystems), 400 nM de cada primer (avance y retroceso, véase
arriba), 250 nM de cada sonda fluorógena (ver arriba) y la matriz
de ADN (20 ng/well). Todas las reacciones se llevaron a cabo en una
placa de 384 pocillos (Abgene, epsom, Uk) y amplificadas mediante
el Thermocyclers Primus-HT (MWG Biotech). Las
condiciones para los ciclos de PCR fueron las siguientes: 50ºC
durante 2 minutos, 95ºC durante 10 minutos, seguido de 40 ciclos de
95ºC durante 15 segundos (paso de fusión) y 60ºC durante 1 minuto.
Tras el desarrollo de la PCR se midió la fluorescencia liberada con
el sistema de detección de secuencias ABI PRISM® 7700 (PE Applied
Biosystems, Forster City, CA, USA).
\newpage
El incremento en la cantidad de fluorescencia de
colorante Reporter durante los 40 ciclos de la amplificación se
registró mediante el detector de secuencia (SDS Versión 1.6, PE
Applied Biosystem). Las modificaciones en la fluorescencia de
colorante Reporter 6-FAM a diferencia de la
modificación en la fluorescencia de colorante Reporter TET fueron
determinadas gráficamente (FAM homocigota contra TET homocigota
contra FAM/TET heterocigota).
Las tres variables principales (TRM en 365 días
= TRM tras 1 año, grado total de GvHD grave (grado III/IV) y estado
de GvHD gastrointestinal) se analizaron en relación a las mutaciones
de NOD2/CARD15. La incidencia acumulativa que refleja el riesgo de
fallecimiento concurrente con otras toxicidades o recidivas de GvHD
y los casos de fallecimiento por recidivas para TRM se calcularon
para cada uno de estos parámetros. El tiempo para obtener el
resultado clínico (TRM/GvHD) se midió a partir del día de referencia
del SCT (trasplante de células madre) de toda la GvHD y de la GvHD
gastrointestinal. Los resultados clínicos se incluyeron en el modelo
hasta el día 100 y para un año de TRM hasta el día 365 según SCT.
Los modelos de regresión multivariantes COX se adaptaron
paulatinamente y evaluaron la relevancia independiente del
pronóstico de las mutaciones NOD2/CARD15. El límite de los
procedimientos de selección fue una probabilidad de error de 0.2.
Para la comparación multivariante de factores de riesgo para TRM y
GvHD se contempló solamente la edad del paciente, el estadio de la
enfermedad en el día del trasplante, el tipo de donante (hermano de
HLA idéntico o URD o RD) y el estado de mutación de NOD2/CARD15.
Para el análisis de los SNP de NOD2/CARD15 se definieron como
mutados los alelos de riesgo elevado menos frecuentes asociados a
la enfermedad de Crohn y una producción restringida de
NF-kB, a diferencia de ello, los alelos más
frecuentes se definieron como wild type. Para el análisis de las
mutaciones en relación con el resultado clínico se formaron los
grupos acorde a 1) el surgimiento de alguna mutación en receptores y
donantes 2) en relación al surgimiento de alguna mutación sólo en
receptores, sólo en donantes o en ambos. El surgimiento acumulativo
permite el ajuste a riesgo concurrente, calculado mediante el
software NCSS (versión 2004), otros análisis estáticos mediante la
ayuda del software SPSS (versión 11.05).
Las mutaciones NOD2/CARD15 se presentaron con
una frecuencia de 21,8% en pacientes y en 13,7% en donantes
incluidos en el presente estudio. Una mutación homocigota se observó
sólo en un paciente y en su donante de HLA idénticos, a diferencia
de ello, en todos los demás pacientes y donantes las mutaciones
fueron heterocigotas. La frecuencia calculada de haplotipo mutado
NOD2-SNP8 fue de 0.056 para el receptor (R) y de
0.045 para el donante (D), para NOD2-SNP12 mutado,
0.021 (R) y 0.009 (D), y para NOD2-SNP13 mutado,
0.027 (R ) y 0.034 (D). Por ello, las frecuencias de haplotipos se
encontraban cercanas al área de controles. Esto arrojó como
resultado un porcentaje total de 70,5% de los injertos, en el cual
tanto el donante como el receptor poseían SNP no mutados (grupo de
wild type). En 22 pares (13%) sólo el receptor presentaba SNP
mutados (R mut), en 16 pares, (9,5%) las mutaciones se presentaron
sólo en los donantes (D mut), y en 12 pares (7%) tanto el donante
como en el receptor presentaron mutaciones (R & D mut). En la
cohorte sucesiva de pacientes, tanto las características
específicas de los donantes como así también los procedimientos
específicos del injerto estuvieron distribuidos de manera regular
entre los pares pacientes/donantes con y sin mutación.
Los pacientes se siguieron durante una media de
16 meses (rango de 0,5 a 59 meses). Primero comparamos el evento en
pacientes del par receptor/donante wild type (n = 119) con el evento
en pacientes en los pares con cualquier mutación (n = 50): En
general, tras un año se había incrementado notablemente la GvHD
grave, de grado III/IV, GvHD gastrointestinal grave y TRM, en pares
con mutaciones NOD2/CARD15, en comparación con el grupo wild type
(véase tabla 1). Casos de fallecimiento por recidiva se presentaron
en ambos grupos: 18 en los 119 pacientes con wild type y 7 de 50
pacientes en pares mutados. Existe un riesgo elevado de GvHD
globales graves en injertos con mutación de donante, si las
mutaciones se dividen según el surgimiento en el receptor o en el
donante o en ambos. Adicionalmente hubo un incremento dramático de
la GvHD gastrointestinal en los subgrupos reducidos de pares con
mutaciones, de receptores como así también de donantes. Como se
muestra en la tabla 2, se incrementó el surgimiento acumulativo de
un año de TRM de 20% en los pares receptor/donante wild type a 49%
en pares que portan una mutación en el receptor (p = 0.004) y a 83%
en pares que presentan una mutación en receptor y en donante (p =
0.001). Una vez más, los casos de fallecimiento por recidivas están
distribuidos de manera casi regular en estos subgrupos.
La fuerte asociación de TRM con la mutación
NOD2/CARD15 se explicó parcialmente por un riesgo incrementado no
sólo de fallecimiento por GvHD sino también por fallas respiratorias
originadas por daños pulmonares difusos primarios o secundarios: A
diferencia de ello, en los grupos wild type sólo 11/30 casos de
fallecimiento (37%) originada por la GvHD y por fallas
respiratorias. La proporción se eleva a 17/26 (65%) en pares con
mutación de NOD2/CARD15.
La figura 1 y la tabla 2 muestran la incidencia
acumulativa (Kum. Inz.) de GvHD agudas graves (grado III/OV) en
relación con SNP de NOD2/CARD15: En comparación el wild type (19%)
la incidencia acumulativa se incrementó a un 36% o 44% en el caso
de mutaciones, o bien del receptor o del donante y a 58% en el caso
de mutaciones en ambos (R & D mut).
La relevancia de las mutaciones del donante y
del receptor se comparó en diferentes subgrupos inmunógenos
incluidos en este estudio. Aunque la correlación de la presencia de
TRM con mutaciones de NOD2/CARD15 fue más clara para los injertos
de hermanos de HLA idénticos, hubo una tendencia paralela en los
injertos URD (véase figura 2, tabla 3). En el grupo URD aumentó el
surgimiento acumulativo TRM tras un año, de 27% en pares de wild
type a 55% en pares mutantes, si el receptor y el donante eran
iguales en HLA A, B, DRB1 y DQB1. La TRM aumentó de 29% a 50% en
pares con uno o dos desviaciones de alelos DRB1 o DQB1.
Los grupos pequeños de injertos, que presentaron
desviaciones de antígenos, mostraron una mortalidad elevada y no
permitieron una evaluación de los roles de las mutaciones de
NOD2/CARD15 en este subgrupo especial. En el análisis multivariante
de regresión de Cox, la edad, el tipo de donante y las mutaciones de
NOD2/CARD15 en los donantes solamente, o también en receptores,
fueron factores de riesgo independientes de TRM. Como se muestra en
la tabla 4, razón de riesgo (hazard ratio) fue, para TRM tras un SCT
alógeno correspondiente a la mutación de NOD2/CARD15 2.4 (p = 0.02;
95% Cl [1.1;5.0]) para mutaciones en el receptor, 2.5 (p = 0.02; 95%
Cl [1.2; 5.4]) para mutaciones en el donante y 6.0 (p = 0; 95% Cl
[2.6; 14.1]) en mutaciones simultáneas de donante y receptor. GvHD
(p = 0.006) como así también mutaciones NOD2/CARD15 (p = 0)
siguieron siendo factores de riesgo de TRM, si en el modelo se
incorpora la GvHD de grado IV como factor de riesgo de TRM. Incluso
si se incorporan GvHD graves de grado III/IV, la distribución de la
mutación NOD2/CARD15 siguió siendo tan significativa, que confirmó
el efecto fuerte e independiente de la mutación de NOD2/CARD15 sobre
el desarrollo de la enfermedad (resultado) tras SCT alógeno.
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La tabla 1 muestra el análisis univariante de la
incidencia acumulativa de la GvHD aguda de grado III/IV, GvHD
gastrointestinal de estadio 2-4 y TRM tras 1 año.
Los pares paciente/donante con genes no mutantes (wild type)
NOD2/CARD15 (n = 119) fueron comparados con los pares con mutaciones
en los receptores o donantes (mutated,
n = 50). La regresión de Cox se utilizó para comparar los grupos y analizar las tasas de peligro o Hazard Ratios.
n = 50). La regresión de Cox se utilizó para comparar los grupos y analizar las tasas de peligro o Hazard Ratios.
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La tabla 2 muestra la incidencia acumulativa
detallada de GvHD de grado III/IV, estadio gastrointestinal
2-4 y TRM tras un año en relación a mutaciones de
NOD2/CARD15 en donante y receptor: Wild type: Donante y receptor
no-mutante (n = 119). R pos = mutación sólo en
receptores (n = 22), D pos = mutación sólo en donantes (n = 16); R
& D pos = mutaciones tanto en receptores como en donantes (n =
12). La regresión de Cox se utilizó para comparar los grupos y
analizar las razones de riesgo o Hazard Ratios.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
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La tabla 3 muestra el análisis univariante de la
incidencia acumulativa de TRM tras un año en pares de
paciente/donante con wild type NOD2/CARD15 respecto de pares con
mutaciones o bien en receptores (R pos) o en donantes (D pos) así
como en mutaciones en ambos (R & D pos). Se llevaron a cabo
análisis por separado para trasplantes de hermanos de HLA idénticos
e injertos URD. La comparación entre los grupos se llevó a cabo
mediante el análisis log rank. 95 Cl intervalos confidenciales.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
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La tabla 4 muestra el análisis de factor de
riesgo multivariante para TRM tras un año. Las características
relevantes previas al trasplante en pacientes y donantes se
compararon con la mutación de NOD2/CARD15 en los receptores (R pos),
donantes (D pos) y en ambos (R & D ps).
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Claims (8)
1. Procedimiento para la predicción y/o el
diagnóstico de enfermedades asociadas a, al menos, uno de los
polimorfismos SS 2978536, alelo T (Nod2-SNP8), SS
2978537, alelo C (Nod2-SNP12), SS 2978539, alelo
inserción C (Nod2-SNP13) en el gen NOD2/CARD15,
mediante la comprobación de, al menos, uno de los polimorfismos
Nod2-SNP8, Nod2-SNP12,
Nod2-SNP13 en el gen NOD2/CARD15, asimismo, en el
caso de las enfermedades asociadas a los polimorfismos
Nod2-SNP8, Nod2-SNP12,
Nod2-SNP13 en el gen NOD2/CARD se trata de
reacciones de rechazo en trasplantes, enfermedades de
Graft-versus-Host, (GVHD, o
enfermedad de injerto contra huésped, EICH), enfermedades de
Host-versus-Graft (HVFD, o
enfermedad de huésped contra injerto, EHCI) y bronquiolitis
obliterante.
2. Procedimiento acorde a la reivindicación 1,
que comprende los siguientes pasos:
- a)
- preparación de una muestra que contiene el gen NOD2/CARD15, es decir, ácidos nucleicos NOD2/CARD15,
- b)
- análisis del gen NOD2/CARD15 para descubrir, al menos, uno de los polimorfismos Nod2-SNP8, Nod2-SNP12, Nod2-SNP13.
3. Procedimiento acorde a las reivindicaciones 1
o 2, que comprende los siguientes pasos
- a)
- Preparación de una muestra que contiene el gen NOD2/CARD15,
- b)
- aislamiento del ADN y/o del ARN de la muestra,
- c)
- realización de un PCR paso primers (iniciadores) específicos para el gen NOD2/CARD15,
- d)
- análisis del gen NOD2/CARD15 para descubrir, al menos, uno de los polimorfismos Nod2-SNP8, Nod2-SNP12, Nod2-SNP13.
4. Procedimiento para la predicción de la
probabilidad del surgimiento de reacciones de rechazo en trasplantes
acorde a una de las reivindicaciones anteriores, que comprende los
siguientes pasos:
- a)
- preparación de una muestra del donador que contiene el gen NOD2/CARD15, así como una muestra del receptor que contiene el gen NOD2/CARD15,
- b)
- Detección, en ambas muestras, de la presencia de uno o múltiples polimorfismos Nod2-SNP8, Nod2-SNP12, Nod2-SNP13.
5. Procedimiento acorde a una de las
reivindicaciones 1-4, en el cual durante el
procedimiento se utiliza, al menos, un oligonucleótido que consiste
en, al menos, 10 nucleótidos, asimismo, el oligonucleótido presenta
una secuencia complementaria al gen NOD2/CARD15 y contiene el
nucleótido complementario para la mutación, SNP8 y/o SNP12 y/o para
la inserción de nucleótido SNP13.
6. Procedimiento acorde a la reivindicación 5,
en el cual el oligonucleótido contiene, además, un marcador de
detección.
7. Procedimiento acorde a una de las
reivindicaciones 1-6, en el cual el procedimiento se
lleva a cabo utilizando, al menos, un microchip o chip de
diagnóstico, asimismo, el microchip o el chip de diagnóstico
contiene un oligonucleótido que consiste en, al menos, 10
nucleótidos, asimismo, el oligonucleótido presenta una secuencia
complementaria al gen NOD2/CARD15 y contiene el nucleótido
complementario para la mutación, SNP8 y/o SNP12 y/o para la
inserción de nucleótido SNP13.
8. Procedimiento acorde a la reivindicación 7,
en el cual el oligonucleótido contiene, además, un marcador de
detección.
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