ES2254382T3 - Polimorfismos del gen transportador de 5-hidroxitriptamina. - Google Patents
Polimorfismos del gen transportador de 5-hidroxitriptamina.Info
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Abstract
Un procedimiento para explorar un sujeto que padece de una enfermedad gastrointestinal que se puede tratar con un antagonista de 5-hidroxitriptamina 3 (5HT3), como ayuda para predecir la respuesta del sujeto a dicho tratamiento, que compre: determinar el genotipo de dicho sujeto en un sitio alélico polimórfico de inserción/deleción en la región 5¿ no codificante del gen del transportador de 5- hidroxitriptamina (5HTT), donde un genotipo de deleción homocigótico (SEC.ID.Nº 1) indica que el sujeto tiene mayor probabilidad de tener una respuesta favorable al tratamiento con un antagonista de 5HT3, en comparación con un sujeto que es heterocigótico u homocigótico para el alelo de inserción (SEC.ID.Nº 2).
Description
Polimorfismos del gen transportador de
5-hidroxitriptamina.
El presente estudio se refiere a polimorfismos
del gen del transportador de 5-hidroxitriptamina
(5-HTT), y fenotipos que están asociados o
correlacionados con los mismos. Más particularmente, el presente
estudio se refiere a la correlación de dichos polimorfismos con la
respuesta de sujetos con trastornos gastrointestinales (tales como
Síndrome del Intestino Irritable (IBS)) para tratamiento
farmacéutico. El presente estudio se refiere adicionalmente a
procedimientos para explorar compuestos para su actividad
farmacéutica. El presente estudio también se refiere a
procedimientos para genotipificar sujetos con propósitos de
predicción.
Se cree que muchos trastornos gastrointestinales
de etiología desconocida, incluyendo Síndrome del Intestino
Irritable (IBS), son trastornos multifactoriales. En muchos de estos
trastornos, no se ha encontrado ningún marcador bioquímico y el
diagnóstico se consigue principalmente por la observación de los
síntomas clínicos. A diferencia de los trastornos de un único gen
mendeliano, los trastornos complejos tales como diabetes, migraña y
enfermedad cardiovascular tienden a ser multifactoriales y están
causadas por la interacción de uno o más genes de susceptibilidad a
factores medioambientales. Hasta la fecha, no se ha identificado
ningún gen de susceptibilidad individual para IBS por estudios de
unión o asociación.
El síndrome del intestino irritable (IBS) es un
trastorno gastrointestinal habitual caracterizado por dolor y
molestia abdominal, y hábito intestinal alterado. IBS puede estar
caracterizado por síntomas de hábito intestinal alterado de
estreñimiento o diarrea, o estreñimiento y diarrea alternos.
Actualmente, no hay un marcador patofisiológico o de diagnóstico
único de IBS. Sin embargo, están disponibles diversos criterios de
diagnóstico para IBS, por ejemplo, Thompson y col., Gastroent.
Int., 2:92 (1989); Manning y col., Br. Med. J. 2:653 (1978);
Thompson y col., Gut 45:1143 (1999).
Se ha demostrado que el antagonismo de receptores
de 5-hidroxitriptamina, tal como por clorhidratote
alosetrón, es útil en el tratamiento de síndrome del intestino
irritable con diarrea predominante.
El clorhidrato de alosetrón (número de registro
CAS:
CAS-122852-69-1;
véase Patente de Estados Unidos Nº 5.360.800) es un antagonista del
receptor 5-HT3. Estudios tanto animales como humanos
indican que el bloqueo del receptor 5-HT3 tiene
valor terapéutico en el tratamiento del síndrome del intestino
irritable, particularmente en IBS con diarrea predominante. (Las
descripciones de todas las patentes de Estados Unidos citadas en
este documento se incorporan en este documento como referencia en
su totalidad).
En estudios doble ciego, controlados con placebo,
se ha demostrado que el clorhidrato de alosetrón reduce el dolor y
mejora la función intestinal en pacientes con Síndrome del Intestino
Irritable (IBS). Véase, Bardhan y col., Aliment Pharmacol Ther enero
de 2000; 14(1):23-34; Jones y col., Aliment
Pharmacol Ther noviembre de 1999;
13(11):1419-27; Camilleri y col., Aliment
Pharmacol Ther septiembre de 1999;
13(9):1149-59; Mangel y col., Aliment
Pharmacol Ther mayo de 1999; 13 Supl 2:77-82. EL
alosetrón se ha indicado adicionalmente como un tratamiento
potencial para el alivio sintomático de diarrea carcinoide. Saslow y
col., Gut mayo de 1998; 42(5):628-34.
Se han identificado y caracterizado receptores de
5-hidroxitriptamina (5HT) en el tracto
gastrointestinal, incluyendo los receptores 5HT3, 5HT4, y 5HT1a;
estos receptores están implicados no sólo en la modulación de la
movilidad intestinal sino también en las vías sensoriales. Se han
identificado diversos antagonistas de 5HT3 (por ejemplo, alosetrón,
granisetrón y ondansetrón) para el tratamiento de IBS. Esta clase de
fármacos parece reducir la sensibilidad visceral y tener efectos
inhibidores sobre la actividad motora del intestino distal. Los
agonistas completos y parciales de 5HT4 (por ejemplo, HTF919,
tegaserod) son agentes terapéuticos potenciales para mejorar IBS con
estreñimiento predominante. Los estudios preliminares sugieren que
estos agentes pueden tener potencial terapéutico en IBS. Farthing y
col., Baillieres Best Pract Res Clin Gastroenterol. octubre de 1999;
13(3):461-71. Los antagonistas de 5HT4
(piboserod, SB-207266A) también se han sugerido para
el tratamiento de IBS.
El 5HTT humano está codificado por un único gen
(SLC6A4) encontrado en el cromosoma 17q12 (Ramamoorthy y col., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 90:2542 (1993); Gelemter y col., Hum. Genet.
95:677 (1995); Lesch y col., J. Neural Transm. 91:67 (1993). El
transportador de 5HT regula la magnitud y duración de las respuestas
serotonérgicas. Se ha identificado previamente un polimorfismo de
inserción/deleción que consta de un segmento de 44 pares de bases en
la región 5' de control de la transcripción cadena arriba de la
secuencia codificante de 5HTT. El alelo con deleción (o corto) de
este polimorfismo está asociado con una eficacia de la transcripción
disminuida del promotor del gen de 5HTT, expresión génica
disminuida, y captación de 5-hidroxitriptamina
disminuida. (Heils y col., J. Neural Transm. 102:247 (1995); Heils y
col., J. Neurochem 66:2621 (1996), Lesch y col., Science 274:1527
(1996)). Diversos estudios bioquímicos sugieren que la función de
captación de 5HT está frecuentemente reducida en enfermedades
psiquiátricas, y una variación en la expresión de 5HTT funcional
debido al polimorfismo del promotor de 5HTT se ha implicado como un
factor de susceptibilidad genética potencial para trastornos
afectivos (Collier y col., Mol Psychiatry diciembre de 1996;
1(6):453-60; Lesch y col., Science 29 de
noviembre de 1996; 274(5292):1527-31; Furlong
y col., Am J Med Genet 7 de febrero de 1998;
81(1):58-63; Menza y col., J Geriatr
Psychiatry Neurol verano de 1999;
12(2):49-52; y Rosenthal y col., Mol
Psychiatry marzo de 1998; 3(2):175-7.
El documento WO94/09828 describe una molécula de
ácido nucleico aislado que codifica un receptor
5-HT4B de mamíferos. La proteína puede usarse en
procedimientos para determinar la unión de ligando, expresión del
receptor, exploración de fármaco y en tratamientos para aliviar
anormalidades asociadas con el receptor tal como síndrome del
intestino irritable.
En Vincent J.B. y col, American Journal of
Psychiatry, 156:1, (enero de 1999), páginas 136-138,
un análisis de asociación genética encontró una asociación positiva
estadísticamente significativa entre el trastorno afectivo bipolar y
polimorfismos y de un gen de serotonina humana (HTR2A) y el
transportado de serotonina (hSert).
Se ha determinado que los polimorfismos en el gen
del transportador de 5-hidroxitriptamina (5HTT)
están correlacionados con la respuesta de sujetos con IBS a terapia
farmacéutica. Más particularmente, se ha descubierto que un
polimorfismo de inserción/deleción en la región no codificante 5'
del gen de 5HTT es un indicador para la respuesta de pacientes con
IBS al tratamiento con un antagonista de 5HT; y se ha identificado
un subconjunto de pacientes con IBS que presenta una incidencia más
alta de alivio de los síntomas de IBS y una incidencia más baja de
estreñimiento cuando se tratan con alosetrón (en comparación con
pacientes con un polimorfismo alternativo en el mismo sitio del gen
de 5HTT).
Un primer aspecto de la presente invención es un
procedimiento para explorar una población de pacientes para
identificar aquellos sujetos con una probabilidad aumentada de
responder favorablemente al tratamiento con un antagonista de 5HT
para un trastorno gastrointestinal. Los sujetos pueden haberse
diagnosticado previamente como que tienen IBS u otro trastorno
gastrointestinal que se puede tratar con un ligando del receptor de
5HT, o puede usarse la exploración junto con intentos de
diagnóstico de IBS.
Un aspecto adicional de la presente invención es
un procedimiento para explorar un sujeto que padece de una
enfermedad gastrointestinal que se puede tratar con un ligando de
5-hidroxitriptamina (5HT), como una ayuda para
predecir la respuesta del sujeto al tratamiento con un ligando de
5HT. El procedimiento comprende obtener una muestra del ADN de un
sujeto y determinar el genotipo del sujeto en un sitió alélico
polimórfico en el gen del transportador de
5-hidroxitriptamina (5HTT), donde los diferentes
genotipos en ese sitio se han asociado con diferentes incidencias
de una respuesta fenotípica al tratamiento con un ligando de 5HT. El
genotipo que se detecta en la muestra indica que el sujeto tiene
probabilidad de tener una respuesta fenotípica asociada a ese
genotipo.
Un aspecto adicional de la presente invención es
un procedimiento para explorar un sujeto con síndrome del intestino
irritable (IBS), como una ayuda para predecir la respuesta del
sujeto a un tratamiento con un ligando de 5HT. El procedimiento
comprende obtener una muestra del ADN de un sujeto y determinar el
genotipo del sujeto en un sitio alélico polimórfico en el gen del
transportador de 5-hidroxitriptamina (5HTT), donde
los genotipos diferentes en ese sitio se han asociado con diferentes
incidencias de una respuesta fenotípica al tratamiento con un
ligando de 5HT.
Un aspecto adicional de la presente invención es
un procedimiento de exploración de un ligando
5-hidroxitriptamina (5HT) para variaciones en un
efecto fenotípico medible entre subpoblaciones genéticas de sujetos
con un trastorno gastrointestinal. El procedimiento comprende
administrar el ligando 5HT a una población de sujetos que padecen
del trastorno gastrointestinal, y obtener muestras de ADN de cada
uno de los sujetos. Las muestras de ADN son genotipos para un alelo
polimórfico del gen del transportador de
5-hidroxitriptamina (5HTT), y se determinan las
correlaciones entre el genotipo del alelo polimórfico y la
existencia de respuesta fenotípica en la población de sujetos. La
detección de un genotipo que está correlacionado con una incidencia
aumentada o disminuida de una respuesta terapéutica deseada o un
efecto secundario (en comparación con la incidencia en sujetos con
genotipos alternativos) indica que la eficacia del ligando en el
tratamiento del trastorno gastrointestinal varía entre las
subpoblaciones genéticas.
Un aspecto adicional de la presente invención es
un procedimiento para tratar sujetos con Síndrome del Intestino
Irritable (IBS) administrando un antagonista del receptor 5HT3,
donde los pacientes tienen un polimorfismo en el gen de 5HTT que es
indicador de una incidencia más alta de alivio de los síntomas de
IBS o una incidencia más baja de los efectos secundarios cuando se
tratan con un antagonista del receptor 5HT3. La incidencia del
alivio está aumentada (y de los efectos secundarios disminuida) en
comparación con sujetos que tienen un polimorfismo alternativo en
el mismo sitio del gen de 5HTT.
Un aspecto adicional de la presente invención es
un procedimiento para tratar sujetos con Síndrome del Intestino
Irritable (IBS) administrando alosetrón a los sujetos, que tienen un
polimorfismo en el gen de 5HTT que es indicador de una incidencia
más alta de alivio de los síntomas de IBS y una incidencia más baja
de estreñimiento cuando se tratan con alosetrón (en comparación con
sujetos con un polimorfismo alternativo en el mismo sitio del gen de
5HTT).
Un aspecto adicional de la presente invención es
un procedimiento para tratar un sujeto que padece de Síndrome del
Intestino Irritable (IBS), identificando el genotipo del sujeto en
un sitio alélico polimórfico en el gen del transportador de
5-hidroxitriptamina (5HTT), donde genotipos
diferentes en este sitio están asociados con diferentes incidencias
de respuesta fenotípica al tratamiento de IBS con un ligando del
receptor de 5HT. Al sujeto se le administra un ligando del receptor
de 5HT que está asociado con una incidencia aumentada de una
respuesta fenotípica favorable en sujetos con el genotipo
identificado.
La Figura 1 es un gráfico basado en los datos
recogidos de pacientes del sexo femenino admitidos en ensayos
clínicos de alosetrón para el tratamiento de IBS. La población de
estudio estaba compuesta de individuos no estreñidos con IBS. Los
sujetos se dividieron en genotipos de 5HTT. De los 219 sujetos, 71
(32,4%) eran 5HTT del/del, 75 (34,2%) eran 5HTT del/ins y 73 (33,3%)
eran 5HTT ins/ins. La Figura 1 muestra el porcentaje de sujetos que
respondieron al tratamiento con alosetrón o un placebo, dividido en
genotipos de 5HTT. "Respuesta" se definió como el alivio de
síntomas de IBS (dolor y molestia abdominal) durante seis semanas de
un estudio de tratamiento de doce semanas. Doscientos nueve sujetos
recibieron alosetrón (102 sujetos) o placebo coincidente (117
sujetos). La proporción de pacientes que consiguió una respuesta
después del tratamiento con alosetrón fue del 68% (21/31) para 5HTT
del/del, del 64% (21/33) para 5HTT del/ins y del 58% (22/38) para
5HTT ins/ins. La proporción de pacientes que consiguió una
respuesta después del tratamiento con placebo fue del 58% (23/40)
para 5HTT del/del, del 38% (16/42) para 5HTT del/ins y del 34%
(12/35) para 5HTT ins/ins.
La Figura 2 compara, entre los genotipos de 5HTT,
el porcentaje de sujetos tratados con alosetrón que presentaron
estreñimiento. De los 102 sujetos tratados con alosetrón, la
proporción de sujetos que presentó estreñimiento fue del 13% (4/31)
para 5HTT del/del, del 30% (10/33) para 5HTT del/ins y del 21%
(8/38) para 5HTT ins/ins.
La Figura 3 es una composición de la información
mostrada en las Figuras 1 y 2, y compara entre los genotipos de
5HTT la incidencia de estreñimiento y el porcentaje de sujetos que
experimentaron alivio de los síntomas de IBS, en sujetos tratados
con alosetrón. Los sujetos con el genotipo de 5HTT del/del mostraron
una incidencia aumentada de respuesta terapéutica favorable con una
incidencia más alta de alivio de los síntomas de IBS y una
incidencia más baja de estreñimiento, en comparación con sujetos que
tenían los genotipos de 5HTT del/ins o ins/ins.
La presente invención se refiere al tratamiento
de trastornos gastrointestinales mediados por receptores de 5HT, más
particularmente al tratamiento del Síndrome del Intestino Irritable
(IBS), y más particularmente al tratamiento de IBS con estreñimiento
no predominante. Se ha determinado que las variaciones polimórficas
en el gen de 5HTT pueden estar correlacionadas con, o asociadas a,
la respuesta a tratamiento farmacéutico, particularmente
tratamiento con ligandos del receptor de 5HT y más particularmente
tratamiento con antagonistas de 5HT3. Se ha identificado que un
polimorfismo de inserción/deleción en la región no traducida 5' del
gen del transportador de 5HT (5HTT) está correlacionado con la
respuesta de sujetos con trastorno gastrointestinal al tratamiento
con un ligando de 5HT.
Se obtuvieron muestras genéticas de sujetos
admitidos en ensayos clínicos de alosetrón para el tratamiento de
IBS. Las muestras genéticas se exploraron para un polimorfismo de
inserción/deleción en la región no codificante 5' del gen del
transportador de 5-hidroxitriptamina (gen de 5HTT),
usando tecnología de reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Los
alelos se marcaron como "del" (deleción) o "ins"
(inserción) que provocan los tres posibles genotipos (del/del;
del/ins o ins/ins). El polimorfismo de inserción (alelo "ins")
tenía SEC.ID.Nº 2.
- Leyenda:
- Las secuencias cebadoras de PCR están en tipo de letra subrayada
- \quad
- Las secuencias no codificantes se muestran en tipo de letra minúscula
- \quad
- Las bases polimórficas se muestran en tipo de letra negrita
- \quad
- La numeración de las bases es con relación a la secuencia mostrada
- \quad
- La numeración del polimorfismo es con relación a las secuencias de ADNc del gen
El alelo "del" representa una deleción de
aproximadamente 44 pares de bases en la región no traducida 5' del
gen de 5HTT. Esta deleción en la región reguladora de la
transcripción se ha asociado a una recaptación disminuida de 5HT y
por lo tanto un nivel basal de 5HT aumentado. Por lo tanto, se
postula que el genotipo del/del provoca una eficacia de la
transcripción más baja, una producción más baja de 5HTT, y una
recaptación de 5HT basal reducida (en comparación con el genotipo
del/ins o ins/ins). Los genotipos del/del, del/ins e ins/ins
estuvieron distribuidos aproximadamente de manera uniforme entre
los sujetos. De 219 sujetos, 71 eran 5HTT del/del; 75 eran 5HTT
del/ins; y 73 eran 5HTT ins/ins.
Se determinó que el genotipo del/del está
asociado con una incidencia aumentada de alivio de los síntomas de
IBS y una frecuencia más baja de estreñimiento como un efecto del
tratamiento con un antagonista de 5HT3 y, por lo tanto, una
incidencia aumentada de respuesta terapéutica favorable al
tratamiento con un antagonista de 5HT3 (en comparación con sujetos
con el genotipo del/ins o ins/ins tratados con el mismo antagonista
de 5HT3).
En cada uno de los tras genotipos de 5HTT,
alosetrón fue más eficaz que el placebo en el alivio de los síntomas
de IBS (Figura 1). Sin embargo, en el grupo del genotipo del/del
(homocigóticos para el polimorfismo de deleción), la incidencia de
alivio de los síntomas de IBS tanto para alosetrón como para el
placebo estuvo aumentada en comparación con otros genotipos de 5HTT
(Figura 1). Los sujetos con el genotipo del/del también mostraron
una incidencia reducida de estreñimiento en comparación con los
grupos del genotipo de 5HTT del/ins e ins/ins (Figura 2). La Figura
3 muestra sujetos con el genotipo 5HTT del/del que mostraron una
incidencia aumentada de respuesta terapéutica favorable con una
incidencia más alta de alivio de los síntomas de IBS y una
incidencia más baja de estreñimiento, en comparación con sujetos que
tenían los genitivos de 5HTT del/ins o ins/ins.
Se han identificado polimorfismos adicionales en
el gen de 5HTT que pueden ser útiles como indicadores de la
respuesta fenotípica al tratamiento con un ligando de 5HT para
enfermedad gastrointestinal. Estos incluyen siete Polimorfismos de
un Único Nucleótido (SNP) identificados buscando SNP en muestras de
ADN de 30 individuos de ensayo. Se amplificó el gen de 5HTT y los
productos de PCR se secuenciaron para identificar los SNP. Se
ensayaron adicionalmente siete SNP (véase Tabla 1) con una
frecuencia de alelo minoritaria de >5% (en una población de 30
personas).
| SNP | Número de Acceso a GenBank | Polimorfismo; Posición en la Secuencia |
| T623C | X76753 | cambio de T a C; en el pb 623 |
| T3287C | X76753 | cambio de T a C; en el pb 3287 |
| G674A | U79746 | cambio de G a A; en el pb 674 |
| C867T | U79746 | cambio de T a C; en el pb 867 |
| A2631C | U79746 | cambio de A a C; en el pb 2631 |
| G160A | X76758 | cambio de G a A; en el pb 160 |
| G769T | X76762 | cambio de G a T; en el pb 769 |
Los SNP se identifican en la Tabla 1 mediante el
cambio en el nucleótido y la posición del polimorfismo; la
numeración de los nucleótidos es la de la secuencia de GenBank
correspondiente.
Un polimorfismo adicional identificado y
explorado en el gen de 5HTT es un polimorfismo de Repetición en
Tándem de Número Variable (VNTR) encontrado en el intrón 2 del gen
de 5HTT, que consta de múltiples repeticiones de una secuencia de 17
pares de bases (véase pb 843-1012 en el Número de
Acceso a GenBank X76754). Un genotipo habitual consta de diez copias
de la secuencia de repetición de 17 pb, pero el número de
repeticiones de 17 pares de bases varía, y puede ser desde menos de
nueve, de 9 a 12, hasta más de doce repeticiones.
Después de la identificación inicial de estos SNP
y el polimorfismo VNTR, se obtuvieron muestras genéticas de sujetos
admitidos en ensayos clínicos de alosetrón para el tratamiento de
IBS, incluyendo una población de sujetos con IBS con estreñimiento
no predominante. Las muestras genéticas se exploran para los
polimorfismos identificados, usando tecnología de reacción en cadena
de la polimerasa (PCR) como se conoce en la técnica. La existencia
de un genotipo particular se correlaciona con la respuesta
fenotípica de los sujetos al tratamiento con alosetrón; dichas
respuestas fenotípicas incluyen conseguir la respuesta adecuada al
tratamiento, incidencia de los efectos secundarios, y transcurso del
tiempo de la respuesta al tratamiento.
De acuerdo con los presentes procedimientos,
puede explorarse genéticamente un individuo que padece de una
enfermedad gastrointestinal que se puede tratar con ligandos de 5HT,
para ayudar a predecir su respuesta a dicho tratamiento. La
exploración comprende obtener una muestra de ADN del sujeto y
explorar el ADN para determinar el genotipo (presencia/ausencia de
alelos polimórficos) en un sitio polimórfico predeterminado en el
gen del transportados de 5-hidroxitriptamina (5HTT),
donde los diferentes genotipos en ese sitio se han asociado
previamente con diferentes incidencias de una respuesta fenotípica
al tratamiento con un ligando de 5HT. La presencia de un genotipo
particular, por lo tanto, indica una probabilidad aumentada de que
el sujeto individual muestre el fenotipo asociado. El genotipo
raramente será absolutamente indicador, es decir, cuando una
población con un cierto genotipo presenta una alta incidencia de un
fenotipo particular, no todos los individuos con ese genotipo
presentarán el fenotipo. Sin embargo, será evidente para los
especialistas en la técnica que genotipificar un sujeto como se
describe en este documento será una ayuda para predecir la respuesta
que tendrá un sujeto al tratamiento con un ligando de 5HT, y por
tanto ayuda en la decisión del tratamiento.
Como se usa en este documento, "genotipificar
un sujeto (o muestra de ADN) para un alelo polimórfico en un locus
genómico definido" o "determinar el genotipo en un sitio
alélico polimórfico" significa detectar qué formas del alelo
están presentes en un sujeto (o una muestra). Como se sabe bien en
la técnica, un individuo puede ser heterocigótico u homocigótico
para un alelo particular. Pueden existir más de dos formas de un
alelo, como es el caso de los marcadores de microsatélites; por
tanto, puede haber más de tres posibles genotipos.
Como se usa en este documento, un sujeto que está
"predispuesto a" una respuesta fenotípica particular en base al
genotipificado de un alelo polimórfico tendrá mayor probabilidad de
presentar ese fenotipo que un individuo con un genotipo diferente en
ese alelo polimórfico. Cuando la respuesta fenotípica se basa en un
polimorfismo bialélico, la respuesta puede diferir entre los tres
posibles genotipos (por ejemplo, para 5HTT: del/del, del/ins e
ins/ins).
Como se usa en este documento, un "subconjunto
genético" de una población consta de aquellos miembros de la
población que tienen un genotipo particular. En el caso de un
polimorfismo bialélico, una población puede estar potencialmente
dividida en tres subconjuntos: homocigotos para el alelo 1,
heterocigotos, y homocigotos para el alelo 2.
Como se usa en este documento, una enfermedad
gastrointestinal "que se puede tratar con ligandos de 5HT" es
una en la que la administración de un ligando de 5HT (en una
formulación farmacéutica apropiada, y una cantidad terapéuticamente
eficaz) ha demostrado reducir o aliviar los síntomas, sin provocar
efectos secundarios inaceptables. Dicha eficacia terapéutica
típicamente se demuestra por la aprobación por la Autoridad
Reguladora (por ejemplo, FDA, EMEA) de la preparación farmacéutica,
o por la publicación de los resultados de estudios clínicos en
revistas médicas evaluadas por los iguales. Las cantidades
terapéuticamente eficaces de dichos compuestos pueden determinarse
fácilmente por los especialistas en la técnica usando, por ejemplo,
estudios de respuesta a dosis. Como se usa en este documento, la
expresión "ligando de 5HT" incluye antagonistas y agonistas de
receptores de 5HT, incluyendo agonistas parciales y fármacos que
interaccionan con 5HTT (por ejemplo, inhibidores selectivos de la
recaptación de serotonina, SSRI). Los ligandos de 5HT pueden unirse
a cualquier subtipo del receptor de 5HT, incluyendo receptores 5HT3
y 5HT4; los ligandos pueden ser específicos para un subtipo de
receptores particular.
Los compuestos relacionados con 5HT conocidos
incluyen antagonistas de 5HT3 (por ejemplo, ondansetrón,
granisetrón, tropisetrón, dolasetrón, mirtazapina, itasetrón,
pancoprida, zatosetrón, azasetrón, cilansetrón,
YM-144 (Yamanouchi) y RS17017 (Roche)).
También se conocen agonistas de 5HT4, incluyendo
tegaserod, prucaloprida, norcisaprida y
4-amino-5-cloro-2-metoxi-N-(piperidin-4-il
1-sustituido)benzamida conocida como
Y-34959 (Yoshitomi Pharmaceuticals), y buspirona. Se
ha propuesto el uso de agonistas de 5HT4 para tratar IBS con
estreñimiento predominante. Los antagonistas de 5HT4 incluyen
piboserod (SmithKline Beecham).
Los agonistas duales de 5HT3 y 5HT4 incluyen
renzaprida (SmithKline Beecham) y E3620 (Eisai). También se conoce
un agonista de 5HT1a, LY315535 (Eli Lilly).
Los inhibidores selectivos de la recaptación de
serotonina incluyen fluoxetina, etc.
Como se usa en este documento, un "efecto
secundario" es una respuesta no deseable a la administración de
un compuesto terapéutico, es decir, un efecto que no está dirigido a
aliviar los síntomas o causa de la enfermedad que se está tratando.
Los efectos secundarios varían desde molestias minoritarias hasta
acontecimientos más serios.
Como se usa en este documento, una respuesta
fenotípica "favorable" al tratamiento es una respuesta en la
que el alivio adecuado de los síntomas (por ejemplo, dolor,
urgencia, hábito intestinal alterado) se consigue con un nivel
aceptable de efectos secundarios. Una respuesta fenotípica
particular puede ser más favorable (por ejemplo, conseguir reducción
más amplia de los síntomas) que otra.
Adicionalmente, la respuesta fenotípica puede ser
el tiempo promedio hasta obtener el alivio adecuado de los síntomas;
los genotipos particulares se asocian con un fenotipo de
"respuesta temprana" cuando el alivio de los síntomas sucede en
un momento más temprano después de que se inicie el tratamiento, en
comparación con el observado para los sujetos con genotipos
alternos. La respuesta terapéutica deseada puede ser el alivio
adecuado de los síntomas en, por ejemplo, el primer mes, seis
semanas, o doce semanas, en comparación con sujetos en los que no se
obtiene el alivio promedio adecuado hasta después de 12 semanas, 18
semanas, 24 semanas o más.
De acuerdo con los presentes procedimientos,
puede explorarse un compuesto con actividad de ligando de 5HT para
la variación en sus efectos entre las subpoblaciones genéticas de
sujetos con un trastorno gastrointestinal. Dichos procedimientos
implican administrar el compuesto a una población de sujetos que
padecen de un trastorno gastrointestinal mediado por 5HT, obtener
muestras de ADN de los sujetos (que puede hacerse antes o después de
la administración del compuesto), genotipificar un sitio alélico
polimórfico en el gen de 5HTT, y correlacionar el genotipo de los
sujetos con sus respuestas fenotípicas (tanto favorables como
desfavorables) al tratamiento. Un genotipo está correlacionado con
una incidencia aumentada de una respuesta terapéutica deseada (o una
incidencia disminuida de un efecto secundario no deseable), en
comparación con la incidencia en sujetos con genotipos alternativos
en el sitio alélico polimórfico, indica que la eficacia del
compuesto en el tratamiento de dicho trastorno gastrointestinal
varía entre subpoblaciones genéticas.
Indicado de otro modo, los procedimientos de la
presente invención pueden usarse para determinar la correlación de
un alelo polimórfico de 5HTT conocido con la respuesta de sujetos
con trastornos gastrointestinales (tales como IBS) al tratamiento
con un ligando 5HT. La población de sujetos con la enfermedad de
interés, se estratifica de acuerdo con el genotipo para el alelo
polimórfico particular, y se evalúa su respuesta a un agente
terapéutico (prospectiva o retrospectivamente) y se compara entre
los genotipos. La respuesta al agente terapéutico puede incluir
cualquiera, o ambos, respuestas terapéuticas deseadas (por ejemplo,
el alivio de los signos o síntomas) y efectos secundarios no
deseables. De este modo, pueden identificarse los genotipos que
están asociados con una incidencia aumentada (o disminuida) de
eficacia terapéutica, o una incidencia aumentada (o disminuida) de
un efecto secundario particular. El aumento o descenso en la
respuesta está en comparación con los otros genotipos, o a una
población como conjunto.
Los polimorfismos son secuencias variantes en el
genoma humano que pueden o no tener una consecuencia funcional. Las
variantes pueden usarse en todos los aspectos de la investigación
genética incluyendo el análisis y diagnóstico de enfermedad
genética, estudios forenses, evolutivos y de poblaciones.
Típicamente se realizan dos tipos de análisis genéticos: estudios de
unión y asociación.
Un estudio de unión proporciona información de
mapa genético sin conocimiento o suposición anterior acerca de la
función de un gen. En un estudio de unión se usan polimorfismos de
ADN para identificar las regiones cromosómicas que son idénticas
entre parientes afectados con la esperanza de que las frecuencias
que comparten alelos sean superiores para un marcador (polimorfismo)
cuya localización cromosómica está cercana a la del alelo de
enfermedad. La clonación física de una región de unión limita la
secuencia de ADN que podría albergar el gen de enfermedad candidato.
Aunque el análisis de unión localiza el locus de la enfermedad en un
cromosoma específico o región cromosómica, la región de ADN en la
que buscar el gen es típicamente grande, del orden de varios
millones de pares de bases.
En contraste con la unión, la asociación muestra
la coexistencia de un polimorfismo y un fenotipo en una población.
Los estudios de asociación se basan en el desequilibrio de unión, un
fenómeno que sucede entre un marcador y un fenotipo si el
polimorfismo marcador está situado en cercana proximidad con el
polimorfismo funcional. Como el marcador y el polimorfismo funcional
están en cercana proximidad, requiere muchas generaciones de
recombinación para separarlas en una población. Por tanto, tienden a
coexistir juntos en el mismo cromosoma a una frecuencia superior a
la esperada. Se dice que un marcador está asociado a un fenotipo
específico cuando su frecuencia es significativamente superior entre
un grupo de fenotipos comparado con su frecuencia en otro. En
general, cuanto más cercano está un marcador al sitio funcionalmente
polimórfico, más fuerte es la asociación.
Los estudios de asociación ofrecen la oportunidad
de mapear finamente regiones de unión, mapear loci refractarios al
análisis de unión y mapear loci con predisposición desconocida. Los
polimorfismos que están en desequilibrio de unión entre sí, pueden
estar espaciados sobre grandes regiones. El desequilibrio de unión
se ha presentado en regiones tan pequeñas como 1 kb o tan grandes
como 500 kb. Los polimorfismos a lo largo de todo un gen pueden
estar en desequilibrio de unión entre sí, de modo que es valioso
estudiar la estructura genómica completa - intrones, exones,
promotores y regiones reguladoras de la transcripción, y regiones 3'
y 5' no traducidas. Un marcador que está en desequilibrio de unión
con un polimorfismo funcional puede ensayarse para la correlación
con un fenotipo.
Los polimorfismos útiles en los presentes
procedimientos pueden ser marcadores en desequilibrio de unión con
polimorfismos funcionales identificados o no identificados, o pueden
ser polimorfismos funcionales.
Se ha determinado que un polimorfismo en el gen
de 5HTT juega un papel en la respuesta de sujetos al tratamiento
farmacéutico de IBS, por tanto, el genotipificado del gen del
Transportador de 5HT (5HTT) (directamente o mediante su producto de
expresión) será útil para identificar compuestos terapéuticos con
efectos medibles que varían entre los genotipos de 5HTT. El efecto a
medir dependerá de la afección gastrointestinal particular,
compuesto terapéutico, y población de pacientes, como será evidente
para un especialista en la técnica. El efecto medible puede ser el
alivio de, o cambio en, un signo o síntoma patológico o la
existencia de un efecto secundario relacionado con la administración
de un compuesto. La medida puede ser objetiva o subjetiva (por
ejemplo, por propio informe del paciente). La asociación de un
genotipo de 5HTT con una repuesta terapéutica proporcionará un
procedimiento para determinar la probabilidad de que un sujeto
individual responda de un modo particular al tratamiento con
ligandos 5HT. En el genotipificado, la característica que
típicamente se mide es una que puede verse influida por un
polimorfismo en el gen o su producto de expresión. Como se usa en
este documento, el término polimorfismo incluye Polimorfismos de un
Único Nucleótido (SNP), polimorfismos de inserción/deleción;
polimorfismos de microsatélites; y polimorfismos de repetición en
tándem de número variable (VNTR).
Los alelos polimórficos típicamente se detectan
determinado directamente la presencia de la secuencia polimórfica en
un polinucleótido o proteína del sujeto, usando cualquier técnica
adecuada como se sabe en la técnica. Dicho polinucleótido
típicamente es ADN genómico, o un polinucleótido obtenido de este
polinucleótido, tal como en una biblioteca fabricada usando material
del individuo (por ejemplo, una biblioteca de ADNc). El
procesamiento del polinucleótido o proteína antes de realizar el
procedimiento de la invención se analiza adicionalmente a
continuación. Típicamente, la presencia del polimorfismo se
determina en un procedimiento que comprende poner en contacto un
polinucleótido o proteína del individuo con un agente de unión
específico para el polimorfismo y determinar si el agente se une al
polinucleótido o proteína, donde la unión indica que el polimorfismo
está presente. El agente de unión también puede unirse a nucleótidos
y aminoácidos flanqueantes en uno o ambos lados del polimorfismo,
por ejemplo, al menos 2, 5, 10, 15 o más nucleótidos o aminoácidos
flanqueantes en total o en cada lado. En una realización, el agente
es capaz de unirse a la secuencia de tipo silvestre correspondiente
mediante la unión a los nucleótidos o aminoácidos que flanquean la
posición del polimorfismo, aunque el modo de la unión será
diferente a la unión de un polinucleótido o proteína polimórfico, y
esta diferencia será detectable (por ejemplo, esto puede suceder en
PCR específica de secuencia como se analiza a continuación).
En el caso en el que la presencia del
polimorfismo se esté determinando en un polinucleótido, puede
detectarse en una forma de doble hélice, pero típicamente se detecta
en una forma de hélice única.
El agente de unión puede ser un polinucleótido
(de hélice doble o única) típicamente con una longitud de al menos
10 nucleótidos, por ejemplo, al menos 15, 20, 30, o más nucleótidos.
El agente puede ser una molécula que es estructuralmente similar a
polinucleótidos que comprende unidades (tal como purinas o
piridinas) capaz de participar en el apareamiento de bases de
Watson-Crick. El agente puede ser una proteína,
típicamente con una longitud de al menos 10 aminoácidos, tal como al
menos 20, 30, 50, 100 aminoácidos. El agente puede ser un
anticuerpo (incluyendo un fragmento de dicho anticuerpo que sea
capaz de unirse al polimorfismo).
Un agente polinucleotídico que se usa en el
procedimiento generalmente se unirá a polimorfismo de interés, y la
secuencia flanqueante, de un modo específico de secuencia (por
ejemplo, hibrida de acuerdo con el apareamiento de bases de
Watson-Crick) y, por tanto, típicamente tiene una
secuencia que es completa o parcialmente complementaria a la
secuencia del polimorfismo y región flanqueante.
En una realización de los presentes
procedimientos, se usa un agente de unión como sonda. La sonda puede
estar marcada o puede ser capaz de estar indirectamente marcada. La
detección del marcador puede usarse para detectar la presencia de
la sonda en (y por tanto unida a) el polinucleótido o proteína del
individuo. La unión de la sonda al polinucleótido o proteína puede
usarse para inmovilizar la sonda o el polinucleótido o proteína (y
por tanto para separarla de una composición o solución).
En otra realización de la invención, el
polinucleótido o proteína del individuo se inmoviliza en un soporte
sólido y después se pone en contacto con la sonda. La presencia de
la sonda inmovilizada en el soporte sólido (mediante su unión al
polimorfismo) se detecta después, directamente detectando un
marcador en la sonda o indirectamente poniendo en contacto la sonda
con un resto que se une a la sonda. En el caso de la detección de
un polimorfismo polinucleotídico, el soporte sólido generalmente
está fabricado de nitrocelulosa o nylon. En el caso de un
polimorfismo proteico, el procedimiento puede basarse en un sistema
ELISA.
Los presentes procedimientos pueden basarse en el
ensayo de ligamiento de oligonucleótidos en el que se usan dos
sondas oligonucleotídicas. Estas sondas se unen a áreas adyacentes
en el polinucleótido que contiene el polimorfismo, permitiendo
(después de la unión) que las dos sondas se liguen entre sí mediante
una enzima ligasa apropiada. Sin embargo, las dos sondas sólo se
unirán (de un modo que permite el ligamiento) a un polinucleótido
que contiene el polimorfismo y, por lo tanto, la detección del
producto ligando puede usarse para determinar la presencia del
polimorfismo.
En una realización, la sonda se usa en un sistema
basado en análisis de heterodúplex para detectar polimorfismos. En
dicho sistema, cuando la sonda se une a una secuencia
polinucleotídica que contiene el polimorfismo, forma un
heterodúplex en el sitio en el que existe un polimorfismo (es decir,
no forma una estructura de doble hélice). Dicha estructura
heterodúplex puede detectarse mediante el uso de una enzima que es
específica de hélice única o doble. Típicamente, la sonda es una
sonda de ARN y la enzima usada es ARNasa H que escinde la región
heterodúplex, permitiendo de este modo que se detecte el
polimorfismo mediante la detección de los productos de escisión.
El procedimiento puede basarse en el análisis de
falta de coincidencia por escisión química fluorescente que se
describe por ejemplo en PCR Methods and Applications
3:268-71 (1994) y Proc. Natl. Acad. Sci.
85:4397-4401 (1998).
En una realización, el agente polinucleotídico es
capaz de funcionar como cebador para una reacción de PCR sólo si se
une a un polinucleótido que contenga el polimorfismo (es decir, un
sistema de PCR específico de secuencia o alelo). Por tanto, sólo se
producirá un producto de PCR si el polimorfismo está presente en el
polinucleótido del individuo. Por tanto, la presencia del
polimorfismo puede determinarse por la detección del producto de
PCR. Preferiblemente, la región del cebador que es complementaria al
polimorfismo está en o cerca del extremo 3' del cebador. En una
realización de este sistema, el agente polinucleotídico se unirá a
la secuencia de tipo silvestre pero no funcionará como cebador para
un reacción de PCR.
El procedimiento puede ser un sistema basado en
Polimorfismo de Longitud de Fragmento de Restricción (RFLP). Esto
puede usarse si la presencia del polimorfismo en el polinucleótido
crea o destruye un sitio de restricción que se reconoce por una
enzima de restricción. Por tanto, el tratamiento de un
polinucleótido con dicho polimorfismo conducirá a diferentes
productos en producción en comparación con la secuencia de tipo
silvestre correspondiente. Por tanto, la detección de la presencia
de productos de digestión con enzimas de restricción particulares
puede usarse para determinar la presencia del polimorfismo.
La presencia del polimorfismo puede determinarse
en base al cambio que produce la presencia del polimorfismo en la
movilidad del polinucleótido o proteína durante electroforesis en
gel. En el caso de un polinucleótido, puede usarse análisis de
polimorfismo conformacional de hélice única (SSCP). Esto mide la
movilidad del polinucleótido de hélice única en un gel
desnaturalizante en comparación con el polinucleótido de tipo
silvestre correspondiente, indicando, la detección de una
diferencia en la movilidad, la presencia del polimorfismo. La
electroforesis en gel con gradiente desnaturalizante (DGGE) es un
sistema similar en el que el polinucleótido se somete a
electroforesis a través de un gel con un gradiente desnaturalizante,
indicando, un diferencia en la movilidad en comparación con el
polinucleótido de tipo silvestre correspondiente, la presencia del
polimorfismo.
La presencia del polimorfismo puede determinarse
usando un ensayo de PCR basado en colorante fluorescente y agente
de inactivación tal como el sistema de detección por PCR Taqman. En
resumen, este ensayo usa un cebador específico de alelo que
comprende la secuencia alrededor, e incluyendo, el polimorfismo. El
cebador específico está marcado con un colorante fluorescente en su
extremo 5', y un agente de inactivación en su extremo 3' y un grupo
fosfato 3' que evita la adición de nucleótidos al mismo.
Normalmente, la fluorescencia del colorante está inactivada por el
agente de inactivación presente en el mismo cebador. El cebador
específico de alelo se usa junto con un segundo cebador capaz de
hibridar con el alelo 5' del polimorfismo.
En el ensayo, cuando está presente el alelo que
comprende el polimorfismo está presente, la ADN polimerasa Taq
añade nucleótidos al cebador no específico hasta que alcanza el
cebador específico. Después libera polinucleótidos, el colorante
fluorescente y el agente de inactivación del cebador específico a
través de su actividad endonucleasa. El colorante fluorescente, por
lo tanto, ya no está en proximidad con el agente de inactivación y
emite fluorescencia. En presencia del alelo que no comprende el
polimorfismo, la falta de coincidencia entre el cebador específico
y el molde inhibe la actividad endonucleasa de Taq y el colorante
fluorescente no se libera del agente de inactivación. Por lo tanto,
midiendo la fluorescencia emitida, puede determinarse la presencia o
ausencia del polimorfismo.
En otro procedimiento para detectar el
polimorfismo, se secuencia un polinucleótido que comprende la región
polimórfica a lo largo de la región que contiene el polimorfismo
para determinar la presencia del polimorfismo.
Por consiguiente, puede utilizarse cualquiera de
las siguientes técnicas en los presentes procedimientos para
genotipificar, como se sabe en la técnica.
\bullet Generales: secuenciación de ADN,
secuenciación por hibridación;
\bullet De exploración: PTT (Técnica de
truncamiento de proteínas), SSCP (análisis conformacional de hélice
única), DGGE (electroforesis en gel con gradiente desnaturalizante),
TGGE (electroforesis en gel con gradiente de temperatura), Cleavase,
Análisis de heterodúplex, CMC (escisión por falta de coincidencia
química), escisión por falta de coincidencia enzimática;
\bullet Basados en hibridación: hibridación en
fase sólida (dot blot, MASDA, dot blot inversos, series de
oligonucleótidos (chips)); hibridación en fase de solución (Taqman,
Molecular Beacons);
\bullet Basados en extensión: ARMS (Sistema de
Mutación Refractaria a Amplificación), ALEX (Extensión Lineal del
Sistema de Mutación Refractaria a Amplificación) SBCE (Extensión de
Cadena de Base Única)
\bullet Basados en incorporación:
Mini-secuenciación, APEX; (Extensión de Cebador en
Serie)
\bullet Basados en enzimas de restricción: RFLP
(polimorfismo de longitud de fragmento de restricción)
\bullet Basado en ligamiento: OLA (Serie
Extensión de Oligonucleótido)
\bullet Otros: Invader (Tecnologías de Tercera
Ola).
La presente invención también proporciona un
ensayo de predicción (cuidado del paciente) o kit de ensayo. Dicho
ensayo ayudará al manejo de la enfermedad de IBS en base a
asociaciones predeterminadas entre genotipo y respuesta fenotípica a
ligandos de 5HT en el tratamiento de enfermedad gastrointestinal.
Dicho ensayo podría tomas dos formatos diferentes:
\bullet un ensayo molecular que analiza el ADN
o ARN para la presencia de polimorfismos predeterminados. Un kit de
ensayo apropiado puede incluir uno o más de los siguientes reactivos
o instrumentos: un medio para detectar la unión del agente al
polimorfismo, una enzima capaz de funcionar sobre un polinucleótido
(típicamente una polimerasa o enzima de restricción), tampones
adecuados para reactivos enzimáticos, cebadores de PCR que se unen a
regiones que flanquean el polimorfismo, un control positivo o
negativo (o ambos), un aparato de electroforesis en gel y un medio
para aislar ADN de una muestra. El producto puede utilizar una de
las tecnologías de chip como se describe por la actual declaración
de la técnica. El kit de ensayo incluirá instrucciones impresas o
legibles a máquina que exponen la correlación entre la presencia de
un polimorfismo específico o genotipo y la probabilidad de que un
sujeto con IBS responda favorablemente a terapia con un ligando de
5HT.
\bullet un ensayo bioquímico que analiza
materiales obtenidos del cuerpo del sujeto, incluyendo proteínas o
metabolitos, que indica la presencia de un polimorfismo
predeterminado. Un kit de ensayo apropiado comprenderá una molécula,
aptámero, péptido o anticuerpo (incluyendo un fragmento de
anticuerpo) que se une específicamente a una región polimórfica
predeterminada (o una región específica que flanquea el
polimorfismo), o un agente de unión como se define en este
documento. El producto puede comprender adicionalmente uno o más
reactivos o instrumentos adicionales (como se sabe en la técnica).
El kit de ensayo también incluirá instrucciones impresas o legibles
a máquina que exponen la correlación entre la presencia de un
polimorfismo específico o genotipo y la probabilidad de que un
sujeto con IBS responda favorablemente a terapia con un ligando de
5HT.
La invención proporciona un procedimiento para
explorar un sujeto diagnosticado con IBS u otro trastorno
gastrointestinal que se puede tratar por ligandos de 5HT, para
determinar la probabilidad de que respondan de un modo particular al
tratamiento con un ligando de 5HT, más particularmente un
antagonista de 5HT3, y más particularmente alosetrón. El
procedimiento comprende explorar el sujeto para un polimorfismo en
el gen de 5HTT que se ha asociado previamente a una incidencia alta
o baja de un resultado terapéutico deseable particular (en
comparación con la incidencia en sujetos con otros genotipos), o
asociado a una incidencia alta o baja de un efecto secundario no
deseado (en comparación con la incidencia en sujetos con otros
genotipos). Los sujetos son mamíferos, y preferiblemente seres
humanos.
El tratamiento de un sujeto con un ligando de 5HT
comprende la administración de una cantidad eficaz del agente
farmacéutico a un sujeto en necesidad del mismo. La dosis del agente
se determina de acuerdo con procedimientos conocidos y aceptados en
las técnicas farmacéuticas, y puede determinarse por los
especialistas en la técnica. Se proporciona un intervalo de
dosificación y concentración en plasma adecuados para alosetrón en
la descripción de la Patente de Estados Unidos Número 5.360.800, la
descripción completa de la cual se incorpora por la presente como
referencia.
Se obtuvieron muestras genéticas de 219 sujetos
humanos del género femenino admitidos en ensayos clínicos de
alosetrón para el tratamiento de IBS. Usando tecnología de PCR como
se sabe en la técnica, se ensayó un marcador genético de
inserción/deleción en el gen del transportador de
5-hidroxitriptamina (gen de 5HTT). Los alelos se
marcaron como "del" (deleción) o "ins" (inserción)
provocando tres posibles genotipos (del/del; del/ins o ins/ins).
El marcador de inserción/deleción estaba en la
región no traducida 5' del gen de 5HTT. El polimorfismo de deleción
(alelo "del") tenía SEC.ID.Nº 1; el polimorfismo de inserción
(alelo "ins") tenía SEC.ID.Nº 2 (inserción mostrada en tipo de
letra negrita):
\vskip1.000000\baselineskip
El segmento borrado comprende los nucleótidos
161-204 de SEC.ID.Nº 2. Las secuencias cebadoras de
CR están en tipo de letra subrayado.
Los presentes genotipos de 5HTT estaban
distribuidos aproximadamente de manera uniforme. De los 219 sujetos
genotipificados para el marcador de 5HTT, 71 (32,4%) eran 5HTT
del/del, 75 (34,2%) eran 5HTT del/ins y 73 (33,3%) eran 5HTT
ins/ins.
El alelo "del" representa una deleción de
aproximadamente 44 pares de bases en la región no traducida 5' del
gen de 5HTT. El genotipo del/del provoca una eficacia de la
transcripción más baja, producción más baja de 5HTT, y recaptación
de 5HT basal reducida (en comparación con el genotipo del/ins o
ins/ins).
Se analizó la respuesta del sujeto a alosetrón en
el ajuste de ensayo clínico y se correlacionó con el genotipo. En
los ensayos clínicos doble ciego, controlados con placebo, los
sujetos recibieron 12 semanas de tratamiento con alosetrón o un
placebo. Una respuesta favorable a alosetrón fue cuando un sujeto
presentó alivio de los síntomas de IBS durante seis semanas del
ensayo de doce semanas. También se registró la incidencia de
diversos efectos distintos, incluyendo estreñimiento.
La respuesta de los sujetos al tratamiento con
alosetrón en el ensayo clínico se estratificó de acuerdo con el
genotipo.
En cada uno de los tres genotipos de 5HTT
alosetrón fue más eficaz que el placebo en la producción de alivio
(Figura 1). Sin embargo, en el grupo de genotipo del/del
(homocigótico para el polimorfismo de deleción), se observó una
incidencia aumentada de alivio de los síntomas de IBS (aumentado en
comparación con otros genotipos de 5HTT). (Figura 1). El alivio de
síntomas de IBS con alosetrón se consiguió en el 68% de los sujetos
del/del (21/31); el 64% de los sujetos del/ins (21/33); y el 58% de
los sujetos ins/ins (22/38).
La existencia de estreñimiento durante el
tratamiento con alosetrón en el ensayo clínico se estratificó de
acuerdo con el genotipo. Los sujetos tratados con alosetrón con el
genotipo del/del mostraron una incidencia reducida de estreñimiento
en comparación con los grupos de genotipo de 5HTT del/ins e ins/ins
(Figura 2). Se presentó estreñimiento en el 21% del grupo de sujetos
total que recibieron alosetrón (n=102). En sujetos del/del (n=31),
4 (13%) presentaron estreñimiento; en sujetos del/ins (n=33), 10
(30%) presentaron estreñimiento; y en sujetos ins/ins (n=38), 8
(21%) presentaron estreñimiento (Figura 2).
Los sujetos con el genotipo de 5HTT del/del
mostraron una incidencia aumentada de respuesta terapéutica
favorable, con incidencia más alta de alivio de los síntomas de IBS
e incidencia más baja de estreñimiento, en comparación con sujetos
con genotipos de 5HTT del/ins e ins/ins (Figura 3).
Se obtienen muestras de ADN de una población de
sujetos con enfermedad gastrointestinal, y se extrae el ADN genómico
usando procedimientos convencionales (extracción automática o usando
formatos de kit). Los genotipos de los sujetos, y cualquier
individuo de control utilizado, se determinan para los polimorfismos
en la secuencia del gen de 5HTT, usando PCR,
PCR-RFLP, ensayos de discriminación alélica Taqman,
o cualquier otra técnica adecuada como se sabe en la técnica.
Si un polimorfismo específico reside en un
producto de amplificación que es de suficiente tamaño físico (por
ejemplo, un polimorfismo de inserción/deleción de múltiples bases),
puede emplearse un ensayo de discriminación de tamaño simple para
determinar el genotipo de un individuo. En este caso, se emplean dos
cebadores para amplificar específicamente el gen de interés en una
región que rodea el sitio del polimorfismo. Se realiza
amplificación por PCR generando productos que difieren en longitud,
dependiendo del genotipo (inserción o deleción) que tengan. Cuando
se someten a electroforesis en gel, los productos de diferentes
tamaños se separan, visualizan, y los genotipos específicos se
interpretan directamente.
También pueden utilizarse ensayos de
PCR-RFLP (reacción en cadena de la
polimerasa-polimorfismo de longitud de fragmento de
restricción) como se sabe en la técnica para detectar polimorfismos.
Para cada sitio polimórfico, un ensayo PCR-RFLP
emplea dos cebadores específicos de gen para hibridar con, y
amplificar específicamente un segmento de ADN genómico que rodea el
sitio polimérico de interés. Después de la amplificación por PCR,
se emplean enzimas endonucleasas de restricción específicas para
digerir los productos de PCR producidos. La enzima utilizada para un
ensayo se selecciona debido a su secuencia de reconocimiento
específica que necesita para unirse a, y escindir el producto de PCR
en presencia/ausencia del polimorfismo, produciendo fragmentos de
diagnóstico de la base específica presente en el sitio polimórfico.
Después de la escisión por la enzima de restricción, se emplea
electroforesis en gel para separar y visualizar los fragmentos
producidos.
Los ensayos Taqman, conocidos en la técnica,
también pueden utilizarse para identificar polimorfismos. Para cada
sitio polimórfico, el ensayo de discriminación alélica usa dos
sondas específicas de alelo marcadas con un colorante fluorescente
diferente en sus extremos 5' pero con un agente de inactivación
común en sus extremos 3'. Ambas sondas tienen un grupo fosfato 3' de
modo que la Taq polimerasa no puede añadir nucleótidos a las
mismas. Las sondas específicas de alelo que comprende una secuencia
que abarca el sitio polimórfico y diferirá sólo en la secuencia en
este sitio (esto no es necesariamente cierto, las sondas específicas
de alelo pueden cambiarse con respecto a la otra de modo que no
sean idénticas en longitud y composición. Sin embargo, cuando
cubren la misma región de ADN, son idénticos excepto el sitio
polimórfico de interés). Las sondas específicas de alelo sólo son
capaces de hibridar sin faltas de coincidencia con el sitio
apropiado.
Las sondas específicas de alelo se usan junto con
dos cebadores, uno de los cuales hibrida con el molde 5' de las dos
sondas específicas, mientras que la otra hibrida con el molde 3' de
las dos sondas. Si el alelo correspondiente a una de las sondas
específicas está presente, la sonda específica hibridará
perfectamente con el molde. La Taq polimerasa, que prolonga el
cebador 5', después retirará los nucleótidos de la sonda específica,
liberando tanto el colorante fluorescente como el agente de
inactivación. Esto provocará un aumento en la fluorescencia del
colorante que ya no está en cercana proximidad con el agente de
inactivación.
Si la sonda específica de alelo hibrida con el
otro alelo, la falta de coincidencia en el sitio polimórfico
inhibirá la actividad endonucleasa 5' a 3' de Taq y por tanto la
liberación del colorante fluorescente. El sistema de detección de
secuencia ABI7700 se usa para medir el aumento en la fluorescencia
de cada colorante específico al final del ciclo térmico de la PCR
directamente en los tubos de reacción de PCR. La información de las
reacciones se analiza después. Si un individuo es homocigótico para
un alelo particular, sólo se liberará la fluorescencia
correspondiente al colorante de esa sonda específica, pero si el
individuo es heterocigótico, entonces ambos colorantes emitirán
fluorescencia.
Después se correlacionan los genotipos de los
individuos con su respuesta fenotípica al tratamiento con un
ligando de 5HT. Se identifican las respuestas que varían entre las
subpoblaciones genéticas.
<110> Manasco, Penelope
\hskip1cmMosteller, Michael
\hskip1cmKong, Ning
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120>Polimorfismos del Gen del
Transportador de 5-Hidroxitriptamina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> PU3932WO
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn versión 3.0
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 484
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 528
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
Claims (3)
1. Un procedimiento para explorar un sujeto que
padece de una enfermedad gastrointestinal que se puede tratar con un
antagonista de 5-hidroxitriptamina 3 (5HT3), como
ayuda para predecir la respuesta del sujeto a dicho tratamiento, que
compre:
determinar el genotipo de dicho sujeto en un
sitio alélico polimórfico de inserción/deleción en la región 5' no
codificante del gen del transportador de
5-hidroxitriptamina (5HTT), donde un genotipo de
deleción homocigótico (SEC. ID. Nº 1) indica que el sujeto tiene
mayor probabilidad de tener una respuesta favorable al tratamiento
con un antagonista de 5HT3, en comparación con un sujeto que es
heterocigótico u homocigótico para el alelo de inserción (SEC.ID. Nº
2).
2. Un procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 1, en el que dicho sujeto padece de Síndrome del
Intestino Irritable (IBS).
3. El procedimiento de la reivindicación 1, en el
que el antagonista se selecciona entre el grupo constituido por:
Alosetrón, granisetrón, ondansetrón.
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