EP1230391A2 - Verfahren zur bestimmung von pcr-produkten, sowie ein pcr-detektions-kit und eine vorrichtung für ein solches verfahren - Google Patents

Verfahren zur bestimmung von pcr-produkten, sowie ein pcr-detektions-kit und eine vorrichtung für ein solches verfahren

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Publication number
EP1230391A2
EP1230391A2 EP00977535A EP00977535A EP1230391A2 EP 1230391 A2 EP1230391 A2 EP 1230391A2 EP 00977535 A EP00977535 A EP 00977535A EP 00977535 A EP00977535 A EP 00977535A EP 1230391 A2 EP1230391 A2 EP 1230391A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
pcr
pcr products
flow cytometer
primers
binding
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP00977535A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Wolfgang GÖHDE
Niels Wedemeyer
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Individual
Original Assignee
Individual
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Publication date
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Publication of EP1230391A2 publication Critical patent/EP1230391A2/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]

Definitions

  • the invention relates to a method according to the preamble of claim 1.
  • the invention relates to a PCR detection kit that can be used in the method and a device for carrying out the method.
  • DANN or RNA sequences in sample material, usually living cells, can be used as a diagnostic and / or therapeutic parameter in a wide variety of applications. It is conceivable that a comparison of a cell sample to be analyzed with known samples or a standardized standard indicates the degree of an infectious or oncological disease. Another area of application is human genetic studies, in which the presence of certain target sequences in unusual amounts suggests any hereditary diseases. Finally, generic methods are also used in forensics, for example when it comes to differentiating the genetic material of different people. The above list is not exhaustive. It only serves to clarify the aim of generic methods. Other application examples, such as quality control of food, can be thought of.
  • Generic methods can also only be used qualitatively to check whether a specific target sequence is present in cells or not (yes / no statement). The main application, however, is quantitative determination.
  • RNA sequence gene expression, RNA virus
  • a sufficient amount of PCR products can be produced from the target sequences by means of PCR so that they can then be quantified.
  • a "relative" quantification of the PCR products can be done, for example, by comparing several different PCR approaches. However, it is also conceivable to use a standard sequence with a known amount of target sequence as a reference and to use the measurement results (amount of PCR products) for absolute calculations of the amount of target sequence from the same sample. Suitable methods of the generic type for flow cytometric detection of PCR products are described, for example, by Yang et. al. (1995), Cytometry 21: 197-202 or Vlieger et. al. (1992) Anal.Biochem. 205: 1-7.
  • a first marking is carried out on the PCR product formed during the PCR by incorporating appropriately labeled nucleotides.
  • the finished PCR product is then thermally separated into single strands. Additional DNA probes are hybridized to the single strands, which have a second label that differs from the first.
  • a microparticle is then coupled to the first label of the PCR product and a fluorescence-labeled antibody to the second label.
  • the colored PCR products can then be determined based on their particle binding in the flow cytometer.
  • the described methods require the following separate steps: 1. PCR reaction to introduce the first label, 2. Hybridization to introduce the second label, 3. Linkage to the particles, 4. Staining of the PCR products with fluorescence-labeled antibodies and 5. Measurement of the particles in the flow cytometer.
  • the object of the invention is to create a method based on the prior art which enables a faster and more reliable determination of PCR products. According to the invention, the object is achieved by a method which has the characterizing features of claim 1.
  • both labels are made during the PCR by using differently labeled primers and / or incorporation of differently labeled nucleotides into the PCR products.
  • Primers are preferably used, each of which is provided with a marking. However, it is also conceivable to use a primer for each target sequence which bears the first label and a nucleotide which bears the second label or to work with different nucleotides which are each provided with the labels.
  • the two different markings are thus provided in a particularly simple manner on each PCR product formed from the target sequence in the course of the amplification.
  • labeled primers Another significant advantage in the preferred use of labeled primers is that the number of labels is clearly defined via the primers. If labeled nucleotides are used, which are incorporated into the product formed during the PCR, it can happen that, for example, several labels appear per DNA strand, which preclude exact quantification. There are different ways in which the two preferred labeled primers can be used (the following also applies analogously to labeled nucleotides).
  • the markings provided on the primers are only specific binding sites, to which, as a rule, the particles or dyes detectable in the flow cytometer can be bound with corresponding complementary counterparts after completion of the PCR.
  • binding sites could e.g. the following compounds: digoxigenin, biotin, dinitrophenol, cholesterol, amines, psoralen etc.
  • the coupling to the particles and / or the dye takes place via antibodies or adapters such as e.g. Streptavidin.
  • Other specifically binding systems familiar to the person skilled in the art are also conceivable.
  • the labels can be used to carry out a specific "fluorochromation" or particle binding to one of the two primers.
  • a suitable dye for the fluorochromation of the PCR products would be e.g. Phycoerythrin, which e.g. can be used in the form of a conjugate with streptavidin. In contrast to the "prior art" process, the coloring takes place simultaneously with the particle attachment.
  • Other dyes include considered: Cy5, Cy3, Cy2, TAMRA, Rhodamine, HEX, ROX, Texas Red, IRD40, IRD41 and AMCA.
  • the method according to the invention is to be used in particular for the quantification of PCR products.
  • a further advantageous embodiment of the invention provides that an additional target sequence to be analyzed is determined simultaneously (i.e. in the same approach), the starting concentration of which is known in a further preferred embodiment (introduction of an internal standard). It goes without saying that the PCR products amplified from this known target sequence are in turn labeled according to the invention, but it must be ensured that the labels enable differentiation from the labeled PCR products from the target sequence to be analyzed.
  • this can be done by using primers for the two different sequences, each of which binds to a particle population of different sizes. In this way, a particularly simple differentiation is possible using particle size measurements in the flow cytometer. It would also be conceivable to use primers with different dyes and then to differentiate them using the color signals. When using different dyes, however, dye-related overlays can occur, which may falsify the measurement results.
  • the invention not only relates to a method according to the invention but also relates to a PCR detection kit that can be used in the method.
  • the kit can all be used for flow cytometric detection
  • Components necessary for PCR products contain such as: solutions and plastic vessels for the removal of non-incorporated nucleotides, microparticles for connecting the PCR products as well as possible staining solutions.
  • the invention also relates to a device with which sample liquid is removed from the PCR vessels and all the steps necessary for preparing for flow cytometry, such as PCR purification, linking the PCR products to particles, and possibly coloring and washing the particles, are carried out automatically become.
  • the device can also be designed such that it automatically feeds the prepared sample into a flow cytometer for measurement.
  • These can be pipetting devices, e.g. Aspirate liquid via a special inlet, carry out the necessary steps to prepare for the measurement and then dispense the prepared sample via a separate outlet.
  • the device can be designed to be used with a PCR device, e.g. a cycler can be combined. It would also be conceivable that a PCR device is integrated in the device.
  • FIG. 1 shows schematically the production of PCR
  • FIG. 2 also shows schematically an apparatus which can be used according to the invention for connecting the cycler and flow cytometer
  • FIG. 3 serves to illustrate the example 3 given below.
  • FIG. 1 shows the method according to the invention starting from a target sequence 10 to be analyzed (shown schematically as a double strand) which is to be amplified by means of PCR (shown by arrow 11).
  • Specific primers 12 and 13, each with markings 14 and 15, are used in the context of PCR 11.
  • the labels 14 and 15 contain specific binding sites 16 and 17 (e.g. biotin / streptavidin etc.)
  • the PCR 11 using the primers 12 and 13 leads to a PCR product 18, each with a bound primer 12 and 13.
  • the staining or particle binding of the PCR product 18 is carried out.
  • microparticles 21 and dye for example a phycoerythrin-streptavidin conjugate 22 22, which are each coupled to different binding molecules 23 and 24, are added.
  • the binding molecules 23 and 24 fit exactly to the binding sites 16 and 17 of the primers 12 and 13. This results in corresponding additions of PCR products to the microparticles and the dye.
  • a finished, appropriately colored and particle-bound product is shown schematically at 25. In fact, of course, not just one product (but a significantly larger number of products) is bound to a particle.
  • the product 25 can be analyzed in a simple manner familiar to the person skilled in the art in a flow cytometer.
  • the device 30 shown in FIG. 2 can be helpful here, which has a holder 31 for a suction cannula 32 that can be moved into different positions (indicated by the arrows). With the suction cannula 32, sample liquid 35 can be removed from PCR reaction vessels 33 which are located in a cycler 34. Automatic treatment of the PCR products (particle binding, staining, washing) etc. contained in the sample liquid 35 can then take place in the device 30 and after treatment the sample liquid can be transferred via a separate output line 36 into the measuring cell (not shown) of a flow cytometer 37.
  • the invention can also cover a device in which a PCR device, such as the cycler 34 shown, is integrated into the device 30.
  • Example 1 Determination of the detection limit of PCR products using flow cytometry
  • a 163 base pair long sequence of the p21 WAF1 gene was amplified.
  • a plasmid clone was used which contained the complete cDNA (clone ID: 309881).
  • a 25 ⁇ l PCR reaction in an Autogen II thermal cycler,
  • the PCR conditions were:
  • the anti-digoxigenin-covered magnetic particles (Röche, Mannheim), which were equilibrated twice in 500 ⁇ l 3 ⁇ binding buffer (15 mM Tris pH7.5; 1.5 mM EDTA, 150 mM NaCl) before the test, became 1 ⁇ l used. After addition of 1 ⁇ l (90 pg) of streptavidin-phycoerythrin staining solution (Sigma, St. Louis), the mixture was incubated for 10 min in a rotating manner at room temperature. 500 ⁇ l of washing buffer (PBS plus 0.02% Tween 20) were then added and the reaction vessel was transferred to a magnetic stand. After decanting the supernatant, the particles were resuspended in 1.5 ml of TE buffer and analyzed in a flow cytometer.
  • washing buffer PBS plus 0.02% Tween 20
  • the PAS 3 (Partec, Weg) was used for this, an argon laser generating the excitation light of 488 nm.
  • the orange emission was determined using a 590 EM filter.
  • the sensitivity of the device was determined using Phyco- erythrin-labeled control particles (FluoroSphere; DAKO, Copenhagen) discontinued.
  • the data were presented as a fluorescence histogram and analyzed using the FlowMax software (Partec). For this purpose, a maximum range was set in FL-II and the signals contained therein were used for the calculation of the mean value.
  • amplifications of the p21 / WAF1 gene were carried out. To this end, lng (2.4 x 10 ⁇ molecules), 100 pg (2.4 x 10 7 molecules), 10 pg (2.4 x 10 6 molecules) and 1 pg (2.4 x 10 5 molecules) were used as the starting quantity. of the p21 / WAFl cDNA plasmid. Between 10 and 25 cycles of the PCR reactions described above, PCR products were removed after each cycle and analyzed as described.
  • the PCR product was detectable after only 12 cycles; after 22 cycles the stationary phase was reached. With an initial amount of 1 pg plasmid, the amplificate can be detected after 20 cycles.
  • FIG. 3 shows a clear decrease in p21 / WAF1 mRNA after 3 h of UV treatment, whereas the PCNA expression was upregulated as early as 1 h after irradiation.

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Abstract

Zur Bestimmung von PCR-Produkten, wobei von mindestens einer Zielsequenz amplifizierte PCR-Produkte in einem Durchflusszytometer gemessen werden und in die PCR-Produkte zwei unterschiedliche Markierungen eingebaut werden, von denen die eine ein Partikel oder eine Bindungsstelle für Partikel ist und die andere Markierung ein in einem Durchflusszytometer detektierbarer Farbstoff oder eine Bindungsstelle für einen solchen Farbstoff ist, werden die zwei unterschiedlichen Markierungen während der PCR durch Verwendung unterschiedlich markierter Primer und/oder unterschielich markierter Nukleotide in die PCR-Produkte eingebaut.

Description

Verfahren zur Bestimmung von PCR-Produkten, sowie ein PCR-Detektions-Kit und eine Vorrichtung für ein solches Verfahren
Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren nach dem Oberbegriff des Anspruches 1. Außerdem bezieht sich die Erfindung auf einen im Verfahren einsetzbares PCR-Detektions-Kit sowie eine Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens erleichtert.
Der mengenmäßige Nachweis bestimmter DANN- oder RNA-Sequenzen (Zielsequenzen) in Probenmaterial, in aller Regel lebenden Zellen, kann als z.B. diagnostischer und/oder therapeutischer Parameter in den unterschiedlichsten Anwendungen herangezogen werden. Denkbar ist, daß über den Vergleich einer zu analysierenden Zellprobe mit bekannten Proben oder einem normierten Standard auf den Grad einer infektiösen oder onkologischen Erkrankung geschlossen wird. Ein weiteres Anwendungsgebiet sind humangenetische Untersuchungen, bei denen aus dem Vorhandensein bestimmter Zielsequenzen in unüblichen Mengen auf eventuell vorliegende Erbkrankheiten geschlossen wird. Schließlich finden gattungsgemäße Verfahren auch in der Forensik Anwendung, wenn es z.B. darum geht, das Erbmaterial verschiedener Menschen zu unterscheiden. Die vorstehende Aufzählung ist nicht abschließend. Sie dient lediglich dazu, die Zielrichtung gattungsgemäßer Verfahren zu verdeutlichen. Es lassen sich durchaus noch weitere Anwendungsbeispiele, z.B. Qualitätskontrollen von Lebensmitteln, denken.
Gattungsgemäße Verfahren können auch lediglich qualitativ zur Prüfung eingesetzt werden, ob eine bestimmte Zielsequenz in Zellen vorliegt oder nicht (Ja/Nein-Aussage). Hauptanwendung ist jedoch die quantitative Bestimmung.
Da eine direkte Bestimmung bestimmter Zielsequenzen in z.B. lebenden Zellen aufgrund der geringen Ausgangsmengen oftmals nicht möglich ist, muß die gesuchte Sequenz zunächst vermehrt (amplifiziert) werden, damit überhaupt eine Analyse möglich ist. Die Amplifizierung erfolgt in aller Regel mittels PCR bzw. RT-PCR, falls eine RNA-Sequenz (Genexpression, RNA- Virus) untersucht werden soll. Die amplifizierten Zielsequenzen sollen im folgenden als PCR-Produkte bezeichnet werden.
Mittels PCR lassen sich aus den Zielsequenzen in ausreichender Menge PCR- Produkte herstellen, um sie anschließend qantifizieren zu könnent. Eine "relative" Quantifizierung der PCR-Produkte kann z.B. über Vergleich mehrerer unterschiedlicher PCR-Ansätze erfolgen. Denkbar ist aber auch, daß man eine Standardsequenz mit bekannter Menge an Zielsequenz als Referenz zugrundelegt und die Meßergebnisse (Menge an PCR-Produkten) für absolute Berechnungen der Menge an Zielsequenz aus derselben Probe zugrundelegt. Geeignete gattungsgemäße Verfahren zur durchflußzytometrischen Detektion von PCR-Produkten sind z.B. von Yang et. al. (1995), Cytometry 21: 197-202 oder Vlieger et. al. (1992) Anal.Biochem. 205: 1-7 beschrieben worden. Bei der einen beschriebenen Methode (Yang et al.) wird an dem während der PCR gebildeten PCR-Produkt durch Einbau entsprechend markierter Nukleotide eine erste Markierung vorgenommen. Das fertige PCR-Produkt wird dann thermisch in Einzelstränge getrennt. An die Einzelstränge werden weitere DNA-Sonden hybridisiert, die eine zweite von der ersten abweichende Markierung aufweisen. In einem weiteren Schritt wird dann an die erste Markierung des PCR-Produktes ein Mikropartikel gekoppelt und an die zweite Markierung ein fluoreszenzmarkierter Antikörper. Die gefärbten PCR-Produkte können dann aufgrund ihrer Partikelbindung im Durchflußzytometer bestimmt werden.
Die andere bekannte Methode (Vlieger et al.) funktioniert relativ ähnlich. Einziger Unterschied besteht darin, daß hier nicht während der PCR markierte Nukleotide angeboten werden, sondern daß einer der beiden eingesetzten Amplifi- kationsprimer die erste Markierung trägt.
Die beschriebenen Verfahren erfordern folgende separate Schritte: 1. PCR- Reaktion zur Einführung der ersten Markierung, 2. Hybridisierung zur Einführung der zweiten Markierung, 3. Anbindung an die Partikel, 4. Färbung der PCR- Produkte mit fluoreszenz-markierten Antikörpern und 5. Messung der Partikel im Durchflußzytometer.
Die Verfahren sind damit relativ arbeits- und zeitaufwendig:
Aufgabe der Erfindung ist es, ausgehend von dem Stand der Technik ein Verfahren zu schaffen, das eine schnellere und sicherere Bestimmung von PCR- Produkten ermöglicht. Erfindungsgemäß wird die Aufgabe durch ein Verfahren gelöst, das die kennzeichnenden Merkmale des Anspruches 1 aufweist.
Erfindungsgemäß ist vorgesehen, daß beide Markierungen schon während der PCR durch Verwendung unterschiedlich markierter Primer und/oder Einbau unterschiedlich markierter Nukleotide in die PCR-Produkte erfolgt.
Vozugsweise werden Primer eingesetzt, die jeweils mit einer Markierung versehen sind. Denkbar ist aber auch, pro Zielsequenz einen Primer einzusetzen, der die erste Markierung trägt und ein Nukleotid, das die zweite Markierung trägt bzw. mit unterschiedlichen Nukleotiden zu arbeiten, die jeweils mit den Markierungen versehen sind.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren werden also in besonders einfacher Weise an jedem im Zuge der Amplifizierung aus der Zielsequenz gebildeten PCR- Produkt die beiden unterschiedlichen Markierungen vorgesehen.
Der zusätzliche im "Stand der Technik"-Verfahren erforderliche Hybridisierungs- schritt (bei dem nach Abschluß der PCR eine DNA-Sonde an die DNA hybridisiert wird, die die zweite Markierung trägt) entfällt.
Ein weiterer wesentlicher Vorteil bei der bevorzugten Verwendung von markierten Primern ist, daß über die Primer die Anzahl der Markierungen eindeutig festgelegt ist. Verwendet man markierte Nukleotide, die während der PCR in das gebildete Produkt eingebaut werden, dann kann es dazu kommen, daß z.B. mehrere Markierungen pro DNA-Strang auftreten, die einer exakten Quantifizierung entgegenstehen. Es gibt unterschiedliche Möglichkeiten, wie die beiden bevorzugt eingesetzten markierten Primer (sinngemäß gilt das Folgende auch für markierte Nukleotide) ausgestaltet sein können.
Eine Möglichkeit ist, daß die an den Primern vorgesehenen Markierungen lediglich spezifische Bindungsstellen sind, an die in aller Regel nach Abschluß der PCR jeweils die im Durchflußzytometer detektierbaren Partikel bzw. Farbstoffe mit entsprechenden komplementären Gegenstücken gebunden werden können. Solche Bindungsstellen könnten z.B. folgende Verbindungen sein: Digoxigenin, Biotin, Dinitrophenol, Cholesterol, Amine, Psoralen etc.. Die Kopplung an die Partikel und/ oder den Farbstoff erfolgt über Antikörper oder Adaptoren wie z.B. Streptavidin. Denkbar sind auch andere dem Fachmann geläufige spezifisch bindende Systeme. Wichtig ist lediglich, daß über die Markierungen eine spezifische "Fluorochromierung" bzw. Partikelbindung an jeweils einem der beiden Primer erfolgen kann.
Ein geeigneter Farbstoff zur Fluorochromierung der PCR-Produkte wäre z.B. Phycoerythrin, der im Rahmen der Erfindung z.B. in Form eines Konjugats mit Streptavidin eingesetzt werden kann. Dabei erfolgt, im Unterschied zu den "Stand der Technik" Verfahren, die Färbung gleichzeitig mit der Partikelanbindung. Als weitere Farbstoffe kommen u.a. in Betracht: Cy5, Cy3, Cy2, TAMRA, Rhoda- min, HEX, ROX, Texas Red, IRD40, IRD41 und AMCA.
Denkbar ist selbstverständlich auch, daß die Fluorochromierung bereits an dem für die PCR eingesetzten Primer vorgesehen ist. Man würde so bereits mit der Amplifizierung Produkte erhalten, die gefärbt sind und könnte auf den sonst gleichzeitig mit der Partikelbindung durchgeführten Färbeschritt verzichten. Theoretisch denkbar wäre auch, daß bereits Partikel-gekoppelte Primer eingesetzt werden. Auf diese Weise könnte man PCR-Produkte direkt an die Partikel gebunden herstellen. Der Anbindungsschritt an die Partikel würde entfallen.
Wie oben ausgeführt, soll das erfindungsgemäße Verfahren insbesondere zur Quantifizierung von PCR-Produkten eingesetzt werden.
Eine weitere vorteilhafte Ausgestaltung der Erfindung sieht vor, daß gleichzeitig (d.h. im selben Ansatz) eine zusätzliche von der zu analysierenden unterschiedliche Zielsequenz bestimmt wird, deren Ausgangskonzentration in einer weiteren bevorzugten Ausgestaltung bekannt ist (Einführung eines internen Standards). Es versteht sich, daß die aus dieser bekannten Zielsequenz amplifizierten PCR- Produkte wiederum erfindungsgemäß markiert werden, wobei jedoch sichergestellt sein muß, daß die Markierungen eine Differenzierung zu den markierten PCR-Produkten aus der zu analysierenden Zielsequenz ermöglichen.
Im einfachsten Fall kann dies dadurch geschehen, daß für die beiden unterschiedlichen Sequenzen Primer eingesetzt werden, die jeweils eine Partikelpopulation mit unterschiedlicher Größe binden. Auf diese Weise ist eine besonders einfache Differenzierung durch Partikelgrößenmessungen im Durchflußzytometer möglich. Denkbar wäre auch, Primer mit unterschiedlichen Farbstoffen zu verwenden und dann eine Differenzierung über die Farbsignale vorzunehmen. Bei Verwendung unterschiedlicher Farbstoffe können jedoch farbstoffbedingte Überlagerungen auftreten, die ggf. die Meßergebnisse verfälschen.
Die Erfindung bezieht sich nicht nur auf ein erfindungsgemäßes Verfahren sondern betrifft auch ein PCR-Detektions-Kit, das in dem Verfahren eingesetzt werden kann. Das Kit kann neben den erfindungsgemäß eingesetzten markierten Primern und/oder Nukleotiden alle für den durchflußzytometrischen Nachweis von PCR-Produkten notwendigen Komponenten enthalten wie z.B.: Lösungen und Kunststoffgefäße für die Enfernung nicht eingebauter Nukleotide, Mikropar- tikel zur Anbindung der PCR-Produkte sowie eventuell Färbelösungen.
Außerdem betrifft die Erfindung auch eine Vorrichtung, mit der aus den PCR- Gefäßen Probeflüssigkeit entnommen wird und alle eventuell notwendigen Schritte zur Vorbereitung für die Durchflußzytometrie wie PCR-Aufreinigung, Anbindung der PCR-Produkte an Partikel, ggf. Färbung und Waschen der Partikel automatisch durchgeführt werden. Die Vorrichtung kann weiterhin so ausgelegt sein, daß sie die vorbereitete Probe automatisch in ein Durchflußzytometer zur Messung einspeist. Es kann sich dabei um Pipettiervorrichtungen handeln, die z.B. über einen speziellen Eingang Flüssigkeit ansaugen, die erforderlichen Schritte zur Vorbereitung der Messung durchführen und dann über einen getrennten Ausgang die vorbereitete Probe wieder abgeben.
Die Vorrichtung kann so ausgelegt sein, daß sie mit einem PCR-Gerät, z.B. einem Cycler kombinierbar ist. Denkbar wäre weiterhin, daß in die Vorrichtung ein PCR-Gerät integriert ist.
Im folgenden soll die Erfindung anhand mehrerer Abbildungen und Beispiele näher erläutert werden.
Dabei zeigt:
Figur 1 schematisch die erfindungsgemäße Herstellung von PCR-
Produkten, die im Durchflußzytometer detektierbar sind,
Figur 2 zeigt ebenfalls schematisch eine erfindungsgemäß einsetzbare Vorrichtung zur Verbindung von Cycler und Durchfluß- zytometer,
Figur 3 dient zur Illustration des nachfolgend angegebenen Beispieles 3.
Fig. 1 zeigt das erfindungsgemäße Verfahren ausgehend von einer zu analysierenden Zielsequenz 10 (schematisch als Doppelstrang dargestellt) die mittels PCR (dargestellt durch Pfeil 11) amplifiziert werden soll. Im Rahmen der PCR 11 werden spezifische Primer 12 und 13 eingesetzt, die jeweils Markierungen 14 und 15 aufweisen. Im gezeigten Fall enthalten die Markierungen 14 und 15 spezifische Bindungsstellen 16 und 17 (z.B.. Biotin/Streptavidin etc.)
Die PCR 11 unter Verwendung der Primer 12 und 13 führt zu einem PCR- Produkt 18 mit jeweils einem gebundenen Primer 12 und 13.
In einem weiteren Schritt, schematisch mit 20 bezeichnet, wird die Färbung bzw. Partikelbindung des PCR-Produktes 18 vorgenommen. Dazu werden Mikroparti- kel 21 und Farbstoff (z.B. ein Phycoerythrin-Streptavidin Konjugat) 22, die jeweils an unterschiedliche Bindungsmoleküle 23 und 24 gekoppelt sind, zugegeben. Die Bindungsmoleküle 23 und 24 passen dabei exakt jeweils zu den Bindungstellen 16 und 17 der Primer 12 und 13. Es kommt daher zu entsprechenden Anlagerungen von PCR-Produkten an die Mikropartikel und den Farbstoff. Ein fertiges, entsprechend gefärbtes und partikelgebundenes Produkt ist schematisch mit 25 dargestellt. Tatsächlich wird natürlich nicht nur eine Produkt (sondern eine deutlich größere Anzahl von Produkten) an einen Partikel gebunden. Das Produkt 25 kann in einfacher dem Fachmann geläufiger Weise in einem Durchflußzytometer analysiert werden. Hierbei kann die in Fig. 2 gezeigte Vorrichtung 30 hilfreich sein, die eine in unterschiedliche Positionen verfahrbare (angedeutet durch die Pfeile) Halterung 31 für eine Ansaugkanüle 32 aufweist. Mit der Ansaugkanüle 32 kann aus PCR- Reaktionsgefäßen 33, die sich in einem Cycler 34 befinden, Probenflüssigkeit 35 entnommen werden. In der Vorrichtung 30 kann dann eine automatische Behandlung der in der Probenflüssigkeit 35 enthaltenen PCR-Produkte (Partikelbindung, Färbung, Waschen) etc erfolgen und nach Behandlung kann die Probenflüssigkeit über eine separate Ausgangsleitung 36 in die nicht dargestellte Meßzelle eines Durchflußzytometers 37 transferiert werden.
Durch die Erfindung kann auch in einer weiteren nicht gezeigten Ausführung eine Einrichtung abgedeckt sein, bei der ein PCR-Gerät, wie z.B. der gezeigte Cycler 34, in die Vorrichtung 30 integriert ist.
Wie angegeben soll die Erfindung auch noch durch einige Beispiele näher erläutert werden:
Beispiel 1: Bestimmung der Nachweisgrenze von PCR-Produkten mit Hilfe der Durchflußzytometrie
Um die Anwendbarkeit und die Sensitivität der vorliegenden Methode zu prüfen, wurde eine 163 Basenpaare lange Sequenz des p21 WAFl-Gens amplifiziert. Dazu wurde ein Plasmidklon verwendet, der die komplette cDNA enthielt (Clone ID: 309881). Für eine 25 μl PCR-Reakton (in einem Autogene II Thermocycler,
Grant Instruments; Cambridge, UK) wurden 1 ng Plasmid, 25 pmol des Oligonu- kleotids Biotin-5'- GTGGACCTGTCACTGTCTTGTAC-3' (Primer 1) und 25pmol Digoxigenin-5'- CTTCCTCTTGGAGAAGATCAG3-3' (Primer 2) eingesetzt. Es wurden 2 units Taq DNA-Polymerase (QIAGEN, Hilden), 100 μmol eines jeden Nukleotids und Pufferlösungen nach Angaben des Herstellers verwendet.
Die PCR-Bedingungen waren:
Primäre Denaturierung bei 94°C für 4 min., 35 Zyklen bei 60 C für 40 sec, 72 C für 1 min. und 92 C für 40 sec. Das amplifizierte PCR-Produkt wurde mit Hilfe des QIAquick PCR Purification Kits (QIAGEN, Hilden) von nichteingebauten Primern und Nukleotiden gereinigt und anschließend im Spektralphotometer bei A26O nm quantifiziert. Zur Anbindung an die magnetischen Partikel wurden 10 ng, lng, 100 pg, 80 pg, 60 pg, 40 pg, 20 pg und 10 pg des PCR-Produktes in einem Volumen von jeweils 1 μl eingesetzt.
Von den Anti-Digoxigenin-abgedeckten magnetischen Partikeln (Röche, Mannheim), die vor dem Test zweimal in 500 μl 3 x Bindungspuffer (15 mM Tris pH7,5; 1,5 mM EDTA, 150 mM NaCl) äquilibriert wurden, wurde 1 μl eingesetzt. Nach Zugabe von 1 μl (90 pg) Streptavidin-Phycoerythrin Färbelösung (Sigma, St. Louis) wurde für 10 min rotierend bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurden 500 μl Waschpuffer (PBS plus 0,02 % Tween 20) hinzugeben und das Reaktionsgefäß in einen Magnetständer transferiert. Nach dem Dekantieren des Überstandes wurden die Partikel 1,5 ml TE-Puffer resuspendiert und im Durchflußzytometer analysiert.
Hierzu wurde das PAS 3 (Partec, Münster) verwendet, wobei ein Argonlaser das Anregungslicht von 488 nm erzeugte. Die Orangeemission wurde mit Hilfe eines 590 EM Filters ermittelt.
Es wurden folgende Einstellungen verwendet: SSC 350 V, FSC 250 V und FL-II 685 V. Die Empfindlichkeit des Gerätes wurde unter Verwendung von Phyco- erythrin-markierten Kontrollpartikeln (FluoroSphere; DAKO, Kopenhagen) eingestellt. Die Daten wurden als Fluoreszenzhistogramm dargestellt und mit Hilfe der FlowMax-Software (Partec) analysiert. Dazu wurde in FL-II ein maximaler Bereich (Range) eingestellt und die darin vorhandenen Signale für die Berechnung des Mittelwertes herangezogen.
Es wurde gezeigt, daß bis zu 40 pg (0,6 fmol) PCR-Produkt nachweisbar sind und erst bei 20 pg die Fluroeszenzintensität nicht mehr von der Hintergrundfluoreszenz der Partikel unterscheidbar ist. Das bedeutet, daß mit dieser Methode kleinste Mengen PCR-Produkt detektierbar und quantifizierbar sind.
Beispiel 2: Messung der PCR-Kinetik mit Hilfe der Durchflußzytometrie
Zur Analyse von PCR-Kinetiken wurden Amplifikationen des p21/WAFl-Gens durchgeführt. Dazu wurden als Ausgangsmenge lng (2,4 x 10§ Moleküle), 100 pg (2,4 x 107 Moleküle), 10 pg (2,4 x 106 Moleküle) und 1 pg (2,4 x 105 Moleküle) des p21/WAFl-cDNA-Plasmids verwendet. Zwischen 10 und 25 Zyklen der oben beschriebenen PCR-Reaktionen wurde nach jedem Zyklus PCR- Produkte entnommen und wie beschrieben analysiert.
Es konnte gezeigt werden, daß bei einer Ausgangsmenge von 1 ng Plasmid das PCR-Produkt bereits nach 12 Zyklen detektierbar war, nach 22 Zyklen ist die stationäre Phase erreicht. Bei einer Ausgangsmenge von 1 pg Plasmid läßt sich das Amplifikat nach 20 Zyklen nachweisen.
Die "real-time"-Detektion von PCR mit dem ABI PRISM zeigt einen sehr ähnlichen Verlauf und eine vergleichbare Empfindlichkeit (Freemann et. al., 1999). Beispiel 3: Nachweis der differentiellen Genexpression mit Hilfe der RT- PCR in Kombination mit der Druchflußzytometrie
Um strahlungsinduzierte bzw. -.supprimierte Genexpression nachzuweisen, wurden humane Keratinozyten (HaCat-Zellie) mit UVB (0,16 minimale Erythemdo- sis; 280-370 nm) bestrahlt. Aus Zellen, die für 1, 3, 5 und 7 h nach Bestrahlung kultiviert wurden, sowie aus unbestrahlten Zellen wurde mit Hilfe des RNeasy Kits (QIAGEN, Hilden) Gesamt-RNA isoliert. Diese wurde photometrisch quantifiziert und hinsichtlich ihrer Qualität im Agarosegel kontrolliert. 2 μg der RNA wurden für die reserve Transkription, die mit der "Omniscript Reverse Transcriptase" (QIAGEN, Hilden) und einem Oligo dT]g durchgeführt wurde, eingesetzt. Von diesen reversen Transkriptions-Ansätzen wurde jeweils 1 μl für die PCR eingesetzt. Es wurden das ß-Actin-Gen (Primer: Biotin-51- CTTCTACAATGAGCTGCGTGTG-3' und Digoxigenin-5'-GCTCATTGCCAA- TGGTGATGA-3'), das p21/WAFl-Gen (Primer siehe oben) und das PCNA-Gen (Primer: Biotin-5'-CTGAGGTACCTGAACTTCTTTAC-3' und Digoxigenin-5'- AGATCCTTCTTCATCCTCGATC-3') analysiert und wie oben beschrieben, pro PCR zwei Proben analysiert. Für das ß-Actin worden Amplifikate bei 15 Zyklen, für PCNA bei 20 Zyklen und für p21 WAFl bei 25 Zyklen entnommen. Die Messung der jeweiligen PCR-Produktmenge erfolgte wie beschrieben am Durchflußzytometer und die Ergebnisse sind in Fig. 3 dargestellt.
Fig. 3 zeigt eine deutliche Abnahme an p21/WAFl-mRNA nach 3h UV- Behandlung, wohingegen die PCNA-Expression bereits 1 h nach Bestrahlung hoch reguliert wurde.
Es konnte gezeigt werden, daß mit der vorgestellten Methode bereits geringe Veränderungen einer Gen-Expression detektiert werden (Abb. 4).

Claims

PATENTANSPRÜCHE
1. Verfahren zur Bestimmung von PCR-Produkten, bei dem von mindestens einer Zielsequenz amplifizierte PCR-Produkte in einem Durchflußzytometer gemessen werden, wobei in die PCR-Produkte zwei unterschiedliche Markierungen eingebaut werden, von denen die eine ein Partikel oder eine Bindungsstelle für Partikel ist und die andere Markierung ein in einem Durchflußzytometer deteküerbarer Farbstoff oder eine Bindungsstelle für einen solchen Farbstoff ist, dadurch gekennzeichnet, daß die zwei unterschiedlichen Markierungen während der PCR durch Verwendung unterschiedlich markierter Primer und/oder unterschiedlich markierter Nukleotide in die PCR-Produkte eingebaut werden.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die beiden unterschiedlichen Markierungen durch Verwendung unterschiedlich markierter Primer in das PCR-Produkt eingebaut werden.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Markierung des einen Primers eine Fluorochromierung oder eine Bindungsstelle für ein fluorochromassoziiertes Molekül ist.
4. Verfahren nach einem der Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die fluorochromassoziierten Moleküle zur Bindung an die PCR-Produkte Antikörper, Streptavidin oder andere spezifisch bindende Moleküle sind.
5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß mehrere unterschiedliche Ausgangssequenzen gleichzeitig bestimmt werden, wobei die pro Sequenz eingesetzten Markierungen so gewählt sind, daß eine getrennte Analyse der jeweils aus den Sequenzen amplifizierten PCR-Produkte des gleichen Ansatzes im Durchflußzytometer möglich ist.
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Menge einer der zu analysierenden Ausgangssubstanzen bekannt ist.
7. Verfahren nach Anspruch 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, daß die jeweils für unterschiedliche Ausgangssequenzen eingesetzten Markierungen Bindungsstellen für unterschiedliche Partikelpopulationen bereitstellen.
8. PCR-Detektionskit für das Verfahren gemäß der Ansprüche 1 - 7, dadurch gekennzeichnet, daß es die entsprechend Anspruch 1 markierten Primer und/oder Nukleotide enthält.
9. Vorrichtung zur Verwendung in dem Verfahren gemäß der Ansprüche 1 - 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Vorrichtung eine Einrichtung zur Entnahme von Probeflüssigkeit aus in einem PCR-Gerät befindlichen Reaktionsgefäßen und Einrichtungen aufweist, mit denen die entnommene Probenflüssigkeit derart behandelt werden kann, daß die in ihr enthaltenen PCR-Produkte im Durchflußzytometer detektiert werden können.
9. Vorrichtung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß das PCR- Gerät in die Vorrichtung integriert ist.
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