EP1521845A1 - Verfahren zum nachweis einer gesteigerten tumorsuszeptibilität - Google Patents

Verfahren zum nachweis einer gesteigerten tumorsuszeptibilität

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EP1521845A1
EP1521845A1 EP03738038A EP03738038A EP1521845A1 EP 1521845 A1 EP1521845 A1 EP 1521845A1 EP 03738038 A EP03738038 A EP 03738038A EP 03738038 A EP03738038 A EP 03738038A EP 1521845 A1 EP1521845 A1 EP 1521845A1
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EP
European Patent Office
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polymorphism
mdm2
detection
mdm2 gene
gene
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP03738038A
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English (en)
French (fr)
Inventor
Axel Meye
Helge Taubert
Timo Hillebrand
Peter Bendzko
Katharina KRÜGER
Matthias Kappler
Manfred Wirth
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Invitek Gesellschaft fuer Biotechnik und Biodesign mbH
Original Assignee
Invitek Gesellschaft fuer Biotechnik und Biodesign mbH
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Filing date
Publication date
Application filed by Invitek Gesellschaft fuer Biotechnik und Biodesign mbH filed Critical Invitek Gesellschaft fuer Biotechnik und Biodesign mbH
Publication of EP1521845A1 publication Critical patent/EP1521845A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/08—Drugs for disorders of the urinary system of the prostate
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    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Definitions

  • the invention relates to a method for the detection of an increased tumor susceptibility by a specific detection of a polymorphism at position 354 A ⁇ G in exon 12 of the human murine-double-minute-gene-2 (MDM2 gene).
  • This polymorphism represents a hereditary marker for an increased cancer risk in humans.
  • the invention furthermore relates to the use of this tumor susceptibility marker for the development of in vitro and in vivo test systems which specifically use this marker for diagnostic, prognostic and possibly also therapeutic methods integrated.
  • the mdm2 gene was first identified in the spontaneously transformed mouse cell line 3T3DM on "double minute" chromosomes. It is known that the gene product MDM2 can transform mouse fibroblasts and lead to uncontrolled and tumor-causing growth.
  • the human mdm2 gene is located on the chromosome section 12ql3-14 and became more important when it was shown that it is an important opponent for the p53-
  • mdm-2 Represents tumor suppressor gene.
  • the mutual regulation takes place via a "feed-back loop", ie the p53 protein activates the transcription of the mdm2 gene and the MDM2 protein formed can in turn bring about the breakdown of the P53 protein.
  • the MDM2 protein has ubiquitin ligase activity for P53, making the latter for the proteosomal Degradation is marked. This results in a very fine regulation of the expression of the P53 protein, which is essential especially in embryogenesis.
  • mdm-2 "knock-out" mice are lethal, but survive if they also do not carry a functionally active p53 gene.
  • MDM2 in addition to the interaction with the p53 tumor suppressor MDM2 also influences another tumor suppressor metabolic pathway, ie that of Rb-E2F-pl6INK4A / pl9ARF.
  • MDM2 can bind to the RB protein and prevent the Rb-mediated Gl cell cycle arrest or interact directly with the transcription factors E2F1 / DP and cause the cells to transition into the S phase.
  • the negative regulation of both tumor suppressor pathways which are affected in approx. 80% of all tumors, as well as numerous findings that prove that the MDM2 protein has a tumor effect, favor the mdm2 gene as a target for gene therapy.
  • MDM2 can interact with numerous proteins, such as P53, CBP / p300, pRB, p73, E2F1, DPI, the L5 ribosoalene ribonucleoprotein particle, pl4ARF and RNA.
  • proteins such as P53, CBP / p300, pRB, p73, E2F1, DPI, the L5 ribosoalene ribonucleoprotein particle, pl4ARF and RNA.
  • sarcomas i.e. malignant tumors of mesenchymal origin.
  • Sarcomas show the highest with 20-30%
  • MDM2 Amplification rate for the mdm2 gene among malignancies Tumors on.
  • Overexpression of MDM2 in transgenic mice results in sarcoma development (regardless of p53 status) in 38% of cases.
  • MDM2 overexpression in sarcoma patients correlated significantly with poorer survival of the affected patients, which could be shown in a multivariate coxregression analysis (Würl et al. 1997).
  • MDM2 (Schiott et al. 1997), a polymorphism in the 5 'untranslated area (Heighway et al. 1994) and another polymorphism in exon 10 in the zinc finger area
  • the object of the invention was to determine tumor-associated mutations or polymorphisms of the human mdm2 gene and to determine their correlations with disease predispositions. Based on these correlations, a method for the molecular genetic diagnosis of these disease predispositions is to be developed. The aim is to establish a model that will result in prophylactic or alliative therapy that can be both surgical and mediocatetic.
  • the invention is based on the finding that the polymorphism A ⁇ G (GAA ⁇ GAG) occurring in codon 354 of exon 12 of the MDM2 gene (nucleotide 1373 of the sequence NM_002392) is not restricted to soft tissue sarcomas, but correlates with the predisposition of various types of malignant tumors and is surprisingly hereditary in nature, ie already conserved in the germline.
  • the invention therefore relates to a method for detecting tumor susceptibility, which is characterized in that a nucleic acid of a subject isolated and the sequence of the human mdm2 gene is genotyped based on the base exchange A ⁇ G (GAA ⁇ GAG) at position 354 of exon 12, a highly specific and very sensitive determination of the allelic status of this polymorphic locus (distinction between homo- and heterozygosity) preferably carried out in the high-throughput process.
  • Genotyping is performed by sequencing or by other methods that are suitable for the detection of point mutations. This includes PCR-based
  • Genotyping methods e.g. allele specific PCR, other genotyping methods using
  • Oligonucleotides [Examples are "dot blotting” or oligonucleotide ligation assays "(OLA)], method under
  • the method according to the invention is suitable for determining a wide spectrum of the most varied pre-dispositions.
  • the method for the detection of the homozygous or heterozygous polymorphism A ⁇ G at position 354 (exon 12) serves as a sufficient criterion for the genetic predisposition for a potential tumor susceptibility, in particular as a sufficient criterion for the genetic predisposition for a potential tumor risk of the affected subject and for his offspring.
  • the method is based on the detection of the homozygous or heterozygous polymorphism as a sufficient criterion of a potential tumor susceptibility for solid epithelial tumors, such as e.g. Prostate cancer (PCa), breast cancer, cervical cancer and / or ovarian cancer.
  • PCa Prostate cancer
  • the method is particularly preferably suitable for the detection of tumor susceptibility of PCa.
  • the molecular biology specialist is given a universal hereditary tumor marker.
  • finding this polymorphism may be the diagnostic basis for preventive measures.
  • Detection is based on isolated nucleic acids, whereby both DNA and RNA can be used. Isolated RNA is rewritten into mRNA and cDNA using methods known to those skilled in the art. The DNA is then sequenced. Based on this finding, new classes of therapeutic agents can be developed according to the invention using this variable (mutated) nucleotide DNA sequence, which are directed to genes which influence the pathways of the mdm2 gene and the mdm2 gene (or related genes ) attack and act via regulation of transcription and translation and to influence their efficiency, preferably by regulating expression.
  • variable (mutated) nucleotide DNA sequence which are directed to genes which influence the pathways of the mdm2 gene and the mdm2 gene (or related genes ) attack and act via regulation of transcription and translation and to influence their efficiency, preferably by regulating expression.
  • genes influencing the pathways of the mdm2 gene are partly known . These include, for example:
  • the invention furthermore relates to in vitro and in vivo test systems. These test systems express the sequence of the human mdm2 gene mutated at position 354A ⁇ G exon 12, and can be used to investigate diseases involving the mdm2 gene and to develop and test individually specific therapeutic agents in general.
  • test systems are known to the person skilled in the art and can be cell lines, xenograft and other animal models, etc.
  • PCa prostate cancer
  • the method can also be integrated in a highly integrative manner into a fully automated DNA extraction from nucleated blood cells and can also be fully automated, either separately or in combination with the molecular sample preparation.
  • the preferred detection method is based on a DNA ELISA and subsequent indirect enzymatic detection of the hybridization result in the 96-well format.
  • this preferred embodiment of a DNA ELISA is not intended to provide further method options for molecular screening of the mdm2 locus to be examined limit.
  • DNA-ELISA double-stranded DNA fragments which flank the mdm2 gene locus to be examined were generated from the previously isolated genomic DNA from the patient blood samples to be examined by means of PCR technology.
  • the pair of primers used for the PCR contained a primer which was biotinylated at its 5 'position.
  • the generated PCR fragment is thus also biotinylated after amplification.
  • the PCR fragment is subsequently transferred to the surface of a streptavidin-coated 96-well microtest plate and covalently bound to the plate surface via the biotinylation.
  • the double-stranded DNA fragment bound to the plate surface is denatured after addition of an NaOH solution and the unbound DNA single strand is removed by means of a short washing step.
  • the covalently bound single strand of DNA subsequently serves as the target sequence for a base-complementary hybridization reaction for genotyping the mdm2 status.
  • Hybridization is then carried out in each case with two FITC-labeled oligonucleotide probes / sample amplificate which are base complementary to the two potentially possible mdm2 allele variants at the mdm2 locus to be examined.
  • the hybridization reaction is indirectly detected enzymatically by means of an enzyme-conjugated anti-FITC antibody reaction with subsequent substrate conversion.
  • Evidence of the existing allele status is provided by evaluating the color changes or their intensities in the respective wells that occurred after the reaction.
  • the color samples can be used to make a clear decision about the presence of homozygous or heterozygous traits become.
  • the method allows 48 patient DNAs to be examined simultaneously with a 96-well plate. The reproducibility and the robustness of the method were proven within the scope of the large sample sizes examined, including blind series. Using additional DNA sequencing, the results generated in the DNA ELISA were clearly verified for a number of the samples.
  • test result was reevaluated for all conspicuous samples and a representative number of inconspicuous samples and 100% independently confirmed by another recognized detection system (direct PCR-DNA sequencing, ALF Express, PharmaciaBiotech).
  • the DNA samples used for this purpose come exclusively from blood donors with correspondingly hard inclusion criteria for the corresponding blood donation (no evidence of a tumor disease at the donation date or before, no known family diseases, no increased natural exposure to radiation and other mutagenic / carcinogenic substances in the professional or private area).
  • PCa Prostate cancer
  • Hematogenous micrometastases primarily affect the skeletal system and especially the pelvis and spine, but also individual organs such as the liver and lungs.
  • surgical and drug therapies aim to suppress the formation or the effect of the hormone testosterone, which significantly promotes the proliferation of the prostate and PCa cells.
  • the correct determination the tumor stage ie whether it is still a locally limited or already metastatic PCa, is therefore very important for the subsequent form of therapy.
  • the current examination methods used in the primary diagnosis of PCa are digital rectal examination, the determination of the tumor marker PSA (prostate-specific antigen) in the serum and when a sample is taken . Biopsy material, its histopathological assessment and, in individual cases, the diagnostic pelvic lymphadenectomy and, if necessary.
  • a beginning metastasis (disseminated PCaella in the blood, low involvement of regional lymph nodes) cannot be diagnosed in the blood up to the present time or, in the case of the lymph nodes, only postoperatively by histopathological
  • CT computed tomography
  • tumor volume and degree are in addition to the histological differentiation
  • the determination of the tumor marker PSA is a very selective and sensitive standard method for the early detection of PCa.
  • the prostate-specific antigen is not a cancer-specific, but a tissue-specific marker of the prostate. - Increased PSA Serum values indicate the presence of PCa.
  • PSA values are particularly difficult in the range between 2-10 ng / ml, since BPH occurs more frequently with increasing age and the PSA value increases with increasing age due to the natural prostate growth.
  • the expression of PSA is regulated by the hormones testosterone and dihydrotestosterone (DHT). With hormonal treatment of patients
  • PCa Due to the health-related importance of PCa (especially in the western industrialized countries), the lack of tumor-specific markers and the known tumor biological and cellular heterogeneity of the tumor, there is an intensive search in the field of clinical research on PCa. is focused on the identification of further genetic and epigenetic cofactors for the sporadic and hereditary PCa. In the USA in particular, there are well-characterized families with an increased incidence of PCA, which allow extensive human genetic studies on (familial) PCa.
  • the present invention discloses a universal hereditary tumor marker with the polymorphism A ⁇ G (GAA ⁇ GAG) at position 354 of exon 12 of the mdm2 gene, in particular for PCa.
  • the polymorphism has been shown to show a strong association with PCa. With the detection of this polymorphism, an increase in the information regarding a genetic predisposition for Pca and possible associated clinical pictures can be achieved.

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis einer gesteigerten Tumorsuszeptibilität durch eine spezifische Detektion eines Polymorphismus an der Position 354 A → G im Exon 12 des humanen murine-double-minute-gene-2 (MDM2-Gen). Dieser Polymorphismus stellt einen hereditären Marker für ein erhöhtes Krebsrisiko beim Menschen dar. Gegenstand der Erfindung ist weiterhin die Verwendung dieses Tumorsuszeptibilitätsmarkers zur Entwicklung von in vitro- und in-vivo Testsystemen, die in spezifischer Weise diesen Marker für diagnostische, prognostische und möglicherweise auch therapeutische Verfahren einbinden.

Description

Verfahren zum Nachweis einer gesteigerten Tumorsuszeptibili at
Besehreibunc-r
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis einer gesteigerten Tumorsuszeptibilität durch eine spezifische Detektion eines Polymorphismus an der Position 354 A → G im Exon 12 des humanen murine-double-minute-gene- 2 (MDM2- Gen) . Dieser Polymorphismus stellt einen hereditären Marker für ein erhöhtes Krebsrisiko beim Menschen dar. Gegenstand der Erfindung ist weiterhin die Verwendung dieses Tumorsuszeptibilitätsmarkers zur Entwicklung von in vitro- und in-vivo Testsystemen, die in spezifischer Weise diesen Marker für diagnostische, prognostische und möglicherweise auch therapeutische Verfahren einbinden.
Das mdm2-Gen wurde erstmals in der spontan transformierten Mauszellinie 3T3DM auf "double minute" Chromosomen identifiziert. Es ist bekannt, dass das Genprodukt MDM2 Mausfibroblasten transformieren und zu einem unkontrollierten und tumorauslösenden Wachstum führen kann. Das humane mdm2-Gen ist auf dem Chromosomenabschnitt 12ql3- 14 lokalisiert und gewann an Bedeutung als sich zeigte, dass es einen wichtigen Gegenspieler für das p53-
Tumorsuppressorgen darstellt. Die gegenseitige Regulation erfolgt über, einen "feed-back loop", d.h. das p53 -Protein aktiviert die Transkription des mdm2-Gens und das gebildete MDM2-Protein kann wiederum den Abbau des P53 -Proteins bewirken. Das MDM2 -Protein besitzt eine Ubiquitin-Ligase- Aktivität für P53, wodurch letzteres für den proteosomalen Abbau markiert wird. Hierdurch wird eine sehr feine Regulation der Expression des P53-Proteins bewirkt, welche vor allem in der Embryogenese essentiell ist. So sind mdm-2 "knock-out" -Mäuse letal, aber überleben, wenn sie zusätzlich auch kein funktioneil aktives p53-Gen tragen. Es ist weiterhin bekannt, dass neben der Wechselwirkung mit dem p53-Tumorsuppressor MDM2 auch einen weiteren Tumorsuppressor-Stoffwechselweg beeinflusst, d.h. den von Rb-E2F-pl6INK4A/pl9ARF. So kann MDM2 an das RB-Protein binden und den Rb-ver ittelten Gl-Zellzyklusarrest verhindern bzw. direkt mit den Transkriptionsfaktoren E2F1/DP wechselwirken und einen Übergang der Zellen in die S-Phase bewirken. Die negative Regulation von beiden Tumorsuppressorwegen, die in ca. 80 % aller Tumoren betroffen sind, sowie zahlreiche Befunde, die belegen, dass das MDM2-Protein tumorgen wirkt, favorisieren das mdm2-Gen als ein Ziel für eine Gentherapie.
Zusammenfassend ist festzustellen, dass spezifische Bereiche von MDM2 mit zahlreichen Proteinen, wie P53, CBP/p300, pRB, p73, E2F1, DPI, dem L5 riboso alen Ribonukleoprotein-Partikel, pl4ARF und RNA wechselwirken können. Die spezifischen Funktionen von MDM2 in der Tumorgenese, dem Zellzyklus und der Apoptose werden in exzellenten Übersichtsarbeiten diskutiert (Freedman et al . , 1999, Momand et al . , 2000, Juven-Gershon and Oren, 1999).
Die Rolle des mdm2 wurde insbesondere an Sarkomen untersucht, d.h. an bösartigen Tumoren mesenchymalen Ursprungs. Sarkome weisen mit 20-30% die höchste
Amplifikationsrate für das mdm2-Gen unter den malignen Tumoren auf . Eine Überexpression von MDM2 in transgenen Mäusen resultiert in 38% der Fälle in einer Sarkomentwicklung (unabhängig vom p53-Status) . Eine MDM2- Überexpression in Sarkom-Patienten korreliert signifikant mit einem schlechteren Überleben der betroffenen Patienten, was in einer multivariaten Coxregressions-Analyse gezeigt werden konnte (Würl et al . 1997) .
Insgesamt weiß man noch relativ wenig darüber, welche normalen bzw. tumorspezifischen Stoffwechselwege durch die mdm2-mRNA bzw. das MDM2-Protein beeinflusst werden. Ein Weg, um die Funktion von Genen zu untersuchen, besteht in der Analyse der Auswirkung von Genalterationen. Das mdm2- Gen wurde bisher jedoch nur sehr wenig auf Genalterationen, d.h. Mutationen oder Polymorphismen untersucht. Es gibt nach intensiver Litearturrecherche insgesamt nur vier Publikationen zu diesem Themenkomplex. Dies sind ein Negativbefund (keine Genalterationsfunde) in humanen Primärtumoren (Silva et al . 2000), selten auftretende Punkt- und Insertionsmutationen im Zinkfingerbereich des
MDM2 (Schiott et al . 1997), ein Polymorphismus im 5' untranslatierten Bereich (Heighway et al . 1994) und ein weiterer Polymorphismus im Exon 10 im Zinkfingerbereich
(Taubert et al . 2000). Dieser Polymorphismus wurde ausschließlich für Weichteilsarkome (im Vergleich zur polymorphen Alleliehäufigkeit bei gesunden Kontrollprobanden) ermittelt . Der Polymorphismus war mit einem Trend zu einem kürzeren Überleben (38 Monate gegenüber 57 Monate bei Patienten ohne Polymorphismus) verbunden . Der Erfindung lag die Aufgabe zugrunde, tumor-assoziierte Mutationen bzw. Polymorphismen des menschlichen mdm2-Gens zu ermitteln und ihre Korrelationenen mit Krankheitsprädispositionen festzustellen. Ausgehend von diesen Korrelationen soll ein Verfahren zur molekulargenetischen Diagnostik dieser Krankheitsprädispositionen entwickelt werden. Ziel ist die Etablierung eines Modells, in dessen Folge eine prophylaktische oder alliative Therapie durchführbar wird, die sowohl chirurgischen als auch medimenkatösen Charakter tragen kann.
Der Erfindung liegt die Erkenntnis zugrunde, dass der in Codon 354 des Exons 12 des MDM2 Gens (Nucleotid 1373 der Sequenz NM_002392) auftretende Polymorphismus A → G (GAA → GAG) nicht auf Weichteilsarkome beschränkt ist, sondern mit der Prädisposition von verschiedenen malignen Tumorarten korreliert und überraschend hereditärer Natur ist, d.h. bereits in der Keimbahn konserviert vorliegt.
Es wurde gefunden, dass dieser Polymorphismus bevorzugt in bestimmten soliden Tumoren epithelialen Ursprungs
(Prostatakarzinom-Entität) korreliert, aber nicht auf diese beschränkt ist, sondern auch für die Suszeptibilität weiterer solider und hämatologischer Tumore eine wesentliche Bedeutung besitzt.
Die Erfindung wird gemäß den Ansprüchen realisiert.
Gegenstand der Erfindung ist deshalb ein Verfahren zum Nachweis einer Tumorsuszeptibilität, das dadurch gekennzeichnet ist, dass eine Nukleinsäure eines Probanden isoliert und die Sequenz des menschlichen mdm2-Gens anhand des Basenaustausches A → G (GAA → GAG) an der Position 354 des Exons 12 genotypisiert wird, wobei eine hochspezifische und sehr sensitive Bestimmung des Alleliestatus dieses polymorphen Genortes (Unterscheidung von Homo- und Heterozygotie) bevorzugt im Hochdurchsatz- verfahren erfolgt .
Die Genotypisierung erfolgt durch Sequenzierung oder durch andere Methoden, die für die Detektion von Punktmutationen geeignet sind. Dazu gehören PCR-gestützte
Genotypisierungsverfahren, wie z.B. allelspezifische PCR, andere Genotypisierungsverfahren unter Verwendung von
Oligonukleotiden [Beispiele sind „dot blotting" oder Oligonucleotide Ligation Assays" (OLA) ] , Verfahren unter
Verwendung von Restriktionsenzymen und „Single Nucleotide
Polymorphism" (SNP) Analyse mittels „Matrix-assisted Laser
Desorption/Ionization Mass Spectrometry" (MALDI) sowie prinzipiell jede zur Verfügung stehende Methode zur Variantendetektion einschließlich der Chiptechnologie in all ihren technologischen Ausführungen.
Ausgehend davon ist das erfindungsgemäße Verfahren zur Bestimmung eines breiten Spektrums verschiedenster Prä- dispositionen geeignet. In einer Ausführungsvariante der Erfindung dient das Verfahren für den Nachweis des homozygoten oder heterozygoten Polymorphismus A → G an Position 354 (Exon 12) als hinreichendes Kriterium für die genetische Prädisposition für eine potentielle Tumorsuszeptibilität, insbesondere als hinreichendes Kriterium für die genetische Prädisposition für ein potentielles Tumorrisiko des betroffenen Probanden und für seine Nachkommen.
In einer bevorzugten Variante ist das Verfahren anhand des Nachweises des homozygoten oder heterozygoten Polymorphismus als hinreichendes Kriterium einer potentiellen Tumorsuszeptibilität für solide epitheliale Tumoren, wie z.B. Prostatakarzinom (PCa) , Mammakarzinom, Zervixkarzinom und/oder Ovarialkarzinom anzuwenden. Besonders bevorzugt ist das Verfahren für den Nachweis einer Tumorsuszeptibilität von PCa geeignet.
Es wird dem molekularbiologisch-spezialisierten Diagnostiker ein universeller hereditärer Tumormarker in die Hand gegeben.
Entsprechend der Erfindung besteht in Abhängigkeit des homozygoten oder heterozygoten Nachweises bestimmter Haplotypen die Möglichkeit, eine di ferenzierte Aussage zur genetischen Prädisposition zu treffen. Dadurch wird eine molekulargenetisch fundierte genetische Beratung ermöglicht .
Weiterhin stellt das Auffinden dieses Polymorphismus ggf. die diagnostische Grundlage für präventive Maßnahmen dar.
Der Nachweis erfolgt anhand isolierter Nukleinsäuren, wobei sowohl DNA als auch RNA verwendet werden kann. Isolierte RNA wird mit dem Fachmann bekannten Methoden in mRNA und cDNA umgeschrieben. Anschließend wird die DNA sequenziert. Aufbauend auf dieser Erkenntnis können unter Verwendung dieser variablen (mutierten) Nukelotid-DNA-Sequenz erfindungsgemäß neue Klassen von Therapeutika entwickelt werden, die auf Gene gerichtet sind, die die Pathways des mdm2-Gens beeinflussen, und das mdm2-Gen (oder damit zusammenhängender Gene) angreifen und via Regulation der Transkription und Translation sowie zur Beeinflussung von deren Effizienz, vorzugsweise durch Regulation der Expression, wirken.
Die Pathways des mdm2-Gens beeinflussende Gene sind z.T. bekannt . Dazu gehören zum Beispiel :
- p53 - pl4
- Rb-pl6INK4A/pl9ARF-E2F - mdr-1.
Bevorzugt führt dies zur Entwicklung von Therapeutika, die auf das humane mdm2-Gen gerichtet sind und dieses an der Position 354 A → G Exon 12 im MDM2-Gen angreifen.
Desweiteren sind Gegenstand der Erfindung in vitro- und in vivo-TestSysteme . Diese Testsysteme exprimieren die an der Position 354 A → G Exon 12 mutierte Sequenz des menschlichen mdm2-Gens, und können zur Untersuchung von Erkrankungen mit Beteiligung des mdm2-Gens dienen, sowie zur Entwicklung und Testung individuell spezifischer Therapeutika im allgemeinen.
Solche Testsysteme sind dem Fachmann bekannt und können Zellinien, Xenotransplantat- und andere Tiermodelle usw. sein. Im folgenden wird die Erfindung am Beispiel des Nachweises einer Tumorsuszeptibilität von Prostatakarzinomen (PCa) näher erläutert, ohne dass sie darauf beschränkt werden soll .
Bei der Durchführung der Analysen ausgewählter und präoperativ gewonnener Blut-DNA-Proben von Patienten mit urologischen Tumor-Proben wurde bei Patienten mit diagnostiziertem primären PCa mit entsprechender Familienanamnese (keine Hinweise auf familiäre PCa-Fälle) und entsprechender Therapie (überwiegend lokal begrenzte PCa, die mittels radiaker Prostatektomie unter kurativem Behandlungsziel entfernt worden sind; seltener Fälle von mittels Chemotherapie behandelten hormonrefraktären PCa) ein gegenüber der Normalbevölkerung der Bundesrepublik Deutschland erhöhter Heterozygotiegrad für den mdm2-SNP A → G an der Position 354 (Exon 12) detektiert .
In sukzessiv erweiterten Analysen konnten bisher in 31 von 229 untersuchten DNA-Proben (13,5%) der Polymorphismus eindeutig nachgewiesen werden. Aus diesem Untersuchungsgut kann eindeutig geschlussfolgert werden, dass die mdm2- Polyorphismusrate gegenüber der Normalbevölkerung mehr als verdoppelt ist (unter der Annahme, dass sich unter den Kontrollprobanden, die zur Bestimmung des Heterozygotiegrades in der gesunden und jungen Normalbevölkerung herangezogen worden waren, auch männliche Probanden mit einem nicht prädiktiv definierbaren PCa- Risiko befinden) . Dieses Ergebnis bedeutet, dass der heterozygote Genlocus ein potentieller Tumorsuszeptilitätsfaktor für Patienten mit sporadischem PCa darstellt.
Interessant war weiterhin die Beobachtung, dass in zwei DNA-Proben von Patienten mit fortgeschrittenen PCa homozygote Allelieresultate (beide Allele entsprachen dem Polymorphismus A -→ G an der Position 354 (Exon 12) auftraten.
Es konnten bestehende Probleme in der HTS-Anwendung für ein molekulares Screening zum Nachweis des individualspezifischen Allelstatus am zu untersuchenden mdm2-Genlocus gelöst werden. Die Bestimmung des zu untersuchenden mdm-2 Polymorphismus wurde mit hoher Sensitivität und bei exakter Typisierung von vorliegender Homo bzw. -Heterozygotie in Patienten-DNA parallel durchgeführt . Die gewählte Methodik ist einfach und schnell in der Durchführung und zeichnet sich durch einen hohen Grad an Reproduzierbarkeit und Robustheit aus.
Das Verfahren kann darüber hinaus hochintegrativ an eine vollautomatische DNA Extraktion aus kernhaltigen Blutzellen gekoppelt werden und ist potentiell ebenfalls separat oder in Kombination mit der molekularen Probenvorbereitung vollständig automatisierbar. Das bevorzugte Nachweisverfahren basiert auf einem DNA-ELISA und nachfolgender indirekt enzymatischen Detektion des Hybridisierungsergebnisses im 96-well Format. Diese bevorzugte Ausführungsvariante eines DNA-ELISAs soll weitere Verfahrensmöglichkeiten zum molekularen Screenings des zu untersuchenden mdm2-Locus allerdings nicht einschränken. In der bevorzugten Ausführungsvariante (DNA- ELISA) wurden aus der zuvor isolierten genomischen DNA aus den zu untersuchenden Patienten-Blutproben mittels PCR- Technologie doppelsträngige DNA-Fragmente generiert, welche den zu untersuchenden mdm2-Genlocus flankieren. Das für die, PCR Verwendung findende Primerpaar enthielt dabei einen Primer welcher an seiner 5' -Position biotinyliert war. Das generierte PCR-Fragment ist damit nach Amplifikation ebenfalls biotinyliert. Das PCR-Fragment wird nachfolgend an die Oberfläche einer Streptavidin beschichteten 96-Well Mikrotestplatte überführt und über die Biotinylierung an der Plattenoberfläche kovalent gebunden. Das an der Plattenoberfläche gebundene doppelsträngige DNA-Fragment wird nach Zugabe einer NaOH-Lösung denaturiert und der nichtgebundene DNA-Einzelstrang mittels eines kurzen Waschschrittes entfernt. Der kovalent gebundenen DNA- Einzelstrang dient nachfolgend als Zielsequenz für eine basenkomplementäre Hybridisierungsreaktion zur Genotypisierung- des mdm2 Status. Hybridisiert wird nachfolgend jeweils mit zwei FITC-markierten Oligonukleotid- sonden/Probenamplifikat, welche basenkomplementär zu den beiden potenziell möglichen mdm2-Allelvarianten am zu untersuchenden mdm2-Locus sind. Der Nachweis der Hybridisierungsreaktion erfolgt indirekt enzymatisch über eine enzymkonjugierte Anti-FITC-Antikörperreaktion mit anschließendem Substratumsatz. Der Nachweis des vorliegenden Allelstatus erfolgt über die Auswertung der nach Ablauf der Reaktion entstandenen Farbumschläge bzw. deren Intensitäten in den jeweiligen Wells. Anhand der Farbmuster kann eindeutig über das Vorliegen von homozygoten bzw. heterozygoten Merkmalsträgern entschieden werden. Das Verfahren gestattet es, mit einer 96-Well- Platte 48 Patienten-DNAs simultan zu untersuchen. Die Reproduzierbarkeit und die Robustheit des Verfahrens wurden im Rahmen der untersuchten großen Probenumfänge einschließlich durchgeführter Blindserien bewiesen. Mittels zusätzlicher DNA Sequenzierung wurden die im DNA-ELISA generierten Ergebnisse bei einer Reihe der Proben eindeutig verifiziert .
Das Testergebnis wurde für alle auffälligen Proben und einer repäsentativen Probenzahl unauffälliger Proben reevaluiert und 100%ig durch ein anderes anerkanntes NachweisSystem (direkte PCR-DNA-Sequenzierung, ALF Express, PharmaciaBiotech) unabhängig bestätigt .
-n
Darüber hinaus wurden in weiteren Blindexperimenten multiple DNA-Aliquots gleicher Probanden sowie Negativkontrollen in abhängigen und unabhängigen Versuchsserien bestimmt . Auch diese Untersuchungen ergaben vollständig übereinstimmende qualitative Ergebnisse, was die Sensititivität des gewählten Nachweisverf hrens belegt . Momentan laufen weiterführende Studien, mit denen endgültige statistische Auswertungen für mehr als 400 Patienten mit nachweisbarem sporadischen PCa erfolgen.
Laufende Untersuchungen zu anderen Karzinomtypen belegten die Assoziation des Auftretens dieses Genpolymorphismus mit einer gehäuften Tumorrate für weitere solide epitheliale Tumorentitäten. So wurde z.B. in 5 von bisher 32 untersuchten Blut-DNA-Proben (15,6%) von Patienten mit Mamma, Zervix- oder Ovarialkarzinomen, ein heterozygoter mdm2-Alleliestatus nachgewiesen.
Zum Nachweis der Spezifität der beschriebenen PCR-ELISA- Analyseresultate wurde eine Probanden-Subpopulation mit bekanntem Alleliestatus zum polymorphen mdm2-Genort reevaluiert. Zusätzlich wurde versucht, durch eine Vergrößerung der Kontrollgruppe die genaue Heterozygotie- frequenz in der Normalbevölkerung (alle in dieser Arbeit beschriebenen DNA-Proben stammen von gesunden Kontroll- probanden bzw. Tumorpatienten aus dem Einzugsgebiet Sachsen und Sachsen-Anhalts aus den Jahren 1996-2001 und wurden mit schriftlicher Einwilligung der Patienten gewonnen und nach der DNA-Präparation anonymisiert archiviert) definieren zu können. Die dafür eingesetzten DNA-Proben stammen ausschliesslich von Blutspendern mit entsprechend harten Einschlusskriterien für die entsprechenden Blutspenden (kein Nachweis einer Tumorerkrankung zum Spendetermin bzw. davor, keine bekannten familiären Erkrankungen, keine erhöhte natürliche Exposition gegenüber Bestrahlung und anderen mutagenen/kanzerogenen Stoffen im beruflichen bzw. privaten Bereich) .
Von 108 Blut-DNA-Proben normaler Probanden, die anteilig bereits von Taubert et al . (2000) mittels Sequenzierung und Restriktionsverdau unabhängig auf den mdm2-Polymorphismus untersucht worden waren, konnten alle damals detektierten heterozygoten DNA-Proben mittels PCR-ELISA eindeutig verifiziert werden. Weiterhin konnten die Polymorphismen- Befunde von 31 DNA-Proben von WTS-Geweben aus dieser Vorstudie mit einer 100%igen Spezifität bestätigt werden. Darüber hinaus wurden von einigen dieser WTS-Patienten (n=6) , deren Tumorgewebe-DNA den mdm2-Polymorphismus aufwies, korrespondierende DNA-Blutproben analysiert, die wiederum alle positiv in der Detektion waren. Somit kann davon ausgegangen werden, dass die an WTS-Patienten-Gewebe- DNA-Proben detektierten Polymorphismen mit hoher Wahrscheinlichkeit alle hereditärer Natur sind, d.h. der Polymorphismus ist in der Keimbahn konserviert.
Das Prostatakarzinom (PCa) ist die zweithäufigste Krebserkrankung des Mannes in Mitteleuropa und hat aufgrund seiner steigenden Inzidenz in den letzten Jahren immer mehr an Bedeutung gewonnen. In den USA stellt sie mittlerweile die am häufigsten diagnostizierte Tumorart dar und repräsentiert nach dem Lungenkarzinom die Tumorentität mit der höchsten Tumor-bedingten Sterberate. Die Krankheit wird in 80% der Fälle bei Männern über 65 Jahren diagnostiziert. Während das lokal begrenzte PCa durch die Entfernung der Prostata heilbar ist, kann bei lokal fortgeschrittenen und metastasierenden Tumoren nicht mehr von einer kurativen Behandlung ausgegangen werden. Die 3-Jahres-Überlebensraten liegen beim metastasierten Tumor nur bei 40%. Die Metastasierung erfolgt beim PCa über die Blut- oder Lymphbahnen. Die primären Ansiedlungsorte der lymphogenen Metastasierung sind die pelvinen Lymphknoten. Hämatogene Mikrometastasen betreffen vornehmlich das Skelettsystem und hier vor allem Becken und Wirbelsäule, aber auch einzelne Organe, wie die Leber und die Lunge. Beim metastasierten PCa zielen operative und medikamentöse Therapien auf die Unterdrückung der Bildung bzw. der Wirkung des Hormons Testosteron, welches maßgeblich die Proliferation der Prostata- und PCa-Zellen fördert. Die korrekte Bestimmung des Tumorstadiums, d.h. ob es sich noch um ein lokal begrenztes oder bereits metastasiertes PCa handelt, ist daher ganz entscheidend für die nachfolgende Therapieform. Die derzeitigen Untersuchungsmethoden, die bei der Primärdiagnostik des PCa angewendet werden, sind die digitale rektale Untersuchung, die Bestimmung des Tumormarkers PSA (prostataspezifisches Antigen) im Serum und bei einer Entnahme von . Biopsiematerial, deren histopathologische Begutachtung sowie im Einzelfall die diagnostisch pelvine Lymphadenektomie und ggf . MRT und CT sowie Knochenszintigrafie . Eine beginnende Metastasierung (disseminierte PCa- ellen im Blut, geringer Befall von regionären Lymphknoten) kann bis zum heutigen Zeitpunkt diagnostisch im Blut nicht bzw. im Falle der Lymphknoten ausschließlich postoperativ durch eine histopathologische
Untersuchung nachgewiesen werden. Die zum präoperativen
Nachweis zur Verfügung stehenden bildtechnischen Verfahren
(CT, MRT) haben eine geringe Sensitivität, die zwischen 22-
26% liegt und erlauben nur die Darstellung von ausgedehnten Metastasen. Da die Metastasierung in einer deutlichen
Abhängigkeit zum Tumorstadium, Tumorvolumen und Tumorgrad steht, sind dies neben der histologischen Differenzierung
(Gleason Score) die wichtigsten Faktoren, die derzeit für eine Prognose der Patienten herangezogen werden.
Die Bestimmung des Tumormarkers PSA (prostataspezifisches Antigen) ist neben der digitalen rektalen Untersuchung eine sehr selektive und sensitive Standardmethode zur Früherkennung eines PCa. Das prostataspezifische Antigen ist jedoch kein karzinomspezifischer, sondern ein gewebespezifischer Marker der Prostata. - Erhöhte PSA- Serumwerte deuten auf das Vorhandensein eines PCa hin. Die
Differenzierung zwischen BPH und Karzinom mit Hilfe des
PSA-Wertes fällt besonders im Bereich zwischen 2-10 ng/ml schwer, da die BPH mit steigendem Alter häufiger auftritt und der PSA-Wert aufgrund des natürlichen Prostatawachstums mit zunehmendem Alter ansteigt. Die Expression von PSA wird durch die Hormone Testosteron und Dihydrotestosteron (DHT) reguliert. Bei einer hormoneilen Behandlung von Patienten
(Hemmung der Wirkung von Testosteron, Dihydrotestosteron) , kommt es zu einem Abfall des PSA-Wertes im Serum.
Aufgrund der gesundheitspolitischen Bedeutung des PCa (insbesondere in den westlichen Industrieländern) , dem Fehlen tumorspezifischer Marker sowie der bekannten tumorbiologischen und zellulären Heterogenität des Tumors gibt es eine intensive Suche auf dem Gebiet der klinischen Forschung zum PCa, die u.a. auf die Identifizierung weiterer genetischer und epigenetischer Kofaktoren für das sporadische und hereditäre PCa fokussiert ist. Insbesondere in den USA gibt es gut charakterisierte Familien mit einer erhöhten PCA-Inzidenz, die weitreichende humangenetische Studien zum (familiären) PCa erlauben.
Die vorliegende Erfindung offenbart einen universellen hereditären Tumormarker mit dem Polymorphismus A → G (GAA → GAG) an der Position 354 des Exons 12 des mdm2-Gens insbesondere für PCa. Es wurde gezeigt, dass der Polymorphismus eine strenge Assoziation zum PCa zeigt. Mit der Detektion dieses Polymorphismus kann eine Erhöhung der Aussage hinsichtlich einer genetischen Prädisposition für Pca und möglicher assoziierter Krankheitsbilder erzielt werden.
Referenzen:
• Freedman DA, Wu L, Levine AJ (1999) Functions of the MDM2 oncoprotein. Cell Mol Life Sei 55: 96-107.
• Juven-Gershon T, Oren M (1999) Mdm2 : the ups and downs . Mol Med 5: 71-83. • Momand J, Wu" HH, Dasgupta G (2000) MDM2--master regulator of the p53 tumor suppressor protein. Gene 242: 15-29.
• Würl P, Meye A, Berger D, Bache M, Lautenschläger C, Schmidt H (1997) Prognostic relevance of C-terminal MDM2 detection is enhanced by positivity in soft tissue sarcomas . Diagn Mol Pathol 6: 249-54.

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zum Nachweis einer Tumorsuszeptibilität, dadurch gekennzeichnet, dass eine Nukleinsäure eines Probanden isoliert und die Sequenz des menschlichen mdm2-Gens anhand des Basenaustausches A → G (GAA → GAG) an der Position 354 des Exons 12 genotypisiert wird, wobei eine Bestimmung des Allelie-Status dieses polymorphen Genortes erfolgt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Nachweis des homozygoten oder heterozygoten Polymorphismus (Mutation) als hinreichendes Kriterium für die genetische Prädisposition . für eine potentielle Tumorsuszeptibilität verwendet wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2 , der Nachweis des homozygoten oder heterozygoten Polymorphismus (Mutation) als hinreichendes Kriterium für die genetische Prädisposition für ein potentielles Tumorrisiko für den Probanden und für seine Nachkommen verwendet wird.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3 , dadurch gekennzeichnet, dass der Nachweis der homozygoten oder heterozygoten Mutation als hinreichendes Kriterium einer potentiellen Tumorsuszeptibilität für Prostatakarzinom, Mammakarzinom, Zervixkarzinom und/oder Ovarialkarzinom verwendet wird.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Genotypisierung durch Sequenzierung der DNA oder durch andere Methoden, die zur Detektion von Punktmutationen geeignet sind, erfolgt.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Genotypisierung durch DNA-ELISA unter Verwendung multipler, hochspezifischer Amplifikationsprimer und markierter Hybridisationssonden erfolgt.
7. Therapeutika, die auf Gene gerichtet sind, die die Pathways bezüglich des mdm2-Gens beeinflussen und/oder den Polymorphismus A → G (GAA → GAG) an der Position 354 des Exons 12 des mdm2-Gen oder damit zusammenhängender Gene angreifen und via Regulation der Transkription und Translation sowie zur Beeinflussung von deren Effizienz, vorzugsweise durch Regulation der Expression, wirken.
8. Therapeutika, die auf das humane mdm2-Gen gerichtet sind und die die ausgetauschte Position A → G (GAA → GAG) an der Position 354 im Exon 12 des mdm2-Gens angrei en • und via Regulation der Transkription und Translation sowie zur Beeinflussung von deren Effizienz, vorzugsweise durch Regulation der Expression, wirken. In vitro- und in vivo-TestSysteme, die die Form des menschlichen mdm2-Gens exprimieren, welche die Mutation (den Polymorphismus) A → G (GAA → GAG) an der Position 354 des Exons 12 des mdm2-Gens aufweist, wobei die Testsysteme zur Untersuchung von Erkrankungen mit Beteiligung des mdm2-Gens dienen, sowie zur Entwicklung und Testung individuell spezifischer Therapeutika im allgemeinen.
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