CN1662661A - 肿瘤易感性增加的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种检测肿瘤易感性增加的方法，该方法是通过特异性检测人的鼠双微体－2(MDM2)基因外显子12的354 A→G位置的多态性来实现的。所述多态性是代表人类罹患肿瘤风险增加的遗传性标记物。本发明还涉及利用所述肿瘤易感性标记物来开发体外及体内检测系统，该系统以特定的方式将所述标记物整合入诊断、预防以及可能的治疗方法中。

Description

肿瘤易感性增加的检测方法

技术领域

本发明涉及一种检测肿瘤易感性增加的方法，该方法是通过特异性检测人的鼠双微体-2(MDM2)基因外显子12的354A→G位置的多态性来实现的。所述多态性是代表人类罹患肿瘤风险增加的遗传性标记物。本发明还涉及利用所述肿瘤易感性标记物来开发体外及体内检测系统，该系统以特定的方式将所述标记物整合入诊断、预防以及可能的治疗方法中。

背景技术

MDM2基因首先在自发性转化的3T3DM小鼠细胞系的双微染色体中被鉴定。已知该基因产物MDM2能够转化小鼠纤维原细胞，从而导致不受控制的、诱发肿瘤的生长。人类的MDM2基因位于12q13-14的染色体片段上，当发现其为肿瘤抑制基因p53的重要的拮抗剂时，其得到了重视。二基因之间的相互调控是通过一个反馈环发生的，即，p53基因活化MDM2基因的转录，而所形成的MDM2基因反过来使得p53蛋白降解。MDM2蛋白对p53显示出泛素连接酶的活性，后者为蛋白体降解的标记。结果达到了对p53蛋白表达的精细调节，而这种调节对胚胎形成是必须的。因此，MDM2基因敲除的小鼠是必死的，但是如果它们不携带有功能性活化的p53基因时，则能够存活。已知MDM2除了与p53肿瘤抑制剂相互作用外，还会影响其它的肿瘤抑制代谢途径，即，Rb-E2F-p16INK4A/p19ARF代谢途径。因此，MDM2可与Rb蛋白结合，阻止Rb介导的G1细胞周期停止，或者直接与转录因子E2F1/DP相互作用并诱导细胞转换进入S期。由于MDM2对两条肿瘤抑制途径都具有负调节作用，而这两条途径对80％的肿瘤都有影响，且许多研究证明，MDM2蛋白具有致肿瘤性(tumourigenic)，因此该基因已经成为基因治疗的一个靶点。

概括说来，MDM2的特异性区域能够与诸如p53，CBP/p300，pRb，p73，E2F1，DP1等多种蛋白、核糖体L5核蛋白颗粒、以及p14ARF和RNA等多种物质相互作用。MDM2对于肿瘤发生、细胞周期、以及凋亡等的特殊功能已经在一些综述中进行了讨论(Freedman et al.，1999，Momand et al.，2000，Juven-Gershon and Oren，1999)。

特别研究了MDM2在肉瘤(即，来源于间叶细胞的恶性肿瘤)中的作用。在恶性肿瘤中，肉瘤具有对MDM2最高的扩增比率-20～30％。MDM2在转基因小鼠中的过度表达导致了38％的肉瘤发生(与p53的数据无关)。通过multivariate Cox回归分析可以看出，肉瘤患者中MDM2的过度表达使得相关病人的生存率显著降低(Würl et al.，1997)。

总的来说，对于MDM2 mRNA或者MDM2蛋白所影响的正常或者肿瘤特异性代谢途径还所知甚少。对基因的功能进行研究的一个途径是分析遗传变异的结果。但是，迄今为止，对于MDM2基因的遗传变异，即，突变或者多态性等，只仅仅进行了很少的研究。对文献的广泛搜索发现，这一主题仅有4篇相关出版物。其中包括：对人原发性肿瘤的阴性发现(没有发现基因变化)(Silva et al.，2000)、在MDM2的锌指区域很少发生点突变和插入突变(Schlott et al.，1997)、在5’-未翻译区域的一种多态性(Heighway et al.，1994)、以及在锌指区域外显子10的多态性(Taubert et al.，2000)。这一多态性被确定为专门针对软组织肉瘤(与健康对照受试者的多态性等位基因频率相比较)。该多态性与存活率降低的趋势相关(有多态性的患者的存活率：38个月；无多态性的患者的存活率：57个月)。

本发明的目的在于鉴别与肿瘤相关的人MDM2基因的突变或多态性，并确定其与易患病体质(predispositions)的相关性。从这些相关性出发，欲开发出针对这些易患病体质的分子遗传学诊断方法。其目的在于建立一个模型，从而可在外科手术以及药物上都能进行预防以及缓解治疗。

本发明是基于这样一种认识，即发生在MDM2基因外显子12密码子354上的多态性A→G(GAA→GAG)(NM_002392序列的核苷酸1373)并不局限于软组织肉瘤，而是与多种恶性肿瘤的发病倾向相关，并且，令人惊奇的，该多态性具有遗传特性，即，其保存于胚芽系中。

已经发现该多态性与某些上皮来源的实体瘤(前列腺实体瘤)具有相关性的倾向，但其并不局限于这些，它还对更多的实体瘤以及血液肿瘤的易感性具有关键性的作用。

本发明是按照权利要求书来实现的。本发明涉及一种检测肿瘤易感性的方法，该方法的特征在于：受试个体的核酸被分离，在外显子12的354位的碱基变换A→G(GAA→GAG)的帮助下，人MDM2基因序列被确定基因型(genotyped)，并且可通过高通量过程对该多态性基因座(在纯合体和杂合体间有区别)的等位基因数据进行高特异性的、且非常敏感的有效确定。

可通过测序或其它适宜检测点突变的方法来检测基因分型。这些方法包括PCR所支持的基因分型方法，例如，等位基因特异性的PCR；使用寡核苷酸的其它基因分型方法(例如，点印迹或者寡核苷酸连接试验(OLA))；使用限制性酶的方法以及通过基质辅助的激光离子化脱附游离质谱(MALDI)进行的单核苷酸多态性(SNP)分析；以及理论上用于变异性检测的任意方法，其中包括任意技术方案的基因芯片技术。

基于上述研究，本发明的方法适于检测广谱的易患不同疾病的体质。在本发明的一个实施方案中，该方法通过检测354位的多态性A→G的纯合性或杂合性来作为具有潜在肿瘤易感性的遗传倾向性的标准，尤其适用于患者及其后代的罹患肿瘤的遗传倾向性的标准。

在一个优选的突变株中，通过检测多态性的纯合性或杂合性，该方法被用作对上皮组织实体瘤，例如前列腺癌(PCa)、乳腺癌、宫颈癌和/或卵巢癌等的肿瘤易感性的遗传倾向性的标准。该方法尤其适用于检测对前列腺癌的肿瘤易感性。

由此为分子生物学诊断专家提供了一个通用的遗传性肿瘤标记物。

根据本发明，通过检测某一单模标本的纯合性或者杂合性，可以为其遗传倾向提供有价值的陈述。由此可根据分子遗传学提供遗传学建议。

此外，该多态性的鉴定可能作为治疗的诊断基础。

可利用分离的核苷酸进行检测，也可使用DNA或者RNA。可利用本领域公知的手段将分离的RNA转录为mRNA或者cDNA。此后，对DNA进行测序。

根据上述知识，通过使用突变的核苷DNA序列，可以根据本发明开发出新的治疗剂，该治疗剂通过调节转录、翻译以及影响其效率而影响MDM2基因的通路并攻击MDM2基因(或与之相关的基因)，优选采用调节表达的方式。

影响MDM2基因的一些基因通路是已知的。例如，它们包括：

·P53-p14

·Rb-p161NK4A/p19ARF-E2F

·Mdr-1。

优选开发出作用于人MDM2基因，并攻击该基因外显子12的354位A→G的治疗剂。

此外，本发明还开发了体外和体内检测系统。这些检测系统表达外显子12的354位A→G突变的人MDM2基因序列，可将该序列用于检测与MDM2相关的疾病，并且可开发检测个体特异性治疗剂。

对本领域技术人员来说，这些检测系统是公知的，它们可以是细胞系、异种移植物、以及其它动物模型等。

下面采用对前列腺癌(PCa)的肿瘤易感性的检测为例，对本发明进行详细说明，但下述说明并非为了对本发明做出限制。

对从泌尿道肿瘤患者手术前所选取的血液DNA样品进行分析，其中与德国正常人群相比，被诊断患有原发性前列腺癌、具有家族性既往病史(未表明该家族中的前列腺癌)、且已进行相应的治疗(主要为治疗处理的目的对局部前列腺癌进行前列腺切除；对个别激素难控制的前列腺癌患者采用化疗)的病人MDM2的354位(外显子12)SNP A→G的杂合性要更高。

在进一步的研究中，在229个受检测DNA样品中，清楚地检测到31个样品具有多态性(13.5％)。由该数字可以清楚地看出，MDM2的多态性比率要比正常人群高1倍(假设在对照个体中检测了杂合性比率，对照个体为健康年轻的正常人群，也包括具有非倾向性可确定的前列腺癌风险的男性个体)。这一结果表示对偶发性前列腺癌患者来说，杂合子基因座是可能的肿瘤易感性因子。

有趣的是，还发现，在晚期PCa患者的两个DNA样品中，得到了纯合子等位基因的结果(两个等位基因都为354位(外显子12)的多态性A→G)。

当在分子筛选中使用HTS来检测待研究MDM2基因座的个体特异性等位基因数据时，可能解决现存的问题。确定待研究的MDM2的多态性，是通过与病人DNA中所存在的纯合或者杂合子的高灵敏性以及确切类型相联系。选定的方法学操作简单快速，具有高度的可重复性以及稳定性。

由上可知，该方法可高度综合地与有核血细胞的全自动化DNA提取相关，并且可能用于全自动分离或者用于分子样品的制备。优选的检测方法是基于DNA ELISA，以及接下来的在96孔格式中对杂交结果的间接酶学检测。但是，这一优选的DNA ELISA实施方案不应被限制在对待研究的MDM2基因座的分子筛选方法中。在优选的实施方案(DNA ELISA)中，利用从待研究患者的血液样品中预先分离的基因组DNA来生成双链DNA片段，将该片段采用PCR技术与待测MDM2基因座的侧边相联(flank)。用于PCR的初始对含有一引物，该引物在5’位置被生物素化。由此所生成的PCR片段在扩增后也被生物素化。接着将该PCR片段转移至链霉抗生素(streptavidin)包被的96孔微检测板中，通过生物素化与板的表面共价连接。通过加入NaOH溶液使与板面结合的双链DNA片段变性，通过洗涤去除未结合的DNA单链。接下来共价结合的DNA单链作为MDM2的基因型碱基互补杂交反应的靶序列。然后用两个FITC-标记的寡核苷酸探针/扩增样品在各种情况下进行杂交，寡核苷酸探针/扩增样品在所研究的MDM2基因座两种可能的MDM2等位基因突变体都具有碱基互补性。该杂交反应通过与酶偶联的抗-FITC抗体反应以及接下来的底物转化而被间接酶学检测。所存在的等位基因情况通过反应完成后对相应孔的颜色变化或者亮度的检测进行鉴别。以颜色为基础，可能清楚地鉴别具有纯合子或者杂合子特性的存在。该方法可能用一个96孔板同时研究48个患者的DNA。已经通过大量研究的样品以及一系列空白对照的研究证实了该方法的可重复性以及稳定性。在附加的DNA序列的帮助下，已经对一系列样品的DNA ELISA生成的结果进行了清楚的验证。

对所有显著性的样品以及典型数量的非显著性样品的检测结果进行重新评价，采用不同的识别检测系统(直接PCR DNA测序，ALF Express，PharmaciaBiotech)得到了100％的确认。

此外，在进一步的空白实验中，通过相关以及非相关实验系列确定了同一检测个体的多个DNA等分以及阴性对照。该研究还得到了定性结果的完全匹配，该定性结果强调了所选用的检测方法的灵敏性。进一步的研究目前正在进行中，该项研究对400多位可检测的偶发性前列腺癌患者进行了确定的数理统计分析。

对于其它类型肿瘤的实验证实了该基因多态性的发生与上皮细胞实体瘤发生率的升高的关系。例如，在32个所研究的患有乳腺癌、宫颈癌或者卵巢癌的血液DNA样品中，其中有5例(15.6％)证实具有杂合MDM2等位基因的情况。

为了证实所述PCR-ELISA检测结果的特异性，对于在多态性MDM2基因座具有已知等位基因情况的分组人口个体进行了重新评价。此外，通过增加对照组来确定正常人群中的精确的杂合体频率(在该方案中描述的所有DNA样品来自健康对照个体以及Saxony和Saxony-Anhalt在1996-2001的肿瘤患者，并且样品的获得都得到了患者的书面同意，且制备的DNA样品为匿名保存)。DNA样品完全从经过严格纳入标准选择的供血者中获得(在供血时以及供血之前没有肿瘤疾患的症状，无已知的家族性疾病，且不论在工作地点或者在家都未暴露于辐射或者其它致突变/致癌性物质)。

对于正常个体的108例血液DNA样品，Taubert et al.(2000)已经通过测序和限制性消化等手段对其中的一定比例样品独立进行了MDM2多态性的研究，所有当时检测为杂合DNA的样品已经通过PCR-ELISA进行了清楚的证实。此外，对已有研究的WTS组织的31个DNA样品进行研究已经证实了100％的特异性。另外，在这些WTS患者中的一些(n＝6)，肿瘤组织DNA显示出MDM2的多态性，对其相应的DNA血液样品进行分析，也发现其为阳性。由此可以看出，WTS患者组织DNA样品的多态性检测高度可能为遗传性的，即，该多态性在生殖细胞系中是保守的。

在欧洲中部男性经常罹患的癌症疾病中，前列腺癌(PCa)排名第二，并且由于近年增加迅速，因此引起了重视。在美国，其已经成为最常检测出的肿瘤类型，并且为肺癌之后的肿瘤相关病死率最高的实体瘤。在80％的情况下，该疾病在65岁以上的男人中诊断出。尽管局部的前列腺癌可以通过切除前列腺治愈，但是对于在局部发展且伴有转移的肿瘤则几乎不可能得到治疗。对于肿瘤转移病人的三年存活率仅为40％。对于前列腺癌，转移通过血流和淋巴管进行传播。淋巴转移的最初侵袭位置为骨盆淋巴结。血液微转移主要影响骨骼系统，最主要的为骨盆、脊骨、以及肝和肺等个体器官。对于有转移的前列腺癌，手术和药物治疗的目的在于抑制睾丸激素的形成和作用，该睾丸激素是前列腺以及前列腺癌细胞增殖的主要原因。因此，对于肿瘤阶段的正确确定，即，该肿瘤是局部的还是已经发展为扩散性，对确定接下来的治疗形式是绝对必要的。在前列腺癌的最初诊断中，目前使用的检测方法为直肠指诊、血清中肿瘤标记物PSA(前列腺特异性抗原)的检测、对取出的或组织切片进行组织病理学检查、个别情况下对骨盆的淋巴结摘除进行检查、并可选择性进行MRT及CT或者骨闪烁扫描法。但是，直到现在，还无法检测血液中或者淋巴结中最初转移的生成(血液中扩散的前列腺癌细胞、区域性淋巴结的低入侵)，而对淋巴结仅可能在术后通过组织病理学检查。可用于术前检测的影像学技术(CT，MRT)灵敏性很低，仅为22-26％，且仅能检测广泛转移的病例。由于转移的发展明显依赖于肿瘤所处的阶段、肿瘤的体积以及肿瘤等级，因此除了组织学区别(Gleason评分)，上述这些也是确定患者预后情况的重要因素。

除了直肠指诊，肿瘤标记物PSA(前列腺特异性抗原)的检测也是前列腺癌早期诊断所用的一种高选择性和灵敏的标准方法。但是，前列腺特异性抗原并非是前列腺的癌症特异性标记物，而仅为组织特异性的标记物。PSA血清值的增加暗示了PCa的存在。通过PSA来区分BPH和肿瘤，在2-10ng/ml范围内是非常难于区分的，这是由于随着年龄的增长BPH发作更频繁，随着年龄的增加，由于前列腺的自然增大使PSA值也会增加。PSA的表达受到睾丸激素和二氢睾酮(DHT)的调节。在对患者给予激素(抑制睾丸激素和二氢睾酮的作用)时，血清中PSA水平降低。

PCa对于健康保健具有重要作用(尤其对于西方工业化国家)，因此，由于缺少肿瘤特异性标记物以及已知的肿瘤生物学和肿瘤细胞异种性，需要对PCa进行深入的临床研究，该研究集中于鉴别偶发性以及遗传性PCa的遗传性以及外成性辅助因子。尤其在美国，对PCa发生率增加的家族进行了表征，将人类基因学研究(家族相关性的)深入到PCa。

本发明公开了一种普遍适用的遗传性肿瘤标记物，该标记物在MDM2外显子12的354位具有A→G(GAA→GAG)的多态性，该标记物尤其适用于前列腺癌。研究已经表明该多态性与PCa具有精确的相关性。通过检测该多态性，可能对PCa的遗传倾向进行更清楚地描述，并可能用于临床。

参考文献

·Freedman D.A.，Wu L.，Levine A.J.(1999)，Functions of the MDM2 oncopro-tein.Cell Mol.Life Sci.55：96-107.

·Juven-Gershon T.，Oren M.(1999)，MDM2：The ups and downs.Mol.Med.5：71-83.

·Momand J.，Wu H.H.，Dasgupta G.(2000)，MDM2-master regulator of thep53 tumour suppressor protein.Gene 242：15-29

·Würl P.，Meye A.，Berger D.，Bache M.，Lautenschlger C.，Schmidt H.(1997)，Prognostic relevance of C-terminal MDM2 detection is enhanced by positivityin soft tissue sarcomas.Diagn.Mol.Pathol.6：249-54.

Claims (9)

1.一种检测对肿瘤具有易感性的方法，其特征在于：分离受试个体的核酸，对人MDM2基因，采用外显子12中354位的碱基交换A→G(GAA→GAG)进行基因分型，用该方法来确定该多态性基因座的等位基因情况。

2.权利要求1的方法，其特征在于，将纯合或杂合多态性(突变)的检测用作肿瘤易感性的遗传倾向性的充分标准。

3.权利要求1或2的方法，其特征在于将纯合或杂合多态性(突变)的检测用作受试者及其后代罹患肿瘤风险的遗传倾向性的充分标准。

4.权利要求1至3任意一项所述的方法，其特征在于将纯合或杂合多态性(突变)的检测用作前列腺癌、乳腺癌、宫颈癌和/或卵巢癌的肿瘤易感性的充分标准。

5.权利要求1至4任意一项所述的方法，其特征在于通过对DNA进行测序或者通过其它适于检测点突变的方法来进行基因分型。

6.权利要求1至5任意一项所述的方法，其特征在于通过多个高特异性的扩增引物以及标记的杂交探针的DNA-ELISA来进行基因分型。

7.一种治疗剂，该治疗剂通过调节转录、翻译以及影响其效率，优选通过调节表达来影响MDM2基因的通路和/或攻击MDM2基因外显子12中354位的多态性A→G(GAA→GAG)、或与之相关的基因。

8.一种治疗剂，该治疗剂通过调节转录、翻译以及影响其效率，优选通过调节表达，作用于人MDM2基因并攻击MDM2基因外显子12中354位A→G(GAA→GAG)的位点变化。

9.一种体外及体内检测系统，该检测系统表达人MDM2基因，该MDM2基因在外显子12的354位具有A→G(GAA→GAG)突变(多态性)，所述检测系统用于研究与MDM2相关的疾病以及用于开发检测个体特异性治疗剂。