WO2001053520A2 - Genchip für ein neugeborenen screening - Google Patents
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Definitions
- the invention relates to a nucleotide carrier for combined oligonucleotides with a selection of oligonucleotides for the detection of certain gene sequences and claims the priority of German patent application 100 02 446.7, to which reference is made in terms of content.
- Hybridization techniques i.e. the targeted attachment of two complementary nucleic acids to one another is an essential document in a large number of molecular biological processes. These techniques are used to detect individual genes or parts thereof in a preparation of genomic DNA or the transcription product of a gene (mRNA) [Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. Molecular cloning: A laboratory manual. 2nd ed., Vol. 2, 1989, Cold Spring Harbor: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 13.96-97; Constanzi C, Gillespie D: Fast blots: immobilization of DNA and RNA from cells. In: Guide to molecular cloning techniques.
- Hybridization is usually combined with a detection reaction and subsequent identification of a nucleic acid sequence.
- one strand of nucleic acid is marked, for example, by dyes, radioactivity or chemiluminescent or fluorescent molecules, while the second is bound to a solid phase.
- the solid phase is usually formed either by nitrocellulose or nylon membranes.
- genomic DNA or RNA the so-called target sequences
- target sequences are separated electrophoretically via an agarose gel, transferred to the nitro or nylon membrane and hybridized with a known DNA or RNA sequence as a probe.
- the hybridization is detected by a previous labeling of the probe and quantified if necessary.
- Hybridization of a probe with a target can now also be carried out using so-called gene chips [Lockhart DJ, Dong H, Byrne MC, Folettett MT, Gallo MV, Chee MS, Mittmann M, Wang C, Kobayashi M, Horton H and Brown EL. Expression Monitoring by Hybridization to High-Density Oligonucleotide Arrays. Nature Biotechnology. 14: 1675-1680, 1996; Wodicka L, Dong H, Mittmann M, Ho MH, and Lockhart DJ. Genome-wide expression monitoring in Saccharomyces cerevisiae. Nature Biotechnology. 15: 1359-1367.1997].
- Gene chips consist of a solid support made of, for example, a plastic or glass, to which up to several thousand oligonucleotides can be applied as probes.
- the surface of the chip which is only a few square centimeters in size, is covered with a "turf" of oligonucleotides with which the complementary nucleic acid sequences of a DNA or RNA sample can hybridize.
- the target sequences are marked beforehand in order to provide later detection of the hybridization.
- the use of gene chips allows the investigation of several thousand different sequences at the same time and thus represents an improvement over the conventional blot methods.
- the hybridization on the chip can be evaluated by a scanner, so that the method can be largely automated.
- Mutations in genes can be identified by sequencing the genetic information (Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 74: 5463-5467, 1977).
- the sequencing of nucleic acids is usually very complex, so that in practice mutations are mostly indirect, i.e. by examining their biochemical and / or physiological effects using biochemical (e.g. enzyme-linked immunoassay), analytical (e.g. high-performance liquid chromatography, gas chromatography, or mass spectrometry) or bacteriological (so-called Guthrie growth inhibition test) procedures.
- the time period between the diagnosis of the gene defect and the beginning of the therapy or preventive measure must be kept as short as possible. This can be done by detecting the mutations directly, ie at the level of the nucleic acids. If possible, this should be done in early childhood.
- genetic aberrations can also be identified by means of the hybridization - already described. This has the advantage that the use of gene chips is possible and the effects of the automated evaluation techniques can be used.
- a DNA chip is known from US Pat. No. 5,837,832, with the aid of which known sequences can be sighted for possible mutations.
- a sequence which is complementary to the so-called reference sequence in question - the so-called wild-type sequence - is synthesized in sections each preferably having a length of 12 to 18 base pairs, as well as sequences which differ from these Widtype sequence sections only in a single base.
- the number of these so-called substitution sequences corresponds to the number of theoretically possible mutations through one base substitution each.
- the invention is therefore based on the object of providing a nucleotide carrier for combined oligonucleotides and a selection of sequences for a nucleotide carrier for combined oligonucleotides or a similar gene-combined examination means, in particular for a newborn screening, by means of which the genetic status of a defined combination is checked disease-relevant genes or gene segments (reference sequences) is possible.
- nucleotide carrier hereinafter “gene chip” with a selection of oligonucleotides with functionally characterized, known to cause certain phenotypes Mutations. These oligonucleotides can be identical or complementary to the reference sequences.
- the mutated oligonucleotides are specifically selected and combined from the spectrum of all theoretically possible mutations in the reference sequence segments.
- the mutations selected in this way, which cause a specific phenotype, are applied to the gene chip with at least one second phenotype-forming oligonucleotides.
- phenotype is broadly defined and refers to all forms, manifestations and consequences that are associated with a selected reference sequence or can be demonstrated by detecting these sequences.
- the phenotypes can be, for example, a body function, a physiological function, e.g. a metabolic disorder, or a genetic predisposition to an illness in the medical sense, e.g. a specific form of cancer.
- Another advantage of the gene chip according to the invention is that a fast, inexpensive and, above all, reliable examination method is provided, the sensitivity of which exceeds that of conventional physiological methods.
- a particularly preferred embodiment of the invention enables the checking of genetic states in the prenatal and neonatal area.
- a screening program for newborns can be a variety Detect genetic metabolic disorders using a small amount of blood.
- a selection of oligonucleotides for at least two or more, for example of the following diseases, can be put together on a chip:
- a chip with oligonucleotides for the diseases “phenylketonuria” and “galactosemia” is particularly preferred. This is preferably further combined with oligonucleotides for "biotinidase deficiency”.
- the diseases mentioned are caused by mutations in a total of 21 defined genes, which include around 150,000 nucleotides including the functionally relevant regulatory regions. Since each nucleotide can be present with one of the four bases adenine, guanine, cytosine and thymine, and insertions, deletions or inversions must also be considered, there are approximately 900,000 different mutation possibilities. Are more complex mutations such as So-called small indels (insertions / deletions), several million different mutations quickly result.
- a gene chip according to the prior art would accordingly have to have several million hybridization sites corresponding thereto. Such a number of sequences cannot be sensibly accommodated and evaluated on the known gene chips.
- oligonucleotides Through the selection of oligonucleotides according to the invention, the sequences required for the detection of the diseases on a gene chip, ie hybridization sites, can be reduced to approximately 5,000. This enables simultaneous mutation detection on a single gene chip. It is also possible to make a selection from the oligonucleotides required for the detection of the diseases listed above and to diagnose only one or a few of the diseases.
- These diseases diagnosed in this particular embodiment are a targeted selection of the most important genetically determined diseases in humans. They are also selected according to the criteria of treatability and the significant frequency in the population. Furthermore, they are essentially due to mutations that are already known. The functionally characterized mutations were combined, each causing 90 to 95% of the actual diseases observed.
- the gene chip according to the invention and the selection according to the invention are based on oligonucleotides for the detection of reference sequences, that is to say also sequences complementary thereto, which lie on 21 genes of the human genome. These are the following sequences, which are specified in their code of the gene bank of the National Center for Biotechnology Information (NCBI).
- NCBI National Center for Biotechnology Information
- Phenylalanine hydroxylase, PAH diagnosis of phenylketonuria [GenBank number: K03020, NM 000277, L47726, U49897].
- Cystathione beta synthase CBS [GenBank numbers: NM 000071, L14577, X98810 to X98823, X88562, X87815, X87816, X91910].
- ACADM medium-chain acyl-CoA dehydrogenase deficiency
- LDLR low-density lipoprotein receptor
- Apolipoprotein B (diagnosis of a defective apolipoprotein B)
- the gene chip according to the invention can therefore contain oligonucleotide sequences which are identical to the corresponding sections of the reference sequences or are complementary thereto. Furthermore, oligonucleotides can be applied which contain functionally characterized mutations or sequences complementary thereto.
- the mutations can be base substitutions, insertions and deletions. More complex mutations such as inversions and indels (as insertions / deletions) are also possible.
- the length of the oligonucleotides applied to the gene chip can be 16 to 25 nucleotides. Preferably 15 to 18 mers are used.
- the sequences which are complementary thereto can be synthesized from the sample to be examined. This synthesis takes place during the labeling reaction necessary for the later detection of the hybridization that has taken place.
- DNA and RNA sequences can be applied to the gene chip according to the invention. Accordingly, nucleotides with uracil can be used. Base analogs can also be used.
- Oligonucleotides that are complementary to sequences of the reference sequences listed in Table 1 are applied to a suitable support using standard techniques, such as are described, for example, in German Patent 196 12 356 or US Pat. No. 5 837 832. This is preferably made of glass coated with gold.
- the oligonucleotides are 15 nucleotides in length. In individual cases, sequences of 16 to 25 nucleotides are also possible.
- the carrier is divided into a plurality of fields, each of which contains only one sequence comprising one mutation.
- the sequences are positioned within the field in such a way that the mutation is as central as possible relative to the reference sequence section.
- the field 1.1 the sequence CAGTGGACATGCTGG, which is complementary to the reference sequence section CCAGCATGTCCACTG (table, line 1, column 2) and the field 1.2 the corresponding mutated oligonucleotide CAGTGGAIATGCTGG, which is complementary to the mutated reference sequence section CCAGCATATCCACTG (column 3, table 3; Mutation underlined).
- Table 1 List of nucleic acid sequences, the complementary sequences of which are applied to the chip. In order to maintain clarity, only the central area of the 15- to 25-mers is shown as a section. The sequence sections not listed are complementary to the reference sequence. The position relative to the reference sequence results from the specification of the codon number.
- oligonucleotide complementary to the mutated reference sequence section is applied to the support at a precisely defined location.
- the nucleotides deviating from the reference sequence result from column 3 of the table.
- sequence information listed in the table relates to the reference sequence with the GenBank number U49897. There are both mis sense or nonsense mutations (Table 1A) and splice variants (Table 1B), deletions (Tables 1C and 1E); Insertions (table 1 D), indels and complex rearrangements selected.
- Column 1 shows the number of the codon affected by the mutation on the reference sequence. The last column shows the amino acid exchange encoded by the mutation.
- Exon 3 plus flanking sequences 22 bp, starting with nucleotide 593, codon 198 22 bp starting with nucleotide 586, codon 196 265 bp relate to exons 5-6 exons 1-5 plus flanking sequences. Exons 9-13 plus flanking sequences. 22 bp starting with nucleotide 589, codon 197 exons 9-11 plus flanking sequences
- Biotinidase, BTD (diagnosis of a biotinidase deficiency).
- ACADM medium-chain acyl-CoA dehydrogenase deficiency
- LDLR low-density lipoprotein receptor
- Apolipoprotein B (diagnosis of a defective apolipoprotein B).
- a selection of oligonucleotides complementary to functionally characterized mutations is applied to the gene chip according to the invention for a newborn screening. These mutations are in Tables 6.1.1. to 6.12.5 specified in their position on the reference sequence and the amino acids concerned.
- the oligonucleotides of the reference sequence listed in Table 3 are applied directly to a suitable support using the known standard techniques. Analogously to Example 1, 15-mer is generally used, but in individual cases 16- to 25-mer oligonucleotides can also be used.
- sequences are in turn chosen so that the sequence deviation present in the mutated reference sequence is approximately central relative to the reference sequence.
- Table 3 contains a list of the nucleic acid sequences that are applied to the chip for diagnosing the biotinidase deficiency. For the sake of clarity, only the central area of the 15 to 25-mer oligonucleotides is shown. The position is specified relative to the reference sequence by specifying the codon number. The normal reference sequence shown in the third column is applied to each mutated reference sequence at a precisely defined location on the support. The sequence sections not shown correspond to the reference sequence.
- Table 4 Diseases recognized with a nucleotide carrier according to the invention.
- This table shows the congenital hereditary diseases and the relevant reference sequences which can be diagnosed with the nucleotide carrier described in the exemplary embodiment. It also contains information on what percentage of clinical diseases is caused by mutations in the corresponding genes that have already been described.
- Tables 6.1.1 to 6.12.5 specify the oligonucleotides relevant to certain diseases on the nucleotide carrier (NT), namely in this relative position, the genes concerned, the number of the codon of the reference sequence, the nucleotides of the reference sequence concerned, the mutated sequences, and the phantopy consequences of the mutations. For reasons of clarity, only the sequence area directly affected is shown. The sections of the oligonucleotides not listed are either identical to the corresponding sequence of the reference sequence or complementary. Deleted nucleotides are shown in lower case.
Abstract
Nukleotidträger mit einer Auswahl von Oligonukleotidsequenzen für den Nachweis von für mindestens zwei Phänotypen relevanten Referenzsequenzen, bzw. deren funktionell charakterisierten Mutationen, wobei die Oligonukleotidsequenzen identisch oder komplementär zu den Referenzsequenzen sind.
Description
"Genchip für ein Neugeborenen Screeninq"
Die Erfindung betrifft einen Nukleotidträger für kombinierte Oligonukleotide mit einer Auswahl von Oligonukleotiden zum Nachweis bestimmter Gensequenzen und nimmt die Priorität der deutschen Patentanmeldung 100 02 446.7 in Anspruch, auf die inhaltlich Bezug genommen wird.
Hybridisierungstechniken, d.h. die gezielte Anlagerung zweier komplementärer Nukleinsäuren aneinander, stellen einen wesentlichen Schrift in einer Vielzahl molekularbiologischer Verfahren dar. Mit diesen Techniken werden einzelne Gene oder Teile davon in einer Präparation genomischer DNA oder das Transkriptionsprodukt eines Genes (mRNA) nachgewiesen [Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. Molecular cloning: A laboratory manual. 2nd ed., vol. 2, 1989, Cold Spring Harbor: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 13.96-97; Constanzi C, Gillespie D: Fast blots: immobilization of DNA and RNA from cells. In: Guide to molecular cloning techniques. Edited by Berger SR and Kimmel AR, Academic Press Inc., San Diego: Methods in Enzymo- logy 1987, 152: p582-87; Schena M et al.: Quantitative monitoring of gene expression pattems with a complementary DNA microarray. Science 1995;270: p467-470].
Eine der wichtigsten Anwendung der Hybridisierung ist die Untersuchung von Veränderungen oder Mutationen einzelner Gene [Ausubel FM, Brent R, Kingston RE, Moore DE, Seidman JG, Smith JA, Struhl K. (Hrsg.) Current protocols in molecular biology, 1998, John Wiley & Sons].
Üblicherweise wird eine Hybridisierung mit einer Nachweisreaktion und anschließender Identifizierung einer Nukleinsäuresequenz kombiniert. Dazu wird ein Nukleinsäurestrang beispielsweise durch Farbstoffe, Radioaktivität oder chemolumineszierende oder fluoreszierende Moleküle markiert, wäh- rend der zweite an eine festen Phase gebunden ist. In den häufig angewandten Southern-Blots für DNA-Analysen und Northern-Blots für RNA- Analysen wird die feste Phase meist entweder durch Nitrozellulose- oder Nylonmembranen gebildet.
In diesen herkömmlichen Blot-Systemen wird genomische DNA oder RNA, die sogenannten Targetsequenzen - über ein Agarosegel elektrophoretisch getrennt, auf die Nitro- oder Nylonmembran transferiert und mit einer bekannten DNA- bzw. RNA-Sequenz als Sonde hybridisert. Die Hybridisierung wird durch eine vorherige Markierung der Sonde nachgewiesen und ggf. quantifiziert. Diese Verfahren sind durch eine hohe Spezifität gekennzeichnet. Sie besitzen aber den Nachteil, daß die Durchführung eines Blotvor- gangs sehr arbeits- und zeitintensiv ist, und in einem Durchgang jeweils nur wenige Sequenzen gleichzeitig untersucht werden können.
Das Hybridisieren einer Sonde mit einem Target kann neuerdings auch durch sogenannte Genchips erfolgen [Lockhart DJ, Dong H, Byrne MC, Fol- lettie MT, Gallo MV, Chee MS, Mittmann M, Wang C, Kobayashi M, Horton H and Brown EL. Expression Monitoring by Hybridization to High-Density Oligonucleotide Arrays. Nature Biotechnology. 14:1675-1680, 1996; Wodicka L, Dong H, Mittmann M, Ho MH, and Lockhart DJ. Genome-Wide Expression Monitoring in Saccharomyces Cerevisiae. Nature Biotechnology. 15:1359-1367,1997]. Genchips bestehen aus einem festen Träger aus beispielsweise einem Kunstoff oder Glas, auf den bis zu mehrere tausend Oli- gonukleotide als Sonden aufgebracht werden können. So wird die Oberflä- ehe des nur wenige Quadratzentimeter großen Chips mit einem "Rasen" von Oligonukleotide bedeckt, mit denen die komplementären Nukleinsäurese- quenzen einer DNA oder RNA-Probe hybridisieren können. Die Targetsequenzen werden zuvor markiert, um den späteren Nachweis der Hybridisierung zu erbringen.
Die Verwendung von Genchips erlaubt die Untersuchung mehrerer tausend verschiedener Sequenzen zur gleichen Zeit und stellt gegenüber den herkömmlichen Blot-Verfahren somit eine Verbesserung dar. Weiterhin kann die Hybridisierung auf dem Chip über einen Scanner ausgewertet werden, so daß sich das Verfahren weitgehend automatisieren läßt.
Für die Herstellung von Genchips oder genkombinatorischen Untersuchungsmitteln sind verschiedene Techniken entwickelt worden, beispielsweise lithographische Verfahren, Siebdruck- oder Reaktionskanalverfahren, elektrochemische/-synthetische Verfahren, ink-jet-Systeme, micropin-Verfah- ren oder open capillary tips. Auch ist die Verwendung von Microbeads bekannt [Lackner KJ et al. Multiplex DNA- und RNA-Analyse an fluoreszenten Microbeads als Alternative zum DNA-Array. Statusseminar Chiptechnologie für DNA-Diagnostik und Sequenzanalyse in Deutschland. DECHEMA 1999].
Mutationen in Genen können durch Sequenzierung der genetischen Information identifiziert werden (Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 74:5463-5467, 1977). Die Sequenzierung von Nukleinsäuren ist in der Regel sehr aufwendig, so daß in der Praxis Mutationen meist indirekt, d.h. über die Untersuchung ihrer biochemischen und/oder physiologischen Auswirkungen durch biochemische (z.B. enzymgebundene Immunmessverfahren), analytische (z.B. Hochleistungsflüßigkeitschromatographie, Gaschromatographie, oder Massenspektrometrie) oder bakteriologische (sog. Guthrie Wachstumsinhibitionstest) Verfahren nachgewiesen werden.
Diese Vorgehensweise hat den Nachteil, daß Mutationen oftmals erst nach dem Ausprägen der durch sie bedingten Stoffwechselstörungen oder Krankheitsbilder erkannt werden und infolgedessen mögliche therapeutische oder kurative Eingriffe erst zu einem späten Zeitpunkt gewählt und eingesetzt werden können. Unter Umständen sind dann bereits irreversible Schädigungen entstanden.
Um das Ausbilden der Krankheitssymptome weitgehend zu vermeiden, muß die Zeitspanne zwischen der Diagnose des Gendefekts und dem Beginn der Therapie bzw. Präventionsmaßnahme möglichst kurz gehalten werden. Dies
kann geschehen, indem die Mutationen direkt, d.h. auf der Ebene der Nukleinsäuren, nachgewiesen werden. Dies sollte möglichst noch im frühen Kindesalter erfolgen.
Neben der Sequenzierung kann die Identifikation genetischer Aberrationen durch die - bereits dargestellte - Hybridisierung erfolgen. Diese hat den Vorteil, daß die Verwendung von Genchips möglich ist und so die Effekte der automatisierten Auswertetechniken genutzt werden können.
Aus der US-Patentschrift 5 837 832 ist ein DNA-Chip bekannt, mit dessen Hilfe bekannte Sequenzen auf mögliche Mutationen gesichtet werden können. Dazu wird zunächst eine zu der in Frage stehenden sogenannten Referenzsequenz komplementäre Sequenz - die sogenannte Wildtyp-Sequenz - in Abschnitten einer Länge von jeweils vorzugsweise 12 bis 18 Basenpaaren synthetisiert, sowie Sequenzen, die jeweils nur in einer einzigen Base von diesen Widtyp-Sequenzabschnitten abweichen. Die Anzahl dieser sog. Substitutionssequenzen entspricht der Anzahl der theoretisch möglichen Mutationen durch je eine Basensubstitution.
Anschließend werden die Sequenzen in einem definierten Muster auf den Chip vorzugsweise derart aufgebracht, daß sie Blöcke mit je fünf nebeneinander liegenden Reihen bilden. Diese beinhalten je eine Wildtyp-Sequenz und in paralleler Anordnung dazu drei Substitutionssequenzen mit jeweils einer der ausgetauschten Base. Eine fünfte Sequenz entspricht wiederum der Wildtypsequenz. Demnach werden fünf Reihen und Sequenzen benötigt, um alle theoretisch möglichen Basenaustausche in einem einzigen Nukleotid innerhalb der Sequenz darzustellen.
In der US-Patentschrift 5 837 832 werden nach diesem Schema menschliche Gene auf Mutationen untersucht, beispielsweise bestimmte Exons des im Zusammenhang mit der Cystischen Fibröse diskutierten Gens CFTR oder des Tumorsurpressorgens p53, dessen Mutationen mit dem Entstehen von Krebserkrankungen assoziiert sind.
Der Nachteil dieser Vorgehensweise liegt darin, daß schon bei relativ kurz- kettigen Genen mehrere 10.000 bis 100.000 verschiedene Sequenzen als potentielle Hybridisierungsstellen auf den Genchip aufgebracht werden müssen, um das gesamte theoretisch mögliche Mutationsspektrum abzudecken. Mit der Erhöhung der Sequenzlänge des zu untersuchenden Gens oder Genabschnitts oder einer simultanen Untersuchung zweier oder mehrerer Gene bzw. Genabschnitte erreicht die für ein sinnvolles Screening erforderliche Anzahl von Hybridisierungsstellen eine die Herstellung und Umsetzung eines entsprechenden Genchips sprengende Größenordnung.
Sollten z.B. die derzeit ca. 40.000 für die genetische Untersuchung interessanten menschlichen Gene mit Hilfe des dargestellten Prinzips gesichtet werden, wäre ein Genchip mit wenigstens 4 x 108 Hybridisierungsstellen erforderlich. Das Herstellen eines solchen Chips ist nach dem heutigem Stand der Technik und selbst mit den sich darin abzeichnenden Entwicklungen nicht realisierbar. Entsprechend läßt sich eine umfassende frühzeitige und schnelle Untersuchung von Gendefekten in praktisch relevantem Umfang nicht durchführen.
Der Erfindung liegt demnach die Aufgabe zugrunde, einen Nukleotidräger für kombinierte Oligonukleotide und eine Auswahl von Sequenzen für einen Nukleotidräger für kombinierte Oligonukleotide oder ein ähnliches genkombiniertes Untersuchungsmittel, insbesondere für ein Neugeborenen Screening, bereitzustellen, durch das/die die Überprüfung des genetischen Zustandes einer definierten Kombination krankheitsrelevanter Gene bzw. Genabschnitte (Referenzsequenzen) möglich wird.
Die Aufgabe wird gelöst durch die in den unabhängigen Ansprüchen angegebenen Merkmale. Bevorzugte Ausführungsformen sind in den Unteran- Sprüchen wiedergegeben.
Die Aufgabe wird im einzelnen gelöst durch einen Nukleotidträger (im folgenden „Genchip") mit einer Auswahl von Oligonukleotiden mit funktioneil charakterisierten, bekanntermaßen bestimmte Phänotypen verursachenden
Mutationen. Diese Oligonukleotide können identisch oder komplementär zu den Referenzsequenzen sein.
Die mutierten Oligonukleotide werden erfindungsgemäß gezielt aus dem Spektrum aller theoretisch möglichen Mutationen der Referenzsequenzabschnitte ausgewählt und kombiniert.
Die derart ausgewählten, einen spezifischen Phänotypen verursachende Mutationen sind mit mindestens einem zweiten Phänotypen begründenden Oligonukleotiden auf dem Genchip aufgebracht.
Der Begriff Phänotyp ist dabei weit definiert und bezieht sich auf alle Ausprägungen, Erscheinungsformen und Konsequenzen, die mit einer ausgewählten Referenzsequenz assoziiert sind oder über einen Nachweis dieser Sequenzen nachgewiesen werden können.
Den Phänotypen kann dabei beispielsweise eine Körperfunktion, eine physiologische Funktion, z.B. eine Stoffwechselstörung, oder eine genetisch bedingte Disposition zu einer Krankheit im medizinischen Sinne, z.B. einer be- stimmten Krebsform, darstellen.
Der erfindungsgemäße Chip hat den erheblichen Vorteil, daß jeweils nur eine begrenzte Anzahl von Hybridisierungsstellen erforderlich ist, so daß ein sinnvoller, in der medizinischen Praxis nutzbarer Einsatz des Genchips in den sich der Hybridisierungsreaktion anschließenden Analysen möglich ist.
Ein weiterer Vorteil des erfindungsgemäßen Genchip besteht darin, daß eine schnelle, kostengünstige und vor allem zuverlässige Untersuchungsmethode bereitgestellt wird, deren Sensitivität diejenige herkömmlicher physiologi- scher Methoden übersteigt.
Eine besonders bevorzugte Ausgestaltung der Erfindung ermöglicht die Überprüfung genetischer Zustände im pränatalen und neonatalen Bereich.
Bei einem Screeningprogramm für Neugeborene lassen sich eine Vielzahl
genetisch bedingter Stoffwechselerkrankungen unter Verwendung einer geringen Menge Bluts erfassen. Erfindungsgemäß kann eine Auswahl von Oligonukleotiden für mindestens zwei oder mehr beispielsweise der folgenden Erkrankungen auf einem Chip zusammengestellt werden:
Phenylketonurie, Ahornsirupkrankheit, Galaktosämie, Homocystinurie, Bioti- nidase-Mangel, Mittelkettiger Acyl-CoA-Dehydrogenase-Mangel, familiäre Hypercholesterinämie, familiär defektes Apolipoprotein-B, zystische Fibröse, Marfan-Syndrom, Smith-Lemli-Opitz-Syndrom, Adrenogenitales Syndrom.
Besonders bevorzugt ist ein Chip mit Oligonukleotiden für die Erkrankungen „Phenylketonurie" und „Galactosämie". Dieser wird vorzugsweise des weiteren kombiniert mit Oligonukleotiden für „Biotinidase-Mangel".
Die genannten Erkrankungen werden durch Mutationen auf insgesamt 21 definierten Genen verursacht, die inklusive der funktionell relevanten regulatorischen Bereiche etwa 150.000 Nukleotide umfassen. Da jedes Nukleotid jeweils mit einer der vier Basen Adenin, Guanin, Cytosin und Thymin vorliegen kann, und auch Insertionen, Deletionen oder Inversionen berücksichtigt werden müssen, ergeben sich etwa 900.000 verschiedene Mutationsmöglichkeiten. Werden des weiteren komplexere Mutationen, wie z.B. sogenannte kleine Indels (Insertionen / Deletionen) einbezogen, ergeben sich schnell mehrere Millionen verschiedener Mutationen.
Ein Genchip nach dem Stand der Technik müßte demnach mehrere Millionen dazu korrespondierender Hybridisierungsstellen aufweisen. Eine solche Anzahl von Sequenzen kann auf den bekannten Genchips nicht sinnvoll untergebracht und ausgewertet werden.
Durch die erfindungsgemäße Auswahl von Oligonukleotiden können die für den Nachweis der Erkrankungen auf einem Genchip erforderlichen Sequenzen, d.h. Hybridisierungsstellen auf etwa 5.000 reduziert werden. Damit ist eine simultane Mutationsdetektion auf nur einem einzigen Genchip möglich.
Es ist auch möglich, unter den für den Nachweis der oben aufgeführten Erkrankungen erforderlichen Oligonukleotiden wiederum eine Auswahl zu treffen und nur eine oder wenige der Erkrankungen zu diagnostizieren.
Bei diesen in dieser besonderen Ausführungsform diagnostizierten Erkrankungen handelt es sich um eine gezielte Auswahl der wichtigsten genetisch bedingten Erkrankungen des Menschen. Ihre Auswahl erfolgt des weiteren nach den Kriterien der Behandelbarkeit und der signifikanten Häufigkeit in der Bevölkerung. Ferner sind sie im wesentlichen auf bereits bekannte Mu- tationen zurückzuführen. Es wurde dabei die funktioneil charakterisierten Mutationen kombiniert, die jeweils 90 bis 95 % der beobachteten tatsächlichen Erkrankungen verursachen.
Nach diesem Prinzip können jedoch auch weitere Erkrankungen, deren ge- netische Ursachen bekannt sind, allein oder in Kombination nachgewiesen werden.
Ebenso ist es möglich, Krankheiten oder Phänotypen bei anderen Organismen, z.B. bei Tieren, zu identifizieren oder nachzuweisen.
Die Erfindung wird im folgenden anhand eines Beispiels einer Auswahl von Erkrankungen des näheren erläutert:
Dem erfindungsgemäßen Genchip und der erfindungsgemäßen Auswahl liegen Oligonukleotide zum Nachweis von Referenzsequenzen, also auch dazu komplementären Sequenzen zugrunde, die auf 21 Genen des menschlichen Genoms liegen. Es handelt sich dabei im einzelnen um folgende Sequenzen, die in ihrem Code der Genbank des National Center for Biotechnology Information (NCBI) angegeben sind. Die zu diagnostizierenden Er- krankungen sind jeweils in Klammern angegeben:
1. Phenylalaninhydroxylase, PAH (Diagnose der Phenylketonurie) [GenBank-Nummem: K03020, NM 000277, L47726, U49897].
2. Quinoid Dehydropteridin Reduktase, QDPR (Diagnose der Phenylketonu- rie) [GenBank-Nummern: NM 000320, M16447, X04882].
3. Mitochondriale verzweigtkettige alpha-Ketosäuredehydrogenase, α-Pep- tid, BCKDHA (Diagnose der Ahornsirupkrankheit) [GenBank-Nummer: Z14093].
4. Mitochondriale verzweigtkettige alpha-Ketosäuredehydrogenase, ß-Pep- tid, BCKDHB (Diagnose der Ahornsirupkrankheit) [GenBank-Nummer:
M55575].
5. Verzweigtkettige Dihydrolipoamid-Transaeylase, DBT (Diagnose der Ahornsirupkrankheit) [GenBank-Nummer: X66785].
6. Galaktose-1 -Phosphat Uridyltransferase, GALT (Diagnose der Galak- tosämie) [GenBank-Nummern: M60091 , NM 000155; L46354 bis 46365,
L46691 bis 46724].
7. Galaktokinase, GALK1 (Diagnose der Galaktosämie) [GenBank-Nummern: NM 002044, NM 000154, L76927, U26401 , M84443].
8. UDP-Galaktose-4-Epimerase, GALE (Diagnose der Galaktosämie) [GenBank-Nummer: L41668] (Diagnose von Galaktosämie).
9. Cystathion-beta-Synthase, CBS [GenBank-Nummern: NM 000071 , L14577, X98810 bis X98823, X88562, X87815, X87816, X91910].
10. Methyltetrahydrofolat-L-Homocystein-S-Methyltransferase, MTR (Diagnose von Homocystinurie) [GenBank-Nummer: AF025794, NM 002454].
11.5,10-Methylentetrahydrofolat Reduktase (NADPH), MTHFR (Diagnose von Homocystinurie) [GenBank-Nummern: U09806, AF105988 bis AF105998]. 12.Biotinidase, BTD (Diagnose eines Biotinidase-Mangels) [GenBank-Num- mern: U63274, U03274].
13. Mittelkettige Acyl-CoA-Dehydrogenase, ACADM (Diagnose eines Mittel- kettigen Acyl-CoA-Dehydrogenase-Mangels) [GenBank-Nummern: M16827, M91422 bis M91432, NM 000016]. 14. Low-Density-Lipoprotein Rezeptor, LDLR (Diagnose der familiären Hy- percholesterinämie) [GenBank-Nummern: NM 000527, L00336 bis
00352, L29401]. 15. Apolipoprotein B (Diagnose eines familiär defektem Apolipoprotein B)
[GenBank-Nummern: X04506, M14162]. 16."Cystic fibrosis transmembrane conduetance regulator", CFTR (Diagnose einer zystischen Fibröse) [GenBank-Nummern: NM 000492, M55131].
17. Fibrillin-1 , FBN1 (Diagnose eines Marfan-Syndroms) [GenBank-Nummern: NM 000138, X63556, L13923].
18. "Latent-transformierender Wachstumsfaktor", beta-Bindeprotein-2, LTBP2 (Diagnose eines Marfan-Syndroms) [GenBank-Nummern: Z37976].
19. Delta-7-Sterolreduktase, DHCR7 (Diagnose eines Smith-Lemli-Opitz- Syndroms) [GenBank-Nummer: AF034544].
20.Sterol 21-Hydroxylase, CYP21 (Diagnose eines Adrenogenitalen Sy- droms) [GenBank-Nummern: M26856, M13935, M13936]. 21.Sterol 17-Hydroxlase, CYP17 (Diagnose eines Adrenogenitalen Sy- droms) [GenBank-Nummern: NM 000102, M14564, M31146].
Der erfindungsgemäße Genchip kann also Oligonukleotid-Sequenzen enthalten, die identisch mit den entsprechenden Abschnitten der Referenzse- quenzen oder aber dazu komplementär sind. Des weiteren können Oligonukleotide aufgebracht werden, die funktioneil charakterisierte Mutationen oder dazu komplementäre Sequenzen enthalten. Bei den Mutationen kann es sich um Basensubstitutionen, Insertionen und Deletionen handeln. Ebenso sind komplexere Mutationen wie Inversionen und Indels (als Insertio- nen/Deletionen) möglich.
Die Länge der auf den Genchip aufgetragenen Oligonukleotide kann 16 bis 25 Nukleotide betragen. Vorzugsweise werden 15 bis 18-Mere verwendet.
Werden die zu den Abschnitten der Referenzsequenz identischen Oligonukleotide auf den Genchip aufgebracht, können die dazu komplementären Sequenzen aus der zu untersuchenden Probe synthetisiert werden. Diese Synthese erfolgt während der für den späteren Nachweis der erfolgten Hybridisierung notwendigen Markierungsreaktion.
Auf den erfindungsgemäße Genchip können sowohl DNA - als auch mit RNA -Sequenzen aufgetragen sein. Entsprechend können Nukleotide mit Uracil Verwendung finden. Ebenso können Basenanaloga eingesetzt werden.
Der erfindungsgemäße Genchip hat den Vorteil, daß er um zukünftig se-
quenzierte und funktionell charakterisierte Oligonukleotide ergänzt werden kann
Im folgenden wird die Erfindung anhand folgender Ausführungsbeispiele des näheren erläutert.
Beispiel 1 :
DNA-Chip zur Mutationsdetektion der Phenylketonurie (PKU)
Oligonukleotide, die zu Sequenzen der in Tabelle 1 aufgeführten Referenzsequenzen komplementär sind, werden mit Hilfe von Standardtechniken, wie sie beispielsweise in der deutschen Patentschrift 196 12 356 oder der US- Patentschrift 5 837 832 beschrieben sind, auf einen geeigneten Träger auf- gebracht. Dieser besteht vorzugsweise aus mit Gold beschichteten Glas. Die Ologonukteotide weisen eine Länge von 15 Nukleotiden auf. Im Einzelfall sind auch Sequenzen von 16 bis 25 Nukleotiden möglich.
Der Träger wird in eine Vielzahl von Feldern aufgeteilt, die jeweils nur eine eine Mutation umfassende Sequenz enthalten. Dabei sind die Sequenzen innerhalb des Feldes derart positioniert, daß die Mutation relativ zu dem Referenzsequenzabschnitt möglichst zentral liegt.
Für die Diagnose der die Phenylketonurie verursachenden Mutationen im Phenylalaninhydroxylasegen (PHA-Gen) ergeben sich auf dem erfindungsgemäßen Genchip insgesamt 548 Felder. Dabei trägt z.B. das Feld 1.1 die Sequenz CAGTGGACATGCTGG, welche komplementär zu dem Referenzsequenzabschnitt CCAGCATGTCCACTG ist (Tabellel , Zeile 1 , Spalte 2) und das Feld 1.2 das entsprechende, mutierte Oligonukleotid CAGTGGAIATGCTGG, welches komplementär zu dem mutierten Referenzsequenzabschnitt CCAGCATATCCACTG (Tabellel , Zeile 1 , Spalte 3; Mutation unterstrichen) ist.
Für die Belegung der Felder 2.1 und 2.2 und alle weiteren wird die Sequenz- information der Zeile 2 der Tabelle 1 fortlaufend entsprechend benutzt.
Tabelle 1 : Liste der Nukleinsäuresequenzen, deren komplementäre Sequenzen auf den Chip aufgebracht werden. Um die Übersichtlichkeit zu wahren, wird lediglich der zentrale Bereich der 15- bis 25-mere als Ausschnitt ge- zeigt. Die nicht aufgeführten Sequenzabschnitte sind zu der Referenzsequenz komplementär. Die Position relativ zu der Referenzsequenz ergibt sich aus der Angabe der Codon-Nummer.
Ein zu dem mutierten Referenzsequenzabschnitt komplementäres Oligonu- kleotid wird an genau definierter Stelle auf den Träger aufgebracht. Die von der Referenzsequenz abweichenden Nukleotide ergeben sich aus der Spalte 3 der Tabelle.
Die in der Tabelle aufgeführten Sequenzinformationen beziehen sich auf die Referenzsequenz mit der GenBank-Nummer U49897. Es sind sowohl Mis- sense oder Nonsens-Mutationen (Tabelle 1A) als auch Spleißvarianten (Tabelle 1B), Deletionen (Tabelle 1C und 1E); Insertionen (Tabelle 1 D), In- dels und komplexe Rearrangierungen ausgewählt.
A) Missense- oder Nonsense-Mutationen
Spalte 1 gibt die Nummer des von der Mutation betroffenen Kodons auf der Referenzsequenz an. Die letzte Spalte gibt den durch die Mutation codierten Aminosäureaustausch wieder.
B) Spleißvarianten
Die Lage der Oligonukleotide, abgeleitet aus der Referenzsequenz mit der GenBank-Nummer U49897, ergibt sich aus Spalten 1-3. Die Spalte 4 spezifi- ziert die Mutation.
C) Kleine Deletionen
Die deletierten Nukleotide sind in Kleinbuchstaben dargestellt.
D) Kleine Insertionen
Indels (Insertionen/Deletionen)
55 GCTTATTTGAg_E2/l2_gTCAGTACTA
E) Größere Deletionen
Exon 3 plus flankierende Sequenzen 22 Bp, beginnend mit Nukleotid 593, Kodon 198
22 bp beginnend mit Nukleotid 586, Kodon 196 265 bp, betreffen Exone 5-6 Exone 1-5 plus flankierende Sequenzen Exone 9-13 plus flankierende Sequenzen 22 bp beginnend mit Nukleotid 589, Kodon 197 Exone 9-11 plus flankierende Sequenzen
F) Komplexe Rearrangierungen
GA-AC Nukleotide 470-471 R157N
Beispiel 2:
DNA-Chip für eine Neugeborenen Screening
Ein DNA-Chip wird in der Weise hergestellt wie in Beispiel 1 des näheren ausgeführt. Auch hier werden der 15- bis 18-mere Oligonukleotidsequenzen mit bekannten Techniken auf einen Träger gebracht. Die Oligonukleotide sind dabei komplementär zu den entsprechenden Abschnitten der Referenz- sequenz bzw. zu den mutierten Sequenzbereichen.
Die Referenzsequenzen liegen auf folgenden Genen:
1. Phenylalaninhydroxylase, PAH (Diagnose der Phenylketonurie) 2. Quinoid Dehydropteridin Reduktase, QDPR (Diagnose der Phenylketonurie).
3. Mitochondriale verzweigtkettige alpha-Ketosäuredehydrogenase, -Pep- tid, BCKDHA (Diagnose der Ahomsirupkrankheit).
4. Mitochondriale verzweigtkettige alpha-Ketosäuredehydrogenase, ß-Pep- tid, BCKDHB (Diagnose der Ahomsirupkrankheit).
5. Verzweigtkettige Dihydrolipoamidtransacylase, DBT (Diagnose der Ahomsirupkrankheit).
6. Galaktose-1 -Phosphat Uridyltransferase, GALT (Diagnose der Galaktosämie). 7. Galaktokinase, GALK1 (Diagnose der Galaktosämie).
8. UDP-Galaktose-4-Epimerase, GALE (Diagnose der Galaktosämie).
9. Cystathion-beta-Synthase, CBS (Diagnose der Homocystinurie).
10. 5,10-Methylentetrahydrofolat Reduktase (NADPH), MTHFR (Diagnose der Galaktosämie). 11. Methyltetrahydrofolat-L-Homocystein-S-Methyltransferase, MTR
(Diagnose der Galaktosämie).
12. Biotinidase, BTD (Diagnose eines Biotinidase-Mangels).
13. Mittelkettige Acyl-CoA-Dehydrogenase, ACADM (Diagnose eines Mittel- kettigen Acyl-CoA-Dehydrogenase-Mangels). 14. Low-Density-Lipoprotein Rezeptor, LDLR (Diagnose der familiären Hy- percholesterinämie)
15. Apolipoprotein B (Diagnose eines familiär defektem Apolipoprotein B).
16. "Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator", CFTR (Diagnose einer zystischen Fibröse). 17. Fibrillin-1 , FBN1 (Diagnose eines Marfan-Syndroms).
18. "Latent-transformierender Wachstumsfaktor", beta-Bindeprotein-2, LTBP2 (Diagnose eines Marfan-Syndroms).
19. Delta-7-Sterolreduktase, DHCR7 (Diagnose eines Smith-Lemli-Opitz- Syndroms). 20. Sterol 21-Hydroxylase, CYP21 (Diagnose eines Adrenogenitalen Sy- droms). 21. Sterol 17-Hydroxlase, CYP17 (Diagnose eines Adrenogenitalen Sy- droms).
Aus diesen Genen sind die in der Tabelle 2 dargestellten Referenzsequenzen, die über ihre Codenummer der Genbank des National Center for Biotechnology Information (NCBI) identifizierbar sind ausgewählt.
Auf den erfindungsgemäßen Genchip für ein Neugeborenen Screening wird eine Auswahl von zu funktionell charakterisierten Mutationen komplementären Oligonukleotiden aufgetragen. Diese Mutationen sind in den Tabellen 6.1.1. bis 6.12.5 in ihrer Lage auf der Referenzsequenz und den betroffenen Aminosäuren spezifiziert.
Insgesamt sind auf dem für das Neugeborenen Screening eingesetzten
Genchip mindestens 3.348 Hybridisierungsstellen zur Diagnose der zwölf häufigsten, behandelbaren Erbkrankheiten vorhanden. Die gemeinsame Präsenz dieser Oligonukleotidsequenzen auf einem Träger erlaubt die simultane Diagnostik dieser Erkrankungen aus nur einer Patientenprobe. Deshalb eignet sich dieser DNA-Chip insbesondere für den Einsatz in neonata- len oder pränatalen Screeningprogrammen.
Aus Tabelle 4 sind weitergehende Informationen bezüglich der zu diagnostizierenden Erkrankungen zu entnehmen.
Tabelle 2:
Gen, Gensymbol Erkrankung GenBank Hybridi-sie-
Nummer d. rungsstellen
Ref.-Sequenz (Mindestzahl)
Phenylalaninhydroxylase, PAH Phenylketonurie U49897, 548 K03020, NM 000277, L47726
Quinoid Dihydropteridin RePhenylketonurie II X04882, M16447 40 duktase, QDPR NM 000320
Alpha-KetosäuredehydrogeAhomsirupkrankheit M55575 48 nase, mitochondrial α- und ß- Z14093
Peptid, X66785
Dihydrolipoamid-Transaeylase
Galaktose-1 -Phosphat Uridyl- Galaktosämie M60091, 230 transferase L46354- 365, NM 000155, L46691-724
Galaktokinase Galaktosämie M84443, 4 U26401 , NM 002044,
NM 000154,
L76927
UDP-Galaktose-4-Epimerase Galaktosämie L41668 16
Cystathion-beta-Synthase Homocystinurie L14577, 176 X98810-23, X88562, X91910, X87815-6, NM 000071
5-Methyltetrahydrofolat-Ho- Homocystinurie AF025794 4 mocystein Methyltransferase NM002454
Reductase
5, 10-Methylentetrahydrofolat Homocystinurie U09806, 32
Reductase, NADPH AF105988-98
Mittelkettige Acyl-CoA-Dehy- MCAD M 16827, 48 drogenase NM 000016, M91422-32
Biotinidase Biotinidasemangel U63274, U03274 28
LDL-Rezeptor Familiäre Hyper- L00336-52, 722 cholesterinämie L29401 , NM 000527
Apolipoprotein-B 3500 Familiär defektes X04506. M14162 2 Apo-B
Gen Erkrankung GenBank Hybridi¬
Nummer d. sierungs¬
Ref.-sequenz stellen
CFTR Zystische Fibröse M55131 , 992 NM 000492
Fibrillin I Maifan X63556, L13923, 272 NM 000138
LTBP2 Marfan Z37976 4
Delta-7-Sterolreduktase Smith-Lemli-Opitz AF034544 84
CYP21. CYP17 Adrenogenitales M26856, 98
Syndrom M31146 M 13935-6, M 14564, NM 000102
Beispiel 3:
DNA-Chip für die Diagnose eines Biotinidase-Mangels
In diesem Beispiel werden die in der Tabelle 3 aufgelisteten Olinukleotide der Referenzsequenz direkt mit Hilfe der bekannten Standardtechniken auf einen geeigneten Träger aufgebracht. Analog zu Beispiel 1 werden in der Regel 15-mere verwendet, im Einzelfall können jedoch auch 16- bis 25-mere Oligonukleotide zum Einsatz kommen.
Die Sequenzen werden dabei wiederum so gewählt, daß die in der mutierten Referenzsequenz vorhandene Sequenzabweichung relativ zu der Referenzsequenz etwa zentral liegt.
Auch hier wird jeweils nur eine Oligonukleotidsequenz auf je ein Feld des Trägers aufgebracht.
Für den Nachweis des Biotinidase-Mangels werden 28 funktionell charakterisierte Mutationen auf den Chip aufgebracht, so daß sich 28 Felder ergeben. Dabei trägt z.B. das Feld 1.1 den Referenzsequenzabschnitt CCAGCATGTCCACTG (Tabellel , Zeile 1, Spalte 3), welcher aus der Gensequenz mit der GenBank Nummer U63274 abgeleitet ist, und das Feld 1.2 die entsprechende mutierte Sequenz CAGTGGA GCTGG (Tabellel , Zeile 1, Spalte 4; Mutation unterstrichen).
Für die Belegung der weiteren Felder sind die in der Tabelle 3 aufgeführten Sequenzinformationen der Zeilen 2 bis 14 der Tabelle 3 entsprechend her-
anzuziehen.
Durch Wahl geeigneter Primer aus dem zum kodierenden Strang der Referenzsequenz (auch Sinnstrang genannt) komplementären Strang für die zum Nachweis der Hybridisierung notwendigen Markierungsreaktion wird sichergestellt, daß die markierten Genabschnitte komplementär zu den auf dem Chip aufgebrachten Oligonukleotidsequenzen sind.
Tabelle 3:
Die Tabelle 3 enthält eine Liste der Nukleinsäuresequenzen, die auf den Chip zur Diagnose des Biotinidase-Mangels aufgebracht werden. Zur verbesserten Übersichtlichkeit wird nur der zentrale Bereich der 15- bis 25-me- ren Oligonukleotide gezeigt. Die Position ist relativ zu der Referenzsequenz durch die Angabe der Codon-Nummer spezifiziert. Zu jeder mutierten Referenzsequenz wird an genau definierter Stelle auf dem Träger die aus der dritten Spalte ersichtliche normale Referenzsequenz aufgebracht. Die nicht dargestellten Sequenzabschnitte entsprechen der Referenzsequenz.
A) Missense- oder Nonsense-Mutationen
Intron-Nr. Art d. Position d. BasenSpleißstelle Mutation austausch
1 Akzeptor +56 G-A
Die Lage der Oligonukleotide auf der Referenzsequenz ergibt sich aus Spalten 2-4; Spalte 5 spezifiziert die mutierte Referenzsequenz; Spalte 1 : Mutationsnummer)
C) Kleine Deletionen
D) Indels (Insertionen/Deletionen)
rCCTCTgcggctgTTACGTGGTT tcc
F) Komplexe Rearrangierungen
15 bp Deletion + 11 bp Ins. in Exon D
Tabelle 4: Erkrankungen, die mit einem erfindungsgemäßen Nukleotidträger erkannt werden.
Diese Tabelle zeigt die angeborenen Erbkrankheiten und die dafür relevanten Referenzsequenzen, die mit dem in dem Ausführungsbeispiel beschriebenen Nukleotidträger diagnostiziert werden können. Außerdem enthält sie Angaben darüber, welcher Prozentsatz der klinischen Erkrankungen durch bereits beschriebene Mutationen in den entsprechenden Genen verursacht wird.
5. Liste der für die unten genannten Erkrankungen relevanten Gene
Krankheit Abkürzung relevante Gene
1 2 3
1 Familiäres defektes ApolipoproteinB APOB3500 APOB
2 Adrenogenitales Syndrom AGS CYP21 CYP17
3 Biotϊnidase-Mangel BIOTIN BTD
4 Zystische Fibröse CF CFTR
5 Familiäre Hypercholesterinämie FH LDLR
6 Galaktosämie GAL GALT GALE GALK1
7 Homocystinurie HOMOCYS CBS MTHFR MTR
8 Marfan-Syndrom MARFAN FBN1 LTBP1
9 Mittelkettige AcylCo-Dehydrogenase-Mangel MCAD ACADM
10 Ahomsirupkrankheit MSUD BCKDHA BCKDHB DBT
11 Phenylketonurie PKU PAH QDPR
12 Smith-Lemli-Opitz-Syndrom SLO DHCR7
Die Tabellen 6.1.1 bis 6.12.5 spezifizieren die für bestimmte Erkrankungen relevanten Olyonukleotide auf den Nukleotidträger (NT), nämlich in dieser relativen Lage, den betroffenen Genen, der Nummer des Codons der Referenzsequenz, den betroffenen Nukleotiden der Referenzsequenz, den mutierten Sequenzen, und den phäntopyschen Konsequenzen der Mutationen. Aus Gründen der Übersichtlichkeit wird jeweils nur der unmittelbar betroffene Sequenzbereich dargestellt. Die nicht aufgeführten Abschnitte der Olyonukleotide sind entweder zu der entsprechenden Sequenz der Referenzsequenz identisch oder komlementär. Deletierte Nukleotide sind in Kleinbuchstaben dargestellt.
6.1.1 Familiäre defektes Apolipoprotein B
6.1.2 Congenitales Adrenogenitales Syndrom
6.1.2.1 IVlissense/Nonsense-Mutationen
6.1.2.3 Kleine Insertionen
6.1.2.4 Kleine Insertioneπ/Deletioπen (Iπdels)
Referenzen
1. Witchel (1998) Hum Mutet Online, #218
2. Wedeil (1992) Proc Natl Acad Sei U S A 89, 7232
6.1.2.5 Große Deletionen
1. White (1984) Proc Natl Acad Sei U S A 81 , 7505
6.1.3 Biotinidasemangel
6.1.3.1 Nonsense/Missense-Mutationen
6.1.3.2 Kleine Deletionen
6.1.3.3 Spleißvarianten
6.1.3.4 Kleine Insertionen / Deletionen (Indels)
6.1.3.5 Komplexe Rearrangierungen
Referenzen
1. Pomponio (1995) Nat Genet 11, 96
2. Pomponio (1996) Hum Mol Genet 5, 1657
6.1.4 Zystische Fibröse
6.1.4.1 Nonsense/Missense-Mutationen
6.1.4.2 Kleine Deletionen
6.1.4.3 Kleine Insertionen
6.1.4.4 Spleißvarianten
6.1.4.5 Kleine Insertionen/Deletioπen (Indels)
6.1.4.6 Große Deletionen
1. Shrimpton (1997) Hum Mutat 10, 436
2. Dean (1992) Genomics 13, 235
3. Grade (1994) Hum Genet 94, 154 4. Chevalier (1998) Hum Mutat S1, S291
5. Mickle (1998) Hum Mol Genet 7, 729
6. Magnani (1996) Hum Genet 98, 102
7. Granell (1992) Am J Hum Genet 50, 1022
8. Lerer (1999) Hum Mutat Online, #231 9. Casals (1997) Hum Genet 101, 365
6.1.4.7 Große Insertionen und Duplikationen
Referenzen
1. Casals (1997) Hum Genet 101 , 365
6.1.4.8 Komplexe Rearrangierungen
1. Doerk (1997) Hum Genet 100, 365
2. Stuhrmann (1997) Clin Genet 52, 240
3. Morral (1993) Hum Mol Genet 2, 677
6.1.5 Familiäre Hypercholesterinämie
6.1.5.1 Nonsense/Missense-Mutationen
6.1.5.3 Kleine Insertionen
6.1.5.4 Spleißvarianten
6.1.5.5 Kleine Insertionen/Deletionen (Indels)
6.1.5.6 Große Deletionen
Referenzen
I . Top (1990) Atherosclerosis 83, 127 2. Hobbs (1986) J Biol Chem 261, 13114
3. Langlois (1988) Am J Hum Genet 43, 60
4. Miyake (1989) J Biol Chem 264, 16584
5. Taylor (1989) J Med Genet 26, 494
6. Peeters (1995) Hum Genet 96, 401 7. Bertolini (1992) Am J Hum Genet 51 , 123
8. Henderson (1988) Hum Genet 80, 371
9. Peeters (1997) Hum Genet 100, 266
10. Chae (1999) Clin Genet 55, 325
I I . Geisel (1995) Hum Genet 12. Chae (1997) Hum Genet 99, 155
13. Horsthemke (1987) Eur J Brachem 164, 77
14. Alberto (1999) Braz J Med Biol Res 32, 739
15. Yamakawa (1989) Hum Genet 82, 317
16. Russell (1989) Arteriosclerosis 9S1, 18 17. Lehrman (1985) Science 227, 140
18. Ma (1989) Clin Genet 36, 219
19. Mandelshta (1993) Hum Mol Genet 2, 256
20. Lehrman (1986) Proc Natl Acad Sei U S A 83, 3679
21. Kajinami (1988) Arteriosclerosis 8, 187
22. Lehrman (1987) J Biol Chem 262, 3354
23. Aalto-Seta (1988) FEBS Lett 230, 31
24. Aalto-Seta (1989) J Clin Invest 84, 499
25. Koivisto (1997) Arterioscler Thromb Vase Biol 17, 1392
26. Sun (1994) Arterioscler Thromb 14, 85
27. Hobbs (1990) Annu Rev Genet 24, 133
28. Horsthemke (1987) J Med Genet 24, 144
29. Hobbs (1987) N Engl J Med 317, 734
30. Moorjani (1993) Lancet 341, 1303
31. Bertolini (1999) Arterioscler Thromb Vase Biol 19, 408
32. Gorski (1998) Hum Genet 102, 562
33. Koivisto (1993) Arterioscler Thromb 13, 1680
6.1.5.7 Große Insertionen und Duplikationen
Referenzen
1. Lehrmann (1987) Cell 48, 827 2. Hobbs (1992) Hum Mutat 1, 445
3. Top (1990) Atherosclerosis 83, 127
4. Lelli (1991 ) Arterioscler Thromb 11 , 234
5. Lelli (1991 ) Hum Genet 86, 359
6. Heath (1999) Atherosclerosis 143, 41
6.1.5.8 Komplexe Rearrangierungen
Referenzen
1. Lind (1998) J Intern Med 244, 19
6.1.6 Galaktosämie 6.1.6.1 Nonsense/Missense-Mutationen
6.1.6.2 Kleine Deletionen
6.1.6.3 Kleine Insertionen
6.1.6.4 Spleißvarianten
6.1.6.5 Komplexe Rearrangierungen
1. Waters (1998) Hum Mutat 12, 344 6.1.7 Homocystinurie
6.1.7.1 Nonsense/Missense-Mutationen
6.1.7.2 Kleine Deletionen
6.1.7.3 Kleine Insertionen
6.1.7.5 Große Deletionen
6.1.7.6 Große Insertionen /Duplikationen
6.1.7.8 Kleine Insertionen / Deletionen (Indels)
Referenzen
1. Kozich (1997) J Inherit Metab Dis 20, 363
2. Kruger (1995) Hum Mol Genet 4, 1155
3. Kraus (1999) Hum Mutat 13, 362
4. Gaustadnes (1998) FEBS Lett 431, 175
5. Sperandeo (19995) J Inherit Metab Dis 18, 211
6. Sebastio (1995) Am J Hum Genet 56, 1324
7. de Franchi (1999) Hum Mutat 13, 453
8. Goyette (1996) Am J Hum Genet 59, 1268
6.1.8 Marfan-Syndrom
6.1.8.1 Nonsense/Missense Mutationen
6.1.8.2 Kleine Deletionen
6.1.8.3 Kleine Insertionen
6.1.8.4 Spleißvarianten
6.1.8.5 Komplexe Rearrangierungen
Referenzen
1. Nijbroek (1995) Am J Hum Genet 57, 8
6.1.9 Mittelkettige Acyl-CoA-Dehydrogenase-Mangel 6.1.9.1 Missense/Nonsense Nukleotid-Austausche
6.1.9.2 KleineDeletionen
6.1.9.3 Kleine Insertionen
6.1.9.4 Spleißvarianten
6.1.9.5 Große Deletionen
1. Morris (1995) Hum Mol Genet 4, 747
6.1.10 Ahomsirupkrankheit
6.1.10.1 Nonsense/Missense Mutationen
6.1.10.2 Kleine Deletionen
6.1.10.3 Kleine Insertionen
Spleißvarianten
6.1.11 Phenylketonurie
6.1.11.1 Nonsense/Missense Mutationen
6.1.11.2 Kleine Deletionen
6.1.11.3 Kleine Insertionen
6.1.11.4 Spleißvarianten
6.1.11.5 Kleine Insertionen-Deletionen (Indels)
6.1.11.6 Große Deletionen
6.1.11.7 Komplexe Rearrangierungen
Referenzen 1. Guldberg (1993) Hum Mol Genet 2, 1703
2. Guldberg (1998) Am J Hum Genet 63, 71
3. Okano (1998) Hum Genet 103, 613
4. Guldberg (1997) J Inherit Metab Dis 20, 845
5. Perez (1997) Am J Hum Genet 60, 95 6. Zschoke (1999) J Inherit Metab Dis 22, 687
7. Waters (1998) Hum Mutat 12, 344 6.1.12 Smith-Lemli-Opitz-Syndrom 6.1.12.1 Nonsense/Missense-Mutationen
6.1.12.2 Kleine Deletionen
6.1.12.3 Kleine Insertionen
6.1.12.4 Spleißvarianten
Referenzen
1. Wassif (1998) Am J Hum Genet 63, 55
Claims
Patentansprüche
1. Nukleotidträger mit einer Auswahl von Oligonukleotidsequenzen, die identisch oder komplementär zu Abschnitten von zu mindestens für zwei genetisch bedingte Phänotypen relevanten Referenzsequenzen sind.
2. Nukleotidträger nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß die Auswahl der Oligonukleotide einen signifikanten Anteil aller relevanten Erscheinungsformen eines Phänotypen bestimmt.
3. Nukleotidträger nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Referenzsequenzen aus der Gruppe der Sequenzen mit folgenden GenBank Nummern ausgewählt sind:
- K03020, NM 000277, L47726, U49897;
- NM 000320, M16447, X04882;
- Z14093;
- M55575;
- X66785; - M60091 , NM 000155; L46354 bis 46365, L46691 bis 46724;
- NM 002044, NM 000154, L76927, U26401 , M84443;
- L41668;
- NM 000071, L14577, X98810 bis X98823, X88562, X87815, X87816.X91910; - AF025794, NM 002454;
- U09806, AF105988 bis AF105998;
- U63274, U03274;
- M16827, M91422 bis M91432, NM 000016;
- NM 000527, L00336 bis 00352, L29401; - X04506, M14162;
- NM 000492, M55131;
- NM 000138, X63556, L13923;
Z37976;
AF034544;
M26856, M13935, M13936;
NM 000102, M14564, M31146.
1. Nukleotidträger nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Oligonukleotide aus der Gruppe der in den Tabellen 6.1.1 bis 6.12.5 spezifizierten Sequenzen ausgewählt sind.
5. Nukleotidträger nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Oligonukleotide eine Länge von 16 bis 25 Nukleotiden, vorzugsweise eine Länge von 15 bis 18 Nukleotiden, aufweisen.
6. Nukleotidträger nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß der Träger aus mit Gold beschichtetem Glas besteht.
7. Nukleotidträger nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche gekennzeichnet durch die Kombination von Oligonukleotiden für den Nachweis von Phenylketonurie und Galaktosämie.
8. Nukleotidträger nach Anspruch 7 gekennzeichnet durch Oligonukleotide für den Nachweis von Biotinidase-Mangel.
9. Verwendung des Nukleotidträgers nach einem der Ansprüche 1 bis 6 zur simultanen Diagnose mindestens zweier Erkrankungen aus der Gruppe folgender Erkrankungen:
Phenylketonurie; Ahomsirupkrankheit;
Galaktosämie; Homocystinurie;
Biotinidase-Mangel;
Mittelkettiger Acyl-CoA-Dehydrogenase-Mangel; familiäre Hypercholesterinämie; familiär defektes Apolipoprotein-B; zystische Fibröse;
Marfan-Syndrom; Smith-Lemli-Opitz-Syndrom; Adrenogenitales Syndrom.
10. Verwendung des Nukleotidträgers nach einem der Ansprüche 1 bis 8 zur neonatalen Untersuchung.
11. Verwendung des Nukleotidträgers nach einem der Ansprüche 1 bis 8 zur pränatalen Untersuchung.
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Cited By (3)
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|---|---|---|---|---|
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Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0256630A1 (de) * | 1986-07-31 | 1988-02-24 | Howard Hughes Medical Institute | Spezifische Sonde zur Identifikation von Mutationen in den humanen Phenylalaningenen |
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Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0256630A1 (de) * | 1986-07-31 | 1988-02-24 | Howard Hughes Medical Institute | Spezifische Sonde zur Identifikation von Mutationen in den humanen Phenylalaningenen |
| US5750335A (en) * | 1992-04-24 | 1998-05-12 | Massachusetts Institute Of Technology | Screening for genetic variation |
| EP0962464A2 (de) * | 1996-01-23 | 1999-12-08 | Rapigene, Inc. | Methoden und Zusammensetzungen zum Nachweis der Bindung eines Liganden-Paars mittels nicht-fluoriszierender Markierungen |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| CRONIN M T ET AL: "CYSTIC FIBROSIS MUTATION DETECTION BY HYBRIDIZATION TO LIGHT-GENERATED DNA PROBE ARRAYS" HUMAN MUTATION, WILEY-LISS, NEW YORK, NY, US, Bd. 7, 1996, Seiten 244-255, XP000991050 ISSN: 1059-7794 * |
| EIKEN H G ET AL: "APPLICATION OF NATURAL AND AMPLIFICATION CREATED RESTRICTION SITES FOR THE DIAGNOSIS OF PKU MUTATIONS" NUCLEIC ACIDS RESEARCH, OXFORD UNIVERSITY PRESS, SURREY, GB, Bd. 19, Nr. 7, 11. April 1991 (1991-04-11), Seiten 1427-1430, XP000371877 ISSN: 0305-1048 * |
| EIKEN HANS GEIR ET AL: "A de novo phenylketonuria mutation: ATG (Met) to ATA (Ile) in the start codon of the phenylalanine hydroxylase gene." HUMAN MUTATION, Bd. 1, Nr. 5, 1992, Seiten 388-391, XP001073536 ISSN: 1059-7794 * |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2002072882A2 (de) * | 2001-03-13 | 2002-09-19 | Ogham Gmbh | Herzchip |
| WO2002072882A3 (de) * | 2001-03-13 | 2003-10-02 | Ogham Gmbh | Herzchip |
| EP1398388A2 (de) * | 2002-08-09 | 2004-03-17 | OGHAM GmbH | Methode zur Bestimmung eines erblichen Thromboserisikos mit DNA-arrays |
| EP1398388A3 (de) * | 2002-08-09 | 2004-06-16 | OGHAM GmbH | Methode zur Bestimmung eines erblichen Thromboserisikos mit DNA-arrays |
| US20090317797A1 (en) * | 2005-01-18 | 2009-12-24 | Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) | Non-Invasive, Prenatal, In-Vitro Method for Detecting the Normal Healthy Condition, the Condition of a Healthy Carrier or the Condition of a Carrier Inflicted with Cystic Fibrosis |
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